神经干细胞范文10篇

神经干细胞范文篇1

【关键词】神经干细胞；2型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力

绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一种新的报告基因，由于其表达产物GFP可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如β2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在GFP的基础上进行F64L和S65T的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），EGFP增强了GFP的荧光性能，更容易观察、检测［1］。2型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体DNA介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体［2］。随着神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）的分离、培养、纯化及生物学功能研究深入［3～5］，寻找NSCs基因修饰载体及标记分子，已成为研究NSCs在体内、外分化调控和细胞工程基因治疗中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。

1材料与方法

1.1病毒载体rAAV-2/EGFP购于863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为5×1011v.g/ml。

1.2神经干细胞分离、培养、鉴定［6］按参考文献进行，体外分离胚胎大鼠大脑额叶皮质、悬浮培养，经Nestine鉴定为神经干细胞（见图1），作为实验细胞株。

1.3主要试剂、仪器DMEM/F12培养液、胎牛血清（HyClone公司产品）；表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）（SIGMA公司产品）；兔抗巢蛋白Nestin抗体、罗丹明标记山羊抗兔二抗（北京中杉金桥公司产品）。相差倒置显微镜（Cannon）、倒置荧光显微镜（Nikon）、细胞计数板、CO2培养箱、超净台、流式细胞仪（BD）。

1.4rAAV-2/EGFP体外转染神经干细胞

1.4.1分组取生长良好的NSCs，机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制备成单细胞悬液，以1×105个细胞/孔接种于4块6孔培养板中，分别按感染复数（MOI）（v.g/cell）=0、1×104、1×105、1×106转染，设四组，其中MOI=0作为未转染对照组。

1.4.2转染转染时先按MOI值计算所需加入rAAV-2/EGFP病毒载体的体积数，在试管中将所需加入rAAV-2/EGFP病毒载体与DMEM/F12培养液混合形成转染液，将每组对应孔中加入相应的2ml转染液，MOI=0作为未转染对照组，同样操作但不转染rAAV-2/EGFP，37℃，5%CO2培养箱培养2h后，1000r/min离心5min，如此DMEM/F12清洗细胞2次，弃病毒残液，补充完全细胞培养液（DMEM/F12加2%B27，20ng/ml的EGF、bFGF）5ml，37℃，5%CO2培养箱培养，常规换液、传代。在倒置荧光显微镜下观察、记录rAAV-2/EGFP转染NSCs后EGFP的表达情况。

1.5rAAV-2/EGFP体外转染对神经干细胞存活、增殖、分化的影响rAAV-2/EGFP转染NSCs后，各组分别在7、14、21天细胞传代时台盼兰拒染法检测细胞活力、细胞计数计算增殖倍数。0.2%台盼兰溶液与细胞悬液混匀，死细胞着色，而活细胞不着色，计数活细胞数及死细胞数。细胞活力为活细胞数/（活细胞数＋死细胞数）。EGFP表达稳定时，10％胎牛血清诱导各组NSCs克隆球分化，观察分化情况。

1.6流式细胞仪检测基因转染率和表达效率［7］rAAV-2/EGFP转染NSCs后，各组在各相应的时间点细胞机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制成单细胞悬液，上流式细胞仪（BD），以未转染组为对照，激发光为488nm、吸收光为530nm，进行数据获取与分析；分析结果用转染率和荧光指数（fluorescentindex，FI）表示。转染率即EGFP阳性细胞的阳性率，荧光指数主要反映了目的基因的表达效率。

每一样品收集1×104个细胞，根据细胞大小设定一个单细胞区域，该区域的细胞用于荧光分析。以未转染组的细胞作为阴性对照，设定GFP阳性细胞区（M1区）使阴性对照M1区细胞数不超过0.1%，流式细胞仪分析结果用转染率和荧光指数FI表示。转染率即为GFP阳性细胞阳性率，FI主要反映了目的基因的表达效率，分别用下列公式计算：转染率=样品M1区细胞百分率－阴性对照M1区细胞百分率；FI=样品M1区细胞百分率样品×M1区平均荧光强度－阴性对照M1区细胞百分率×阴性对照M1区平均荧光强度。在上述两个公式中，减数很小，一般情况下可忽略不计。

1.7统计学处理各组数据均用x±s表示，组间比较用单因素方差分析，实验数据用统计软件SPSS11.0进行统计学处理。

2结果

2.1rAAV-2介导的EGFP基因在NSCs中的表达rAAV-2/EGFP转染NSCs，10天后EGFP开始表达，倒置荧光显微镜下可见各转染组神经球受蓝色光激发产生的呈团块状的绿色荧光，但较弱且强度不一，总体上感染复数越大荧光越强；随后表达显著增加，21天时达高峰，这时荧光较强（见图2），表明细胞球中多数细胞被转染并成功表达EGFP，细胞继续传代培养，仍可见大量荧光。

2．2rAAV-2对神经干细胞活力、增殖、分化的影响不同MOI的rAAV-2转染组和未转染对照组的NSCs在倒置显微镜下观察，均生长良好，细胞透光性好，形态完整，细胞碎片少，NSCs形成克隆球速度相当，细胞稳定性好，可连续传代，各组细胞在7、14、21天台盼兰拒染法检测细胞活力差异均无显著性（P＞0.05）（见表1）。同时各组细胞在7，14，21天细胞计数从而计算增殖倍数，转染组与未转染对照组在相应时间点差异亦无显著性（P＞0.05），并在培养过程中呈指数生长趋势（见表2）。表1rAAV-2转染对NSCs活力的影响注：均为同一时间点转染组和未转染组对照比较，组间比较P＞0.05，差异无显著性表2rAAV-2转染对NSCs增殖倍数的影响注:均为同一时间点转染组和未转染对照组比较，组间比较P＞0.05，差异无显著性。

EGFP表达稳定时，10％胎牛血清诱导各组分化后，各组均可见神经干细胞克隆球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中6h左右细胞克隆球贴壁，12h后即发现有突起从团块边缘长出，24h后见有少数细胞从克隆球的边缘向外迁移，分化为有突起的细胞，有的细胞迁移速度较快，以后分化的细胞逐渐增多，从克隆球周围迁移出，呈放射状排列，随着时间的推移，突起不断增粗与延长并互相连接成网状，1周以后，各组NSCs克隆球几乎完全分化，形成大量胞体呈圆形或椭圆形、具有1～2细长突起的神经元样细胞和胞体较大、形态不规则、具有多个粗突起的星形胶质样细胞。MAP-2、GFAP免疫荧光分别鉴定分化细胞，荧光显微镜下各组均可见MAP-2阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。rAAV-2转染的神经干细胞不仅可以分化为神经元和胶质细胞，细胞形态保持正常，且转染不影响神经元和胶质细胞的分化比例。各组MAP-2、GFAP阳性细胞比例见表3，差异均无显著性（P值均＞0.05）。表3不同MOI转染组和未转染对照组MAP-2、GFAP阳性细胞的比较注：组间比较P>0.05，差异无显著性

2.3rAAV-2对神经干细胞的转染效率EGFPEGFP开始表达后，于14、21、28天流式细胞仪检测各MOI的rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率（见表4）：可见21天为其表达高峰，此时MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%（见图3），荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06。表4不同MOI的rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率

3讨论

近年来，神经干细胞的研究发展迅速，但仍存在许多问题，如细胞移植时常常不能区别供体细胞与宿主细胞，不能较精确地观察植入细胞的存活及生长分化情况，也就难以对脑内移植的功效作出一个客观评价。随着基因工程技术的发展，人们可根据不同的科研及治疗目的，对神经干细胞进行不同的遗传学修饰，以期制成基因工程细胞，这些细胞极具科研和应用价值，受到广泛关注。病毒载体和非病毒载体是目前基因修饰中常用的两大类载体。非病毒载体有脂质体、质粒、分子偶联载体等，基因转移效率低。病毒载体应用最广泛，约占85%，其中腺相关病毒、逆（反）转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒是基因治疗中最常用的4种病毒载体，病毒载体安全性问题至关重要［8］。各种病毒载体都有自己的优点和不足，但是逆（反）转录病毒是随机整合入宿主DNA、可能会引起“插入诱变”、也有可能产生具有复制能力的病毒［9］；腺病毒不能整合到宿主染色体DNA上，表达时间短暂，所以不能持续表达所需产物，且可能刺激免疫反应［10］；单纯疱疹病毒对人类具有明显的致病性，能够从潜伏状态激活［11］。而AAV-2是一种单链的微小DNA病毒，需要辅助病毒才能有效地复制，具有与人类疾病无相关、宿主范围广，并能整合入宿主细胞DNA，去除其复制蛋白Rep和包装蛋白Cap基因,仅具有感染宿主的功能,安全性较高,成为较理想的基因修饰载体,倍受瞩目。其具有下列优点:目前尚未发现该病毒在人体中致病,所以比较安全；感染宿主细胞广泛,包括非分裂细胞和分裂细胞,特别是神经元和神经胶质感染性较强；能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减小了插入突变激活原癌基因的可能性，rAAV虽然失去了整合特异性，但反向末端重复序列中没有转录调控组件，因而减少了插入突变的可能性；外源基因表达稳定，可长达2年［2，12］。NSCs具有自我复制、增殖分化的能力，是基因修饰、基因治疗的靶细胞。

AAV-2能否有效地转染神经干细胞，且转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等有无影响，值得探讨。因为如果转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等天然性能产生影响，都会对细胞、机体造成严重后果，那么将会极大地限制其在基因修饰、基因治疗方面的应用。许多学者采用AAV转染神经干细胞，得到的结果各不相同。Hughes等［13］研究认为rAAV-2对神经干细胞球略有效率低下的转染能力，其仅观察5天转入基因的表达情况，而腺相关病毒转染细胞后基因表达的高峰期为1个月左右，转入基因5天时可能没有表达或者表达量很少。本实验分离培养了大鼠胚胎源性神经干细胞，用rAAV-2/EGFP转染NSCs，对其进行基因修饰，我们的结果提示：转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等未产生影响，rAAV-2对神经干细胞没有毒性作用，不影响神经干细胞的生物学特性，是神经干细胞间接体外法基因治疗的理想载体；MOI=1×104、1×105、1×106转染10天后，EGFP开始表达，荧光显微镜下可见弥漫于整个NSCs克隆球中的绿色荧光，起始表达强度不一，随MOI值的增大而增强，而且EGFP的表达强度随着时间的延长而逐渐增强，至转染后第21天达到高峰并维持,此后荧光指数不再增大；此时行流式细胞仪检测：MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%,荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06。仅以转染率不能够全面衡量一个基因载体的转移效率，无法反映多拷贝基因转移，也不能反映目的基因的表达效率。荧光指数能更为全面地反映基因转移和表达效率；以GFP基因为报告基因，用流式细胞仪分析基因转移效率（转染率和荧光指数）优于传统人工计数法，并且还可用流式细胞仪进一步筛选表达EGFP阳性的细胞。AAV是通过靶细胞膜上的表面肝素聚糖蛋白（surfaceheparinproteinofglycans,SHPG）为受体介导转染的［14］，而受体的数目和功能是有限的，当AAV与受体结合达平衡时，发挥最大生物效应，再增大MOI也不会提高转染效率。因此我们可以解释rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率随MOI值的增大而增强，但MOI为1×105、1×106转染效率相差不大，可能是AAV与受体结合达到了平衡，转染达到了稳定，结合实验经济因素，因而MOI=1×105为最佳MOI。另外，还有可能是由于神经干细胞AAV受体表达强弱、培养方法、转染时间、检测方法的不同等因素，引起不同学者实验研究结果上的差异。

GFP相对分子质量小，这也是它作为报告基因的一大优点；GFP与目的基因融合后对目的基因的结构功能没有影响，大量表达对细胞也无毒性作用。在我们的研究基础上，将rAAV-2/EGFP与一些促进NSCs存活和定向分化的营养因子，如GDNF、VEGF等目的基因构建成融合基因，以GFP基因为报告基因，rAAV-2为载体，一起转染移植的NSCs，不需用其他检测方法，只需荧光显微镜下观察GFP的表达情况，便可针对另一基因作相关研究，将对中枢系统的研究手段有更好的应用价值。

【参考文献】

1ChalfieM,TuY,EuskirchenG,etal.Greenfluorescenproteinasamarkerforgeneexpression.Science,1994,263:802-805.转载于范文中国网。

2LoWD,QuG,SferraTJ,etal.Adeno-associatedvirus-mediatedgenetransfertothebrain:durationandmodulationofexpression.HumGeneTher,1999,10:201-213.

3ReynoldsBA,WeissS.Generationofneuronsandastrocytesfromisolatedcellsoftheadultmammaliancentralnervoussystem.Science,1992,255:1707-1710.

4MckayR.Stemcellsinthecentralnervoussystem.Science,1997,276:66-71.

5宣爱国,龙大宏,等.BDNF和神经干细胞联用对老年痴呆鼠基底前脑胆碱能神经元和学习记忆能力的影响.神经解剖学杂志，2005,21,365-371.

6徐汉荣，晋光荣，张海军，等.胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离、培养与鉴定.东南大学学报（医学版），2006，25（4）：248-251.

7刘然义,罗慧玲.一种用流式细胞式检测基因转移效率的新方法.癌症,2002,21:267-271.

8MulliganRC.Thebasicscienceofgenetherapy.Science,1993，260：926-932.

9VanTendelooV,VanBroeckhovenV,BrenemanZN.Genetherapy:principlesandapplicationstohematopoieticcells.Leukemia,2001,15:523-544.

10YangY,NunesFA,BerencsiK，etal.CelluarimmunitytoviralantigenslimitsE1-deletedadenovirusesforgenetherapy.ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:4407-4411.

11PalellaTD,HidahaY.ExpressionofhumanHRTPMrnainbrainsofmiceinfectedwitharecombinantherpessimplexvirus-1vectir.Gene,1989,80:137-144.

12DyallJ,SzaboP,BernsKL.Adeno-associatedvirus（AAV）site-specificformationofAAV-AAVS1junctioninaninvitrosystem.ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:12849-12854.

神经干细胞范文篇2

关键词：神经干细胞临床应用

1NSC的来源

据来源部位的不同，可分为胚胎来源及成体来源，分别称为胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成体干细胞(AdultStemCell，ASC)。ESC来源于胚胎胚泡阶段，即胚胎发育过程中植入于宫壁内之前阶段。ASC来自于成体组织，能在很长一段时间内准确复制自己，进行自我更新，能生长成成体的细胞类型，具有一定形态特征和指定的功能。由于ESC研究与应用面临伦理、宗教、法律、免疫排斥和潜在致瘤性等问题，在实际操作上仍有一定困难。而ASC“可塑性”的发现及相关研究在不同程度上避免了这些问题，是细胞替代治疗和基因组织工程研究的热点之一。

2临床应用

对于神经系统退行性病变及严重损伤，NSC移植有可能替代衰老、变性和死亡的神经细胞，重建神经网络，恢复受损的脑功能。这种治疗方法具有以下的特点：a.NSC在脑中能根据周围环境的诱导而分化成相应的细胞类型，其形态功能与附近原有细胞非常类似。b.免疫源性弱，免疫反应小。c.低毒性，致瘤性弱。

3细胞替代治疗

传统观点认为中枢神经系统神经元的产生只发生于胚胎期及出生后的一段时间，成熟的神经元很难或不能分裂，各种原因造成神经元的变性坏死，其缺失将是永久性的，只能由胶质细胞来替换。

NSCSHASC可朔性的发现，使神经系统疾病的治疗进入了新的时代。细胞替代治疗策略包括：a.利用调控手段刺激、促进内源性NSC更新修复，产生神经细咆替代变性、坏死的神经细胞，从而达到修复神经功能的目的。b.移植外源性和内源性NSC，使其生长、分化为神经元和神经胶质细胞进行修复。需要说明的是这两种方法并非孤立，而是可以同时使用并互相促进的。NSC移植方法包括：a.细胞悬浮液立体定位注射法；b.胶原基质包埋移植法；c.生物材料(PGA、PLA等)吸附移植法；d.静脉内细胞悬液输入法；e.脑室内或腰穿细胞悬液注射法。从来源上看，细胞替代治疗包括以下几方面。

3.1ESC：主要来源于早期胚胎(桑椹胚一胚泡)，在有分化抑制因子的条件下分化为NSC。

3.2异体NSC：主要来自流产的胎脑室管膜组织，越早期的胎儿NSC的比例越高。

3.3自体NSC：临床志愿者术中脑组织碎片分离得到的NSC或是收集脑室周围的NSC在体外培养扩增后植入患者体内，或是运用药物刺激内源性NSC增殖分化(如把TGF-a注射到帕金森病模型中，发现动物侧脑室和海马齿状回的NSC增殖并迁移到受损区域，分化为多巴胺神经细胞，引起症状的改善)。

3.4MSC：来源广泛，免疫源性弱，注入人体后，无明显的炎症反应和淋巴细胞浸润，同时植入后没有观察到神经胶质细胞增生和肿瘤细胞的发生。

3.5HSC：用于造血系统疾病的治疗已取得了满意的效果。研究发现HSC在星形胶质细胞条件培养液中分化的细胞GFAP、NSE和Nestion阳性表达。Borila等发现成人骨髓的HSC在体外培养条件下可分化为不同的神经细胞，将HSC移植入新生儿体内，一个月后在脑室区和脑室下区检测到了NSC，并进而分化为功能性的少突胶质细胞和神经元。

4基因或药物治疗

载体NSC的应用中枢神经系统损伤后神经修复困难的原因之一，是中枢神经系统内没有稳定的适合神经元轴突再生的微环境，包括胶质细胞增生形成疤痕，对神经元轴突再生形成空间障碍、促神经生长因子或神经营养因子的缺乏和神经元轴突生长抑制因子的存在等。NSC作为基因载体是近几年研究的新方向，其独有的生物学特性：a.良好基因可操作性，可携带多个外源基因，转染后可在体内、外稳定表达；b.具有远距离迁徙能力；d.对外源性基因容受性强；e.免疫源性弱；f.体外易于保持微分化状态；g.随微环境作相应分化的特点能实现神经移植区域的细胞替代等，使其成为中枢神经系统疾病基因治疗的理想载体。转基因NSC一方面分泌细胞因子，产生对NSC和神经元的营养、保护、抗凋亡作用；另一方面，NSC分化的细胞将产生神经元、神经胶质细胞等，有望实现受损细胞结构的重建与替代。同时，作为基因载体，NSC还可通过基因修饰产生特殊的蛋白质，用于神经系统肿瘤和其他疾病的治疗。

5组织培养在适当的条件作用下，NSC有可能在体外培养体系中形成神经组织，如果此目标实现，将大大推进NSC的临床应用。

6病毒致神经疾病机制研究NSC已用于鼠的致肿瘤病毒的神经疾病发病机制的研究。通过将病毒转染到NSC中，利用NSC的生物学特性，使病毒在试验动物脑内扩散，观察其神经毒力。

7NSC联合生物材料应用通过在损伤的神经组织中植入生物材料“支架”，保护了神经组织不受进—步的损害，减少疤痕和空洞的形成，在一定程度上促进和引导了神经轴突的再生和延伸。Suzuki等使用藻酸盐为载体填充损伤的脊髓后，将胚胎海马源性的NSC植入损伤部位，2周后发现NSC明显移行，并整合入受者脊髓中；不使用藻酸盐，移植细胞成活很少。目前这方面的研究不多。可应用的生物材料主要有：a.天然聚合物：藻酸盐水凝胶、Ⅰ型胶原等；b.合成生物可降解材料：聚乳酸等；c.合成生物非降解聚合物：聚甲基丙烯酸羟乙酯等；d.可降解材料复台物：聚羟基丁酸盐与藻酸盐水凝胶复合物等；e.非降解材料复合物导管：丙烯酸聚合物或PNA/PVC的共聚物制成的导管。Borgens等报道，用聚乙烯二醇能使脊髓损伤部位的神经冲动传导恢复，从而恢复脊髓功能。

8问题和展望

虽然NSC应用于临床有广阔的前景，但目前仍有很多问题急需解决，如ESC研究引起法律、生物医学、神学、社会学和伦理道德方面的争议。以及其致畸性，制约着ESC的基础研究和应用。NSC的定向诱导分化，永生化NSC的致瘤性，转染的目的基因长期稳定表达及调节，iNSC迁移的机制和调控，以及基因工程细胞技术中如何选择合适的启动子、基因和移植物以及移植位点的确定等等。但这些并没有影响其临床应用的步伐，相信随着NSC基础和临床研究的不断深入，NSC在临床上的应用将取得突破性的进展。

参考文献

[1]冯定庆.神经干细胞的基础研究进展及应用前景[J];解剖学研究;2004年01期.

神经干细胞范文篇3

关键词：神经干细胞临床应用

一、NSC的来源

据来源部位的不同，可分为胚胎来源及成体来源，分别称为胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成体干细胞(AdultStemCell，ASC)。ESC来源于胚胎胚泡阶段，即胚胎发育过程中植入于宫壁内之前阶段。ASC来自于成体组织，能在很长一段时间内准确复制自己，进行自我更新，能生长成成体的细胞类型，具有一定形态特征和指定的功能。由于ESC研究与应用面临伦理、宗教、法律、免疫排斥和潜在致瘤性等问题，在实际操作上仍有一定困难。而ASC“可塑性”的发现及相关研究在不同程度上避免了这些问题，是细胞替代治疗和基因组织工程研究的热点之一。

二、临床应用

对于神经系统退行性病变及严重损伤，NSC移植有可能替代衰老、变性和死亡的神经细胞，重建神经网络，恢复受损的脑功能。这种治疗方法具有以下的特点：a.NSC在脑中能根据周围环境的诱导而分化成相应的细胞类型，其形态功能与附近原有细胞非常类似。b.免疫源性弱，免疫反应小。c.低毒性，致瘤性弱。

三、细胞替代治疗

传统观点认为中枢神经系统神经元的产生只发生于胚胎期及出生后的一段时间，成熟的神经元很难或不能分裂，各种原因造成神经元的变性坏死，其缺失将是永久性的，只能由胶质细胞来替换。NSCSHASC可朔性的发现，使神经系统疾病的治疗进入了新的时代。细胞替代治疗策略包括：a.利用调控手段刺激、促进内源性NSC更新修复，产生神经细咆替代变性、坏死的神经细胞，从而达到修复神经功能的目的。b.移植外源性和内源性NSC，使其生长、分化为神经元和神经胶质细胞进行修复。需要说明的是这两种方法并非孤立，而是可以同时使用并互相促进的。NSC移植方法包括：a.细胞悬浮液立体定位注射法；b.胶原基质包埋移植法；c.生物材料(PGA、PLA等)吸附移植法；d.静脉内细胞悬液输入法；e.脑室内或腰穿细胞悬液注射法。从来源上看，细胞替代治疗包括以下几方面。

3.1ESC：主要来源于早期胚胎(桑椹胚一胚泡)，在有分化抑制因子的条件下分化为NSC。

3.2异体NSC：主要来自流产的胎脑室管膜组织，越早期的胎儿NSC的比例越高。

3.3自体NSC：临床志愿者术中脑组织碎片分离得到的NSC或是收集脑室周围的NSC在体外培养扩增后植入患者体内，或是运用药物刺激内源性NSC增殖分化(如把TGF-a注射到帕金森病模型中，发现动物侧脑室和海马齿状回的NSC增殖并迁移到受损区域，分化为多巴胺神经细胞，引起症状的改善)。

3.4MSC：来源广泛，免疫源性弱，注入人体后，无明显的炎症反应和淋巴细胞浸润，同时植入后没有观察到神经胶质细胞增生和肿瘤细胞的发生。

3.5HSC：用于造血系统疾病的治疗已取得了满意的效果。研究发现HSC在星形胶质细胞条件培养液中分化的细胞GFAP、NSE和Nestion阳性表达。Borila等发现成人骨髓的HSC在体外培养条件下可分化为不同的神经细胞，将HSC移植入新生儿体内，一个月后在脑室区和脑室下区检测到了NSC，并进而分化为功能性的少突胶质细胞和神经元。

四、基因或药物治疗载体NSC的应用

中枢神经系统损伤后神经修复困难的原因之一，是中枢神经系统内没有稳定的适合神经元轴突再生的微环境，包括胶质细胞增生形成疤痕，对神经元轴突再生形成空间障碍、促神经生长因子或神经营养因子的缺乏和神经元轴突生长抑制因子的存在等。NSC作为基因载体是近几年研究的新方向，其独有的生物学特性：a.良好基因可操作性，可携带多个外源基因，转染后可在体内、外稳定表达；b.具有远距离迁徙能力；d.对外源性基因容受性强；e.免疫源性弱；f.体外易于保持微分化状态；g.随微环境作相应分化的特点能实现神经移植区域的细胞替代等，使其成为中枢神经系统疾病基因治疗的理想载体。转基因NSC一方面分泌细胞因子，产生对NSC和神经元的营养、保护、抗凋亡作用；另一方面，NSC分化的细胞将产生神经元、神经胶质细胞等，有望实现受损细胞结构的重建与替代。同时，作为基因载体，NSC还可通过基因修饰产生特殊的蛋白质，用于神经系统肿瘤和其他疾病的治疗。

五、组织培养

在适当的条件作用下，NSC有可能在体外培养体系中形成神经组织，如果此目标实现，将大大推进NSC的临床应用。

六、病毒致神经疾病机制研究

NSC已用于鼠的致肿瘤病毒的神经疾病发病机制的研究。通过将病毒转染到NSC中，利用NSC的生物学特性，使病毒在试验动物脑内扩散，观察其神经毒力。

七、NSC联合生物材料应用

通过在损伤的神经组织中植入生物材料“支架”，保护了神经组织不受进—步的损害，减少疤痕和空洞的形成，在一定程度上促进和引导了神经轴突的再生和延伸。Suzuki等使用藻酸盐为载体填充损伤的脊髓后，将胚胎海马源性的NSC植入损伤部位，2周后发现NSC明显移行，并整合入受者脊髓中；不使用藻酸盐，移植细胞成活很少。目前这方面的研究不多。可应用的生物材料主要有：a.天然聚合物：藻酸盐水凝胶、Ⅰ型胶原等；b.合成生物可降解材料：聚乳酸等；c.合成生物非降解聚合物：聚甲基丙烯酸羟乙酯等；d.可降解材料复台物：聚羟基丁酸盐与藻酸盐水凝胶复合物等；e.非降解材料复合物导管：丙烯酸聚合物或PNA/PVC的共聚物制成的导管。Borgens等报道，用聚乙烯二醇能使脊髓损伤部位的神经冲动传导恢复，从而恢复脊髓功能。

八、问题和展望

虽然NSC应用于临床有广阔的前景，但目前仍有很多问题急需解决，如ESC研究引起法律、生物医学、神学、社会学和伦理道德方面的争议。以及其致畸性，制约着ESC的基础研究和应用。NSC的定向诱导分化，永生化NSC的致瘤性，转染的目的基因长期稳定表达及调节，iNSC迁移的机制和调控，以及基因工程细胞技术中如何选择合适的启动子、基因和移植物以及移植位点的确定等等。但这些并没有影响其临床应用的步伐，相信随着NSC基础和临床研究的不断深入，NSC在临床上的应用将取得突破性的进展。

参考文献：

[1]冯定庆.神经干细胞的基础研究进展及应用前景[J];解剖学研究;2004年01期.

神经干细胞范文篇4

关键词：神经干细胞临床应用

1NSC的来源

据来源部位的不同，可分为胚胎来源及成体来源，分别称为胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成体干细胞(AdultStemCell，ASC)。ESC来源于胚胎胚泡阶段，即胚胎发育过程中植入于宫壁内之前阶段。ASC来自于成体组织，能在很长一段时间内准确复制自己，进行自我更新，能生长成成体的细胞类型，具有一定形态特征和指定的功能。由于ESC研究与应用面临伦理、宗教、法律、免疫排斥和潜在致瘤性等问题，在实际操作上仍有一定困难。而ASC“可塑性”的发现及相关研究在不同程度上避免了这些问题，是细胞替代治疗和基因组织工程研究的热点之一。

2临床应用

对于神经系统退行性病变及严重损伤，NSC移植有可能替代衰老、变性和死亡的神经细胞，重建神经网络，恢复受损的脑功能。这种治疗方法具有以下的特点：a.NSC在脑中能根据周围环境的诱导而分化成相应的细胞类型，其形态功能与附近原有细胞非常类似。b.免疫源性弱，免疫反应小。c.低毒性，致瘤性弱。

3细胞替代治疗

传统观点认为中枢神经系统神经元的产生只发生于胚胎期及出生后的一段时间，成熟的神经元很难或不能分裂，各种原因造成神经元的变性坏死，其缺失将是永久性的，只能由胶质细胞来替换。

NSCSHASC可朔性的发现，使神经系统疾病的治疗进入了新的时代。细胞替代治疗策略包括：a.利用调控手段刺激、促进内源性NSC更新修复，产生神经细咆替代变性、坏死的神经细胞，从而达到修复神经功能的目的。b.移植外源性和内源性NSC，使其生长、分化为神经元和神经胶质细胞进行修复。需要说明的是这两种方法并非孤立，而是可以同时使用并互相促进的。NSC移植方法包括：a.细胞悬浮液立体定位注射法；b.胶原基质包埋移植法；c.生物材料(PGA、PLA等)吸附移植法；d.静脉内细胞悬液输入法；e.脑室内或腰穿细胞悬液注射法。从来源上看，细胞替代治疗包括以下几方面。

3.1ESC：主要来源于早期胚胎(桑椹胚一胚泡)，在有分化抑制因子的条件下分化为NSC。

3.2异体NSC：主要来自流产的胎脑室管膜组织，越早期的胎儿NSC的比例越高。

3.3自体NSC：临床志愿者术中脑组织碎片分离得到的NSC或是收集脑室周围的NSC在体外培养扩增后植入患者体内，或是运用药物刺激内源性NSC增殖分化(如把TGF-a注射到帕金森病模型中，发现动物侧脑室和海马齿状回的NSC增殖并迁移到受损区域，分化为多巴胺神经细胞，引起症状的改善)。

3.4MSC：来源广泛，免疫源性弱，注入人体后，无明显的炎症反应和淋巴细胞浸润，同时植入后没有观察到神经胶质细胞增生和肿瘤细胞的发生。

3.5HSC：用于造血系统疾病的治疗已取得了满意的效果。研究发现HSC在星形胶质细胞条件培养液中分化的细胞GFAP、NSE和Nestion阳性表达。Borila等发现成人骨髓的HSC在体外培养条件下可分化为不同的神经细胞，将HSC移植入新生儿体内，一个月后在脑室区和脑室下区检测到了NSC，并进而分化为功能性的少突胶质细胞和神经元。

4基因或药物治疗载体NSC的应用

中枢神经系统损伤后神经修复困难的原因之一，是中枢神经系统内没有稳定的适合神经元轴突再生的微环境，包括胶质细胞增生形成疤痕，对神经元轴突再生形成空间障碍、促神经生长因子或神经营养因子的缺乏和神经元轴突生长抑制因子的存在等。NSC作为基因载体是近几年研究的新方向，其独有的生物学特性：a.良好基因可操作性，可携带多个外源基因，转染后可在体内、外稳定表达；b.具有远距离迁徙能力；d.对外源性基因容受性强；e.免疫源性弱；f.体外易于保持微分化状态；g.随微环境作相应分化的特点能实现神经移植区域的细胞替代等，使其成为中枢神经系统疾病基因治疗的理想载体。转基因NSC一方面分泌细胞因子，产生对NSC和神经元的营养、保护、抗凋亡作用；另一方面，NSC分化的细胞将产生神经元、神经胶质细胞等，有望实现受损细胞结构的重建与替代。同时，作为基因载体，NSC还可通过基因修饰产生特殊的蛋白质，用于神经系统肿瘤和其他疾病的治疗。

5组织培养

在适当的条件作用下，NSC有可能在体外培养体系中形成神经组织，如果此目标实现，将大大推进NSC的临床应用。

6病毒致神经疾病机制研究

NSC已用于鼠的致肿瘤病毒的神经疾病发病机制的研究。通过将病毒转染到NSC中，利用NSC的生物学特性，使病毒在试验动物脑内扩散，观察其神经毒力。

7NSC联合生物材料应用

通过在损伤的神经组织中植入生物材料“支架”，保护了神经组织不受进—步的损害，减少疤痕和空洞的形成，在一定程度上促进和引导了神经轴突的再生和延伸。Suzuki等使用藻酸盐为载体填充损伤的脊髓后，将胚胎海马源性的NSC植入损伤部位，2周后发现NSC明显移行，并整合入受者脊髓中；不使用藻酸盐，移植细胞成活很少。目前这方面的研究不多。可应用的生物材料主要有：a.天然聚合物：藻酸盐水凝胶、Ⅰ型胶原等；b.合成生物可降解材料：聚乳酸等；c.合成生物非降解聚合物：聚甲基丙烯酸羟乙酯等；d.可降解材料复台物：聚羟基丁酸盐与藻酸盐水凝胶复合物等；e.非降解材料复合物导管：丙烯酸聚合物或PNA/PVC的共聚物制成的导管。Borgens等报道，用聚乙烯二醇能使脊髓损伤部位的神经冲动传导恢复，从而恢复脊髓功能。

8问题和展望

虽然NSC应用于临床有广阔的前景，但目前仍有很多问题急需解决，如ESC研究引起法律、生物医学、神学、社会学和伦理道德方面的争议。以及其致畸性，制约着ESC的基础研究和应用。NSC的定向诱导分化，永生化NSC的致瘤性，转染的目的基因长期稳定表达及调节，iNSC迁移的机制和调控，以及基因工程细胞技术中如何选择合适的启动子、基因和移植物以及移植位点的确定等等。但这些并没有影响其临床应用的步伐，相信随着NSC基础和临床研究的不断深入，NSC在临床上的应用将取得突破性的进展。

参考文献

[1]冯定庆.神经干细胞的基础研究进展及应用前景[J];解剖学研究;2004年01期.

神经干细胞范文篇5

对于该病的诊断，由病史、症状、体征等临床特点，提供了第一手重要的诊断依据。目前更为突出的是影像学检查手段的完善、发展，使早期、超早期诊断成为可能。

1.1CT目前，急性脑卒中患者的头颅CT平扫检查是常规影像检查，因其能迅速而敏感地发现脑出血的存在，进行第一步最重要的鉴别诊断。先进的CT设备可在卒中发生数小时内提供诊断信息，最常见的CT改变为大脑中动脉闭塞时的大脑中动脉高密度征，其他的早期缺血改变包括豆状核密度下降、岛带消失、半侧脑沟消失和半侧脑实质密度下降，后两种CT异常提示了梗死面积大、预后不良及进行溶栓治疗的危险性增加［1～3］。近年，随着螺旋CT的发展，CT血管成像及灌注成像为脑梗死的早期诊断提供了更多的帮助。

1.1.1CT血管成像（CTA）CTA为通过静注碘化造影剂后，经螺旋CT扫描进行血管重建成像，其成像质量正在接近常规血管造影。这项技术可以检测颅外颈动脉狭窄程度和斑块形态，还可以可靠地检测颅内血管狭窄、栓子和中等大小或一些更大的动脉瘤。因可较直观地看到脑的血液循环情况，故对脑梗死的早期诊断有重要意义。

1.1.2CT灌注成像CT灌注成像技术，主要通过团注碘对比剂显示毛细血管内对比剂通过时引起的脑组织密度变化状态。在急性脑缺血早期，特别是发病2～4h的超早期，常规CT平扫改变轻微或无异常改变，一旦出现低密度病灶，就被认为是缺血性梗死形成，代表形态结构的破坏。而灌注成像能早期发现灌注异常区，对估计侧支循环和患者的预后极为重要［4，5］。近年来，多层CT灌注成像的时间和空间分辨率高，可快速、准确、无创和三维地评价脑循环内血流动力学变化［4］。

1.2核磁共振（MR）磁共振成像（MRI）是目前最重要的辅助检查之一，在采用T1加权和T2加权成像上，早期在6h后就可出现异常，表现为长T1和长T2信号，T1为低信号，T2为高信号。更为早期的诊断方法为弥散加权像（DWI）和灌注成像（PWI），可以自症状出现数分钟发现异常，最多在发病后1h左右即可出现。

1.2.1DWIDWI是利用磁共振中弥散（布朗运动）效应显示被检组织中水分子的微观运动，对早期缺血改变非常敏感，在缺血性脑血管病中，其在缺血后105min即可看到高信号［4］。其反映的是细胞内水肿情况，是细胞死亡的标志［6］。在梗死早期，DWI的检测很敏感，且具有相对特异性。其表现显示出较高诊断准确性，但在很多急性神经综合征中可呈阳性，应同时观察ADC（表观弥散系数）图，以除外多发硬化等引起DWI异常的疾病［4，7］。对多发性梗死的患者，DWI明显优于T2加权像，但最近证实对小的脑干腔隙性梗死有可能漏诊。

1.2.2PWI利用这一技术可以获取脑灌注状态的相关信息，最常用的是团注对比剂追踪技术。PWI反映的是血流灌注的情况，可提供最早和最直接的血流下降的信息，在缺血区呈现高信号，发现早期缺血较DWI更为敏感［4］。从脑梗死早期直到病后48h这段时间内，DWI和PWI联合应用效果明显优于常规MRI。DWI与PWI的联合应用十分重要，因为发病后数分钟内二者即可观察到梗死的位置及范围。而PWI面积和DWI面积之差，即缺血但无细胞坏死的区域，也就是半暗带的面积，据此可判断是否适合溶栓治疗［6］。

1.2.3磁共振血管成像（MRA）其对血液流动非常敏感，是在流动的血液与静止的脑组织之间信号差异的基础上进行的，可产生颈部和颅内血管的血管造影样成像。此技术是一项血流依赖性技术，血流信号的消失并不肯定意味着血管完全闭塞，而只能说明血流速度降低到了某个临界值。其成像方法有许多序列，其中2D相差MRA只捕获真正开放的血管，因此对区分缓慢血流、无血流与正常血流是一项特别有帮助的技术。各序列应联合应用，以免误诊。

1.2.4磁共振频谱（MRS）是MR技术的新进展之一，可以评价指定脑区的代谢活动及某种代谢物的浓度。其可以早期诊断脑梗死，并对预后做出判断，脑梗死后不同时间、不同部位和大小，MRS表现有所不同。其不足之处主要在于检查时间长，使高龄及体弱者的检查受限，也可能使开始治疗的时间延迟［8］。

2治疗

对于急性脑血管疾病一般的治疗是注意监测生命体征和防止各种并发症的发生。首先应通过保持呼吸道通畅、充分供氧、防止误吸等手段预防呼吸道的并发症。有学者指出［9］，除要防止呕吐物被误吸外，急性期饮食也应非常谨慎。在意识不太好时，或有吞咽障碍时，均应严格禁食，采取肠道外途径维持营养，或用鼻饲管维持营养及给药。对脑梗死目前研究及临床所关注的是超早期溶栓治疗、抗凝、降纤治疗等方面。

2.1溶栓治疗该疗法是近年研究的热点，其目的是希望使血管尽早再通，恢复缺血区的血液供应，抢救那些缺血但尚未坏死即“半暗带”区的神经元，使患者的功能恢复，减少后遗症，提高患者的生活质量。

2.1.1适应证和禁忌证现认为溶栓治疗无绝对的年龄限制，溶栓应在发病的3h内进行，国内的尿激酶静脉溶栓可至6h。如有下列情况不宜进行溶栓治疗:3个月内有卒中和严重头颅外伤史;2周内有外科大手术和严重躯体外伤史;既往脑出血病史;颅内肿瘤、动静脉畸形或动脉瘤;21天内有胃肠道或泌尿道出血;1周内在非压迫部位有动脉穿刺或腰穿史;同时口服抗凝药物;查体血压≥185/110mmHg;血小板<100×109/L;PT>15s;APTT超过参考值范围;血糖<2.7mmol/L或>21.6mmol/L。头颅CT发现颅内出血为绝对禁忌证，在首次CT扫描即出现大面积梗死的早期征兆时，溶栓治疗应谨慎。

2.1.2药物溶栓常用的药物有尿激酶、链激酶、tPA等。其中只有tPA是唯一经过FDA批准的药物，现链激酶很少应用［10］。临床使用的tPA为重组DNA技术生产，是国外常用的溶栓药物。其血清中半衰期为4～6min，但同血块中的纤维蛋白结合后半衰期延长。成人剂量为0.9mg/kg，首先在1min以上的时间内静脉推注总量的10%，余量在1h内静脉滴注，总量≤90mg。用药过程中定时进行神经功能评价，如出现严重头痛、恶心和呕吐、急性高血压，应停止用药，并急做CT检查。另一种溶栓药物尿激酶为国内所常用，其半衰期约（14±6）min，入血后直接作用于纤溶酶原，通过溶解血栓中的纤维蛋白而发挥作用。半衰期后其溶栓和抗凝作用仍可维持6～8h。用法为先给予25万U左右的负载剂量，然后继续给予，以达溶栓目的。总剂量一般认为为75～150万U，也有主张100～200万U［9］。另有认为［11］，溶栓成功后6～8h应追加尿激酶25～50万U（先在总量中扣除），1h内滴完，以防止复发梗死。根据溶栓途径，有动脉溶栓、静脉溶栓之分。利用溶栓药物进行治疗，经研究，动脉、静脉途径均可利用。一般认为，动脉溶栓的时间窗可为静脉溶栓的2倍。如通过介入手段，则再通率相对较高。2.1.3机械溶栓机械溶栓是一种新兴的技术，是利用导管将血栓破坏装置直接送入闭塞动脉中的血栓栓子处，这些机械采用超声、激光能和产生吸力的生理盐水喷射治疗卒中。其具有能够在数分钟内破坏血栓的优点，而即便动脉内溶栓治疗也需要2h才能溶解1个血栓。有些装置已进入临床试验，另有一些即将进入临床试验。早期的临床试验已表明，此方法治疗急性脑梗死是可行的［12］。

2.2抗凝、降纤治疗抗凝药物常用的有肝素、肝素类似物和华法林等。抗凝治疗不能溶栓，没有使血管再通的作用，只能防止血栓的进展及防止栓子的再次形成，从而防止再次栓塞。目前许多专家建议，卒中或短暂性脑缺血发作后，早期足量肝素治疗适应证:（1）有心源性再栓塞的高度危险性;（2）有症状脑动脉夹层分离;（3）有症状颅内动脉粥样硬化性狭窄或溃疡形成;（4）基底动脉血栓形成，在动脉内溶栓治疗前;（5）高凝性凝血病;（6）静脉窦血栓形成，即使是在与脑出血有关时［13］。应用抗凝治疗前必须进行CT检查以排除不典型的出血，现有争议的是抗凝的时机。低分子肝素皮下注射相对于普通肝素安全。降纤治疗主要是应用蛇毒制剂，其主要成分是类凝血酶（TLE），TLE与凝血酶相似，但对凝血因子Ⅷ无作用，不会使纤维蛋白交联成不溶凝块，因此不会导致凝血，而起降纤和抗凝作用。目前所用蛇毒制剂有国产的蝮蛇抗栓酶、降纤酶等，国外的有安克洛酶、东菱克栓酶等，此外尚有口服的蚓激酶等也有降纤作用。最近国内研究显示，虽然给药后纤维蛋白原及凝血酶原活性均有明显下降，但发病2周及出院时的神经功能缺损评分及Barthel指数两组无明显差异［9］。

2.3其他治疗其中比较重要的是血压的控制。在2003年版AHA指南中，指出除非舒张压>120mmHg或收缩压>220mmHg，否则应拒绝降压治疗［14］。一般认为，与患者的年龄和高血压病史有关。年龄越大，高血压病史越长，脑梗死急性期的血压控制越应谨慎进行，以免引起低灌注而加重缺血。每24h降压幅度不宜>30/20mmHg［11］。药物可选用静脉给予拉贝洛尔等，应避免舌下含服心痛定等钙拮抗剂，因为其可被快速吸收导致血压急剧下降。抗血小板聚集治疗也为人们所关注，常用的药物有阿司匹林、潘生丁、抵克力得等。目前阿司匹林的预防性作用已得到肯定，有学者认为与潘生丁合用比较理想，对不能进行溶栓治疗的病例，应在发病24～48h内给予阿司匹林［10，14］。

3神经干细胞移植―未来的希望

利用神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究已成为关注的焦点之一。已有明确的证据表明，不仅胚胎期未成熟的神经组织，而且成人中枢神经系统的特定部位也存在神经干细胞，这些特定部位的神经干细胞在特定的条件下具有再生能力［15］。因此，希望通过激活内源性神经干细胞或植入外源性神经干细胞对一些神经系统变性疾病、脑血管疾病和外伤引起的神经元脱失进行治疗。神经干细胞移植不是对抗神经病变的病理过程，而是通过其潜在的自我修复功能，使受损组织得以新生。现该方法已试用于帕金森病的治疗，我们期待它的成功。

参考文献

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神经干细胞范文篇6

ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells

【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.

【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis

【摘要】目的：表达具备生物活性的重组小鼠Wnt3a信号蛋白.方法：应用脂质体转染试剂将重组真核表达载体pSecTag2/HygroBWnt3a转染并筛选稳定表达的NIH3T3细胞，WesternBlot鉴定重组Wnt3a蛋白的表达，并对Wnt3a/NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力给予检测.结果：Wnt3a信号蛋白在Wnt3a/NIH3T3细胞中获得稳定表达，Wnt3a信号蛋白能够明显提高NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力.结论：在NIH3T3细胞中表达的重组Wnt3a信号蛋白具备生物活性.

【关键词】Wnt3a；真核表达；接触抑制；细胞凋亡

0引言

小鼠Wnt3a基因是Wnt基因家族中的重要成员，其编码表达Wnt3a信号蛋白.Wnt3a信号蛋白可以激活经典的Wnt/βcatenin信号通路.Wnt3a信号蛋白对神经干细胞表现出明显的促神经元分化的作用.我们应用基因重组的方法，从小鼠胚脑中克隆Wnt3acDNA，构建真核表达载体，通过阳离子脂质体试剂将目的基因导入NIH3T3细胞中，建立稳定表达Wnt3a信号蛋白的NIH3T3细胞株，并对其生物学活性进行初步分析.

1材料和方法

1.1材料真核表达载体pSecTag2/HygroBWnt3a由本研究室构建.NIH3T3细胞株由安徽医科大学病理教研室吴强教授惠赠.多聚赖氨酸购自博士德公司；胎牛血清及DMEM购自Gibco公司.潮霉素及LipofectamineTM2000转染试剂盒、购自Invitrogen公司.质粒小量提取试剂盒WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationsystem,ReverseTranscriptionSystemRTPCR试剂盒购自Promega公司；鼠抗mycmAb、鼠抗βcateninmAb购自SantaCruz公司，FITC标记的兔抗鼠二抗、TRITC标记的兔抗鼠二抗购自北京中山公司；台盼蓝购自sigma公司.其他试剂均为进口分装或国产分析纯.

1.2方法

1.2.1NIH3T3细胞的培养将冻存的NIH3T3细胞复苏后用含100g/L的胎牛血清的DMEM培养液，在37℃50mL/LCO2培养箱中培养，3d换液1次,传代3至4次使细胞达到良好的生长状态.

1.2.2NIH3T3细胞的转染按LipofectamineTM2000试剂说明书操作进行.转染前24h用胰蛋白酶消化贴壁的NIH3T3细胞，再以无血清及无双抗的DMEM培养基重悬，并按1×105的细胞密度接种于6孔培养板，培养24h后，当细胞生长至85%～90%融合度时，取纯化的重组质粒pSecTag2/HygroBWnt3a2μg，溶于250μL无血清的DMEM培养基中，得到A液.取3μLLipofectamineTM2000加于97μL无血清的DMEM培养基中，得到B液.将A,B液混匀，室温放置30min后加入0.8mL含100g/L胎牛血清的DMEM培养基，轻轻混匀，均匀滴加于经无血清培养基洗涤的贴壁细胞表面，于37℃50mL/LCO2培养箱中培养24h.弃去转染液，加2mL完全培养液继续培养.转染后48h，待细胞生长至接近融合时收集上清，并按1∶3的密度传代.继续培养至细胞密度达50%～70%.弃去培养液，更换浓度为600mg/L的潮霉素培养液进行筛选.转染时，设置转染空载体pSecTag2/HygroB的组和正常细胞阴性对照组.约14d后，可见有阳性克隆形成，继续扩增培养.稳定表达Wnt3a蛋白的细胞株命名为Wnt3a/NIH3T3（W/3T3），转染空载体的细胞株命名为empty/NIH3T3（E/3T3），正常细胞阴性对照组命名为control/NIH3T3（C/3T3）.

1.2.3重组Wnt3a蛋白鉴定转染48h后，分别收集C/3T3,E/3T3和W/3T3细胞各约1×106及其培养上清液.以SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，并将其与细胞培养上清液真空冷冻干燥，浓缩至1/2体积，以鼠抗mycmAb为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，使用WesternBlot方法行重组Wnt3a蛋白的鉴定.

1.2.4βcatenin的表达鉴定分别在转染后6,12,24h收集W/3T3,E/3T3及C/3T3细胞各约1×106，以SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，以鼠抗βcateninmAb为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，使用WesternBlot方法进行鉴定.

1.2.5Wnt3a/NIH3T3细胞增殖特性的鉴定以密度约1×105接种W/3T3,E/3T3及C/3T3细胞于24孔培养板，隔日观察，台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞.

1.2.6Wnt3a/NIH3T3细胞抗凋亡实验以密度约1×105接种W/3T3,E/3T3及C/3T3细胞于24孔培养板，24h后台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞数，同时更换含10g/L胎牛血清的DMEM培养液，定时观察并台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞，计算存活细胞与原始细胞数的比值.

统计学处理：用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析.

2结果

2.1重组Wnt3a蛋白在的NIH3T3细胞中获得表达WesternBlot鉴定发现转染Wnt3a基因的NIH3T3细胞裂解液中有一Mr约为45×103的特异性条带，在转染Wnt3a基因的NIH3T3细胞培养上清液、E/3T3及C/3T3细胞裂解液和细胞培养上清液中，均未发现相应条带(图1).

1:W/3T3组细胞裂解液；2：W/3T3组细胞培养上清液；3：E/3T3组细胞裂解液；4：C/3T3组细胞裂解液.

图1WestemBlot鉴定Wnt3a信号蛋白的表达（略）

2.2Wnt3a/NIH3T3细胞中βcatenin的表达上调对Wnt信号通路中的重要信息分子βcatenin的表达情况进行WesternBlot鉴定，在Mr约90×103处出现特异性条带(图2)，但无时间依赖性.

1~3:培养6,12,24h.

图2各实验组βcatenin表达（略）

2.3Wnt3a/NIH3T3细胞融合密度明显增高经台盼蓝染色计数活细胞，以密度约1×105接种的E/3T3及C/3T3细胞3d后生长至融合密度，此时细胞融合密度约4.6×105，但W/3T3细胞继续生长至第6d，细胞融合密度约13×105，与另外两组相比，W/3T3细胞融合密度明显增高（P<0.01）(图3，4).

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

图3各实验组细胞融合密度观察(倒置×100)（略）

2.4W/3T3细胞抗凋亡能力明显增高经台盼蓝染色计数活细胞，更换含10g/L胎牛血清的培养液48h后，E/3T3及C/3T3细胞大量凋亡，细胞数明显减少，但W/3T3细胞数无明显减少，抗凋亡能力明显提高（P<0.01）(图5，6).

图4实验组细胞数变化（略）

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

图5各实验组细胞抗凋亡能力观察(倒置×100)（略）

图6实验组存活细胞比例（略）

3讨论

Wnt信号蛋白为含有23～24个保守型半胱氨酸残基,在人类的基因组中已经发现Wnt基因19种［1-2］.Wnt3a是Wnt基因家族的重要成员，其基因早在1992年就已经被发现，而且多种的真核细胞被用于它的表达，但由于其低溶解度及疏水性等特点，一直未能纯化出具备生物活性的Wnt3a信号蛋白.1998年，Shibamoto等［3］使用L细胞（鼠胸腺激酶缺陷细胞株；LMTK）作为表达细胞时，在培养上清中发现了大量具备生物活性的Wnt3a蛋白，约400μg/L.Willert等［4］所纯化的Wnt3a信号蛋白通过激活Wnt信号通路促使骨髓中的造血干细胞分裂和自我复制，认为Wnt可能在一系列组织的自我更新中起信号作用.

βcatenin是经典的Wnt/βcatenin信号通路中重要的信息分子［5］，其在Wnt信号通路关闭的情况下，βcatenin被磷酸化而迅速降解.Wnt信号通路被激活后，βcatenin在胞内大量聚集，并进入细胞核，启动下游靶基因的转录，产生生物学效应.βcatenin表达的明显上调代表Wnt信号通路被激活.实验中WesternBlot鉴定发现βcatenin表达明显上调，但没有发现与时间有依赖关系.实验中表达的重组Wnt3a信号蛋白带有myc标签，Burrus等［6］认为如果Wnt3a信号蛋白带有标签将影响其活性，甚至失活.但同样有文献［7,8］中应用的Wnt3a信号蛋白带有myc,HA等标签，而且文献中对其活性同样做了详细的描述.本实验够构建的重组Wnt3a信号蛋白具备生物学活性，但未能与野生型（wildtype）Wnt3a信号蛋白活性做详细的比较，其生物学活性的变化有待进一步分析.

Wnt3a蛋白可以促进神经干细胞向神经元分化.在使用含有Wnt3a信号蛋白的条件培养液培养E11.5d的胎鼠前脑神经干细胞发现，神经干细胞大量分化成为MAP2阳性的神经元.去除Wnt3a信号蛋白后，神经干细胞恢复增殖能力，而且当条件培养液中的FGF2去除后，分化的神经元形态更为成熟［8-9］.来源于小鼠大脑皮质的神经干细胞转基因后超表达Wnt信号蛋白，即使在培养液中加入FGF2，依然大量向神经元分化，但阻断Wnt信号通路后神经元的分化被抑制［10］.

Wnt信号通路的生物学作用十分复杂，不同的Wnt基因，不同的细胞，甚至不同的细胞状态都有可能产生不同的作用［11］.在本实验中我们采用pSecTag2/HygroBWnt3a真核表达载体，NIH3T3细胞作为表达细胞，成功表达重组Wnt3a信号蛋白，初步探讨了Wnt3a信号蛋白的生物学活性，为进一步建立用于以治疗为目的的分子移植的方法奠定基础.

【参考文献】

［1］MillerJR.TheWnts［J］.GenomeBiol,2002,3(1):3001-3015.

［2］PapkoffJ,SchryverB.Secretedint1proteinisassociatedwiththecellsurface［J］.MolCellBiol,1990,10(6):2723-2730.

［3］ShibamotoS,HiganoK,TakadaR,etal.CytoskeletalreorganizationbysolubleWnt3aproteinsignaling［J］.GenesCells,1998,3(10):659-670.

［4］WillertK,BrownJD,DanenbergE,etal.Wntproteinsarelipidmodifiedandcanactasstemcellgrowthfactors［J］.Nature,2003,423(6938):448-452.

［5］WillertK,NusseR.βcatenin:AkeymediatorofWntsignaling［J］.CurrOpinGenetDev,1998,8(1):95-102.

［6］BurrusLW,McMahonAP.BiochemicalanalysisofmurineWntproteinsrevealsbothsharedanddistinctproperties［J］.ExpCellRes,1995,220(2):363-373.

［7］FischerL,BolandG,TuanRS.Wnt3Aenhancesbonemorphogeneticprotein2mediatedchondrogenesisofmurineC3H10T1/2mesenchymalcells［J］.JBiolChem,2002,277(34):30870-30878.

［8］MuroyamaY,KondohH,TakadaS.Wntproteinspromoteneuronaldifferentiationinneuralstemcellculture［J］.BiochemBiophysResCommun,2004,313(4):915-921.

［9］UedaY,HijikataM,TakagiS,etal.Wnt/betacateninsignalingsuppressesapoptosisinlowserummediumandinducesmorphologicchangeinrodentfibroblasts［J］.IntJCancer,2002,99(5):681-688.

神经干细胞范文篇7

1DPSC的定义和基本生物学性质

成牙本质细胞是一种终末细胞，不具备进一步分化的能力，因此，一般认为成牙本质细胞在遭受损伤后，牙髓内的某些具有分化功能的前体细胞可进一步分化为成牙本质细胞，并分泌相关细胞基质，修复受损组织，这种前体细胞即为DPSC。DPSC具有较强的增殖能力和较高的分化潜能，正是这两种生物学性质，决定了DPSC在牙源组织修复和骨性修复方面具有重要的作用〔2〕。Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓内可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓细胞命名为DPSC，研究人员应用酶消化法对成人第三磨牙的牙髓细胞进行培养，并与骨髓间充质干细胞进行比较，结果显示:这两种细胞具有极为相似的免疫学特性，并且，该研究进一步证实DP-SC经体外诱导后，可形成高密度的钙化小结，将DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)支架复合后移植到小鼠背侧皮下，经过一段时间后，能观察到类似于牙本质-牙髓复合体样的结构。

2DPSC的多向分化潜能

作为一种成体干细胞，DPSC具备多向分化的潜能，这种潜能不仅仅局限在骨性分化方面，研究人员在成脂分化、神经分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生医学研究领域有着重要的指导意义。

2.1DPSC的骨性分化DPSC的骨性分化是关于DPSC定向分化研究较早的一项内容，近些年来，又有了进一步的发展。Mori等〔4〕采用成骨分化培养基进行对DPSC的骨性诱导分化，结果发现，某些典型成骨细胞基因，如:碱性磷酸酶、I型胶原、骨桥蛋白等均大量表达;应用微阵列及RT-PCR技术进一步研究发现，在成骨分化过程中，胰岛素样生长因子结合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受体相关基因(NURR1)均发生表达上调现象，这一机制在成骨分化过程中有着重要的意义。D''''Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨诱导过程中，加入血管内皮生长因子，结果显示:这种方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促进了成骨分化的进程。

2.2DPSC的神经分化DPSC来源于胚胎时期的神经脊，在神经分化方面具备一定的潜能。Király等〔6〕采用低温损伤的方法制备3日龄Wistar大鼠脑缺损模型，于颅内注入DPSC进行修复，研究发现:DPSC趋向分布于室下区、胼胝体下区等神经系统祖细胞区，并表达微管蛋白(N-tubulin)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)等神经细胞标志，对损伤部位有一定的修复作用，并且具有神经系统相关细胞的电压依从性。因此，该结果进一步显示，DPSC在脑损伤体内修复方面，可以作为一种有效的修复细胞。Karaz等〔7〕研究表明:DPSC不仅可以分化为神经干细胞，而且在分化能力方面，高于传统的骨髓间充质干细胞。

2.3DPSC的成脂分化除成骨分化、神经分化方面，成脂分化也是DPSC的一项重要潜能。Nozaki等〔8〕于成脂培养基中加入胰岛素、地塞米松等诱导成脂，经过一段时间的作用，可见细胞中有脂滴的形成，并且在分化过程中多能性标记转录因子(Oct3/4、Sox2)均呈现下调趋势，Nanog基因无显著变化;通过基因微阵列分析，研究人员进一步发现:过氧化物酶体增生物激活受体信号通路的多种组分，均发生变化。所以，对这些基因的调控，在细胞成脂分化过程中有着重要意义。

3DPSC的分化诱导因素

在细胞分化的过程中，分化方向、分化程度、分化速度均会受到一系列物化因素、生物因素的影响，协调各方面因素对控制细胞定向分化有着重要意义。Ito等〔9〕将犬类的DPSC与不同的支架材料相结合，并用这种结合物治疗骨缺损，结果发现不同的支架材料，修复效果会有较大差异，其中DPSC/富血小板血浆(PRP)复合物具备较好的修复效果。Galler等〔10〕将DP-SC接种于水凝胶支架上，并将复合物移植到经过次氯酸钠(NaClO)、乙二胺四乙酸(EDTA)处理过的牙本质内部，培养6w后，发现经NaClO处理的牙本质与复合物结合较好，接触面形成大量细胞陷窝;经乙二胺四乙酸(EDTA)处理的牙本质可以诱导进一步DPSC向成牙质细胞分化，进一步表达牙本质涎蛋白，提高牙本质的修复速度。Yang等〔11〕以大鼠DPSC为研究对象，在常规成骨分化培养基中添加白细胞介素β(IL-1β)，结果显示，细胞的骨唾液蛋白、牙本质基质蛋白等矿化物质的表达均上调，体内实验也得到了相似结果，可见，IL-1β在成骨矿化过程中有一定的促进作用。骨形态发生蛋白在诱导成骨方面有着重要作用，Liu等〔12〕分离扩增家兔DPSC后，将这种种子细胞接种在羟基磷灰石、胶原等支架材料上，并用骨形态发生蛋白II进行刺激处理，结果成骨速度明显提高，最后制备的复合物更有利于体内移植和组织修复。

4DPSC的重编程与再分化

2006年，Takahashi等〔13〕将4个转录因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)导入已处于终末分化状态的小鼠成纤维细胞中，从而获得了一种类似于胚胎干细胞的多能性细胞，称为“诱导性多能干细胞”(inducedpluripotentstemcells，iPScells)。这种方法可以非常稳定的制造多能干细胞，引起了极大的关注。继此之后，人类体细胞被成功诱导为iPS的报道〔14〕和老年人皮肤成纤维细胞被诱导为iPS细胞亚群的报道〔15〕相继出现，这种细胞被认为是一种极具前景的干细胞。体细胞通过一定诱导方式，转变为iPS细胞亚群的过程称为“重编程”;iPS经过定向诱导，再次分化为其他种类细胞的过程，称为“再分化”。DPSC作为一种可以快速自我更新的成体干细胞，同样具备重编程和再分化的潜能。Yan等〔16〕采用逆转录病毒介导法，将4个因子(Lin28/Nanog/Oct4/Sox2或c-Myc/Klf4/Oct4/Sox2)导入DPSC中，将DPSC重编程为iPS细胞亚群。DPSC来源的iPS细胞亚群表达阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TRA)-1-60、TRA-1-80、TRA-2-49、Nanog、Oct4、Sox2等表面标记，具备多向分化的潜能，可分化成3个胚层的组织，而且可被定向诱导分化为神经干细胞和神经元。Tamaoki等〔17〕对多株DPSC进行重编程诱导，结果显示不同株的DPSC在重编程效率方面会有很大差别，不同株DPSC来源的iPS细胞亚群的再分化能力也有较大不同。因此，建立一种高效安全的重编程模式和再分化方法，仍是干细胞领域的研究热点。

神经干细胞范文篇8

[论文摘要]牙齿组织工程学是指利用体外和体内培养的手段从单细胞获得整个牙齿的组织工程手段。其关键之处是获得具有较强生长和分化能力的种子细胞、优选较为适宜的支架材料，以及构建有较强再生能力的细胞-支架复合体。

近年来，随着发育生物学、分子生物学、细胞生物学、干细胞以及生物材料学等领域的新进展组织工程学也取得了长足的发展。所谓的牙齿组织工程学是运用生命科学和工程学的方法、原理和技术，在体外构建有生物活性的组织，植入体内，修复缺损组织，重建功能的一门新兴学科。众所周知，牙齿的发生发育经历有初始发生期、蕾状期、帽状期、钟状期、分化期、分泌期以及牙根的形成等阶段，由上皮和间充质的相互作用完成。即便使用单细胞进行培养，牙齿结构的发生和发育也要经历这些必然阶段。这为牙齿组织工程学的研究奠定了基础。然而组织工程学并不是一项简单的工程，需要各个方面的工作相互协调，相互配合。

一、牙齿组织工程与干细胞

干细胞是一类具有自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。其可在体外分离、扩增和冷冻保存，在一定的条件下可被诱导分化为不同的细胞或组织。根据发生学来源的不同可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。

随着生物技术及组织工程学的发展，可通过干细胞定向分化技术，培育出特定的组织或器官。其原理是人为干预干细胞的分化方向，使这些细胞按照我们的需要分化成单一的组织或器官。组织工程牙齿的研究常以干细胞、信号分子及生物支架为基础[1-2]，在体外通过组织重组技术及器官培养等方法研究牙齿的再生。Sharpe等[3]利用小鼠胚胎牙上皮和不同来源的间充质干细胞（胚胎干细胞和神经干细胞）及成人骨髓干细胞重组后再植入小鼠体内可获得牙齿结构，Young等[4]也通过组织工程的方法制备了齿/骨杂交体，即用猪第三磨牙的牙蕾细胞种植到生物可降解的支架PGA或PLGA上，在成年大鼠的视网膜上生长4周后即得牙移植块；同样从猪的骨髓中分离诱导成骨细胞，并种植到PLGA支架上，在透氧的生物反应器系统中培养10天后即得骨移植块；将以上的牙移植块和骨移植块组合在一起重新植入大鼠的视网膜上生长8周后，经过组织学和免疫组化的方法分析发现齿/骨杂交体不仅能产生牙本质、修复牙本质及釉质组织，还能表达骨钙蛋白、骨涎蛋白以及Ⅲ型胶原。Kramer等[5]将骨髓间充质干细胞与牙周韧带细胞共培养，发现共培养的骨髓间充质干细胞骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达量明显增加，而骨涎蛋白的表达量明显降低，体现了共培养的骨髓间充质干细胞能够获得牙周韧带细胞的特性，可用于进行牙周组织的修复。这在一定程度上说明了，利用组织工程的方法在体外再生牙齿是可能的[6-7]。且在一定条件下不仅牙髓干细胞能够再生牙齿结构，其他来源的间充质干细胞也能够产生类似牙齿硬组织的结构。

二、牙齿组织工程与生物支架

组织工程将培养细胞种植于外源性细胞外基质（ECMs）以构筑细胞/支架材料复合物。这种外源性ECMs就是由生物相容性良好和可降解的生物材料制备的三维多孔支架。组织工程支架的设计和选择对于组织工程来说是非常关键的一步。组织工程支架材料的目的是为构建组织的细胞提供一个三维支架，有利于细胞的粘附、增殖乃至分化，为细胞生长提供合适的外环境。理想的生物支架材料需要满足如下要求：（1）具备良好的生物相容性，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；（2）具有可降解性及适宜的降解速率，当移植的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解；（3）具有符合细胞、组织器官要求的生物力学强度；（4）具有良好的细胞界面关系，能相互作用以保存和促进细胞功能；（5）便于加工成理想的二维或三维结构，而且移植到体内后能保持原有形状。

Gronthos等[8]以HA/TCP为支架，将体外扩增的牙髓干细胞(DPSCs)植入裸鼠背侧皮肤下，可获得牙本质/牙髓样结构。此外，在由组织工程支架材料PLGA或PGA/PLLA构成的牙型支架中，植入打散猪胚磨牙牙胚或大鼠的磨牙牙胚，均能形成一个包含牙本质、成牙本质细胞、界限清晰的牙髓腔、Hertwig氏上皮根鞘(HERS)和成釉器的结构[9-10]。07年，KazuhisaNakao等人将打散的小鼠胚胎14.5天的上皮和间充质添加到用胶原做成的支架上，在体内和体外均培养出了完整的并富含有血管和神经纤维的牙齿结构[11]。

传统的牙齿组织工程是在体内构建细胞支架复合体。体内构建是将细胞——支架复合体植入体内，修复组织缺损。这种方法的明显优点就是能够利用体内独特的生长环境为牙齿的再生提供条件适宜并无菌的环境。但随着组织工程的进一步发展，体内重建已经不能满足实际工作的需要。必须能够实现在体外重建的模式。体外构建是通过体外组织培养的方法将种子细胞接种到支架材料上，在体外进行组织构建。体外重建具有一些较体内构建容易控制条件、利于实验观察等优点，然而在传统的静态培养条件下体外重建却很难达到真正的组织重建，但随着生物反应器和灌注培养系统的先后出现，体外构建条件也有了明显改善[12]。

三、展望

随着干细胞研究的飞速发展和生物材料的不断改进，运用实验胚胎学、发育和分子生物学的研究结果，科学家预测在不久的将来实现牙齿的再生是完全可能的。比较理想的方法是:体外培养种子细胞，形成牙胚后植入患者先天无牙颌区或缺失牙区，使长出具有良好形态并能行使其生物功能的组织工程化牙齿，从而取代传统的人工种植牙。随着Dentigenix和Odontis等牙齿组织工程公司的出现以及日立等大型企业的介入可能会大大加速有关的研究进程以及商业化产品的推出，但也可能同时会阻碍相关研究结果的透明度。但不管怎样，组织工程化牙齿将走入临床应用，这将是现代组织工程学向口腔疾病治疗的传统观念和方法发起的最具革命的性挑战，必将在口腔医学领域引起一场划时代的变革。

参考文献：

[1]MauneyJ.R.Biomaterials.2005;26.

[2]ZhangY.D.CellRes.2005;15.

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[4]YoungCS.TissueEng.2005;11.

[5]KramerP.R.JDentRes.2004;83.

[6]HondaMJ.JOralMaxillofacSurg.2006;64.

[7]YenAHandSharpePT.ExpertOpinBiolTher.2006;6.

[8]GronthosS.ProcNatlAcadSciUSA，2000，97.

[9]DuailibiMT.JDentRes，2004，83.

[10]YoungCS.JDentRes.2002.81.

神经干细胞范文篇9

[论文摘要]牙齿组织工程学是指利用体外和体内培养的手段从单细胞获得整个牙齿的组织工程手段。其关键之处是获得具有较强生长和分化能力的种子细胞、优选较为适宜的支架材料，以及构建有较强再生能力的细胞-支架复合体。

近年来，随着发育生物学、分子生物学、细胞生物学、干细胞以及生物材料学等领域的新进展组织工程学也取得了长足的发展。所谓的牙齿组织工程学是运用生命科学和工程学的方法、原理和技术，在体外构建有生物活性的组织，植入体内，修复缺损组织，重建功能的一门新兴学科。众所周知，牙齿的发生发育经历有初始发生期、蕾状期、帽状期、钟状期、分化期、分泌期以及牙根的形成等阶段，由上皮和间充质的相互作用完成。即便使用单细胞进行培养，牙齿结构的发生和发育也要经历这些必然阶段。这为牙齿组织工程学的研究奠定了基础。然而组织工程学并不是一项简单的工程，需要各个方面的工作相互协调，相互配合。

一、牙齿组织工程与干细胞

干细胞是一类具有自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。其可在体外分离、扩增和冷冻保存，在一定的条件下可被诱导分化为不同的细胞或组织。根据发生学来源的不同可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。

随着生物技术及组织工程学的发展，可通过干细胞定向分化技术，培育出特定的组织或器官。其原理是人为干预干细胞的分化方向，使这些细胞按照我们的需要分化成单一的组织或器官。组织工程牙齿的研究常以干细胞、信号分子及生物支架为基础[1-2]，在体外通过组织重组技术及器官培养等方法研究牙齿的再生。Sharpe等[3]利用小鼠胚胎牙上皮和不同来源的间充质干细胞（胚胎干细胞和神经干细胞）及成人骨髓干细胞重组后再植入小鼠体内可获得牙齿结构，Young等[4]也通过组织工程的方法制备了齿/骨杂交体，即用猪第三磨牙的牙蕾细胞种植到生物可降解的支架PGA或PLGA上，在成年大鼠的视网膜上生长4周后即得牙移植块；同样从猪的骨髓中分离诱导成骨细胞，并种植到PLGA支架上，在透氧的生物反应器系统中培养10天后即得骨移植块；将以上的牙移植块和骨移植块组合在一起重新植入大鼠的视网膜上生长8周后，经过组织学和免疫组化的方法分析发现齿/骨杂交体不仅能产生牙本质、修复牙本质及釉质组织，还能表达骨钙蛋白、骨涎蛋白以及Ⅲ型胶原。Kramer等[5]将骨髓间充质干细胞与牙周韧带细胞共培养，发现共培养的骨髓间充质干细胞骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达量明显增加，而骨涎蛋白的表达量明显降低，体现了共培养的骨髓间充质干细胞能够获得牙周韧带细胞的特性，可用于进行牙周组织的修复。这在一定程度上说明了，利用组织工程的方法在体外再生牙齿是可能的[6-7]。且在一定条件下不仅牙髓干细胞能够再生牙齿结构，其他来源的间充质干细胞也能够产生类似牙齿硬组织的结构。

二、牙齿组织工程与生物支架

组织工程将培养细胞种植于外源性细胞外基质（ECMs）以构筑细胞/支架材料复合物。这种外源性ECMs就是由生物相容性良好和可降解的生物材料制备的三维多孔支架。组织工程支架的设计和选择对于组织工程来说是非常关键的一步。组织工程支架材料的目的是为构建组织的细胞提供一个三维支架，有利于细胞的粘附、增殖乃至分化，为细胞生长提供合适的外环境。理想的生物支架材料需要满足如下要求：（1）具备良好的生物相容性，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；（2）具有可降解性及适宜的降解速率，当移植的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解；（3）具有符合细胞、组织器官要求的生物力学强度；（4）具有良好的细胞界面关系，能相互作用以保存和促进细胞功能；（5）便于加工成理想的二维或三维结构，而且移植到体内后能保持原有形状。

Gronthos等[8]以HA/TCP为支架，将体外扩增的牙髓干细胞(DPSCs)植入裸鼠背侧皮肤下，可获得牙本质/牙髓样结构。此外，在由组织工程支架材料PLGA或PGA/PLLA构成的牙型支架中，植入打散猪胚磨牙牙胚或大鼠的磨牙牙胚，均能形成一个包含牙本质、成牙本质细胞、界限清晰的牙髓腔、Hertwig氏上皮根鞘(HERS)和成釉器的结构[9-10]。07年，KazuhisaNakao等人将打散的小鼠胚胎14.5天的上皮和间充质添加到用胶原做成的支架上，在体内和体外均培养出了完整的并富含有血管和神经纤维的牙齿结构[11]。

传统的牙齿组织工程是在体内构建细胞支架复合体。体内构建是将细胞——支架复合体植入体内，修复组织缺损。这种方法的明显优点就是能够利用体内独特的生长环境为牙齿的再生提供条件适宜并无菌的环境。但随着组织工程的进一步发展，体内重建已经不能满足实际工作的需要。必须能够实现在体外重建的模式。体外构建是通过体外组织培养的方法将种子细胞接种到支架材料上，在体外进行组织构建。体外重建具有一些较体内构建容易控制条件、利于实验观察等优点，然而在传统的静态培养条件下体外重建却很难达到真正的组织重建，但随着生物反应器和灌注培养系统的先后出现，体外构建条件也有了明显改善[12]。三、展望

随着干细胞研究的飞速发展和生物材料的不断改进，运用实验胚胎学、发育和分子生物学的研究结果，科学家预测在不久的将来实现牙齿的再生是完全可能的。比较理想的方法是:体外培养种子细胞，形成牙胚后植入患者先天无牙颌区或缺失牙区，使长出具有良好形态并能行使其生物功能的组织工程化牙齿，从而取代传统的人工种植牙。随着Dentigenix和Odontis等牙齿组织工程公司的出现以及日立等大型企业的介入可能会大大加速有关的研究进程以及商业化产品的推出，但也可能同时会阻碍相关研究结果的透明度。但不管怎样，组织工程化牙齿将走入临床应用，这将是现代组织工程学向口腔疾病治疗的传统观念和方法发起的最具革命的性挑战，必将在口腔医学领域引起一场划时代的变革。

参考文献：

[1]MauneyJ.R.Biomaterials.2005;26.

[2]ZhangY.D.CellRes.2005;15.

[3]OhazamaA.JDentRes.2004;83.

[4]YoungCS.TissueEng.2005;11.

[5]KramerP.R.JDentRes.2004;83.

[6]HondaMJ.JOralMaxillofacSurg.2006;64.

[7]YenAHandSharpePT.ExpertOpinBiolTher.2006;6.

[8]GronthosS.ProcNatlAcadSciUSA，2000，97.

[9]DuailibiMT.JDentRes，2004，83.

[10]YoungCS.JDentRes.2002.81.

神经干细胞范文篇10

氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。

1材料与方法

1.1新生大鼠海马神经元的分离和培养

技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank''''s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量0.25%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。

1.2大鼠海马神经元的鉴定

1.2.1烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色

取培养6d6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免疫组织化学染色。弃去培养液，4%多聚甲醛室温固定1h，加入0.3%H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶，0.1%TritonX-100破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗1∶200兔抗鼠NSE抗体，4℃湿盒过夜，0.01mmol·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37℃温箱孵育60min;0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加SABC过氧化物酶复合物，37℃温箱中孵育60min，0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加DAB显色液作用3～10min，自来水冲洗后，常规脱水，透明封片。光镜下观察NSE表达阳性细胞。

1.2.2尼氏染色

6孔培养板的细胞培养7d时，取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液，0.01mmol·L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定1h，0.01mmol·L-1PBS清洗3次，氯仿中1min，95%、70%乙醇各1min，蒸馏水清洗，置于1%甲苯胺蓝染液中染色20min，95%乙醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏体显示清晰为准，37℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

1.3实验分组

在培养的第3天加入氟西汀（常州第四制药厂生产），根据药物浓度不同，将实验细胞分为5组，分别加入1、10、20、40μmol·L-1氟西汀;正常对照组加入等体积的培养基。

1.4海马细胞形态定量分析

倒置相差显微镜（德国Zeiss公司产品）下观察加药48h后的海马神经元形态，每组各孔随机选择20个视野（每个视野0.17mm2），记录每个视野内细胞长出突起的神经元数目，目镜测微尺随机测量15个神经元突起的长度和胞体的长径。

1.5统计学处理

应用SPSS12.0软件进行统计分析，各项检测结果以x-±s表示。多组比较及组间两两比较采用方差分析。

2结果

2.1海马神经元形态学观察

倒置相差显微镜下观察，培养1d，细胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单突起的小细胞为主。培养6d，神经元胞体较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏的网络（图1）。培养12d，神经元胞体进一步增大，突起形成比较稠密的网络。培养24d，神经元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩解，突触断裂。

2.2海马神经元鉴定

NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第6天的神经细胞，胞浆和突起被染成棕黄色为NSE抗体表达阳性细胞，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元的纯度为90%。见图2A。

2.3氟西汀对海马神经元形态学的影响

结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少（P<0.05），最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）。表1氟西汀对加药48h海马神经元形态学的影响（略）

3讨论

本实验严格控制胰酶的量和消化时间，采用了0.25%胰蛋白酶低浓度溶液、30min长时间消化的方法，尽可能减少分离过程中的化学损伤。为了避免操作过程中的机械损伤，分离时动作轻柔，规律换药，每72h半量换液1次，换液时速度快，以减少对神经元生长的影响。本实验采用了差速贴壁生长，去除了成纤维细胞，并采用B27无血清培养基，可以选择性地促使神经元生长，抑制非神经元的生长和繁殖［3］，从而可以纯化海马神经元。NSE是神经元分化成熟的特异性标志酶之一，它主要表达于神经元的胞体、轴突、树突部分［4］，通过NSE免疫细胞化学染色方法，可以鉴定体外培养的新生大鼠海马神经元及其纯度。本实验通过NSE免疫化学染色，发现大部分细胞胞浆和突起被染成棕黄色，计数阳性细胞百分率为90%。尼氏体是神经元的特征性结构之一，存在于神经元胞体和树突内，可被碱性染料染成深色的颗粒和斑块，它是细胞内的一种蛋白质合成装置，可作为观察神经细胞功能状态的灵敏指标。本实验观察到培养的海马神经元胞质内尼氏体数量较多，说明培养的海马神经细胞生长良好。NSE免疫细胞化学染色和尼氏染色结果提示，本实验能培养出纯度较高、生长良好的海马神经元。氟西汀不仅是广泛应用的抗抑郁药，而且可以用于治疗癫痫、偏头痛、认知障碍、焦虑障碍、儿童孤独症等诸多神经精神疾病。目前研究认为，氟西汀抗抑郁效应与它对海马的神经保护作用有关，这种作用可能是通过促进海马细胞增殖来抵抗神经元的萎缩和丢失来实现的。李鹂等［1］研究发现，氟西汀在显著改善抑郁大鼠抑郁行为的同时，增加了海马齿状回神经前体细胞的数目，其增殖也增强，推测促进海马神经元再生可能是氟西汀治疗抑郁症的机制之一。李云峰等［5］通过慢性应激建立小鼠抑郁模型，认为氟西汀促进海马齿状回神经元再生可能是抗抑郁剂共同作用机制之一，并且可能与提高海马BDNF水平密切相关。一些临床研究的结果也提示抗抑郁药具有神经保护作用。Santarelli等［6］

研究发现5-HT再摄取抑制剂能部分逆转认知功能障碍大鼠海马齿状回神经元增殖减少及树突萎缩，并能促进海马神经元的再生和存活。Yatte等［7］通过高分辨率的MRI和立体定位方法测定海马容量，发现持续性接受抗抑郁药物治疗与只在发作时接受治疗的患者相比，海马容量无显著性降低。

本研究首次以体外培养的新生SD大鼠海马神经元为模型，通过细胞形态定量分析，探讨氟西汀对海马神经元生长的影响。Chiou等［8］通过MTT方法，发现浓度在55μmol·L-1以下的氟西汀可明显促进海马神经干细胞存活，在20μmol·L-1时达到高峰。根据Chiou等［8］的研究结果，本实验选择了浓度分别为1、10、20、40μmol·L-1的氟西汀来干预海马神经元。结果发现不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少（P<0.05），最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）。结果表明氟西汀对海马神经元生长的影响有浓度依赖性，浓度过低（1μmol·L-1）对海马神经元生长的作用不明显，适当浓度（10μmol·L-1）可以促进海马神经元的生长发育，浓度过高（40μmol·L-1）则抑制海马神经元的生长。本实验中氟西汀浓度为40μmol·L-1即出现对海马神经元的抑制作用，与Chiou等［8］研究结果不完全一致，表明氟西汀对海马神经元和神经干细胞的影响存在差异。氟西汀促海马神经元生长的机制尚不明了，有研究［9］表明，长期给予氟西汀后，大鼠海马神经元的脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA表达明显高于对照组，而BDNF具有很强的刺激和促进神经细胞生长和分化，维持神经细胞存活和正常功能的作用，Dwivedi等［10］发现氟西汀不仅能够增加海马BDNFmRNA的表达，还可以逆转皮质酮导致的海马BDNFmRNA表达的降低。据此可以推测，氟西汀促海马BDNF表达可能是促海马神经元生长的机制之一。非营养因子家族，包括睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等，都能促进海马神经元的生长，氟西汀是否也可能通过上调这些因子的表达而促进海马神经元的生长有待研究。

本实验结果提示，氟西汀可以促进新生大鼠海马神经元的生长，这为氟西汀治疗与海马损害有关的神经精神疾病提供实验基础和理论依据。氟西汀促海马神经元生长的确切机制尚待进一步探讨。

【参考文献】

［1］李鹂，涂自良，杜士明，等.氟西汀对实验性抑郁症大鼠抑郁行为及海马神经元再生的影响［J］.医药导报，2006，25（4）:280-282.

［2］BrewerGJ.Isolationandcultureofadultrathippocampalneurons［J］.JNeurosciMethods，1997，71（2）:143-155.

［3］BrewerGJ，TorricelliJR，EvegeEK，etal.Optimizedsur-vivalofhippocampalneuronsinB27-supplementalneuron-basal，anewserum-freemediumcombination［J］.JNeurosciRes，1993，35（5）;567-576.

［4］SchmechelDE，BrightmanMW，MarangosPJ.Neuronsswitchfromnon-neuronalenolasetoneuron-specificenolaseduringdifferentiation［J］.BrainRes，1980，190（1）:195-214.

［5］李云峰，刘艳芹，张有志，等.抗抑郁剂对慢性应激小鼠海马神经元再生的影响［J］.中国药理学通报，2004，20（4）:385-388.

［6］SantarelliL，SaxeM，GrossC，etal.Requirementofhipp-ocampalneurogenesisforthebehavioraleffectsofantide-pressants［J］.Science，2003，301（5634）:805-809.

［7］YatteI，ShelineMD，MokhtarH，etal.Untreateddepressionandhippocampalvolumeloss［J］.AmJPsychiatry，2003，160（7）:1516-1518.

［8］ChiouSH，ChenSJ，PengCH，etal.Fluoxetineup-regu-latesexpressionofcellularFLICE-inhibitoryproteinandin-hibitsLPS-inducedapoptosisinhippocampus-derivedneuralstemcell［J］.BiochemBiophysResCommun，2006，343（2）:391-400.