化学发光免疫十篇

化学发光免疫篇1

关键词：临床检验;化学发光免疫分析;应用;阳性检出率

化学发光是一种常见的科学现象，利用化学发光现象可以进行免疫分析检验，这种技术在近年来得到了越来越广泛的推广。在此之前，临床上主要采用免疫酶技术、免疫荧光技术以及放射免疫技术等进行临床检验，这几种检验方法各有优缺点，在临床应用上均存在一定的缺陷。而随着化学发光免疫分析技术的不断发展，其在临床检验中操作简单、检测速度快、灵敏度高、易于控制以及污染少等优点逐渐显现出来，因此越来越受到了医学界的青睐。我院近年来也在临床检验中化学发光免疫分析的应用方面做出了许多临床研究与实践，并取得了一定的成果，现将我院自2012年3月至2014年3月期间内收治的两组共100例乙肝患者纳入临床研究对象，分别利用化学发光免疫分析法和酶联免疫吸附测定法检验其血样中的乙型肝炎病毒核心抗体，对比分析两种检验方法的阳性检出率，报道如下：

1资料与方法

1.1 一般资料

用于临床研究的100例乙肝患者是由我院自2012年3月至2014年3月期间内收治的，其中男性患者有52例、女性患者有48例，各占总数的52%、48%;年龄在20-75岁之间不等，平均年龄（47±3.6）岁;病程在5个月-23年之间不等，平均病程（8.72±2.13）年;所有患者均自愿提供血液样本进行检验。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

仪器分别选用瑞士罗氏公司所生产的E601电化学发光全自动免疫分析仪和北京普朗公司所生产的DNM-9602A酶联免疫检测仪，试剂分别选用瑞士罗氏公司所生产的ECLIA检验试剂和沈阳惠民公司所生产的ELISA检验试剂。

1.2.2 检验方法

令100例患者清晨空腹，抽取其静脉血液作为检验样本，然后分别利用化学发光免疫分析法和酶联免疫吸附测定法检验其血样中的乙型肝炎病毒核心抗体。化学发光免疫分析法的操作步骤如下：①采用还原剂将待测血样进行预处理;②在血样标本中加入乙型肝炎核心抗原并进行恒温培育，使其与血样标本中的乙型肝炎病毒核心抗体形成抗原抗体复合物;③分别加入经生物素标记的乙型肝炎病毒核心抗体和经钌标记的乙型肝炎病毒核心抗体，使其与乙型肝炎核心抗原结合;④加入由链霉素包被的磁珠以形成固相复合物;⑤待电极表面吸附磁珠后使用三丙胺清洗液进行冲洗，从而令电极表面结合物发生发光反应;⑥根据检出光信号来确定血样标本中的乙型肝炎病毒核心抗体数量，光信号越强，则血样标本中的乙型肝炎病毒核心抗体数量越少。酶联免疫吸附测定法的操作步骤如下：①在血样标本中加入经辣根过氧化物酶标记的乙型肝炎病毒核心抗体酶结合物并进行恒温培育，使酶标抗体与血样标本中的乙型肝炎病毒核心抗体经竞争结合微孔板上固相抗原的结合位点;②洗涤血样标本后加入底物，从而令结合于固相的酶标抗体显色;③根据结合于固相的酶标抗体数量来确定血样标本中的乙型肝炎病毒核心抗体数量，结合于固相的酶标抗体数量越少，则血样标本中的乙型肝炎病毒核心抗体数量越多。

1.3 统计学分析

对上述临床研究中所记录的数据皆利用SPSS 19.0统计学软件进行统计，对所有计数资料均采取t检验，对计量资料均采取卡方检验，P

2 结果

利用化学发光免疫分析法检验的乙型肝炎病毒核心抗体阳性检出率为97%，利用酶联免疫吸附测定法检验的乙型肝炎病毒核心抗体阳性检出率为79%，两组检验结果的数据比较差异具有统计学意义（P

表1 两种检验方法的检验结果对比表

3 讨论

化学发光免疫分析是临床上近年来所推广使用的一种新型标记免疫检验技术，它具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、易于控制以及污染少等优点。在应用学科上，化学发光免疫分析的一级学科为免疫学、二级学科为应用免疫、三级学科为免疫学检测和诊断。化学发光免疫技术主要包括有两个反应过程，即免疫反应过程和化学发光反应过程，其整个工作原理如下：首先在抗原或者抗体上面标记化学发光物质或其他发光的酶标记物，使其发生免疫反应，也即发生抗原和抗体的特异性结合，从而形成复合物，然后再在复合物中加入氧化剂或发光底物，使复合物发光，最后再根据经仪器检测所得到的发光强度与待测物质的浓度所呈现的线性关系来达到浓度测定的目的。其中，能够发生化学发光的物质大多都是有机化合物，而其发光反应也大多都是氧化反应，这主要是因为有机化合物的氧化反应能够提供足够的中间体，当这些中间体具有了较高的能量后，就能够释放光子发光。总体来说，化学发光免疫技术主要可以分为发光物免疫测定、发光酶免疫测定以及发光辅助因子免疫测定等几种类型。

乙型肝炎病毒核心抗体是人体发生乙肝病毒感染后最易产生的检测指标，它的临床检测率非常高，通常情况下，急性乙肝、慢性乙肝以及乙肝病毒携带者血样中的高效价乙型肝炎病毒核心抗体阳性检出率可高达90%以上。近年来，随着临床检验技术的不断发展，化学发光免疫分析在乙肝患者乙型肝炎病毒核心抗体的检测中也得到了越来越广泛的应用，并取得了显著的效果。

本文主要以乙肝患者血样中乙型肝炎病毒核心抗体的检验为例来研究临床检验中化学发光免疫分析的应用，并将其与酶联免疫吸附测定法进行对比。本组所选取的100例乙肝患者均为自愿提供血液样本进行检验。根据本次临床研究结果显示：利用化学发光免疫分析法检验的乙型肝炎病毒核心抗体阳性检出率为97%，利用酶联免疫吸附测定法检验的乙型肝炎病毒核心抗体阳性检出率为79%，两组检验结果的数据比较差异具有统计学意义（P

参考文献：

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[3]梅. 电化学发光免疫分析及其在临床检验中的应用分析[J]. 中国医药科学，2014，23：102-103+156.

化学发光免疫篇2

【关键词】 临床检验；应用；化学发光免疫技术

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.11.826 文章编号：1004-7484（2013）-11-6802-02

化学发光免疫技术具有标本用量较少、稳定性较高、标记物制备较容易、不污染环境、操作简便以及便于实现自动化等优点，主要将免疫分析与化学反光分析相结合，被广泛应用到临床医学和基础医学中。化学发光免疫技术是继酶免疫、发射免疫以及荧光免疫测定之后的免疫技术，在临床检验中经常需要检测和分析表征性物质，以判断疾病以及身体病理特征[1]。通过在临床检验中应用化学发光免疫技术，快速分析各种物质，能够提高检测的灵敏度与准确度。

1 化学发光免疫技术的概况

化学发光免疫技术主要包括化学发光分析和免疫分析系统，用于抗原、抗体、酶、激素、维生素以及脂肪酸等检测分析技术。化学发光分析是根据免疫反应情况，待免疫反应完之后加入酶或氧化剂等发光底物，发光底物经过氧化会形成处于激发状态的中间体，通过发射光子来释放能量，以达到稳定状态。而免疫分析是在抗体或抗原之上利用标记物进行直接的标记，标记物为化学物质或酶，待抗体或抗原发生反应后，会产生带有抗体免疫的复合物。

化学发光免疫技术的原理是以化学发光剂对抗体或抗原进行直接标记，待磁颗粒性、抗体或抗原发生反应之后，在磁场的作用下，分离处于游离状态和结合状态的化学发光剂，将发光促进剂加入到结合状态的部分，使其进行快速的发光反应，并以定性或定量的方式检测处于结合状态的发光强度。化学发光免疫技术系统具有操作较为简单，结果较为准确可靠，且自动化程度较高以及试剂储存的时间较长等优点，可根据激发态分子能量的来源，将化学发光的过程分为生物发光、光照发光和化学发光。

2 化学发光免疫技术在临床检验中应用的类别

化学发光免疫技术在临床检验中，主要分为酶催化化学发光的免疫分析、直接标记发光物质的免疫分析以及电化学发光的免疫分析。酶催化化学发光的免疫分析是通过抗体或抗原在标本中发生反应之时，采用发光的酶作为标记物。直接标记发光物质的免疫分析是采用吖啶酯对体或抗原进行直接标记，待抗体或抗原发生免疫反应后会产生一种复合物，加入氢氧化钠和带有双氧水的氧化剂后呈碱性，出现发光、分解等现象[2]。而电化学发光的免疫分析过程包括化学反光和电化学，将三丙胺作为电子供体，对抗体或抗原用三联吡啶钌进行标记，在电场的作用下，通过电子转移而产生发光反应。

3 在临床检验中应用化学发光免疫技术的分析

3.1 应用化学发光免疫技术分析传染性疾病 乙型肝炎病毒是血清学的标志物，是治疗和评价机体免疫功能的重要指标。诊断乙型肝炎病毒中的抗体或抗原的表面部分是否受到感染，这样的诊断为常规酶法，但常规酶法会使低病毒含量的携带者出现漏检的情况。化学发光免疫技术和以前的常规酶法相比，具有线性范围宽和高灵敏度等特点，在临床检验中应用化学发光免疫技术对传染性疾病进行分析，如对于已感染免疫病毒的儿童，应对其体内的甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及单纯疱疹病毒以Bowser等进行测定，检测出的灵敏度较高。

3.2 应用化学发光免疫技术分析肿瘤标志物 肿瘤标志物指肿瘤肿瘤在发生与增殖的过程中，通过肿瘤细胞进行合成、释放或者是机体与肿瘤细胞发生反应，产生酶、激素、白质以及癌基因产物等物质。患者的细胞、血液以及组织中都会有肿瘤标志物，利用化学发光免疫技术能够快速的寻找到难以发现的肿瘤标志物。通过对患者进行体外的辅助诊断以及术后监测，能够缓解患者的病痛。采用Mac等诊断和监测食管癌患者的病情，如对血清中的癌胚抗原浓度、鳞状细胞癌的抗原浓度等进行检测。以Raslan和Shabin对健康孕妇德阴道液和胎膜早破中的人绒毛膜促线性激素和AFP标志物进行比较，AFP的特异性和敏感度较高。

3.3 应用化学发光免疫技术分析心脏疾病 在临床检验中，经常以同丁酶对心脏疾病患者进行定量测定。心肌损伤的标志物包括肌酸激酶、肌红蛋白和肌钙蛋白T，应用化学发光免疫技术分析心脏疾病的标记物，能够提高检测的准确度。通过采用Dutra等将肌钙蛋白T（cTnT）的受体分子制成免疫传感器，应用于早期心肌梗死的临床检测，其方法较好，具有相关性，可以应用到临床中对标本进行检测。

3.4 应用化学发光免疫技术分析激素 激素是细胞和细胞间进行信息传递的媒介，主要指散在内分泌细胞中或内分泌腺所分泌出来的高效能的活性物质。在临床检测中应用化学发光免疫技术分析和测定性激素、甲状腺激素等激素，能够为临床诊断和治疗提供比较可靠、准确的实验室数据，提高检测的灵敏度和特异性[3]。通过以Vutyavanich等对血清中的促黄体生成素、素、促卵泡生成素以及催乳素等进行检测，以Karlsson对患者甲状旁腺进行检测，以Gayk和Schmidt对骨代谢标志物中的降钙素进行测量，并和放射免疫法相比，其精密度和准确度较高。

3.5 应用化学发光免疫技术分析其他物质 在临床检验中，应用化学发光免疫技术还可以分析细菌、维生素、免疫球蛋白、细胞因子、酶以及基因等。通过Dasgupta等对血清中高辛含量进行检测，以Quan等对食物中含有的盐曲霉毒素B1进行检测。

综上所述，化学发光免疫技术具有不污染环境、操作简便以及便于实现自动化等优点，被广泛应用到临床医学和基础医学中。在临床检验中应用化学发光免疫技术，能够为临床检验提供数据依据，提高检测的精密度和准确度。

参考文献

[1] 施丽娟.发光免疫分析技术及在临床检验中的应用[J].检验医学与临床，2012，6（4）：57-58.

化学发光免疫篇3

【摘要】 目的： 建立检测甲胎蛋白化学发光免疫定量分析方法. 方法： 采用双抗体异位点一步夹心法，以甲胎蛋白单克隆抗体作为固相包被，采用改良过碘酸钠法进行甲胎蛋白多克隆抗体与碱性磷酸酶偶联制备酶标抗体；以金刚烷胺衍生物CSPD作为底物，优化CSPD与SapphireII发光体系；用国家标准品校定定量标准品，建立了人血清AFP的化学发光免疫定量分析法. 用该法检测800份正常人血清，确定正常值参考范围，将临床血清标本100份与bayer Acs: 180全自动发光体系统进行比较. 结果： 本方法的最低检出量为2.0 ng /mL，线性范围2.0~600.0 ng/mL，批内和批间的变异率分别为6.7%和7.7%，回收率在98.2%~102.5%之间. 与CEA(3 μg/mL)的交叉≤0.15%；与铁蛋白(10 μg /mL) ≤0.04%；与人血清白蛋白（200 g/L）≤2.5×10-8，与人血清丙球蛋白（100 g/L）≤2.0×10-8，与bayer Acs:180比较相关系数r=0.994（P

【关键词】 甲胎蛋白类；化学发光测定法；定量分析

【Abstract】 AIM: To establish a method of chemiluminescent immunoassay for determination of alpha fetoprotein(AFP) in human serum. METHODS: The twosite enzyme immunoassay is based on the direct sandwich technique. A monoclonal antibody was bonded to the microplate for coating and the conjugation of alkaline phosphatase to another polyclonal antibody was performed by NaIO4 method. Chemiluminescent immunoassay was established by optimizing CSPD and SapphireII luminescent system. Sensitivity， linear scope， precision， interference and recovery for the method were evaluated. The reference range was defined by testing 800 serum samples from healthy subjects.The comparison for 100 serum samples from patients was assayed by the bayer Acs:180 Automated Immunoassay system. RESULTS: The detectable minimum was 2.0 ng/mL. The linear scope was from 2.0 to 600.0 ng/mL. Average inter and intraassay were 7.7% and 6.7%， respectively. The recoveries ranged from 98.2% to 102.5%. The crossreacting rate for CEA(3 μg/mL)， Ferritin(10 μg /ml)， HAS(200 g/L)， IgG(100 g/L) were≤0.15%， 0.04%， 2.5×10-8 and 2.0×10-8， respectively. Compared with bayer Acs:180 Automated immunoassay system， the relative coefficient was 0.994（P

【Keywords】 alphafetoproteins; chemiluminescent measurements; quanti tative analysis

0引言

甲胎蛋白（AFP）为最常用的肿瘤标志物之一. 是目前最好的可实际用于早期诊断原发性肝癌的指标，可在症状出现前6~12 mo作出诊断. 其他一些转移性肝癌及肝外肿瘤如睾丸肿瘤， 卵巢肿瘤，胃癌，胰腺癌，结肠癌，支气管癌，肾癌，乳腺癌和白血病等血液中的AFP也可增高. AFP属糖蛋白，分子量70000，含糖40 g/L，正常人血清AFP含量在2~8 μg/L之间，AFP正常值一般低于25 μg/L;本文根据化学发光免疫分析法的原理建立并研制了甲胎蛋白化学发光定量测定试剂盒，现将结果报道如下.

1材料和方法

1.1材料

抗AFP单抗腹水购自OEM公司；AFP多克隆抗体为自制；AFP纯品抗原购自Fitzgeral公司；碱性磷酸酶（ALP）由华美生物工程公司提供；化学发光底物CSPD及增强剂购自PE公司；过碘酸钠（NaIO4）、硼氢化钠（NaBH4）、乙二醇、2，4二硝基氟苯（DNFB）均购自Sigma；Sephadex G200凝胶柱层析购自LKB公司，DE52离子交换柱购自Sigma，聚苯乙烯塑料白色不透明微孔板购自深圳金灿华；luminescent化学发光仪（芬兰雷勃）；洗板机（BioRad）；AFP国家标准品购自中国药品生物制品检定所. 标本均为血清，清亮无溶血，-20℃冻存. 分别为健康体检门诊的成年男性200份，成年女性（非妊娠女性）200份，青少年200份，老年人标本200份，其中男女比例为1∶1；临床标本100份是陕西省人民医院放免科采集的肿瘤或疑似患者血清.

1.2方法

1.2.1AFP单克隆抗体的纯化抗AFP单抗腹水用500 g/L的饱和硫酸铵沉淀，再溶解透析后DE52换柱纯化，分部收集，测定蛋白浓度. 蛋白浓度应在4~10 g/L之间，无菌过滤，加1 g/L NaN3后分装. -20℃存放.

1.2.2AFP多抗血清制备与纯化纯品AFP免疫健康雄性山羊，首次剂量0.5 mg/只. 4 wk后加强免疫，剂量减半，共加强免疫3次. 耳静脉采血测定效价，双扩散效价>1∶128的羊，进行心脏采血，分离血清，羊抗AFP血清按照1.3.1方法进行纯化.

1.2.3碱性磷酸酶标记抗体的制备采用改良过碘酸钠乙二醇法进行标记［1］，将获得的IgGALP用含100 g/L小牛血清的0.05 mol/L (pH 7.6)TBS缓冲液按1∶1000稀释成工作液，保存于-20℃.

1.2.4AFP校准品制备用系列国家标准品标定AFP纯品抗原后，用AFP校准品稀释液稀释成含量分别为0， 10， 25， 50， 15， 600 ng/mL系列浓度，用国家标准品做定量曲线进行校准品浓度测定、相关性分析，建立定量标准品.

1.2.5化学发光系统的优化［2-3］由SapphireII不同浓度的增强剂和CSPD组成底物工作液，进行化学发光值（RLU）测定，进行底物工作液的优化.

1.2.6固相化抗体微孔板的制备［4］将抗AFP单抗用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释成1.0， 2.0， 5.0， 7.0， 10.0， 15.0 μg/mL的包被浓度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)37℃封闭2 h后晾干备用，确定包被选择最佳包被抗体工作浓度.

1.2.7正常人参考血清的确定用优化好的AFP化学发光定量试剂对800份健康人标本进行浓度测定，进行统计学分析，计算x+2 S，确定正常血清参考范围.

1.2.8化学发光免疫检测样品或标准品于相应孔分别加25 μL后，每孔再各加抗AFPALP75 μL，在震荡器上混匀1 min，置37℃恒温反应60 min. 洗掉游离成分，加入底物工作液50 μL，ALP催化底物脱磷酸酯，并发出463 nm的可见光，第10 min后测定各加样品孔的发光值RLU，并将数据用化学发光检测仪定量软件Luminoskan Ascent version 2.4.1软件进行定量分析.

2结果

2.1底物工作液的优化CSPD浓度为0.8， 0.4， 0.2， 0.1 mmol/L，SapphireII浓度为2.0， 1.0， 0.5， 0.25 g/L，分别用碱性磷酸酶1∶1000， 1∶10000在5， 10 min进行化学发光测定，记录不同增强剂和CSPD浓度的发光值，分别做出CSPD浓度RLU的曲线和SapphireIIRLU的曲线（图1）.

分析上述数据可得出以下结论CSPD在0.4 mmol/L以下时，RLU随CSPD浓度的变化而成比例变化，在0.4 mmol/L时达到平台，可能是底物浓度在0.4 mmol/L时使酶达到饱和. 增强剂SapphireII浓度对RLU的变化较复杂，在0.5~1 g/L时达到最大RLU，以后随着增强剂浓度的增加RLU反而下降. 确定底物工作液配制的浓度为：0.4 mmol/L的CSPD，增强剂SapphireII浓度为1.0 g/L.

2.2包被抗体浓度和酶标记抗体浓度的确定根据不同包被抗体浓度测定定量标准品的发光值，分别做出不同浓度包被抗体RLU的曲线（图2）. 包被浓度低时试剂的整体发光值也低，随着包被浓度的升高发光值也相应升高，在5.0 μg/mL时，发光值达到一个平台期（此时灵敏度达到一个平台期），选择标准曲线接近于直线时的包被浓度（5 μg/mL）为最佳.

2.3最低检出量平行测定20孔零值校准品血清，计算零值校准品RLU平均值（x）及标准差(S)，以x+2 S为测定值代入标准曲线方程中，求出其对应的浓度值，所对应的浓度值即为最低检出量为2.0 ng/mL.

2.4特异性检测分别测定与CEA(3 μg /mL)、铁蛋白(10 μg /mL)、人血清蛋白(200 g/L)、人丙种球蛋白(200 g/L)的交叉反应率，分别为≤0.15%， ≤0.04%， ≤2.5×10-8， ≤1.03×10-8.

2.5精密度测定AFP浓度为48.8~73.2 ng/mL的质控血清，重复检测3次，每次重复20孔，进行精密度测定，计算批内、批间平均变异系数分别为6.7%， 7.7%.

2.6正常人参考血清的确定对800份健康人血清检测进行统计，其中有95.4%的小于8.0 ng/mL，正常浓度只有上限而无下限，上限浓度去除5%的不可信区间，同时参考放免检测结果和目前公认的正常值范围，本检测方法的正常人血清应小于25 ng/mL.

2.7准确度取3份临床样本分别加入5 ng/mL， 20 ng/mL， 50 ng/mL浓度的血清样品测试样品的加入回收率，对3份临床样本分别进行90%， 60%， 30%稀释计算稀释回收率，结果显示：加入平均回收率为98.6%，平均稀释回收率为102.3%.

2.8与进口试剂的比较［5］与bayer ACS: 180 全自动化学发光系统的AFP试剂共同对100份临床标本进行检测，二者所得的数值进行分析，其相关性有统计学意义（图3），LumiassayTM=1.2715×ACS: 180 -0.4126（n=100），（r=0.994， P

3讨论

甲胎蛋白（AFP）为最常用的肿瘤标志物之一，其定量检测的方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法，各具特点.

本研究建立的甲胎蛋白(AFP)化学发光免疫定量分析方法［6］，采用自行设计AFP多抗血清制备和纯化工艺，采用改良过碘酸钠乙二醇法对AFP多抗进行ALP标记，较传统的戊二醛交联法标记效率要高，灵敏度、特异性都较好；采用金刚烷衍生物及其增强剂作为发光底物系统［7］， 其酶解速度快，达到最大光信号时间短，且发光信号强、持续时间长，信噪比高，通过优化增强剂的浓度能使发光强度增强100~100 000倍；可测定浓度线性范围宽，样品无需稀释即可检测. 由于化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响，有很高的灵敏度，该方法最低检出量为2.0 ng/mL. 该方法克服了传统的放射免疫法带来的环境污染和健康危害；操作简单，检测自动化程度高，适用于全自动和半自动仪器.

本研究建立的方法敏感性、特异性、线性范围、精密度、回收率均能满足常规临床检测要求，其采用的是开放式反应系统，因此可与大多数的化学发光检测仪器配套使用，在临床推广应用.

【参考文献】

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化学发光免疫篇4

基于电化学聚合在金电极表面固定兔抗人免疫球蛋白g抗体与人免疫球蛋白g及标记有ru(bpy)2+3 的羊抗人免疫球蛋白g抗体之间发生特异性免疫反应，形成三明治结构，成功建立了用于测定人血清中免疫球蛋白g的电化学发光(ecl)免疫技术。利用此方法测定人免疫球蛋白g含量，浓度在50 μg/l～2 mg/l范围内与电化学发光强度呈良好的线性关系，线性回归方程为y(a. u.)=48.41+0.09x(μg/l) (n=7)；检出限为20 μg/l (3σ)。测得正常人血清中免疫球蛋白g平均含量为11.2 g/l ，结果令人满意。

【关键词】 人免疫球蛋白g 电化学发光 免疫检测 电化学聚合

1 引言

免疫检测法具有快速、灵敏、选择性好等特点，被广泛应用于临床诊断、法医学、药物学和环境科学等研究领域[1～6]。特别是近年来，随着对免疫传感器的深入研究，发展了多种检测技术，包括电化学、光学、压电检测、放射免疫分析法和电化学发光检测法等[7～12]。其中，放射免疫分析法涉及环境污染问题，酶免疫分析法受到酶保存和检测灵敏度的限制；荧光免疫法有光的散射和杂光的干扰等问题，限制了其在免疫方面的应用。电化学发光是一种由于电化学反应引起化学发光的现象，具有操作简便、背景信号低、易于控制、特异性高等特点。133229.cOMru(bpy)2+3化合物在电化学发光中是一种应用最为广泛的发光物质，由于它具有灵敏度高，稳定性好，发光效率高等特点，所以被广泛用于实际生物样品的分析检测[13,14]。

免疫球蛋白(igg)是人体血清中含量最高的抗感染抗体，约占血清免疫蛋白的70%～80%，其含量的高低往往作为慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的参考值，所以对其含量检测意义重大。现有igg检测方法有压电免疫传感器技术[15]、酶免疫法[16]和荧光免疫法[17]等。

对于生物传感器，生物分子固定的数量和活性是非常重要的，直接影响传感器的性能。传统的固定方法，如硅片上的硅烷化固定技术、金电极表面的巯基自组装法以及戊二醛等化学试剂组装法等，操作复杂，组装时间长，难以保持生物分子的活性。采用吡咯和生物分子共聚的方法，不但操作简便、耗时少、易于控制，还能适用于微电极及微量试剂的选择性固定。这种方法常用于酶传感器、安培传感器及电位传感器，应用于电化学发光免疫传感器却少有报道。本研究采用聚合吡咯和抗体的方法将抗体固定到金电极表面通过三明治免疫结合法实现对人igg的电化学发光免疫检测，结果令人满意。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

mpie型电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限责任公司）；chi630电化学工作站(美国chi公司)；三电极工作体系：金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，参比电极为ag/agcl电极(3.0 mol/l kcl)。

ru(bpy)2+3nhs ester用于标记抗体（美国sigma公司）；羊抗人igg，人igg，兔抗人igg，牛血清蛋白(bsa)(北京鼎国生物技术有限责任公司)；健康人血清由华东师范大学校医院提供；吡咯(国药集团化学试剂有限公司)；透析袋(上海源聚生物科技有限公司)；发光检测液：1.0×10－3 mol/l 三丙胺(tpra)＋5.0×10－3 mol/l liclo4 ＋2.0×10－2 mol/l 磷酸盐缓冲溶液(ph 8.7)；其它试剂均为分析纯，所有溶液均用aquapro系统制得的蒸馏水配制。

2.2 实验方法

2.2.1 ru(bpy)2+3 标记羊抗人抗体的制备 参照文献[18]方法，称取1 mg ru(bpy)2+3nhs ester溶于100 μl二甲亚砜中，再将此混合溶液加入到1 ml羊抗人igg中，在37 ℃的条件下避光搅拌12 h后，将溶液转移至透析袋中，用磷酸盐缓冲溶液(ph 7.2)透析除去未标记的ru(bpy)2+3，直到透析液没有ecl信号。透析袋内即为标记有ru(bpy)2＋3的羊抗人igg。

2．2．2 电化学聚合吡咯固定抗体 将金电极在金相砂纸上抛光后置于无水乙醇和蒸馏水中分别超声清洗 5 min，于－1.0～+1.0 v电位下在0.1 mol/l h2so4溶液中循环扫描20 min，取出后用蒸馏水冲洗干净，将新鲜处理好的电极浸入含有0.1 mol/l 吡咯、0.1 g/l兔抗人igg、0.1 mol/l kcl 的0.1 mol/l磷酸盐缓冲溶液(ph 7.2)中，在800 mv的电压下聚合200 s，取出用蒸馏水冲洗干净。

2．2．3 免疫组装和电化学发光检测 将1%bsa滴加到修饰有抗体的电极表面作用20 min后，再滴加10 μl人igg溶液到电极表面组装2 h，最后将标记有ru(bpy)2＋3的羊抗人igg与电极组装2 h后，完成电极的免疫组装。

以铂丝为对电极，ag/agcl电极(3.0 mol/l kcl)为参比电极，组装好的电极为工作电极，自制的石英皿为检测池，注入发光检测液，在工作电极上施加从0.45～1.2 v的循环电压，检测工作电极上的ecl信号。

3 结果与讨论

3.1 电极修饰过程表征和ru(bpy)2+3标记羊抗人抗体的电化学性质

为了保持抗体的生物活性，故选择在中性条件下聚合吡咯。对聚合过程进行了阻抗表征，由阻抗图谱(图1)可知，吡咯聚合后阻抗值增大，这是因为在中性条件下吡咯聚合后其电化学活性降低，与文献[19]报道吡咯在ph＞5条件下聚合后电子传导能力下降，导电性变差一致。而在共聚吡咯和抗体时由于抗体对电子传递的阻碍作用，使其阻抗值明显大于单聚吡咯的阻抗值。随着每一步组装，阻抗值都明显增大，分别为2974 ω(人igg)和4980 ω(ru(bpy)2+3标记羊抗人igg)。

图1 经过不同修饰的金电极在0.01 mol/l k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]中的阻抗图（略）

fig.1 eis for the different gold electrodes measured in 0.01 mol/l k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]

频率 (frequency): 1～1×105 hz。如图2所示，ru(bpy)2+3标记的羊抗人igg(b)在1.1 v附近有明显的氧化峰与ru(bpy)2+3(a)的电化学性质一致[20]；在tpra存在条件下，在1.17 v附近有明显的发光信号(b)如图3，与未标记抗体的ru(bpy)2+3发光信号(a)相似，表明ru(bpy)2+3标记到羊抗人igg上后其电化学性质和电化学发光性质并没有发生改变。而未标记ru(bpy)2+3的抗体在0.45～1.2 v没有明显发光信号。

图2 在0.1 mol/l pbs中ru(bpy)2+3(a)，ru(bpy)2+labled antibody(b)和antibody(c)相对于检测电压的ecl强度（略）

fig．2 cyclic voltammogram of ru(bpy)2＋3(a)，ru(bpy)2+3labled antibody(b) and antibody(c) in 0.1 mol/l pbs

电压（potential）：0.45～1.2 v vs. ag/agcl；扫速（scan rate）：100 mv/s。

图3 在发光检测液中ru(bpy)2＋3(a)，ru(bpy)2+3labled antibody(b)和antibody(c)相对于检测电压的ecl强度（略）

fig.3 ecl intensity vs. potential curve for ru(bpy)2＋3(a)，ru(bpy)2+3labled antibody(b) and antibody(c) in the determining solution

电压（potential）：0.45～1.2 v vs. ag/agcl；扫速（scan rate）：100 mv/s。

3.2 实验条件的优化

3.2.1 电化学聚合时间对ecl的影响 文献[21]采用800 mv恒电位聚合吡咯(0.1 mol/l)，聚合时间直接影响到聚吡咯的厚度和抗体的固定量如图4所示。随着聚合时间的增加，ecl强度明显增强；200～300 s时ecl强度基本上处于平台；但是当聚合时间大于300 s后，ecl强度开始逐渐降低。根据文献[22]，ru(bpy)2+3的发光机理如下：

tpra－etpra·+

tpra·+tpra·+ h+

tpra·+ru(bpy)2＋3＋ru(bpy)＋3+product

ru(bpy)＋3+tpra·+ru(bpy)2＋3*+product

tpra氧化产物tpra·+与ru(bpy)＋3反应生成ru(bpy)2＋3*, ru(bpy)2＋3*再由激发态返回基态ru(bpy)2+3时以光的形式放出能量。因此tpra的氧化对ecl强度有着重要的影响。

图4 聚合时间对ecl强度的影响（略）

fig.4 effects of polymerization time on ecl intensity

电压(potential)：0.45～1.2 v vs. ag/agcl；扫速(scan rate)：100 mv/s。所以随着聚合时间的增加，聚吡咯层变厚，导电性变差，tpra在电极表面氧化难度增加，因而导致ecl强度下降。

本实验选择聚合时间为200 s。

3.2.2 免疫结合时间对ecl的影响 由于羊抗人igg和人igg结合时间与兔抗人igg与人igg结合时间相近，实验中采用的两组免疫结合时间相同，考察了结合时间从10 min到4 h中ecl值。实验结果表明：在室温下当免疫时间从10 min到2 h，ecl值逐渐增加；当免疫时间大于2 h，ecl值达到一个平台基本保持不变，这表明抗原抗体之间的特异性结合基本完成，因此实验选择免疫结合时间为2 h。

图5 ph值对ecl强度的影响（略）

fig.5 effects of ph value of detecting buffer solution on ecl intensity

电压(potential)： 0.45～1.2 v vs. ag/agcl；扫速 (scan rate)：100 mv/s。

3.2.3 发光检测液的优化 根据文献报道，三丙胺的存在能极大地增强ru(bpy)2+3的ecl强度，clo－4能抑制金电极表面自身氧化，增加ecl强度[23]。另外发光检测液的ph值对ru(bpy)2+3的ecl强度亦有很大的影响。由图5可以看出，ph<8.5时ecl强度随着ph值增加而迅速增加；当ph 8.5～9.2时ecl强度达到一个平台，ph>9.2时ecl强度迅速下降。

实验选择检测液的最佳条件为1.0 ×10－3 mol/l三丙胺(tpra)＋5.0×10－3 mol/l liclo4＋2.0×10－2 mol/l磷酸盐缓冲溶液(ph 8.7)。

3.3 igg的检测

3.3.1 igg的线性范围及检出限 在最佳检测条件下，进行了igg浓度检测，结果如图6所示。igg浓度在50 μg/l～2 mg/l范围内与ecl强度呈良好线性关系，其回归方程为y(ecl强度a.u.)=48.41+0.09x(igg浓度 μg/l)(n=7)，相关系数为0.996，检出限为 20 μg/l(3σ)。与文献[13]方法比较，该方法具有更高的灵敏度，检出限降低1个数量级。

图6 不同浓度igg与ecl强度关系图（略）

fig.6 correlation between igg concertration from 50 μg/l to 10 mg/l vs. the ecl intensity. insert: the concentration of igg was from 50 μg/l to 2 mg/l vs. ecl intensity

电压（potential）： 0.45～1.2 v vs. ag/agcl；扫速（scan rate）：100 mv/s。

3．3．2 实际血样中igg的检测 取正常人血清，用pbs缓冲溶液稀释，按照上述测试方法测定igg含量，同时加入标样作加标回收率实验，实验结果见表1。实验结果表明：实际血样中人血清igg测量值分别为13.0、10.0和10.5 g/l，加标回收率分别为92％、90％和106％，均在正常人血清人igg含量(8～14 g/l)[14]范围之内。回收率实验亦表明本方法可行。

表1 人血清中igg浓度检测结果（略）

table 1 results of igg in human serum using the ecl biosensor

4 结论

介绍了一种新型检测人igg的免疫方法，用电化学聚吡咯固定生物分子免疫组装后进行ecl检测。实验操作简单，耗时少，固定效率高，易于控制。此检测方法不但能用于人igg的检测，还能应用于其它抗原抗体的免疫检测、dna检测以及免疫药物的筛选。 此技术将有望用于多种抗原抗体的同时检测和免疫芯片的研制。

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化学发光免疫篇5

河南省商丘市第一人民医院检验科，河南商丘 476100

[摘要] 目的 探讨化学发光免疫分析技术（ECLIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）在乙肝病毒血清学检验中的应用效果。方法 选取2012年1月—2014年1月在我院就诊的疑似乙肝患者150例，分离血清后分别应用ELISA和ECLIA进行检测，比较两种检测方法的效果。结果 ELISA和ECLIA检测出HBsAg阳性分别63例和82例，两者比较差异显著（P<0.05），同时ECLIA法检测的批内CV和批间CV的重复性均明显高于ELISA法（P<0.05）。结论 与ELISA检验法比较，ECLIA法具有更高的HBsAg阳性检出率，且能进行精确的定性定量检测，值得临床推广应用。

[

关键词 ] 乙肝病毒；血清学检验；ELISA；ECLIA

[中图分类号] R373.21

[文献标识码] A

[文章编号] 1672-5654（2014）11（b）-0032-02

[作者简介] 张怡莎(1982-)，女，汉族，河南省太康县，本科，技师，研究方向：免疫类，从事的工作：医学检验。

我国是乙型肝炎病毒（HBV）感染率较高的国家，且目前尚无针对该病的特效疗法，因此对于该病进行早期诊断尤为重要。目前采用标记免疫学方法检查HBV血清学指标是诊断HBV感染的主要手段，目前常用的免疫学方法主要包括化学发光免疫分析技术（ECLIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）两种，本文就这两种方法在乙肝病毒血清学检验中的应用进行比较，以为临床选择有效的诊断手段提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月—2014年1月来我院就诊的疑似乙肝患者150例，所有患者诊断标准均参照《WS299-2008乙型病毒性肝炎诊断标准》，其中男性86例，女性64例，年龄18~56岁，平均年龄（41.3±5.7）岁。

1.2 检验方法

1.2.1 仪器和试剂对所有患者均分别行化学发光免疫分析技术（ECLIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检验 。

1.2.2方法所有患者均于检验当天清晨空腹抽取肘部静脉血10 mL，以3000r离心率离心10 min后分离出血清待检。将所有患者的血清均分为两份，先后采用ELISA和ECLIA进行检验，每次以定值参比血清作为质控，操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 ELISA检验方法和判定标准采用双抗原夹心法进行测定，用去离子水稀释将50 mL的浓缩洗涤液至1000 mL置于专门的洗液瓶中，并将酶标试剂置于试剂预定位置读取吸光度值，以阴性对照平均吸光度（A）值×2.1为临界值，以标本OD值与临界OD值的比值（S/OD）≥1.00判定为阳性，否则判定为阴性。

1.2.4 ECLIA检验方法和判定标准同样也采用双抗体夹心法进行检验，将配套反应杯、吸头和洗液等放置在预定位置，采用75%酒精棉球擦洗试剂，将HBsAg和生物素标记的HBsAb与待测样品共同培育，再和亲和素标记的磁微粒孵育，经过反复洗涤使游离的抗原和抗体与复合物分离，并加入三丙胺，启动ECL反应，用其激光强度判定HBsAb浓度，若HBsAb＞10 mlU/mL则判定为阳性，否则判定为阴性。

1.2.5重复性比较选取HBsAg含量低、中、高浓度的阳性血清共分成20份进行冷冻保存，每天测量1次，其中10份计算批间重复性，其余10份用来计算批内重复性。

1.3 统计学方法

应用spss 15.0处理所有数据，计数资料应用χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBsAg阳性率比较

对ELISA和ECLIA两种检测方法的阳性率比较，ECLIA测定的HBsAg阳性率明显大于ELISA，且差异显著（P<0.05），详见表1。

2.2 重复性比较

对ELISA和ECLIA两种检测方法的重复性比较，除高浓度HBsAg含量比较外，其余指标结果的比较均显示ECLIA的重复性明显优于ELISA，且差异显著（P<0.05），详见表2。

3 讨论

乙型肝炎病毒是一种全球性传染性疾病，我国乙肝病毒表面抗原（HBsAg）携带者高达10%[1]，其中HBsAb（乙肝病毒表面抗体）是人体感染HBV后针对HBsAg产生的特异性抗体，由于目前尚无特效疗法，所有早期诊断HBsAb尤为重要[2]。在本研究中我们对乙肝病毒血清学检验分别应用ELISA和ECLIA进行检验比较，结果显示ECLIA法HBsAg阳性检出率为54.7%，明显高于ELISA法的42.0%（P<0.05），这主要与两种不同检验的具体方法有关，其中ELISA法是临床中传统的诊断乙肝方法，因其具有简便、快速、价格低廉的特点，因此被广泛应用于HBsAg的检测中，但该方法仅能进行定性分析，不能进行定量分析，同时当待测标准中物质浓度过高时可能会出现假阴性，且由于不同厂家生产的抗原和抗体试剂具有较大的差异，加之反复洗板带来的误差，更易出现较高的假阴性[3-4]。ECLIA技术是一种采用生物素-亲和素技术，其在电极表面可由电化学引发的特异性化学发光反应，是目前最为先进的化学发光免疫测定系统之一[5]。

ECLIA技术使用的载体是受电磁铁控制的顺磁性微粒，其全面的实现了检测的自动化和标准化，减少了因人工操作带来的误差，并可精确的进行定性定量分析，大幅度减少了批内、批间的误差[6-7]。同时电磁铁的电磁快速消失性有利于游离抗体和复合抗体的分离，从而降低了由游离抗体所导致的假阴性结果，提高了ECLIA检测的特异性[8-9]从本研究批内、批间重复性的研究结果中发现，两种方法检出率的差异主要集中在低浓度，而高浓度无显著差异（P<0.05），这说明ELISA可对高浓度的HBsAb进行检测，而对低浓度的HBsAb检测率较低，而ECLIA具有更加广泛的检测方法，同时在我们的检验结果中，其检出率差异主要集中在低浓度区，而高浓度区的差异无统计学意义（P>0.05），这可在一定程度上说明ELISA更适用于高浓度HBsAb，而ECLIA的检测范围更广，而加大对低浓度HBsAg的检出率可更加有效的控制传染源[10-11]。

总之，与ELISA法比较，ECLIA法在乙肝病毒血清学检验中具有更高的优越性，可明显提高HBsAg的阳性检出率，并能准确的进行定性和定量分析，并可早期发现病情，从而更好的为临床及时可控制传染源提供依据，为改善患者病情赢得时间，意义重大，因而值得临床推广应用。

[

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化学发光免疫篇6

【摘要】

目的: 研制人血清中促甲状腺素（TSH）的化学发光免疫检测试剂盒。方法: 采用辣根过氧化物酶标记的抗TSHβ亚单位特异性单克隆抗体(mAb)， 与固相包被的抗TSHα亚单位的另一mAb配对， 以鲁米诺作为底物， 采用两步法建立了双位点夹心法人血清TSH的化学发光免疫定量分析法。结果: 该方法灵敏度为0.0788 mIU/L， 批内CV平均为4.7%， 批间CV平均为8.4%， 平均回收率为93.05%。该检测与LH、 FSH和HCG无交叉反应。部分实验样品的测试结果显示该试剂与国外同类试剂（雅培architect i2000）的测定结果明显相关(r＝0.984)。结论: 该方法具有较高的灵敏度、 重复性和准确度， 与其他同类产品相比简便、 快捷、 成本低， 适于临床检测和科研应用。

【关键词】 促甲状腺激素（TSH） 化学发光免疫分析法 试剂盒

促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone， thyrotropin， TSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素， 由α和β2个亚基组成， 相对分子质量(Mr)为28000[1]。TSH本身受下丘脑分泌的TSH释放激素TRH的调控， TSH的主要生理作用是调节甲状腺激素的合成与分泌， 血液中甲状腺激素水平与腺垂体分泌TSH的量之间有负反馈抑制关系[2]。甲状腺功能改变时， TSH的波动较甲状腺激素更迅速且明显， 是反映下丘脑垂体甲状腺轴功能的敏感指标， 因此采用灵敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay， CLIA)是一种灵敏的免疫分析方法， 在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用[3]。本研究根据化学发光免疫分析法的原理研制了血清TSH的检测试剂盒， 与国内外同类产品相比具有简便、 快捷、 成本低等优点。

1 材料和方法

1.1 材料 TSH单克隆抗体(mAb)、 TSH标准品抗原和辣根过氧化物酶（HRP）为Sigma公司产品， 光免板为Thermo Electron公司产品， 化学发光底物为BioRad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标准品的配制 将TSH抗原标定后溶于小牛血清中， 配制成含0.1， 1， 5， 20， 100 mIU/L的标准溶液。

1.2.2 抗体包被板的制备 将100μL含TSH mAb（0.5mg/L）的pH9.6碳酸盐缓冲液加至包被板中， 37℃包被2 h， 再用含10 mg/L BSA的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液于37℃封闭2 h后晾干备用。

1.2.3 酶标记物的制备 TSH的酶标记物采用过碘酸钠法制备， 然后经0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液透析过夜后， 加入等量的甘油于-20℃保存备用。

1.2.4 检测方法 将50 μL待测样品或标准品加入包被TSH的光免板中， 37℃温育30 min， 弃反应液， 用洗涤液（含0.5 mg/L Tween20的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液）洗5次， 加酶标记物50 μL， 37℃温育30 min后同样用洗涤液洗5次， 然后加入发光底物于5～10 min内测定各孔的发光值RLU。样本中的TSH浓度依据由标准品TSH浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。

2 结果

2.1 动力学性质 在HRP鲁米诺H2O2发光体系中， 将不同量的免疫复合物加入发光液中， 发光强度（RLU）随反应时间而变化。10 min后RLU接近峰值， 在5～15 min内RLU较为稳定， 随后开始缓慢下降。

2.2 反应条件优化

2.2.1 加样量对RLU的影响 样本和酶标记物的加样量分别为50 μL和100 μL考查标准品（0、 0.1、 1、 5、 20、 100 mIU/L）RLU， 发现加样量为100 μL与50 μL RLU相差不大， 说明50 μL的加样量反应能达到平衡(图1)。

图1 加样量对RLU的影响（略）

2.2.2 反应模式对RLU的影响 采用二步法。第一步: 加入标准品和待测样品后， 将反应体系在37℃分别温育15、 30、 45、 60 min; 第二步: 加入酶标记抗体后， 将反应体系在37℃分别温育15、 30、 45、 60 min。结果表明温育时间为30 min时反应皆能达到平衡(图2)。

图2 温育时间对RLU的影响（略）

A: 第一步温育时间对RLU的影响; B: 第二步温育时间对RLU的影响.

2.3 稳定性 将试剂盒放置于37℃ 6 d后， 比较与放置前参考标准品各点RLU值， 参考标准品各点RLU值未见明显降低， 且本底发光值无明显升高， 表明试剂盒标准曲线无明显漂移， 满足稳定性要求。

2.4 方法学评价

2.4.1 标准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下， 以标准血清的浓度（0～100 mIU/L）制作的标准曲线见图3。同时测定20个零标准， 用零标准均值加上2倍标准差， 计算出此方法的灵敏度为0.0788 mIU/L。

图3 TSH标准曲线（略）

2.4.2 精密度 取低(4.44 mIU/L)、 中(19.45 mIU/L)和高(79.23 mIU/L)3种TSH浓度各重复测定10次， 测定批内CV分别为6.2%、 3.3%和4.6%， 平均为4.7%。隔日分别进行5次独立试验， 测批间CV分别为8.3%、 7.6%和9.3%， 平均为8.4%。

2.4.3 准确性 在已知TSH浓度的血清中加入3种不同浓度的标准血清，测定加入回收率为93.05%。将TSH浓度为44.42 mIU/L的血清用标准零血清分别按1/2、 1/4、 1/8、 1/16稀释， 测量各稀释浓度的TSH含量， 测定稀释回收率为99.86%。

2.4.4 特异性 在已知浓度的血清样品中加入不同浓度的LH、 FSH和HCG后， 对TSH的测定无干扰。

2.4.5 与进口试剂的比较 将研制的TSH CLIA定量检测试剂盒与Abbott architect i2000全自动化学发光系统共同对30例正常人、 20例甲亢及80例甲低临床标本进行检测， 通过数据分析， 得出两个检测系统所得数值具有明显相关性(图4)。

图4 与Abbott全自动化学发光系统相关性曲线（略）

3 讨论

血清促甲状腺素定量检测的方法主要有放射免疫法、 酶联免疫法、 时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法等几种[4]。考虑到目前化学发光和时间分辨荧光分析仪器几乎全部为国外厂商生产， 而绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆绑销售的垄断模式， 并在仪器中人为设置排它性检测程序， 从而抬高了配套试剂盒价格， 增加了检测成本， 所以本工作旨在开发国产低价、 稳定、 通用的人血TSH CLIA试剂盒。首先对读数时间进行了动力学研究， 发现其在5～15 min内RLU处于平台期，反应时间选择10 min。其次对反应条件进行了实验摸索， 在不同的温育时间和加样量的条件下， 各RLU值相差不大， 因此选择了50 μL的加样量与两步共1 h的反应时间。

我们研制的TSH化学发光免疫测定试剂盒通过方法学鉴定表明无论是灵敏度、 准确性、 特异性等技术指标均达到了临床诊断的要求[5]; 同时该方法具有操作方便， 反应时间短和成本低等优点， 具有较广阔的市场应用前景。

参考文献

[1] Hay ID， Bayer MF， Kaplan MM， et al. American thyroid association assessment of current free thyroid hormone and thyrotropin measurements and guidelines for future clinical assays[J]. Clin Chem， 1991， 37(11): 2002-2008.

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化学发光免疫篇7

【关键词】 胶体金法 ;化学发光免疫法 ;人绒毛膜促性腺激素; 弱阳性

人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）是受精卵着床后由胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，分子量为3868.8u，结构中包括β链和α链2条非共价结合的亚基。α链亚基与黄体生成素（LH）、促卵泡成熟激素（FSH）、促甲状腺成熟激素（TSH）的α链亚基相类似，能与这些激素产生交叉免疫反应[1]。β链亚基与这些激素则有较大差异，交叉免疫反应很小，为免疫学检测HCG的靶位[2]。可比较精确的反映β-HCG在血中的浓度。β-HCG检测可以诊断早孕，滋养层细胞肿瘤的诊断、疗效观察和预后判断，诊断宫外孕，先兆流产的处理依据，不全流产的鉴别诊断，诊断异位HCG肿瘤，生育研究等。因此准确及时的报告β-HCG结果对临床判断一些急诊病例非常必要。由于贝克曼库尔特全自动化学发光仪在检测结果<1000mIU/mL 时用原倍（仪器编码设置为151）检测，>1000mIU/mL时必须要用稀释方法（仪器编码设置为152）检测。如冒然用编码151检测，势必造成检测重复，浪费人力物力，延迟了出报告的时间，严重时会耽误病人病情的分析。本文就本院1000例门诊妇产科病人血清分析，联合应用两种方法，节约成本，提高效率，并对3例血清胶体金初筛弱阳性发光仪阴性的血清标本做出总结讨论。

1.原理

胶体金试纸条由抗-β人绒毛膜促性腺激素（HCG）单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体分别固相于硝酸纤维膜和胶体金标记的抗-α人绒毛膜促性腺激素（HCG）单克隆抗体（固相）制成。化学发光免疫法检测原理是根据微粒子酶促化学发光，将抗体结合在特定纳米材料上，采用双抗体夹心法，以金刚烷AMPPD为标记底物，在碱性磷酸酶（ALP）的催化下，AMPPD分解成AMP-D，释放出的化学能转化为光信号而发光，发光信号的强度与ALP成正比，检测信号的强度即可达到定量分析的目的。

2. 材料与方法

2.1 标本 本院1000例门诊妇产科病人血清，无溶血、黄疸等现象。

2.2 仪器与试剂 贝克曼库尔特公司生产DXI 800化学发光免疫分析仪，试剂盒与校准品皆为美国原装进口试剂，质控品为英国朗道实验室有限公司生产的免疫多项检测用质控品。胶体金试纸条为蓝十字生物药业（北京）有限公司生产的蓝梦孕知早早孕检测试纸条。试剂、校准品和质控品均在有效期内。

2.3 方法

2.3.1用分离胶试管采取病人血液3ml，待血液凝固后用3000r/min离心10min分离出病人血清待用。

2.3.2室温下将胶体金试纸条有箭头的一端插入血清中，5秒钟后取出平放，5分钟内观察显示结果。测试纸插入血清深度不可超过MAX标志线，阳性对照线必须明显。在检测线位置（T）以及对照线位置（C）各出现一条红色反应线，提示阳性，仅在对照线位置（C）出现一条红色反应线提示为阴性。

2.3.3如果胶体金初筛结果为阴性和弱阳性，用贝克曼库尔特全自动化学发光仪上的编码151检测，强阳性就用编码152检测。

3.结果

对本院1000例门诊妇产科病人血清用两种方法检测，其中阳性结果标本560例，阴性结果标本440例，有3例胶体金检测假弱阳性结果，后用化学发光仪检测为阴性。三例病人经询问未用任何药物。两种方法结果如表1：

表1

阳性

阴性

合计

化学发光法

560

440

1000

蓝梦早早孕试纸条

563

437

1000

4 . 讨论

化学发光免疫法是一种具有高灵敏度、高精密度和高特异性的免疫法[3]，贝克曼库尔特公司生产的DXI 800因此具有高特异性、高灵敏性、高准确性、高稳定性、检测速度快等特点，可以用来诊断早孕，滋养层细胞肿瘤的诊断、疗效观察和预后判断，诊断宫外孕，先兆流产的处理依据，不全流产的鉴别诊断，诊断异位HCG肿瘤，生育研究等，适应了临床诊断的要求。但是，化学发光免疫法线性范围稍窄[4]，浓度高于1000 mIU/mL时需要用仪器中预设置的稀释代码152测量，而原装试剂昂贵，成本高，重复测量既浪费了财力，也拖延了患者取报告的时间，在异位妊娠等需要术前快速明确诊断的病例中不能及时提供给临床可靠数据，延误了诊断的时间，导致临床医生难以做出正确的决策。胶体金免疫结合试验是在酶免疫结合试验的基础上的一种固相标记免疫分析技术，其特点是单份测定、操作简单（一步操作）、快速、准确性高和重复性好，除商品试剂外不需要任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果[5]。实验重复性好，特异性高，不受溶血和脂血的干扰[6]。因此联合应用胶体金方法筛选阴性和弱阳性标本，上机用化学免疫法测原倍（仪器编码设置为151）检测，强阳性结果的标本（预估>1000mIU/mL）用稀释方法（仪器编码设置为152）检测，可以克服这些缺点，节约成本，及时快速地提供给临床医生可靠数据。

HCG是由滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，由α和β亚单位组成，α亚单位的氨基酸排列顺序和黄体生成素（LH）、促卵泡成熟激素（FSH）、促甲状腺成熟激素（TSH）的α亚单位大体相同，相互间可发生交叉反应。而β亚单位结构特异，不存在于其他糖蛋白激素中，根据这一特点制备的β-HCG单克隆抗体，可将上述激素之间的交叉反应降低到最低值[7]。在用胶体金检测的440例阴性标本中，发现的3例假弱阳性标本，经化学发光免疫法检测为阴性，询问病人之前未用任何药物。该现象是因为交叉反应或因为某些原因检测到其他无活性的HCG分子造成假阳性导致。化学发光免疫法的试剂为β-HCG单克隆抗体，且准确性比胶体金高，因此，对化学免疫法检测阴性而胶体金检测弱阳性的结果应考虑上述原因。胶体金早早孕试验筛选出现的弱阳性，原因可能和试条内包埋的小鼠单克隆和多克隆抗体有关，检测可能受到非HCG分子的影响，如LH、FSH、TSH;也可能因为某些原因检测到其他无活性的HCG分子（如游离β亚单位和β-核心片段）时，血HCG值呈弱阳性[8]。因此如发现血清胶体金检测阳性与机器检测阴性不符的情况时，应考虑这些原因，育龄妇女在非排卵期可以用尿液胶体金复查排除。

还有一些文章报导高浓度HCG在用胶体金检测时候出现假阴性或弱阳性，也要在工作当中注意。用胶体金试纸检测尿HCG时，发现绒癌、恶性葡萄胎患者的标本出现假阴性。过量HCG分别与试纸中胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体和羊抗人HCG多抗血清结合而不再形成金标记的HCG抗体-HCG-羊抗人HCG多抗“夹心复合物”，不再出现阳性结果，此现象称HOOK现象，即钩状效应[9]。这表明，当HCG浓度远远大于胶体金试纸条的检测上限时，表现出钩状效应[10]，为HCG浓度过高导致抗原过剩造成的假象。因此如果出现胶体金检测为阴性或弱阳性，机器检测数值很高时，可以将血清稀释再用胶体金试纸条复查，如稀释后为强阳性可以判断为钩状效应所致。

参考文献：

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[5] 王利君，何思春，王修石.胶体金试纸检测尿HCG的钩状效应及对策[J].国际放射医学核医学杂志，2006，3（1-13）：64

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[7]叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京：东南大学出版社，2006：300.

[8]刘淑芬，周锋荣.发光免疫法检测β-HCG胶体金早早孕试纸初筛弱阳性血清的分析[J].检验医学与临床，2010，6（7-11）：1100

化学发光免疫篇8

1.武汉市普爱医院检验科，湖北武汉 430033；2.武汉大学基础医学院，湖北武汉 430071

[摘要] 目的 分析化学发光法和酶联免疫法在丙肝病毒抗体检测中的应用价值。方法 同时应用化学发光法和酶联免疫吸附法检测60例丙肝确诊感染者和100例健康体检者的抗丙型肝炎病毒抗体，计算其阴性符合率、阳性符合率以及总符合率，用Kappa检验计算待评价诊断一致性。选取化学发光法初检验结果为阳性的标本100例，按照S/CO.值分为低值组（1<S/CO.<8）和高值组（S/CO.≥8），经抗HCV经重组免疫印迹试验（RIBA）对化学发光法试剂的检测界限值进行评估。 结果 ELISA法与化学发光法检测HCV抗体结果阳性符合率：87.7%，阴性符合率：91.3%，总符合率：90.0%，Kappa 系数为0.760，两者具有高度的一致性，两种方法在常规临床检测中并无明显差异。阳性低值组中12份标本经RIBA试剂确证为阳性，而高值组中44份标本确证为阳性。结论 ELISA是目前HCV抗体筛查中较为常用的方法，其试剂盒多为第三代试剂，特异性较好，化学发光法近期在HCV抗体筛查中逐渐得到重视，其试剂的灵敏度较高， 两种试剂均可用于丙型肝炎抗体检测。化学发光法的阳性判定标准应进行评估，以提高特异性。

关键词 丙型肝炎；抗体；化学发光；ELISA

[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）07（b）－0193-02

[作者简介] 万大朋（1982.4-），男，湖北武汉人，学士，技师，研究方向：检验的临床研究。

[通讯作者] 刘胜武。

丙型肝炎(简称丙肝)是严重威胁人类健康的传染病之一，主要通过血液传染，我国平均感染率为3.2%，由此估算感染人数约3 700万。输血是丙型肝炎病毒（HCV）的主要传播途径，目前研究发现，除丙型肝炎病毒（HCV）急、慢性期患者外，输血后许多无症状的受血者中也可发现HCV抗体[1]。当前抗-HCV抗体检测多采用酶联免疫吸附法（ELISA），结果受抗原、抗体的变异影响较大，且国内各类抗-HCV检测试剂的检测性能存在较大差异。近期采用化学发光免疫分析(CLIA)检测抗-HCV抗体的试剂已进入我国市场，为分析化学发光法和酶联免疫法在丙肝病毒抗体检测中的应用价值。现分析2012年1月—2013年12月间该院收治的同时应用化学发光法和酶联免疫吸附法检测60例丙肝确诊感染者的临床资料，报道如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料

60例HCV确诊感染者血清标本来自该院的门诊和住院患者，其诊断符合2004年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、中华医学会肝病学分会联合修订的《丙型肝炎防治指南》的有关标准[1]，其中男性33例，女性27例，年龄18~82岁，平均年龄（39.8±4.3）岁，病程3个月~21年，平均病程（6.5±2.1）年。所有患者均知情同意，签署知情同意书。100例正常血清标本来自该院自愿参与研究的健康体检者，其中男性36例，女性24例，年龄18~81岁，平均年龄（39.4±3.9）岁。

1．2 仪器与试剂

ELISA法仪器为瑞士FAME全自动酶标分析系统，采用厦门新创科技有限公司生产的抗-HCV试剂盒；CLIA法仪器为美国强生Vitros 3600化学发光免疫分析仪，试剂盒为相配套试剂。确认试剂（重组免疫印迹法）使用Chiton RIBA－3.0 SIA，Cop Emeryville，CA。

1．3 检测结果判断

ELISA法:以（0.1×阳性对照平均A 值+阴性对照平均A值）确定Cut-off值，以检测值≥Cut-off值为阳性。CLIA法: S/CO.值≥1为阳性。确认试验：出现2条以上HCV蛋白条带为阳性。

1．4 方法

同时用ELISA法和CLIA法对160份样本进行抗HCV抗体检测，按说明书进行操作。另选取100份化学发光法初检结果阳性的标本，分为两组：低值组（1＜S/CO.＜8）和高值组（S/CO.≥8）。对两者结果不符的样本用免疫印记法试剂（HCV RIBA）再次进行确认，以再确认结果为正确。

1．5 统计方法

用四格表统计临床数据，并计算阴性、阳性以及总符合率，所得数据采用统计学软件spss17.0处理，样本率以χ2检验。用Kappa检验计算发光法试剂与ELISA试剂的诊断一致性，按照Kappa系数大小以极差、微弱、弱、中度、高度和极强对诊断一致性强度进行判断，极差：Kappa系数＜0；微弱：Kappa系数0～0.2；弱：Kappa系数0.21～0.4；中度：Kappa系数0.41～0.6；高度：Kappa系数0.61～0.8；极强：Kappa系数0.81～1.0[2]。

2 结果

2．1 ELISA和CLIA方法检测丙型肝炎病毒抗体结果的符合性

结果显示使用传统ELISA试剂与化学发光方法试剂检测抗HCV抗体的诊断一致性较高，临床检测中差异有统计学意义(P＜0.05）。见表1。

2．2 化学发光法抗-HCV初检阳性标本的RIBA确认试验结果见表2。

3 讨论

目前广泛使用的第三代HCV抗体ELISA试剂增加了HCV Ns5区表达的蛋白作为抗原，大增加了灵敏度和特异性。但临床使用该类试剂筛检HCV感染者，仍存在一定数量的假阳性和假阴性结果[3]，特别是在HCV低流行率人群中，如无偿献血者，假阳性问题一直比较突出。此外，国内常用的HCV抗体酶免试剂皆没有灰区的设定，试剂盒cutoff值计算方法各厂家也都不一致，导致国产试剂盒之间的检测性能存在较大的异质性，亦是假阳性比较多的原因 [4-5]。

在临床实验室中检验中，需先对使用的方法和程程序进行评估，确定其符合要求后才可正式使用。Kappa检验是用于分析计数资料和等级分组资料一致性检验中的一种方法，在肝炎病毒血清标志物等二分变量（阴性、阳性）检测中，一般选择使用使用检验法，以判断不同方法学是否存在一致性及相关程度。该文结果显示化学发光法与酶联免疫法在丙型肝炎病毒抗体检测中的Kappa系数达到0.76，具有高度一致性，与同类研究报道结果基本一致[4]，结果表明两种试剂均可用于血源筛查、临床术前初筛。ELISA试剂的特异性较好，发光试剂的灵敏度较高，两种试剂均存在漏检现象，实际工作中如能联合应用可提高检出率[6]。

另外该研究参照美国CDC丙型肝炎实验导则[7]，使用S/CO.≥8可判断为阳性作为分组依据，对发光法初筛阳性的标本再进行RIBA确认试验，发现低值组的阳性率为24%，而高值组的阳性率为88%，提示中国人群的抗HCV阳性预测值与美国有一定的差异，目前的抗-HCV 诊断试剂盒均采用基因工程或合成多肽抗原，而由于HCV基因易发生变异，其基因呈现高度异质性，编码氨基酸序列明显改变，可引起抗原性的改变，现阶段试剂的检测抗原多为2型抗原，而以往的研究发现，我国HCV患者多为1型，因此当前的试剂并不适用于中国所有地区[4]。提示实验室应对抗HCV试剂的S/CO.比值设定进行评估，使用在所有人群中经过验证的能够预测确认试验≥95%阳性率的S/CO.比值作为是否进行确认试验的依据，并设立一定范围内的灰区，以达到灵敏度和特异性的最佳平衡[8]，该研究还提示对初检呈弱反应者有必要进行确认试验，跟踪观察。

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化学发光免疫篇9

[关键词] 化学发光免疫分析仪；操作；维护；故障处理

[中图分类号]R392-33 [文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2009）05（b）-127-02

美国拜耳公司生产的ACS:180SE全自动化学发光免疫分析仪以其独特的免疫分析技术，齐全的检测项目，简便的操作，快速、灵敏的测试结果，在临床上广泛应用。该机使用的一次性样品杯、定标液、酸碱试剂、辅助试剂等均为厂家负责免费提供，降低了检测成本，方便了客户。

1 仪器的使用环境及保养

环境温度、尘埃、电源的稳定性对机器的影响很大。环境温度和湿度过高或过低，仪器都会报警，因此实验室应安装空调和除湿机。室内湿度过大时仪器无法正常启动，可用吹风机对准仪器后部的窗口吹10～15 min即可。同时要做好环境的防尘、清洁工作。定期用无水乙醇擦拭吸样针和试剂针，同时调整吸样针和试剂针的位置，试验用水必须使用达标水质。

2 操作流程

2.1 仪器工作全程由微机控制

仪器自检、灌注、编排工作表、样本和试剂的识别与定标、样本和试剂的混合、进样、清洗等均由自动程序控制，操作简便。

2.2 样品杯为一次性使用，厂家负责免费提供

使用时将杯子放如杯仓内，由机械装置引导自动进入轨道，吸样针和试剂针将样本和试剂吸入，反应分析后样品杯被清洗送入污物仓，同时将检测结果自动传送至电脑，整个过程全自动化检测。

2.3 吸针均由程序自动控制

为使吸样针和试剂针准确吸样和吸试剂，机内有一负压泵为吸针提供负压，针上有传感器及液面检测器负责检测。吸针的吸样位置和吸样量多少均由程序自动控制。

2.4 结果分析

分析结果直接传入英文版的微机，再自动传送至中文版的微机中，打印中文综合报告。

3 常见故障及处理

3.1 系统故障及电路故障

当系统发生故障时，英文版微机显示器左上角窗内后黄色表识闪动，机内故障检测系统将指示出故障发生的具体部位及处理办法。大部分故障可自己解决。当电路发生故障时就要与厂家维修工程师联系解决。因为控制仪器的微机是全英文版的，所以操作人员必须能够具备一定的英文水平，仪器旁也应该随时放置英文词典以备查用。

3.2 微机故障

微机是该系统的心脏。有时由于微机不能启动，与主机之间的连接松动等都会造成整个系统不能工作。这时应该检查微机电源、与主机间的连接线路、系统软件等。如确属微机本身硬件或软件故障，就要与厂家维修工程师联系解决。

3.3 卡杯子

卡杯子故障是该仪器出现故障率较高的现象之一。杯子一旦卡住，整个检测过程就要重新开始，既浪费时间又浪费试剂。

3.3.1 杯仓卡杯子由于样品杯是在杯仓内任意放置，由仓内机械传送带随机拾取的，使用一段时间后仓内灰尘及塑料样品杯上的毛刺等都可能使杯子卡住。此时轨道上无杯，机器空走。解决的方法是将机器左侧上外板拆下，将卡杯取出，用棉签蘸取无水乙醇清洁传输带、杯仓即可。

3.3.2 污物仓卡杯子检测后样品杯被清洗送入污物仓内。长时间使用后，杯子进入污物仓的出口处会有灰尘积聚，出口斜面变涩，使杯子不能顺利滑入污物仓，从而堵住出口。此时仪器报警，检测停止。解决的方法是将污物仓打开，用用棉签蘸取无水乙醇清洁杯子出口即可。

3.4 过滤器渗漏或过脏

仪器左边上一小窗可看见水过滤器。由于受水炙和环境的影响，如果一段时间结果出现较大偏差，并从小窗上看到过滤器发黄或是渗漏，就需要与厂家维修站联系更换水过滤器。

3.5 样品（试剂）盘无动作

当传动装置发生故障时，样品（试剂）盘不能动作，此时应首先检查传动马达有无动作，在拆开清洁后发生此故障，多半是由于条形码检测器没有检到条形码。只要将样品（试剂）盘转一下位置就可解决。所以在拆盘时要记住原始位置很重要。如果条形码检测器灯不亮，无扫描，则是检测器本身故障，就要与厂家维修工程师联系解决。

3.6 液面检测故障

当进样（吸试剂）的1～3号针任一发生故障时，该针进到样本（或试剂）杯中，只是轻点一下，不能吸液，则要考虑是否液面检测器损坏。可将两只针上液面检测器互换。如果故障也随之转移，就可断定是液面检测器损坏。此电路板在机上为软线连接，拆装时要格外小心，以免扩大故障。

3.7 水量过少或水液面过低

在仪器的左面有上下两个水桶，上面是净水桶，下面是污水桶。两个水桶分别由两个带圆型塑料垫的盖子盖住。使用一段时间后，即使净水桶里是满的仪器也会出现水液面过低的报警现象。此时，可打开净水桶盖子，将盖子上的圆形塑料垫转动位置盖上即可。如果长期磨损，转动后仍不能解决，就需要与厂家维修站联系更换塑料垫。

3.8 样品或试剂量过少，液面过低

此时吸针因吸不到样品或试剂而报警，无法检测。可将样品管或试剂瓶稍微向上提3～5 mm，以不影响吸针吸样为准，这样可将样品或试剂液面稍微提高，从而顺利检测，同时避免了试剂的浪费。

总之，在使用过程中日常维护和保养至关重要，能消除隐患，降低故障率；如果能了解一些常见的故障发生的原因并及时加以处理，更有利于提高仪器的使用效率，充分发挥该仪器快速、准确的性能。

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化学发光免疫篇10

【摘要】目的：探讨酶联免疫吸附试验（ELISA）、时间分辨免疫荧光法(TRFIA)、化学发光法(CLIA)三种乙型肝炎血清标志物检测方法的精密度和检测灵敏度。方法：用酶联免疫吸附试验、时间分辨免疫荧光法、化学发光法分别测定经乙型肝炎病毒DNA定量检测阳性患者的HBsAg水平，分析三种方法的检测灵敏度和和精密度。结果：化学发光法测定灵敏度较酶联免疫吸附试验法和时间分辨免疫荧光法测定灵敏度高，三种方法用于低浓度HBsAg检测时，化学发光法的阳性检出率较酶联免疫吸附试验和时间分辨免疫荧光法均高，差异明显，P＜0.05，差异具有统计学意义。结论：化学发光法法具有检测灵敏度高、对HBsAg阳性检出率高的特点，其优势尤其在检测低浓度HBsAg时体现更充分，值得临床作为低浓度HBsAg检测时推广应用。

【关键词】乙型肝炎血清标志物；酶联免疫吸附试验（ELISA）；时间分辨免疫荧光法(TRFIA)；化学发光法(CLIA)

临床上常用乙肝血清标志物作为诊断乙肝病毒感染与否的诊断标准，本资料采用ELISA（酶联免疫吸附试验）、 (TRFIA)、 (CLIA)三种方法对经乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测的阳性患者的HBsAg水平进行检测，分析三种方法的检测灵敏度和精密度。

1 对象和方法

1.1对象临床样本先经乙肝病毒 DNA定量聚合酶链反应方法进行检测呈阳性，然后采用电化学光反应检测方法遴选下列模式: 1~50HBsAg COI临床样本30例, 小于1HBsAg COI的临床样本30例,其中男26例,女34例，患者年龄从18岁至55岁不等。

1.2检验方法按照试剂盒说明书进行酶联免疫吸附试验测定，按照Elecsys2010全自动电化学发光仪和配套试、酶标仪等仪器设备使用说明书及检验科相关准操作程序进行样品检测。

1.2.1 灵敏度实验：取国家临检中心提供的临界值血清稀释成不同的浓度,采用用化学发光法, 酶联免疫吸附试验法及时间分辨免疫荧光法分别重复测定5次，统计测定结果，统计测定结果。

1.2.23种方法重复性取1.2.1步骤稀释的HBsAg COI处于1~50的临床样本30例,分别采用化学发光法, 酶联免疫吸附试验法及时间分辨免疫荧光法分别重复测定5次，统计测定结果，统计测定结果。

1.2.3 临床样本的检测：采用化学发光法, 酶联免疫吸附试验法及时间分辨免疫荧光法分别测定60例患者的HBsAg水平并与电化学光反应检测的结果进行对比。

1.4统计学方法所有收集的检测数据均用SPSS17.0统计分析软件包进行处理。计量数据以±s表示， 采用配对t检验，计数数据采用χ2检验。且P

2结果

2.1 三种方法的检测灵敏度：CLIA法灵敏度较ELISA法和TRFIA高。

2.2ECLIA法、ELISA法及胶体金法测定HBsAg各模式的结果

从上表可以看出，CLIA法较ELISA法及TRFIA法对于低浓度的HBsAg检出率较高，差异显著，P＜0.05，有统计学意义。

3讨论

有资料显示[1]，全球目前有乙型肝炎病毒携带者近3亿,我国乙型肝炎携带者为0.93亿，是世界上几个乙肝高发国之一。乙肝血清标志物作为临床诊断乙肝患者的诊断标准，其检测方法一直以来受到临床技术人员的高度重视，其从最早的免疫扩散试验、对流免疫电泳试验发展到现在的酶联免疫吸附试验、时间分辨免疫荧光法、化学发光法、聚合酶链反应（PCR）检测及更高层次的免疫PCR检测方法[2]。期间淘汰了一些灵敏度和精密度均较差的检验方法，目前，临床较常使用的是酶联免疫吸附试验、时间分辨免疫荧光法、化学发光法三种方法[3]。乙肝病毒患者的早期诊断对治疗效果及预后的影响很大，早期患者的HBsAg一般较低，能找到合适的方法对低浓度的HBsAg进行检测，对早期乙肝患者的发现具有重大的临床意义[4]。本组研究资料显示，化学发光法测定灵敏度较酶联免疫吸附试验法和时间分辨免疫荧光法测定灵敏度高，采用CLIA法、ELISA法及TRFIA法对低浓度HBsAg COI样本进行检测的结果表明：当HBsAg COI为1-50的时候，ELISA法及TRFIA法的阳性检出率分别为：50%和33.33%，也就是说两者的漏检率分别达到了50%和66.67%，因此，为了尽可能保证医疗安全，临床检测患者和血库血样时应尽可能采用CLIA法，以保证低浓度HBsAg的检出率[5]。

参考文献

[1］ 王鹏,张文艳.免疫电化学发光[J］.分析化学,1998,26(7):898-903.

[2］ 郑怀竞,韩松.临床检验ELISA指南[M］.北京:北京医科大学,2003.64.

[3］ 陈佑明,黄敬,熊符,等.时间分辨荧光免疫分析法和免疫放射分析法检测HBsAg的对比分析[J］.标记免疫分析与临床, 2006, 13(1): 50-51.

[4］ 廖慧芳.乙型肝炎病毒三种检测结果的临床分析[J］.湖南师范大学学报(医学版), 2009, 6(2): 56-57.

[5］ 魏来,陶其敏.努力规范肝脏疾病的免疫学诊断[J］.中华检验医学杂志,2003,26(2):69.