蛋白酶体十篇

蛋白酶体篇1

【关键词】牙龈卟啉单胞菌；牙龈蛋白酶R；蛋白酶激活受体；牙周炎

【中图分类号】Q51

【文献标志码】A

牙龈卟啉单胞菌是牙周重要的致病菌之一，其分泌的牙龈蛋白酶包括牙龈蛋白酶R（gingipain　R，rgp）和牙龈蛋白酶K（gingipain　R，kgp），是牙龈卟啉单胞菌主要的毒力因子之一。蛋白酶激活受体（protease　activated　receptor，PAR）是一种可识别多种分子的跨膜蛋白，rgp通过激活PAR在牙周炎的发生发展过程中起重要的作用。

1　rgp和PAR的组成和生物学特性

1.1rgp的组成和生物学特性

牙龈蛋白酶又称牙龈卟啉单胞菌蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或胰酶样蛋白酶，存在于牙龈卟啉单胞菌外膜、膜泡或细胞外。牙龈卟啉单胞菌至少85％的水解活性和100％的胰酶样活性是由其蛋白酶产生的，因而牙龈蛋白酶被认为是牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子，在牙体支持组织包括牙槽骨的破坏中起重要的作用，与牙周炎密切相关。牙龈蛋白酶根据其水解肽段是精氨酸特异性的或赖氨酸特异性的，分为rgp和kgp。rgp包括相对分子质量9.5×104的rgpA和相对分子质量5.0×104的rgpB两种形式，分别由rgpA和rgpB基因编码。rgpA又称为HRgpA。rgpB只含有一个催化结构域，而rgpA除此之外还具有一个血凝蛋白或黏附结构域，两者在催化结构域的DNA和蛋白质水平上都具有高度同源性。rgpA由于含血凝蛋白或黏附结构域，因此在一些活性上面有别于rgpB或起增强作用。

1.2PAR的组成和生物学特性

PAR属于鸟苷酸结合蛋白[guanylate　binding　protein，GBP（简称G-蛋白）]偶联受体家族，具有7个跨膜单位，可在多种细胞中表达。在人牙周组织中，PAR可在上皮细胞、牙龈成纤维细胞、破骨细胞、肥大细胞、巨噬细胞、炎症浸润细胞和T细胞等免疫细胞中表达。PAR既可以表达于正常的组织细胞，也可以表达于炎症的组织细胞。PAR-1、3、4为凝血酶受体；PAR-2为胰岛素和肥大细胞纤维蛋白溶酶，凝血因子Ⅶa和Xa，以及其他未知蛋白水解酶的受体。PAR的配体均隐藏在N末端的细胞外结构域中，当其受到丝氨酸蛋白酶的酶切作用时才显露出来，通过与分子内的结构域相结合并发生构象改变而激活PAR，继而激活G－蛋白偶联的信号传导通路。已知的G－蛋白包括刺激型G－蛋白（stimulating　G　protein，Gs）、抑制型G－蛋白（inhibitory　G　protein，Gi）、Gq类蛋白（与磷脂酶激活有关）、转导素G－蛋白（transduction　g　protein，Gt）和G12类蛋白以及其他G－蛋白（other　G　protein，Go）等亚家族，其中，PAR-1和2可通过Gq、Gi、G12和G13，PAR-4可通过Gq、G12和G13引起磷脂酶C（phospho-lipase　C，PLC）激活；而PAR-3尚未有相关G-蛋白受体的研究。

此外，PAR尚与促丝裂原激活蛋白激酶通路和核因子-kB途径相关，引起各种炎症因子、趋化因子表达，启动炎症反应，参与一系列的致病过程：血栓形成，调节血管通透性，介导血管平滑肌的收缩、增生和肥大以及骨细胞的分化和肥大。PAR的激活在牙周组织中也可引起一系列的炎症过程，因而是牙周炎发生发展过程中重要的信号受体，但其具体机制及信号转导通路仍不清楚。

2　rgp对PAR的激活作用

rgpA和rgpB均可以激活PAR-1、2和4受体，但rgp能否激活PAR-3尚无文献报道。不同的牙周细胞表达的PAR不同，PAR对rgp的敏感性也不同，PAR激活后表达的反应亦有差别，从而在不同的方面共同影响牙周炎的致病过程。

2.1rgp激活PAR诱导宿主细胞释放炎症因子

rgp信号分子通过PAR可启动宿主细胞炎症信号转导通路、诱导大量炎性因子分泌，从而参与牙周炎的致病过程，包括局部炎症反应和全身炎症反应。牙龈卟啉菌主要集于牙菌斑中，分泌rgp于龈沟液并进入周围组织激活PAR，从而诱导上皮细胞、单核细胞、中性粒细胞和成纤维细胞等宿主细胞产生炎症因子，这些炎症因子既可聚集于局部引发急性或慢性牙周炎，亦可进入血液循环系统。rgp可通过PAR-1和2信号转导通路刺激牙龈上皮细胞分泌一系列的促炎性因子，如白细胞介素（interleukin，IL）－1、6和8以及肿瘤坏死因子－α。类似的结果包括在rgp刺激的单核细胞中PAR-2表达增加，单核细胞趋化蛋白－1的分泌亦增加。同样的，在表达PAR-2的中性粒细胞中可见到IL-1、6和8的分泌增加。这些细胞炎症因子的表达量与牙周炎症的程度有关，当牙周炎症改善时，细胞炎症因子水平也明显下降，同时还伴随着PAR表达的改变。

PAR的表达往往具有时间依赖性和质量浓度依赖性，但牙周炎的发生发展是一个较漫长的过程，其时间依赖性可能只表现于初始阶段；而在质量浓度依赖性上，随着rgp质量浓度的增加，PAR表达达到峰值，而后逐渐下降。这在炎症因子方面则表现为当rgp的质量浓度较低时，炎症因子水平上升，从而促进炎症反应的发展；而当炎症病变进展，在rgp的质量浓度较高时，组织破坏已经较为严重，炎症因子的水平下降。有研究认为，IL-8由炎症细胞产生，可被降解；同时，IL-8的分泌可在rgp刺激上皮细胞和成纤维细胞等的情况下增加。Belibasakis等也报道了类似的研究结果。

在单核细胞中，rgp可以通过PAR诱导炎症因子产生，这些炎症因子与Toll样受体以及核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding　oligomer-ization　domain，NOD）-1和2配体具有协同作用。其机制可能在于通过PAR的激活而引发宿主抵抗牙龈卟啉菌的防御系统，然后通过Toll样受体以及NOD-1和2识别病原相关分子模式起到协同作用。

2.2rgp激活PAR影响宿主的防御

如前所述，rgp可通过激活PAR诱导单核细胞、中性粒细胞和上皮细胞等分泌趋化因子使吞噬细胞聚集并分泌抗菌肽，增强黏膜的防御功能，共同抵抗致病菌。抗菌肽（包括人β-防御蛋白）在口腔黏膜包括在牙龈组织抵抗致病菌侵袭的先天性免疫中发挥作用。有报道称，rgp具有降解抗菌肽的功能，在临床牙周炎中也有抗菌肽降低的病例，因此，牙周致病菌往往可以抵抗宿主的这些先天免疫防御功能。rgpA还可激活T细胞和B细胞上的PAR-1、2和4，分别降解CD27和CD70，从而影响由T细胞介导的细胞免疫反应，增加牙龈卟啉单胞菌致病的危险性。

诸多体外研究显示，PAR-2在牙周致病菌抵抗宿主的先天免疫防御功能中发挥着重要的作用。Holzhausen等发现，受PAR-2激动剂刺激的大鼠，其牙周炎症加剧，牙槽骨进一步吸收，粒细胞持续浸润。他们在另一Par-2基因敲除的小鼠试验中则发现，其牙周炎症好转。此外，Wong等同样采用Par-2基因敲除的小鼠与野生型感染及Par-1基因敲除的小鼠相比较，却没有发现小鼠的牙槽骨丧失，而其肥大细胞浸润和辅助T细胞依赖的炎症细胞因子则大量减少。Belibas-akis等发现在rgp的作用下，人T细胞PAR-2的表达可增加，而且T细胞较为敏感。结合上述研究可以认为，PAR-2以及上述细胞经激活PAR-2信号通路后的后续反应在牙周炎症的发展过程中起着重要的作用。

2.3rgp激活PAR在牙周炎中的其他作用

rgp激活PAR可促进骨吸收，造成牙周附着丧失并促进牙周袋加深。Uehara等发现在成纤维细胞中，PAR-1和2经rgp激活后，肝细胞生长因子分泌增加，该因子参与牙周的炎症过程，可促进破骨细胞的形成。rgp还可作用于破骨细胞，可使PAR-2的表达增高，细胞内钙离子浓度增加，激活破骨细胞并促进骨吸收。

用rgpA和rgpB作用于血小板，可使其上的PAR-1和4激活，最终引起血小板聚集。该现象成功地解释了牙周炎与心血管疾病之间的关系，但没有明显的证据表明其牙周致病作用。在牙髓细胞中，rgpB可通过激活PAR-2促进神经肽、降钙素基因相关肽和P物质的表达，从而解释了牙周炎与牙髓炎症之间的联系。

蛋白酶体篇2

摘要：目的 构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法 利用PCR技术和基因重组技术，克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd， 插入中介载体pMD18T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET15b，构建表达质粒pET15b/rgpAcd，通过限制性酶切鉴定。结果 PCR产物电泳结果显示，在大约1.5kb处有一特异的条带，与预期的大小一致，核酸序列测定与分析的结果表明，克隆的1476bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性，未发生任何突变；构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致，表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功。结论 成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体，为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。

关键词：牙龈卟啉菌；蛋白酶；表达载体

ABSTRACT: Objective To construct prokaryotic expression vector of the catalytic domain of rgpAcd of porphyromonas gingivalis (Pg). Methods The desired DNA fragment rgpAcd was obtained by PCR and was separately sequenced and identified by inserting into intervector pMD18T Vector. The correct fragment was linked with and cloned into an prokaryotic expression vector pET15b. Results A 1476bp specific fragment was obtained and DNA sequencing showed that the fragment was consistent with those of the published. After the recombinant expression plasmid was confirmed by enzymes digestion， it showed that the prokaryotic expression vector of rgpAcd gene was constructed successfully. Conclusion The protein of rgpAcd will be obtained for further study. Successful construction of live attenanated vaccine candidate plasmid lays solid foundation for future animal experiments and clinical trials.

KEY WORDS: porphyromonas gingivalis; gingipain; expression vector

牙周炎是口腔中的常见病和多发病。其引起的牙龈萎缩、牙槽骨丧失一般难以再生，目前治疗上尚无有效的方法。因此，牙周炎的早期预防至关重要。牙周炎是一种细菌感染性疾病，当牙周致病菌侵袭牙周组织时，人体会通过局部细胞免疫和全身免疫影响牙周炎的发生和发展，这就使牙周炎的免疫学预防和治疗成为可能。流行病学研究表明，革兰氏阴性厌氧菌牙龈卟啉菌(porphyromonas gingivalis， Pg)与牙周炎的发生、发展显著相关，是牙周炎的优势致病菌。

因此，研究设计针对Pg牙周炎疫苗，有可能对牙周炎的预防和治疗产生积极的影响。

近年来，牙周炎疫苗的研制和开发正日益受到关注。国外学者已在这方面进行了一些研究，发现以Pg蛋白酶免疫动物可以产生高水平的血清抗体，抵抗Pg的定植，并减轻由Pg引起的牙槽骨吸收。本实验旨在通过基因克隆和基因重组等技术获得Pg蛋白酶rgpA的催化结构域(gingipain rgpA catalytic domain， rgpAcd)基因并构建表达载体，为进一步研制重组活载体疫苗奠定了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与载体 Pg ATCC 33277(四川大学华西口腔生物实验室)、大肠杆菌TOP10(北京天为时代科技有限公司)、中介载体pMD18T Vector(Takara)、原核表达载体pET15b

(Novagen)。

1.2 主要试剂 rTaq DNA Polymerase、限制性内切酶及DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、Xgal和IPTG(Takara)；DNA Marker Ⅵ、DNA Marker Ⅶ、细菌基因组 DNA 提取试剂盒、离心柱型质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天为时代科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细菌DNA的提取 Pg ATCC 33277用改良 GAM 培养基[1mg/L维生素K1、5%(体积分数)脱纤维蛋白羊血]，在37℃厌氧条件下(体积分数：80%N2，10%H2，10%CO2)培养5d，接种2-3个平皿，刮下细菌，离心收集菌体，-20℃保存备用。采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取Pg DNA。获得的DNA采用紫外吸收法作定量和纯度检测。

1.3.2 PCR扩增特异性基因片断 以Pg基因组DNA为模板，根据Pavloff等报道的Pg rgpA基因序列(GI：557067)，设计rgpAcd引物，上游包含NdeⅠ酶切位点和起始密码子ATG，下游包含终止密码子TGA。上游引物的序列 为5′CATATGTACACACCGGTAGAGG3′(22bp)，下游引物的序列为5′TCAGCGAAGAAGTTCGGGGGCA3′(22bp)。由上海生工生物工程技术公司合成。用rTaq酶扩增rgpAcd基因，PCR反应体系为50μL。反应条件：94℃预变性5min，进入热循环――94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min 30s。共35个循环后，再72℃延伸20min。将PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

1.3.3 PCR产物的克隆和重组质粒的鉴定 PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，与pMD18T Vector连接进行T/A克隆，以连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂碟，进行Xgal/IPTG蓝白斑筛选。挑选白色克隆，摇菌，用离心柱型质粒小提试剂盒提取质粒，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。酶切正确的阳性克隆送上海生工生物工程技术公司测序。正确的重组质粒命名为pMD18T/rgpAcd。

1.3.4 原核表达质粒pET15b/rgpAcd的构建和鉴定 分别将已构建并经测序鉴定的pMD18T/rgpAcd用BamHⅠ/SalⅠ双酶切，原核表达载体pET15b 用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，低熔点胶回收酶切片段后，以T4连接酶连接，转化至E.coli TOP10感受态细胞中，对阳性菌落进行酶切鉴定。正确的原核表达质粒命名为pET15b/rgpAcd。

2 结

果

2.1 Pg ATCC 33277 DNA的定量及纯度 经紫外吸收法测定，A260/A280 =1.76，说明DNA纯度较高，基本没有RNA及蛋白污染。DNA质量浓度为68mg/L。电泳结果显示所获得DNA纯度较高，且DNA链大于15kb(图1)。图1 Pg基因组DNA电泳图（略）

2.2 PCR产物的获得 PCR产物电泳，在大约1.5kb处有一特异的条带，与预期的大小(1476bp)一致(图2)。图2 PCR产物电泳图（略）

2.3 重组质粒的鉴定 以TA法将PCR产物克隆至中介载体pMD18T中，重组质粒pMD18TrgpAcd经BamHⅠ和SalⅠ双酶切，与预期相符(图3)。测序结果同GenBank中收录的序列完全一致，未发生任何突变。图3 pMD18T/rgpAcd重组质粒BamHⅠ/SalⅠ双酶切图（略）

2.4 表达质粒的构建与鉴定 重组质粒pMD18TrgpAcd用BamHⅠ和SalⅠ双酶切出所需片段，定向插入经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切的原核表达载体pET15b中，构建表达质粒pET15b/rgpAcd，该重组质粒经NdeⅠ酶切后，与预期大小一致(图4)，表明成功构建表达质粒。图4 pET15b/ rgpAcd表达质粒NdeⅠ酶切图（略）

3 讨

论

目前有关牙周炎的免疫学研究主要包括主动免疫和被动免疫两个方面，被动免疫疗效维持时间短又需要长期反复应用，而采用主动免疫则变得简单。主动免疫疫苗又分为灭活疫苗及亚单位疫苗、多肽疫苗、基因疫苗、重组活载体疫苗等，这些疫苗已用于动物实验，并获得了一定的成功。Pg是慢性牙周炎中最主要的优势菌群，是目前公认的牙周炎病原菌。但是Pg全菌细胞抗原成分较多，免疫后易与人体组织产生交叉免疫反应，有引起自身免疫性疾病的危险。因此，提取Pg中具有能诱导免疫保护作用的特异抗原，可提高免疫保护的效果，减少不良反应的发生。寻找一种合适抗原是牙周炎疫苗研究的首要步骤，也是目前国内外学者研究的重点。

Pg表面具有一系列逃避宿主防御机制及破坏宿主组织的毒性因子，如脂多糖、菌毛、外膜蛋白、血凝素和蛋白酶等，其中蛋白酶(gingipain)在Pg致牙周病作用中占有重要地位。蛋白酶是一类结构和功能十分相似的蛋白质，具有多种生物学活性，在细菌粘附中起重要作用，并具有很好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答，被认为是很有潜力的牙周炎疫苗抗原。国际生化联合会( International Union of Biochemistry) 将其分为两类：一为蛋白酶R(RGP)，作用于底物后只在精氨酸位置水解蛋白质，故以前也称为精氨酸特异性蛋白酶；二为蛋白酶K(KGP)，作用于底物后只在赖氨酸位置水解蛋白质，故以前也称为赖氨酸特异性蛋白酶。RGP和KGP属于半胱氨酸蛋白酶，归属梭菌蛋白酶家族。研究表明，通过严格的纯化和基因分析可得到3种主要的Pg蛋白酶，即rgpA、rgpB和kgp。其中rgpA不仅影响细菌的定植和生长，而且侵袭和破坏宿主组织，影响免疫反应和血管系统，导致牙周炎具有其临床症状；同时rgpA具有很好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。因此，针对蛋白酶rgpA设计的牙周炎疫苗将成为防治牙周病的重要手段。近年来，随着分子生物学的发展，国内外学者已在RGP的遗传学方面做了大量的研究工作，对其基因、蛋白结构，结构与功能的关系有了更深入的了解。1995年Pavloff 等首次克隆了Pg H66和W50的rgpA基因全长，由6.3kb组成，包括全部编码区和5＇3＇非编码区，开放读框包括5112个核苷酸，编码1704个氨基酸的蛋白。在核苷酸nt 889-894位点上存在TATA盒，nt949-951位点上有ATG启动密码子，后接一信号序列。其中前277个氨基酸是前肽部分，包括信号肽和N端前序列；228-720氨基酸为成熟肽蛋白酶结构域即rgpAcd，721-1704氨基酸为血凝集素结构域。其中rgpAcd为RGP的生物活性部分，包括492个氨基酸。本实验根据已发表的Pg rgpA序列设计引物，采用PCR方法从Pg ATCC 33277 DNA中扩增出rgpAcd的基因片断，克隆到中介载体pMD18T Vector中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET15b，构建了表达质粒pET15b/rgpAcd，为进一步研制重组活载体疫苗奠定了坚实的基础。

本实验所用的pET15b 载体属于T7 RNA 聚合酶/启动子表达系统。该表达系统有一个特点，就是需用不同的宿主菌进行外源基因的克隆和表达，在外源基因表达产物是宿主菌的毒蛋白时，在同一宿主菌进行克隆和表达会很困难，有时是不可能的。因此在本实验中，用于克隆的宿主菌TOP10不表达T7RNA聚合酶，宿主菌的其他RNA聚合酶不识别T7RNA启动子，rgpAcd基因得不到表达，不会对宿主菌造成影响，从而保证rgpAcd基因的克隆顺利进行。在完成rgpAcd基因的克隆后，再将重组质粒pET15b/rgpAcd转化可以表达T7 RNA 聚合酶的宿主菌，在IPTG的诱导下，启动T7启动子控制的rgpAcd基因，表达rgpAcd蛋白。此外，pET15b载体表达的融合蛋白含有6×HisTag，可以被特异吸附His的镍金属螯合柱纯化或通过组氨酸琼脂糖珠进行纯化。这为今后体外表达并纯化其活性蛋白，进一步研制重组活载体疫苗提供了可能。

参考文献

[1]朱江，谢昊，樊明文. 牙周炎免疫防治研究进展 . 口腔医学纵横， 2000，16(1):6567.

[2]Rajapakse PS， OBrienSimpson NM， Slakeski N， et al. Immunization with the RgpAKgp proteinaseadhesin complexes of porphyromonas gingivalis protects against periodontal bone loss in the rat periodontitis model . Infect Immun， 2002，70(5):24802486.

[3]Pavloff N， Potempa J， Pike RN， et al. Molecular cloning and structural characterization of the Arggingipain proteinase of porphromonas gingivalis . J Bio Chem， 1995， 270(3):10071010.

[4]OBrienSimpson NM， Paolini RA， Reynolds EC. RgpAKgp peptidebased immunogens provide protection against porphromonas gingivalis challenge in a murine lesion model . Infect Immun， 2000， 68(7):40554063.

[5]Yonezawa H， Ishihara K， Oluda K. Arggingipain a DNA vaccine induces protective immunity against infection by porphromonas gingivalis in a murine model . Infect Immun， 2001，69(5):28582864.

[6]Nakagawa T， Saito A， Hosaka Y， et al. Gingipains as candidate antigens for porphyromonas gingivalis vaccine . Keio J Med， 2003， 52(3):158162.

蛋白酶体篇3

[关键词]骨骼肌；蛋白代谢；细胞培养；凋亡

[中图分类号]Q591.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2014）07-0541-04

The influence of caspase3 to the cultured skeletal muscle cells'proteolysis

WU Yan-qiu,CHAI Jia-ke,ZHANG Hai-long,GENG Yi-nan

(Burns Institute,The First Affiliated Hospital to the General Hospital of PLA,Beijing 100048, China )

蛋白酶体篇4

关键词：米曲霉（aspergillus oryaze）；中性蛋白酶；产酶条件

中图分类号：tq925；q93-33 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2014）07-1637-04

optimizing the solid fermentation conditions of neutral protease from

aspergillus oryzae gn-2 strain

huang yan，ju lu-ning

（minbei vocational and technical college， nanping 353000，fujian，china）

abstract： the optimal solid fermentation conditions of neutral protease from aspergillus oryzae gn-2 strain was studied. the results of single factor test showed that the highest neutral protease activity was obtained under the conditions of wheat bran and soybean powder addition ratio 4∶1， fermentation time 60 h，temperature 30 ℃，water addition 10 ml， inoculum amount 2.0 ml 1×106 spores/ml spore suspension， the initial medium ph 6.0，0.02%（nh4）2so4 1 ml. the results of orthogonal experiment showed that the highest neutral protease activity was obtained when the solid fermentation was carried out at 25 ℃ for 72 h， water addition 20 ml and the addition ratio of wheat bran and soybean powder 4∶1， with the highest neutral protease activity of 1 016.9 u/g.

key words： aspergillus oryzae； neutral protease； enzyme production conditions

中性蛋白酶是指最适作用ph介于6.0～7.5的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。它是最早发现并广泛应用于工业生产的蛋白酶制剂，被广泛应用于皮革脱毛、饲料加工、畜禽血液蛋白质水解、酒和饮料的澄清以及医药治疗等领域[1-3]。

米曲霉（aspergillus oryaze）具有丰富的蛋白酶系，能产生酸性、中性和碱性蛋白酶，能耐受较高温度，广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中[4]。米曲霉易于固体培养，所产的中性蛋白酶热稳定性高，有利于酶制剂的制作和保存，培养原料来源广泛，价格便宜，用于食品行业和化妆品行业将有广泛的前景[5]。吴继星等[6]研究表明，微生物培养基组成与产酶有极大的相关性。近年来，研究者采用正交设计的方法对培养基组分和培养条件进行优化筛选，并取得一定成效[7]。

本研究从酿造酱油曲精中分离到一株米曲霉菌株，命名为gn-2，研究了培养条件对米曲霉gn-2产中性蛋白酶的影响，通过正交试验确定了其中4个影响因素的最优组合，为该菌株的开发利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源：米曲霉gn-2，从上海迪发酿造生物制品有限公司优质酱油曲精分离纯化得到。

pda培养基：马铃薯200 g/l，蔗糖20 g/l。

豆粉汁培养基：mgso4 0.5 g/l，kh2po4 1.0 g/l，（nh4）2so4 0.5 g/l，可溶性淀粉20 g/l，黄豆汁1 l。

发酵培养基：黄豆粉3 g，麸皮12 g，去离子水15 ml，装入250 ml三角瓶搅拌混合均匀。

1.2 主要试剂和仪器

主要试剂：干酪素（国药集团化学试剂有限公司）；l-酪氨酸（上海翔军生物科技有限公司）；福林酚试剂（上海分子免疫生化实验室有限公司）。

主要仪器：yc-w型冷冻恒温振荡器（镇江格瑞生物工程有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；tgl-16m型高速台式冷冻离心机（湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司）；721e型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；dhg-9070型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；sw-cj-2fd型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；alc-114型电子分析天平（北京赛多利仪器有限公司）；ph211c型台式数显酸碱度计（意大利hanna）。 1.3 方法

1.3.1 菌种的分离

化 挑取2环曲精于100 ml无菌生理盐水中，磁力搅拌器搅拌30 min打散孢子，采用稀释平板涂布法对供试菌种进行分离纯化。培养后，挑取生长快、产孢子致密、表面颜色一致的单菌落，移入pda斜面培养基，培养后置于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 孢子悬液的制备 挑取斜面培养基米曲霉gn-2孢子两环，于100 ml无菌生理盐水中，磁力搅拌器搅拌30 min打散孢子，取样置于光学显微镜下，利用血球计数板计数，调整孢子密度约为1×106 个/ml。

1.3.3 发酵条件 取接种孢子悬液2.0 ml于发酵培养基中，30 ℃恒温培养72 h。

发酵培养基配方为麸皮∶黄豆粉=4∶1，加水量为15 ml，装料量15 g。

1.3.4 蛋白酶活力测定 参照文献[8]绘制l-酪氨酸标准曲线并测定中性蛋白酶的活力。酶活力单位定义：40 ℃、ph 7.2条件下，每克米曲霉l min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为1个中性蛋白酶活力单位（u/g）。

1.3.5 发酵条件对米曲霉gn-2产中性蛋白酶的影响

1）发酵时间。发酵培养基接种后，分别在24、36、48、60、72 h取样，测定酶活力。

2）培养基组分。在总量不变前提下，控制发酵培养基中麸皮与黄豆粉的比例分别为1∶4、2∶3、1∶1、3∶2和4∶1，灭菌后接种培养，取样测定酶活力。

3）培养基加水量。发酵培养基中分别加水10、15、20、25、30 ml，其他发酵条件不变，灭菌后接种培养，取样测定酶活力。

4）温度。将接种后的发酵培养基分别置于20、25、30、35、40 ℃培养72 h，取样测定酶活力。

5）接种量。发酵培养基中加水量分别为14.5、14.0、13.5、13.0、12.5 ml，灭菌后分别接入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 ml孢子悬液，培养后取样测定酶活力。

6）培养基起始ph。在发酵培养基中分别加入适量的1 mol/l hcl或naoh溶液，调整后使培养料的ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，灭菌接种后培养，取样测定酶活力。

7）无机盐。以15 ml下列无机盐溶液：0.05% mgso4·7h2o、0.1%k2hpo4、0.2%kno3、0.001%feso4·7h2o和0.02%（nh4）2so4，代替发酵培养基中的去离子水，灭菌接种后培养，取样测定酶活力。

以上各试验每个处理3次重复。

8）发酵条件的正交试验。根据单因素试验筛选结果，选择培养时间、培养基组分（麸皮∶豆粉）、加水量、培养温度4个因素进行发酵条件的正交试验，按照l9（34）设计4因素3水平试验，9个组合，3次重复，优化发酵条件。正交试验因素和水平如表1所示。

1.3.6 粗酶液的制备 准确称取固体发酵样品5 g于25 ml，ph 7.2的0.5 mol/l磷酸缓冲液中，搅拌均匀后于40 ℃恒温振荡锅中，100 r/min浸提30 min。浸提液过滤后所得滤液即为粗酶液，用于后期测定。

1.4 数据处理与分析

采用excel 2003和spss 15.0软件对数据进行单因素方差分析，差异显著性分析采用多重比较法（lsd），数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线的绘制

在波长680 nm处，酪氨酸浓度在10～80 mg/l范围内线性关系良好，其回归方程为y=0.092 9x+0.015 8，r2=0.991 5。标准曲线如图1所示。

2.2 发酵时间对产酶的影响

图2结果表明，在试验时间范围内，米曲霉gn-2菌株产中性蛋白酶活力呈先升高后降低的变化规律。当发酵时间为60 h时，中性蛋白酶酶活力达到最高值，为（244.1±8.93） u/g。之后继续培养，中性蛋白酶活力降低。

2.3 培养基组分对产酶的影响

图3结果表明，发酵培养基中麸皮与黄豆粉的比例对米曲霉gn-2产中性蛋白酶有明显影响。麸皮所占比例越大，米曲霉gn-2产中性蛋白酶的酶活力越高。当麸皮∶黄豆粉=4∶1时，酶活力达到最大值，为（538.6±12.21） u/g。这可能与麸皮原料对米曲霉产中性蛋白酶的诱导作用有关。

2.4 培养基加水量对产酶的影响

由图4可以看出，培养基加水量对米曲霉gn-2产中性蛋白酶有明显影响。在本试验条件下，产酶最适加水量为10 ml，且随着培养基加水量的增加，中性蛋白酶酶活力逐渐下降。可能一方面是由于培养基含水量过高，菌丝体前期徒长，形成孢子的时间延长，使中性蛋白酶产量下降；另一方面，培养基含水量过高致使培养基的透气性下降，氧气供给不足，使菌体生长不良，产酶量也下降。

2.5 温度对产酶的影响

由图5可以看出，温度对米曲

霉的产酶能力有较大的影响。25 ℃以下，菌体生长缓慢，产酶量较少。温度高于30 ℃时，产酶量迅速下降。培养温度为25、30 ℃时，酶活力较高。当培养温度为25 ℃时，酶活力达到最高值，为（635.6±16.31） u/g。当培养温度为40 ℃时，可能由于固体发酵料中心热量不能及时扩散，导致烧曲现象，以至酶活力降到最低点，约为最高值的4.57%。

2.6 接种量对产酶的影响

表2结果表明，接种量可影响米曲霉gn-2产中性蛋白酶的活力。随着接种量的增加，米曲霉产酶能力呈先增强后减弱的趋势；当接种量为2.0 ml时，中性蛋白酶酶活力最高，达到（656.3±16.64） u/g。可能是因为接种量过小时，菌体生长缓慢，发酵迟缓；接种量过大时，则因菌体生长过快导致营养和氧气缺乏，从而影响酶的产生[3]。 2.7 培养基起始ph对产酶的影响

表3结果表明，培养基起始ph对米曲霉产中性蛋白酶有一定影响。随着培养基起始ph的增大，中性蛋白酶酶活力呈先升高后降低的变化趋势；ph 为6.0时，酶活力最高，达到（589.4±15.22） u/g。ph为7.0时，酶活力下降到（461.5±13.85） u/g。当ph为9.0时，酶活力降低到最小值，为（315.9±11.76） u/g。

2.8 无机盐对产酶的影响

由表4可知，无机盐对米曲霉产中性蛋白酶也有影响，mg2+、k+、nh4+对产酶有促进作用，fe2+对产酶有明显的抑制作用。当无机盐为0.02%（nh4）2so4溶液时，中性蛋白酶酶活力最高，达到（859.6±16.34） u/g。

2.9 发酵条件的正交试验结果

在单因素试验的基础上，采用正交试验优化培养基中各组分的配比与培养条件。由表5可知，试验条件下优化水平的最佳组合为a1b3c3d3，米曲霉gn-2产中性蛋白酶的最优培养基配方与培养条件为培养基组分麸皮∶豆粉为4∶1、培养温度25 ℃、加水量20 ml、培养时间72 h。极差分析可知，各因子对酶活力影响大小顺序为培养温度、培养基组分、培养时间、加水量。方差分析（表6）表明，培养温度对产酶量的影响显著，而发酵培养基组分、培养时间以及加水量对产酶量的影响不显著。按照最佳组合试验得到的酶活力为1 016.9 u/g。

3 结论与讨论

单因素试验表明，固体发酵的适合产酶条件为麸皮∶黄豆粉为 4∶1，发酵时间 60 h，培养温度25 ℃，培养基加水量10 ml，接种量2.0 ml孢子悬液，培养基起始ph 6.0，无机盐0.02%（nh4）2so4 1 ml。正交试验结果表明，培养温度为25 ℃、加水量为20 ml、麸皮∶豆粉为4∶1、培养时间为72 h 的组合酶活力最高，达1 016.9 u/g。笔者在后续试验中采用该正交试验的优化条件，进行了3次发酵培养，结果酶活力均值为（993.6±14.62） u/g。说明经过优化，酶活力得到了提高。

中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，也可以通过微生物生产。由于动植物资源受到各种条件的限制，不易扩大生产。而微生物具有生长快、种类多等优点，且微生物易变异，通过菌种改良可以进一步提高酶的产量，改善酶的生产和酶的性质，因此目前工业酶制剂大部分都是通过微生物发酵进行大规模制造的。可以生产蛋白酶的微生物有细菌、放线菌和真菌等。米曲霉可以生产多种酶，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，中性蛋白酶为其中的一种。米曲霉是一种常用的酶制剂生产菌种。本试验主要探讨了多种因素对米曲霉固体发酵产中性蛋白酶的影响，得到的试验结果与前人的研究结果[4，5]基本一致。但是若要应用于生产实践，需要根据具体情况选择合适的条件。

在生产中，若能够提高菌株的产酶能力，则可节约生产成本，获得较大的经济效益。当前，有研究者通过理化因子诱变或者基因工程技术对菌株进行改良处理，筛选得到一些产酶能力较高的菌株。由于诱变具有不定向性，因此这方面的研究有待进一步深入。

参考文献：

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蛋白酶体篇5

[关键词] 唐草片；蛋白质组；CYP450；依非韦伦

[收稿日期] 2014-01-10

[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09303013）；国家自然科学基金面上项目（81271834）

[通信作者] 张丽军，Tel： （021）57036557， E-mail： ；程能能， E-mail：

细胞色素CYP450是一个多功能氧化酶的超家族，为临床70%～80%药物的第一相代谢酶[1]，在药物作用下CYP450酶也发生表达和功能调控等变化[2]。近年来研究发现很多中草药如人参和藜芦等都对CYP450酶有调控作用[3-4]。唐草片是唯一一个被国家食品药品监督管理局（CFDA）批准用于HIV感染者的辅助用药，正被越来越多的患者所使用。但是唐草片成分复杂，其对抗病毒药物的影响令人担忧。因此，研究唐草片和抗病毒药物（如依非韦伦）联合用药时对CYP450蛋白质表达的影响具有重要意义。

研究CYP450酶的方法常为免疫酶联、酶活测定以及PCR等，但是这些方法难以批量研究CYP450酶。近年发展的蛋白质组学方法以其高通量、高灵敏度等特点在CYP450酶研究中得以应用[5]。本研究采用SDS-PAGE分离微粒体蛋白质、切取CYP450酶对应分子量的条带、通过液相色谱串联质谱进行鉴定，采用多反应监测（MRM）方法对鉴定的CYP2C11进行定量分析。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 依非韦伦片剂（规格600 mg/片， 批号S2520） 由Merck公司生产，唐草片（规格400 mg/片，批号090301）由上海百岁行药业有限公司生产。蛋白质组试剂购自通用电气公司[The General Electric （GE） Company （Fort Myers， Florida， USA）]， 乙腈、甲醇和甲酸均为Merck公司（Whitehouse Station， NJ， USA）的色谱纯试剂。其他分析试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 动物处理 10只雄性SD大鼠180～200 g，购自上海市公共卫生临床中心动物中心。所有的大鼠实验通过单位伦理审核且获得上海市公共卫生临床中心的伦理批文，饲养在温度控制的房间里，且保证12 h白天与黑夜交替。所有大鼠自由进食，随机分为2组，每组5只包括单独服用EFV组（命名为EFV）， 同时服用EFV和唐草片（命名为EFV-0T）。EFV和唐草片的用药剂量分别为54，864 mg・kg-1。实验前大鼠被禁食过夜（12 h），单次用药，给药1 h后正常喂水和食物，12 h后使大鼠安乐死，肝脏用于微粒体分离。

1.3 微粒体分离 按照文献报道的方法[5-6]稍作修改后进行微粒体的分离，大鼠安乐死后，剪碎肝组织，用生理盐水反复冲洗去除血液，同时去除结缔组织。然后加入2倍体积的匀浆缓冲液（100 mmol・L-1 Tris-HCl （pH 7.4， 4 ℃）， 0.15 mol・L-1蔗糖， 25 mmol・L-1 KCl， 5 mmol・L-1 MgCl2和20 mmol・L-1蛋白酶抑制剂，用Ultra Turrax T8 （Janke and Kunkel， IKA Labortecnik， Staufen， Germany） 匀浆器匀浆。匀浆液经 2 400 ×g离心10 min去除未破碎的细胞、细胞核和细胞碎片，收集上清；15 000×g，4 ℃离心10 min，收集上清；100 000×g，4 ℃离心60 min，沉淀即为微粒体；用PBS洗涤2次，12 000×g，4 ℃离心 20 min收集沉淀。沉淀储存在-80 ℃冰箱内以便后续实验使用。

1.4 CYP450酶的鉴定 从以上分离的微粒体中提取蛋白质，每只大鼠100 μg微粒体蛋白质用SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝G250染色。按照文献报道的方法[5-6]切取相对分子质量为45， 62 kDa的条带，用胰酶（40 mg・L-1）消化，然后用纳升液相色谱（戴安Ultra 3000，日本）串联质谱（Bruker HCT离子肼质谱，德国）进行鉴定[7]。

1.5 MRM定量CYP450酶 CYP2C11被选做MRM定量，采用HPLC（SHIMADZU HPLC， 日本）串联质谱（Applied Biosystems API3200，美国）进行定量分析[8-10]。合成内标肽（IS） ELNNALQNLARTI （ESAT-6）（该多肽来自结核分泌抗原6 kDa的64～76位氨基酸序列）。用100 μL 2% ACN 和 0.1%甲酸从第2条带提取CYP2C11多肽，且加入10 μL 的 1 mg・L-1内标 （IS），吸取45 μL样品用于质谱分析。Acclaim PepMap C18色谱柱（150 mm×1.0 mm， 5 μm） ，流速为0.06 mL・min-1。色谱梯度为0～12 min，4%～45% ACN（含0.1%甲酸）；12～20 min，45% ACN （含0.1%甲酸）；20～25 min，80% ACN （含0.1%甲酸）和25～50 min，4% ACN（含0.1%甲酸）。 质谱参数为MRM模式，离子源电压5 500 V；CAD 60；DP 50；EP 8 和CE 35。CYP2C11的特征肽通过Expasy blast搜索获得。MRM定量的离子对选自HCT离子肼质谱鉴定的结果，且片断离子的m/z

2 结果

2.1 CYP450酶鉴定 通过差速离心的方法从大鼠肝脏中分离微粒体，用SDS-PAGE分离，见图1。EFV单独处理和EFV与唐草片联合用药组的电泳条带基本一致。切下相对分子质量从42～62 kDa的3条蛋白质带用于质谱鉴定，一共鉴定了16个CYP450同工酶，见表1，包括CYP2B，CYP2C和CYP3A等。人工检查匹配的肽段确证各蛋白质都被准确鉴定。

2.2 CYP2C11定量分析 用于MRM定量的CYP2C11的多肽需满足以下条件： 多肽的mascot 搜索得分超过39；在序列中没有C，M或者NG氨基酸，没有N端的Q或者E；没有胰蛋白酶漏切的位点，也就是说在序列中部没有R或者K；没有已知的糖基化位点；在C-端没有脯氨酸（Pro）如P1和P2；多肽的长度为1～25个氨基酸；通过NCBI 或者Expasy blast搜索确定用于定量的蛋白质特征肽。CYP2C11的1条m/z为711.5的多肽满足以上条件。随后采用三重四极杆质谱API3200扫描母子离子对，扫描到四对能用于准确定量的离子对，见图2。通过比较相对峰面积发现CYP2C11在EFV与唐草片同时服药组中上调了1.6倍（P

3 讨论

大鼠肝脏微粒体酶参与内源物质（类固醇等） 和外源化合物（药物、食品添加剂和环境污染物等） 等的代谢过程，同时其活性易受某些化学药物的诱导作用，从而影响大鼠的代谢，因此开发全面研究CYPP450 酶的方法具有重要的意义。本研究有效富集了肝脏微粒体，采用基于SDS-PAGE的蛋白质组学方法鉴定了16个CYP450酶。该方法比常用的免疫酶联法以及PCR等方法具有更高的通量。

中药成分非常复杂，对CYP450 酶的作用是一种客观存在[4]，本研究发现与EFV单独服药组相比，唐草片与EFV联合用药上调CYP2C11的表达。本研究首次利用蛋白质组学方法研究唐草片对CYP450代谢酶的影响，且利用现代质谱技术准确定量了CYP2C11的表达变化。但是唐草片对CYP2C11调控的作用机制以及其对其他CYP450代谢酶的影响有待深入研究。

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Proteomic study on effect of Tangcao pill on microsome CYP450

ZHANG Li-jun ， JIA Xiao-fang ， YIN Lin， LIU Xiao-qian， SHEN Yin-zhong， LU Hong-zhou， CHENG Neng-neng

（1. College of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 200032， China；

2. Shanghai Public Health Clinical Center， Fudan University， Shanghai 201508， China）

[Abstract] Tangcao pill is commonly applied in adjuvant and even alternative therapy for patients with AIDS. However， the herb contains complex ingredients， but with unknown effect against anti-HIV drug and unknown function. Because CYP450 emzyme is the main metabolic enzymes of the drug， it is of important significance to study the regulation of CYP450 enzymes before and after the combined administration of Tangcao pill and EFV. Proteomics， due to its high throughout and high sensitivity， has been widely applied in CYP450 enzyme study. In this paper， liver microsomes were separated through differential centrifugation. Their proteins were separated through SDS-PAGE. The three protein bands that CYP450 enzymes were located were cut and identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Totally 16 CYP450 isoenzymes were identified. Furthermore， in order to make a quantitative analysis on the effect of tang herb on CYP450 emzyme， the multiple reaction monitoring （MRM） technology based on MS was adopted. The CYP2C11 was selected based on the results of the mass spectrum identification of proteins. The characteristic polypeptides were obtained through searching Expasy blast database. The m/z of the fragment ions was less than 800. In the paper， the m/z of ion pairs of CYP2C11 were 711.5/232.1， 711.5/319.2， 711.5/466.2 and 711.5/595.3， and the m/z of ESAT-6（internal standard，IS） were 735.5/215.3， 735.5/389.3， 735.5/460.3 and 735.5/524.3. The relative peak （analyte/IS） area was adopted for the relative quantitative analysis. Compared with the EFV single administration group， the EFV and Tangcao pill combined administration group showed a 1.6-fold increase in CYP2C11. The results of the paper indicated that Tangcao pill may affect drug metabolism by regulating metabolic enzymes such as CYP2C11， but the specific mechanism still unknown.

蛋白酶体篇6

[关键词] 雄激素受体；磷酸化蛋白激酶B；三阴性乳腺癌；表达

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（b）-0124-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of androgen receptor （AR） and phosphorylated protein kinase B （P-PKB） in triple negative breast cancer. Methods From March 2012 to March 2015， in Central People's Hospital of Huizhou City， 115 patients with breast cancer were selected， among them， 54 cases were triple negative breast cancer， 61 cases were non-triple negative breast cancer. The expression of AR and P-PKB was detected by immunohistochemistry S-P method. The expression of AR， P-PKB， and AR in triple negative breast cancer and triple negative breast cancer tissues were compared， and the relationship between the expression of P-PKB and the clinicopathological parameters were analyzed. Results AR positive expression rate of triple negative breast cancer was significantly lower than non-triple negative breast cancer （P < 0.05）； P-PKB positive expression rate of triple negative breast cancer was significantly higher than non triple negative breast cancer （P < 0.05）； AR expression of triple negative breast cancer tissues had a significantly negative correlation with clinical stage and lymph node metastasis（r = -0.295， -0.311， P < 0.05）； P-PKB expression of triple negative breast cancer tissues had a significantly positive correlation with clinical stage and lymph node metastasis（r = 0.332， 0.329， P < 0.05）. Conclusion AR， P-PKB expression have a great significance in triple negative breast cancer， can be used as an important indicator of prognosis， and they are expected to become new targets in treatment of triple negative breast cancer.

[Key words] Androgen receptor； Phosphorylated protein kinase B； Triple negative breast cancer； Expression

三阴性乳腺癌是指孕激素受体（PR）阴性、雌激素受体（ER）阴性以及人类表皮生长因子受体2（HER2）低表达的乳腺癌，是一种被认为独立的临床病理类型，其占乳腺癌的15%～20%[1]。相比其他类型乳腺癌，三阴性乳腺癌预后性差，肿瘤分级高，且更容易复发[2-3]。靶向治疗及内分泌治疗对三阴性乳腺癌的治疗效果差，目前，放化疗是其主要治疗手段，但是治疗效果仍然不太理想[4]，因此，三阴性乳腺癌临床治疗方案的制订一直是临床医师的重大挑战。雄激素是性激素的一种，雄激素受体（AR）及其配体雄激素在乳腺生物学上及致癌作用上扮演重要角色[5]。蛋白激酶B（PKB）属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种信号转导蛋白，磷酸化蛋白激酶B（P-PKB）即活化的PKB，其在促进细胞异常繁殖分化、促进癌症的发生发展中扮演重要角色[6]。基于以上分析，本研究通过分析三阴乳腺癌患者与非三阴乳腺癌患者及三阴乳腺癌不同分期患者间的AR、P-PKB的表达情况，以探讨AR、P-PKB在三阴性乳腺癌的表达意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年3月～2015年3月惠州市中心人民医院（以下简称“我院”）收治的三阴性乳腺癌患者54例，均经病理学检查以及免疫组化染色确认，以ER、PR阴性及HER2低表达定义为三阴性乳腺癌。所有患者均为女性，年龄30～75岁，平均（52.34±8.93）岁；临床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例；肿瘤≥5 cm 8例，

1.2 纳入标准及排除标准

纳入标准：①有完整的临床资料，包括一般情况、治疗方式、肿瘤大小、病理诊断等；②未行新辅助化疗；③签属知情同意书者。

排除标准：①入院时生命体征不平稳患者；②远处脏器转移者；③携带肝炎病毒患者，或严重肝、肾等脏器功能不全患者；④合并其他恶性肿瘤者；⑤手术禁忌或过敏体质者。

1.3 主要仪器与试剂

石蜡切片机（Thermo Shandon Ltd.，Finesse E型号），显微镜（上海彼爱姆，XSP-BM-2CB型号），离心机（山东博科生产，BK-TDZ5型号），免疫组织修复盒（北京驰明瑞生物科技有限公司，18孔规格），蛋白激酶B多克隆抗体（上海钰博公司，1 mg/mL），雄激素受体（AR）多克隆抗体（上海钰博公司，1 mg/mL），自制PBS缓冲液，自制柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），自制0.3%过氧化氢溶液等。

1.4 检测方法

采用免疫组化S-P法检测AR、P-PKB表达，严格根据试剂盒说明书标准进行操作。对115份包埋肿瘤石蜡块进行连续切片，每张切片厚度为4 μm，置于60℃烤箱中石蜡包埋切片脱蜡（烤箱内放置120 min），切片脱蜡置水，采用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复，将其于过氧化氢溶液（浓度为0.3%）中浸入10 min，阻断内源化过氧化氢酶的活性，然后再采用10%正常血清封闭，放置于室温孵育10 min，滴加雄激素受体（AR）多克隆抗体、蛋白激酶B多克隆抗体，放置于4℃下过夜，滴加生物素标记的二抗，再放置于37℃温箱孵育20 min，再滴加辣根酶标记链霉素的三抗，再放置于37℃温箱孵育20 min，DAB染色。显微镜观察。

1.5 结果观察与判断标准

AR的阳性表达主要依据是细胞核内是否出现染色为棕褐色颗粒沉积。在400倍镜视野下随机选择5个不同视野进行计数，对选定视野中的肿瘤细胞总数和AR阳性肿瘤细胞数进行计数，并计算AR阳性肿瘤细胞百分比，再求5个视野的平均值作为判断的结果，根据文献评价标准[7]，将AR阳性肿瘤细胞百分比分为四个等级，

P-PKB的阳性表达主要依据是细胞质内是否出现染色为棕黄色颗粒分布。在400倍视野下随机选择5个不同视野进行计数，对选定视野中的肿瘤细胞总数和P-PKB阳性肿瘤细胞数进行计数，并计算P-PKB阳性肿瘤细胞百分比，再求5个视野的平均值作为判断的结果，根据文献评价标准[8]，将P-PKB阳性肿瘤细胞百分比分为四个等级，

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0进行数据统计处理，，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。对肿瘤临床分期、淋巴结转移情况与AR和P-PKB的相关性情况采用Spearman相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR和P-PKB在乳腺癌组织中表达

三阴性乳腺癌的AR阳性表达率明显低于非三阴性乳腺癌（P < 0.05）；三阴性乳腺癌的P-PKB阳性表达率明显高于非三阴性乳腺癌（P < 0.05）。见表1。

2.2 三阴性乳腺癌组织中AR表达与临床病理参数相关性

三阴性乳腺癌组织中AR的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著负相关（P < 0.05）。见表2。

2.3 三阴性乳腺癌组织中P-PKB表达与临床病理参数相关性

三阴性乳腺癌组织中P-PKB的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著正相关（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

三阴性乳腺癌是基底细胞样型中的一类乳腺癌，其远处转移率较高，患者容易出现骨转移、内脏转移及脑转移[9-10]，因此，在所有类型的乳腺癌中，三阴性乳腺癌是预后性较差，肿瘤分级较高，最容易复发的一类乳腺癌[11-12]。现阶段，三阴性乳腺癌缺乏有效的治疗手段，靶向治疗及内分泌治疗几乎无效，而放化疗治疗也难以取得十分满意的效果[13-14]。为了寻找三阴性乳腺癌有效的治疗手段，众多学者开始从一些肿瘤细胞分子标志物入手研究了一些新的治疗手段，如表皮生长因子受体抑制剂、抗血管生成抑制等等[15-16]，但是这些新的治疗手段的有效性尚未得到大量临床试验数据的支持。为此，本研究想通过分析AR与P-PKB在三阴乳腺癌患者中的表达情况，来探讨AR与P-PKB在三阴性乳腺癌患者病情发展中的作用机制，以期发现三阴乳腺癌治疗的新靶点。

雄激素是一种性激素，AR是雄激素作用的中介物质，属于细胞核内的X染色体上基因所编码的核受体，根据相关研究显示[17]，AR及其配体雄激素在乳腺癌形成与发展中扮有重要角色。本研究结果发现，54例三阴性乳腺癌患者中AR阳性表达率为48.14%，这也与相关报道一致。研究结果还显示，三阴性乳腺癌患者的AR阳性表达率明显低于非三阴性乳腺癌患者（P < 0.05），这说明在三阴性乳腺癌患者中AR阳性表达率较低，而在Qi等[18]的研究结果中，证实AR的阳性表达与ER和PR表达呈现正相关性，这解释了本研究中三阴性乳腺癌患者中AR阳性表达率较低的原因。目前，ER和PR已经成为公认的判断乳腺癌恶化程度的权威指标，而AR的阳性表达又与ER和PR有一定的关联性，因此，AR的阳性表达也可能作为预后的重要指标。本研究结果显示，三阴性乳腺癌组织中AR的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著负相关（P < 0.05），这说明AR阴性患者肿瘤组织临床分期较高且易于发生淋巴结转移，而AR阳性患者肿瘤组织临床分期较低且不易发生淋巴结转移，这也正好证明了AR的阳性表达可以作为三阴乳腺癌患者的预后的重要指标，究其原因，可能是因为AR在抑制乳腺癌细胞增殖中起到了一定的作用，阻止了乳腺原位癌向浸润性癌的转变。另外，干扰AR信号通路可能对治疗三阴性乳腺癌患者具有一定的积极意义，因此，AR也有可能成为未来治疗三阴性乳腺癌的新靶点。

PKB属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种信号转导蛋白，P-PKB即活化的PKB，其在促进细胞异常繁殖分化、促进癌症的发生发展中扮有重要角色，已有研究显示[19-20]，许多肿瘤的发生与发展与P-PKB的表达密切相关，但是目前还未有关于三阴性乳腺癌患者P-PKB的表达情况的研究[21]。本文研究结果显示，三阴性乳腺癌患者的P-PKB阳性表达率明显高于于非三阴性乳腺癌患者（P < 0.05），说明三阴性乳腺癌具有P-PKB阳性高表达性，而P-PKB阳性高表达性又导致肿瘤组织细胞的繁殖分化，这也决定了三阴性乳腺癌预后性差、肿瘤分级高、易复发等特征。本文的研究结果也在一定程度上证实了以上推论，研究结果显示，阴性乳腺癌组织中P-PKB的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著正相关（P < 0.05），说明P-PKB阳性高表达三阴性乳腺癌患者的肿瘤临床分期较高且易于发生淋巴结转移，而P-PKB阴性及阳性低表达三阴性乳腺癌患者的肿瘤临床分期较低且不易发生淋巴结转移。综合以上分析，三阴性乳腺癌患者中P-PKB表达情况可以作为三阴性乳腺癌患者的一项重要预后指标。另外，P-PKB阳性高表达是由于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/PKB信号通路异常活化引起，PI3K/PKB信号通路的活化又与唯一的抑癌基因PTEN缺失密切相关，而以目前的医疗技术，还无法解决基因缺失引起的疾病，唯一能做到的就是降低PI3K/PKB信号通路的活化状态，降低P-PKB的阳性表达，因此，P-PKB也有望成为治疗三阴性乳腺癌的新靶点。

综上所述，AR、P-PKB在三阴性乳腺癌的表达具有重要的意义，可以作为预后的重要指标，并有望成为未来治疗三阴性乳腺癌的新靶点。

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蛋白酶体篇7

[关键词] 胶质瘤；解聚素-金属蛋白酶17；表皮生长因子受体

[中图分类号] R730 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（a）-0027-04

Expression of ADAM17 and EGFR in human brain glioma and its clinical significance

SHEN Zhaoli XUE Fei SHEN Rui CHEN Xianzhen

Department of Neurosurgery， the 10th People's Hospital Affiliated to Tongji University， Shanghai 200072， China

[Abstract] Objective To explore the expression of ADAM17 and EGFR in human brain gliomas and its clinical signifcance. Methods 38 patients with human brain glioma treated for surgical operation in the 10th People's Hospital Affiliated to Tongji University （"our hospital" for short） from January 2011 to November 2013 were analyzed retrospectively. 15 patients with cerebral trauma treated for surgical operation in our hospital were selected as the control group. SP immunohistochemical method and Western blot were used to examine the expression of ADAM17， EGFR， and the relationship between the expression of ADAM17， EGFR and pathological grading in human brain glioma was analyzed. Results ADAM17 and EGFR expression in human brain glioma were significantly higher than those in the normal controls （P < 0.05）. The expression levels of ADAM17 and EGFR proteins increased with the increased grade of malignancy， and difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion ADAM17 and EGFR are expressed in the human brain glioma. The levels of ADAM17 and EGFR in human brain glioma increased with the rise of tumor grade. The results indicate that ADAM17 and EGFR may play important roles in the occurrence of human brain gliomas， and be related to the malignancy of glioma.

[Key words] Glioma； ADAM17； EGFR

人脑胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤之一，死亡率较高，其发病原因尚不完全清楚。大量研究发现多种细胞因子及基因参与了其发病过程[1]。解聚素-金属蛋白酶17（adisintegrin and metalloproteinase17，ADAM17）是金属蛋白酶解聚素家族成员之一，又称为肿瘤坏死因子转换酶。大量研究资料显示，ADAM17在多种恶性肿瘤中呈高表达状态，且与肿瘤的浸润程度、转移情况密切相关[2]。上皮生长因子受体（epidermalgrowth factor receptor，EGFR）是一种膜受体，具有酪氨酸蛋白激酶活性，与生长因子构成信号通路，被激活后可以传递细胞信号。许多研究已发现，EGFR在多种恶性肿瘤中活性增高，并且与肿瘤的恶性程度密切相关[3]。纵观大量关于ADAM17和EGFR的研究，随着人们对其基础及临床研究的不断深入，其临床应用越来越广泛，在非小细胞肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中表达较高，但与脑胶质瘤关系的相关研究并不多。鉴于其在多种恶性肿瘤组织中高表达的情况，可将其作为许多肿瘤的诊断标志物并判断肿瘤转移和预后情况。本研究通过观察ADAM17和EGFR在人脑胶质瘤组织中的表达特点，为临床应用提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集同济大学附属第十人民医院（以下简称“我院”）2011年1月～2013年11月收治的并行外科手术治疗的人脑胶质瘤患者38例，其中，女20例，男18例，年龄11～85岁，平均（44.26±7.19）岁。纳入标准：所有患者均无其他严重合并症，无代谢性疾病，所有患者术前均行MRI或CT检查，且均为首次行手术治疗，术前未进行过放化疗。根据神经系统肿瘤分级标准来对其进行组织学分级，其中，将Ⅰ级和Ⅱ级人脑胶质瘤患者作为低度恶性胶质瘤组（实验组1），共17例，其中，Ⅰ级8例，Ⅱ级9例；Ⅲ级和Ⅳ级人脑胶质瘤患者作为高度恶性胶质瘤组（实验组2），共19例，其中，Ⅲ级12例，Ⅳ级7例。选择同期在我院行外科手术治疗脑外伤患者15例为对照组，其中，女8例，男7例，年龄13～84岁，平均（42.57±7.14）岁，均经我院病理科检验证实为正常脑组织。本研究经我院伦理委员会通过，患者对本研究知情同意并签署知情同意书。经统计学分析，两组患者的年龄、性别等一般情况比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法 采用S-P法进行ADAM17和EGFR表达检测，步骤按照试剂盒说明书进行操作。PBS代替一抗作为阴性对照。采用已知阳性表达的胶质瘤标本作为阳性对照。镜下观察标本。ADAM17表达显示无阳性细胞数或细胞膜未着色为阴性；细胞膜着色不完整（+），阳性细胞数70%，为强阳性。EGFR蛋白定位于细胞膜和细胞质，阳性结果以胞质内出现棕黄色颗粒为标准，根据阳性细胞率及染色强度按下述标准分级：阴性（-）：随机视野中未发现阳性细胞；弱阳性：胞浆内均匀分布浅棕黄色反应，阳性细胞数50%。

1.2.2 Western blot法 将冻存的脑组织经常规裂解液裂解和均浆后，提取脑细胞总蛋白50 μg，经变性，电泳，转膜，以标准蛋白为参照，封闭后，分别加入抗ADAM17、EGFR一抗（1∶1000 稀释），4℃过夜，冲洗，加入二抗室温震荡孵育1 h，洗涤后，采用化学发光显影定影，并采用影像系统分析数据。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAM17和EGFR免疫组织化学结果

在人脑胶质瘤细胞中ADAM17阳性表达主要在细胞膜和细胞浆，呈黄色、棕黄色或黄褐色。在对照组脑组织细胞中呈微量表达，以弱阳性为主。在实验组1中以阳性表达为主，在实验组2以强阳性表达为主。

EGFR蛋白主要表达在肿瘤细胞胞浆和胞膜，为棕黄色或棕褐色颗粒。在实验组1患者脑组织中着色浅，阳性细胞数少；在实验组2患者脑组织中着色深，阳性细胞数多，分布密集。

2.2 ADAM17和EGFR Western blot结果

与对照组比较，胶质瘤患者脑组织中ADAM17和EGFR含量明显增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。实验组2患者脑组织中ADAM17和EGFR表达较实验组1高，且差异有统计学意义（P < 0.05），见表1。

表1 各组ADAM17和EGFR的表达比较（x±s）

注：与对照组比较，aP < 0.05；与实验组1比较，bP < 0.05；ADAM17：解聚素-金属蛋白酶17；EGFR：上皮生长因子受体

3 讨论

胶质瘤在我国发病率较高，约占所有原发性神经系统肿瘤的60%，具有发病率高、复发率高、病死率高和治愈率低的特点[4]，其病因至今尚未完全明确。据多年来流行病学的调查研究及实验与临床观察显示，可能与家族聚集性及遗传、饮食、吸烟及饮酒、职业暴露和环境致癌物、电磁场、电离辐射、手机、疾病等诸多刺激因素有关。这些因素均可使正常组织或胚胎残留组织受到影响，一方面无限制增殖，另一方面凋亡减少，从而导致肿瘤的发生发展[5-6]。治疗上主要以手术切除为主，目前准确的组织学诊断对指导手术及术后相关治疗具有重要意义。有研究显示，ADAM17和EGFR在肿瘤的发生发展和转移等方面有着重要的影响，因此它在肿瘤的诊断、治疗、远期预后中存在着潜在的价值[7]。

ADAMs（a disintegrin and metalloproteinase）家族有20余种成员，它包含了金属蛋白酶区、富半胱胺氨酸区、去整合素区、跨膜区、胞内区、信号肽区、前调控区、上皮生长因子区。它们参与了生育、黏附、迁移、炎症、肌管形成、蛋白水解、细胞传导以及肿瘤的发生、发展、转移等多种生物学功能。ADAM17是ADAM家族的一种，在蛋白水解、生物活性因子释放、细胞黏附、融合、迁移及信号传递等过程中发挥着重要作用[8]。ADAM17在很多类型的细胞中都有表达，例如胰腺癌细胞、乳腺癌细胞等。目前，许多学者通过进行相关实验证实ADAM17在多种恶性肿瘤中表达呈阳性，且明显高于正常组织或细胞。许多研究运用免疫组化SP法、RT-PCR、Western-blot等方法在mRNA及蛋白水平研究了ADAM17与胶质瘤的关系，发现胶质瘤患者ADAM17表达量与淋巴结转移的数目呈正相关，表明ADAM17与肿瘤进展密切相关[9]。其发生机制可能与ADAM17参与调节细胞使其黏附于相邻细胞和细胞外基质有关。

有学者对脑胶质瘤组织ADAM17的表达进行了大量试验及临床研究，结果显示，ADAM17在脑胶质瘤组织中表达增强，且在高度恶性的胶质瘤中ADAM17的表达较低度恶性胶质瘤中表达明显增强，差异显著，从而提示脑胶质瘤的发生和发展过程与ADAM17有关。同时也有研究证实，ADAM17在胶质瘤中的表达同胶质瘤的恶性程度密切关系[10-11]，与本研究结果相一致。本研究应用免疫组化和Western blot法检测人脑胶质瘤组织ADAM17蛋白的表达情况，结果显示，ADAM17在脑胶质瘤组织中表达增强，且在高度恶性胶质瘤中表达更为强烈。提示ADAM17可能参与胶质瘤的发生和发展过程，与胶质瘤的恶性程度呈正相关。有研究显示，ADAM17具有蛋白剪切酶样的作用，可以调节细胞的增殖、运动能力等，其机制可能为，ADAM17调节细胞使其黏附于相邻细胞及细胞外基质，是肿瘤细胞发生和发展的起始步骤。因此，ADAM17可作为胶质瘤病理分级及判断预后的辅助指标之一[12]。ADAM17的基因结构、生理功能、调节机制及与肿瘤的关系逐渐被人们认识。这为脑胶质瘤抗肿瘤的靶向治疗提供了可靠的依据。

胶质瘤是中枢神经系统的一种原发性肿瘤。有大量资料报道该肿瘤的形成和发展与血管生成、细胞增殖、凋亡、细胞黏附等因素密切相关。在人脑恶性胶质瘤中常常出现扩增、重排、突变和过度表达，借助于信号转导使细胞生长失控和转化[13]。胶质瘤细胞沿着神经纤维的走行或者是沿着血管周围间隙附着在血管内皮细胞的基底膜进行转移，且与肿瘤的恶行程度密切相关。

EGFR是皮生长因子受体家族成员，分子量为170 000，在多种肿瘤组织中有过度表达，如头颈部鳞状细胞癌、消化系统恶性肿瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾脏、前列腺和子宫颈癌以及神经胶质瘤等。EGFR具有酪氨酸激酶活性的膜表面受体，活性与各种肿瘤发生发育过程密切相关，包括破坏细胞周期，抑制血管生成、发展，影响肿瘤细胞凋亡、迁徙和转移等。EGFR与配体结合后发生自身磷酸化，从而激活体内下游多种细胞信号蛋白，促进细胞的分裂和增殖，而在肿瘤中则可促进肿瘤细胞的增殖、黏附、新生血管形成、侵袭与转移，抑制肿瘤细胞的凋亡。早在1985年有学者报道EGFR在人胶质瘤中的表达，其活化是多种肿瘤增长的重要信号之一，并证实与肿瘤恶性程度有关[14]。在肿瘤细胞发生和发展过程中，EGFR发挥着重要调节作用，其信号转导途径异常可促进肿瘤细胞生长[15]。有实验表明，EGFR是胶质瘤分化程度的重要标志，阳性表达程度与胶质瘤的恶性度密切相关，并呈正相关。EGFR作为一种生物学指标，是判断肿瘤预后的重要参数之一。也有研究显示，EGFR在肿瘤细胞膜信息转换中起着重要作用，EGFR的过度表达不断刺激细胞分裂增殖，最终导致肿瘤的发生。曾有研究结果提示肿瘤细胞胞浆内和新生血管旁EGFR均有高度表达。有学者对血管内皮生长因子（VEGF）结合位点进行了相关研究，表明VEGF可以通过旁分泌方式作用于肿瘤旁血管内皮细胞膜上的靶受体，从而发挥作用，因此揭示VEGF是也一种重要的旁分泌血管生长因子。关于EGFR与胶质瘤细胞凋亡的相关性报道较少。有研究证实，EGFR在胶质瘤中常常过度表达，且其过表达和患者恶性预后相关。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的表达增高或表达异常。EGFR与肿瘤细胞的发生发展密切有关，其可能机制为EGFR的表达异常引起下游信号传导的增强[10]。有研究表明EGFR在胶质瘤中的表达率可达25%～50%，并且有EGFR基因的扩增。国外文献报道应用EGFR基因单克隆抗体治疗脑胶质瘤有一定的效果。胶质瘤在实验室中已取得很好的疗效。本研究采用免疫组化法及Western blot法检测EGFR在胶质瘤中的表达，结果发现，EGFR在胶质瘤中的表达明显高于对照组，且在高级别胶质瘤中表达显著高于低级别胶质瘤，提示其表达阳性率和强度与人脑胶质瘤恶性程度密切相关。

随着对ADAM17和EGFR在脑胶质瘤侵袭转移过程中作用机制的逐步深入研究，其在胶质瘤的治疗中所具有的潜在价值逐渐突显，可考虑将其作为抗癌药物设计的靶点。

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蛋白酶体篇8

于N组（P

PTPN2的表达减少可能导致NF-κB表达增强而加重牙周组织破坏。

[关键词] 糖尿病； 牙周炎； 非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2； 核因子-κB

[中图分类号] R 781.4 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.009

有研究[1]显示：糖尿病患者罹患牙周炎时，其炎症反应较非糖尿病患者严重，进展迅速，易造成明显的牙周组织破坏。如何有效地预防和治疗糖尿病患者的牙周炎，是目前临床工作中的难点之一。患牙周炎时，过度的炎症反应是造成牙槽骨等牙周组织损害的重要原因之一。侵入牙周组织的细菌能激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途径，导致多种炎性细胞的活化和炎症因子的过表达，促进炎症的发生发展，最终导致牙周组织破坏[2]。有研究[3]表明：非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2，PTPN2）在免疫、炎症反应的信号转导中具有重要的调节作用，其表达水平降低与一些免疫、炎症性疾病的发生发展密切相关。在糖尿病牙周炎条件下，牙周组织中PTPN2和NF-κB的表达与牙周组织破坏有何种关系，国内外的研究还较少。本文通过观察实验性糖尿病牙周炎小鼠模型牙周组织中PTPN2、NF-κB的表达与牙周组织破坏的关系，探讨PTPN2、NF-κB蛋白在糖尿病牙周炎中参与牙周组织损害的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验试剂和仪器

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自美国Sigma公司；PTPN2兔抗多克隆抗体（Biotech公司，美国），NF-κB鼠抗单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；

SP试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技

术有限公司）；体视显微镜（Olympus公司，日本），

Nikon 80i型显微镜（Nikon公司，日本），2035型切

片机（Leica公司，德国）。

1.2 动物分组及牙周炎小鼠模型的构建

4周龄16～18 g的健康雄性C57BL/6J小鼠18只（四川大学动物中心提供），随机分为3组：正常对照组（N组）、单纯牙周炎组（P组）及糖尿病牙周炎组（DP组），每组6只。N组按无特定病原体（specific patho-

gen free，SPF）级动物常规饲养，不做任何处理。DP组喂饲高脂高糖食物，并按55 mg·kg-1腹腔注射STZ，每天1次，连续注射5 d；末次注射1周后检测血糖，若血糖≥16.65 mmol·L-1确认糖尿病动物模型建立成功[4]。确认建模成功1周后，各组小鼠均给予正常饮食。P、DP组在1%戊巴比妥钠麻醉下通过口内涂布的方

式接种牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，

P.gingivalis）建立牙周炎模型。P. gingivalis的密度为

1×109 CFU·mL-1，接种0.05 mL，连续接种5次，隔日接种。接种菌液由保存菌种P. gingivalis ATCC 33277活化增菌后，挑取平板上活的单个菌落，用加入2%羟甲基纤维素的无菌PBS配成密度为1×109 CFU·mL-1的

菌悬液。接种时在小鼠每个后牙的龈沟内涂布菌液。末次接种4周后处死各组小鼠（处死动物前再次检测血糖确定DP组小鼠血糖值≥16.65 mmol·L-1），取上下颌组织进行观察；将上颌组织进行常规固定、脱钙、石蜡包埋，制作切片；分离下颌软组织，洗净下颌骨，干燥备用。

1.3 体视显微镜观察后牙牙槽骨的附着丧失面积

取各组小鼠下颌骨进行体视显微镜检查，在放大15倍情况下计算全部后牙牙槽骨的附着丧失面积，即所有后牙牙槽嵴顶到釉牙骨质界之间的面积。

1.4 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察

牙周附着丧失的高度

取上颌组织沿第二磨牙颊舌向连续切片，HE染色，镜下观察牙周组织病损情况，计算第二磨牙颊、舌侧牙周组织附着丧失高度（即牙周袋底部至釉牙骨

质界之间的高度）并取均值作为该牙的附着丧失高度。

1.5 免疫组织化学染色观察PTPN2和NF-κB的表达

取上颌组织切片进行免疫组织化学SP法染色，PTPN2兔抗多克隆抗体（1∶100）、NF-κB鼠抗单克隆抗体（1∶100）为一抗，PBS代替一抗作为空白对照。

PTPN2、NF-κB阳性信号为细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒。每个标本选取具有较明显牙周炎病理表现的3张切片，每张切片在100倍视野下选取着色最强的区域，换至400倍光镜下随机选取5个视野拍摄

照片，应用Image Pro-plus图像分析软件测量每张切片的平均光密度值（average optical density，AOD）。

1.6 统计学分析

所得数据经SPSS 13.0软件进行处理，结果用x±s表示，组间差异采用完全随机设计单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 体视显微镜观察结果

体视显微镜下，下颌后牙牙槽骨附着丧失面积的测量结果见表1，其形态学变化见图1。

由表1可见：N组的附着丧失面积低于P和DP组，其差异有统计学意义（P0.05）。由图1可见：N组牙槽骨形态较正常，未出现明显骨吸收（图1A）；P、DP组可见牙槽嵴顶高度降低，牙槽骨表面有骨吸收陷窝，根分叉暴露（图1B、C）。

2.2 HE染色结果

采用HE染色观察上颌牙槽骨的形态学变化见图2，其附着丧失高度的测量结果见表1。由图2可见：

N组附着丧失很少（图2A）；P、DP组有牙周袋形成，上皮钉突增生成网状，牙周组织中有慢性炎细胞浸润（图2B、C）。由表1可见：N组的附着丧失高度小

于P和DP组（P0.05）。

2.3 免疫组织化学染色结果

3组的免疫组织化学染色情况见图3，其AOD测量结果见表1：PTPN2蛋白在正常牙龈上皮细胞、牙周结缔组织细胞的细胞质与细胞核中均有表达，在N组的表达强度高于P组及DP组（P

DP组表达的差异无统计学意义（P>0.05）；NF-κB表达于牙周组织细胞的细胞质与细胞核中，在N组的表达强度明显低于P组及DP组（P0.05）。

3 讨论

牙周炎是主要的口腔疾病之一，在糖尿病患者中具有较高的发病率，是糖尿病的第六大并发症。因其常导致严重的附着丧失与骨吸收，极大地影响患者的生活质量，所以糖尿病牙周炎的发生发展机制及防治手段在牙周疾病研究中倍受关注。

患有糖尿病时，宿主对病原微生物产生的过度炎症反应是造成牙周组织破坏的重要原因。作为一种真核细胞转录因子，NF-κB的激活与多种炎症性疾病密切相关。在正常生理情况下，NF-κB常与其抑制蛋白（inhibitor κB，I-κB）家族成员结合，以无活性复合物的形式存在于细胞中；当病原微生物及其产物如内毒素等细胞外信号作用于细胞时，可激活相应受体将信号传导入细胞内，使I-κB磷酸化并与NF-κB解离，导致NF-κB进入细胞核内与特异的DNA序列结合，调节靶基因转录和表达，促进炎症的发生发展[5]。有学者[6]发现：牙周炎患者牙周组织

细胞的细胞核及细胞质中NF-κB的激活率远高于正常组织；在另外的研究[7-8]中发现：牙周致病菌P. gin-

givalis侵入牙龈上皮细胞时会激活NF-κB途径，引起白细胞介素等炎症因子的生成增加，并可趋化中性粒细胞等炎细胞到感染部位，引发炎症反应。此外，NF-κB可抑制中性粒细胞等炎细胞的正常凋亡，使其死亡从而崩解释放多种破坏牙周组织的酶，增强炎症反应[2]。已有研究[9]发现：NF-κB与糖尿病状态

下的炎症损伤调节有重要的关系，降低NF-κB的水平可有效改善糖尿病患者神经系统的炎性病变。本实验结果显示：与正常对照组相比，糖尿病牙周炎小鼠的牙周组织有明显的附着丧失，出现牙周袋及炎细胞浸润，且NF-κB表达增强。其可能机制为细菌感染牙周组织时，牙龈成纤维细胞、巨噬细胞等细胞的NF-κB途径被激活，引起白细胞介素、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症因子释放，趋化并活化炎症细胞，释放更多的炎性介质，致使炎症反应加剧并加重组织损伤，如诱导结缔组织间质细胞产生基质金属蛋白酶使间质中的胶原降解，刺激基质细胞凋亡限制牙周组织修复，促进破骨细胞分化及骨吸收等[10-11]。有学者[12]发现，在糖尿病条件下，巨噬细胞、中性粒细胞等细胞对细菌释放的内毒素的反应更为敏感，能释放更多的炎症因子，并使炎症反应延长，这能促进糖尿病并发的炎症反应出现严重的破坏且进展迅速。本实验中，DP组小鼠的牙周附着丧失量、NF-κB表达量的测量值与P组的差异无统计学意义，可以考虑在下一步实验中采用Micro CT、实时荧光聚合酶链反应、免疫印迹法等灵敏度更高的方法进一步检测组间的差异。

PTPN2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的重要成员，有两种mRNA编辑方式：一种编码形成相对分子质量为4.8×104的蛋白质，称为TC48，定位于内质网和高尔基复合体；另一种编码形成相对分子质量为4.5×104的蛋白质，称为TC45，定位在细胞核内[3]。TC45发

挥主要的生物学作用，当细胞受到刺激后，TC45游离出细胞核，使细胞质内的蛋白质，如表皮生长因子受体、蛋白酪氨酸激酶（Janus kinase，JAK）、信号转导与转录激活因子（signal transducer and activator of

transcription，STAT）等去磷酸化，抑制下游信号通路的转导，调节炎症和免疫反应[3]。在敲除PTPN2的动

物模型体内，血清中肿瘤坏死因子等炎症介质的水平升高，并出现广泛而严重的炎症性疾病[13]。本实

验发现，DP组和P组小鼠的牙周组织中出现明显的组织破坏及炎症反应，同时PTPN2的表达低于N组，提示PTPN2的表达水平下降可能是造成牙周炎症反应加剧及组织损伤的原因之一。可能机制是PTPN2能抑制巨噬细胞产生TNF-α，并与肿瘤坏死因子受体相关因子-2相互作用，抑制TNF-α介导的炎症反应；它能使集落刺激因子-1受体及Src酪氨酸激酶去磷酸化，进而调节Erk信号转导通路，抑制单核细胞的增殖、分化与炎性反应；它可降低JAK的酪氨酸磷酸化程度，并可使STAT上的酪氨酸去磷酸化以调节STAT的活性，进一步下调JAK/STAT信号通路的传导，从而抑制干扰素-γ、白细胞介素-6介导的基因表达与炎症反应，减少组织损害[14-15]，而PTPN2表达减少时，这些作用减弱，可以加速牙周组织的破坏。

本实验显示，与正常小鼠相比，糖尿病牙周炎

与单纯牙周炎小鼠的牙周组织中PTPN2表达减少，

同时NF-κB表达增高，提示PTPN2可能通过调节NF-κB的表达影响牙周炎的进程，其机制可能是PTPN2表达下降，抑制巨噬细胞分泌TNF-α以及抑制TNF-α介导的炎症反应作用减弱，而TNF-α可以促使中性粒细胞活化并释放活性氧，使I-κB磷酸化并激活NF-κB信号转导通路，进而加重炎症反应及组织破坏[16]。

综上所述，本实验观察到糖尿病牙周炎时牙周组织中NF-κB表达增强，PTPN2表达减弱，提示在糖尿病牙周炎的发生发展过程中，NF-κB可能有促进作用，PTPN2可能有抑制作用，且PTPN2的表达水平下降可能导致NF-κB表达增多而加重牙周组织的破坏。了解这些因子相互作用的机制及其与牙周破坏之间的关系，有助于为今后寻找糖尿病牙周炎的防治措施提供新思路。

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蛋白酶体篇9

1半月光氨酸蛋白酶

1.1蛋白酶蛋白酶是具有生物活性的大分子物质，是各种寄生虫的重要组成成分。蛋白酶可以大致分为外肤酶和内肤酶两组。前者具有选择性裂解竣基末端和氨基末端的能力，后者则专门裂解多肤的内链。蛋白酶还可以根据其催化活性位点的化学组成成分进一步细分为五种类型:半胱氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和金属蛋白酶。这些不同的催化活性位点在蛋白质裂解的过程中起到重要作用。

1.2寄生虫半胱氨酸蛋白酶寄生虫半胱氨酸蛋白酶分为CA,CD两大主族，这两大族仍可细分为不同的家族，很多重要的寄生虫蛋白酶属于CA主族下的C1,C2家族，且全都为分泌型或胞内作用型。属于C1家族的酶可以细分为三个亚族:博来霉素水解酶,样组织蛋白酶,B样组织蛋白酶。拥有钙结合域的钙蛋白酶则属于C2家族。存在于溶酶体状隔间中的豆荚样蛋白酶属于CD主族。

编码寄生虫半胱氨酸蛋白酶的基因广泛存在于各种寄生虫中，在寄生虫的生活史中是极为重要的物质。比如虫体对营养的摄取，在宿主体内的移行，生殖发育，参与逃避宿主的免疫监视，对细胞的浸润与毒力，脱包囊，虫卵的孵化与蜕皮等过程均与该酶有重要关系。其中最主要的功能之一是通过影响Th1或Th2型应答来调节宿主的免疫应答从而使宿主无法有效驱逐入侵机体的寄生虫，从而达到免疫逃避的目的。因此该酶将决定寄生虫能否长期寄生于宿主体内。

1.3寄生虫半胱氨酸蛋白酶的免疫原性与免疫逃避机制寄生虫分泌的半胱氨酸蛋白酶对于宿主来说是一种具有很强免疫原性的异己物质。成熟的肝片吸虫拥有两种半胱氨酸蛋白酶,通过免疫分析发现这两种酶是免疫优势抗原具有较高的敏感性与特异性。大片吸虫分泌的半胱氨酸蛋白酶具有很强的免疫原性，是抗寄生虫感染的潜在保护性抗原。曼氏迭宫绦虫裂头蝴的半胱氨酸蛋白酶能够引起宿主特异性抗体反应。屋尘瞒排泄物中的半胱氨酸蛋白酶家族)是一种常见的过敏原。有报道称在感染了血吸虫的成年人肠道中得到的两种半胱氨酸蛋白酶与其他哺乳动物宿主血清发生了特异性抗体反应。以上实例说明了半胱氨酸蛋白酶具有一定的免疫原性，可用于疫苗的构建与诊断。

肝片吸虫分泌的一种被命名为样组织蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶家族)能有效作用于宿主的I型胶原蛋白、层粘连蛋白、以及免疫球蛋白等底物，该酶可水解粘连蛋白，并将宿主的免疫球蛋白裂解为片段，因此降低了宿主嗜酸性粒细胞的粘附能力与巨噬细胞对寄生虫的免疫作用。另外该虫利用诱导后的半胱氨酸蛋白酶对细胞表面CD4进行切割，使得肝片吸虫用抑制了淋巴细胞的增殖，抑制了宿主的Th1型反应，实现免疫逃避。溶组织阿米巴分泌的半胱氨酸蛋白酶的高效底物是抗体，是该虫免疫逃避机制中最重要的因素。同样，肥头绦虫分泌的半胱氨酸蛋白酶也可以降解宿主的抗体。一些寄生虫分泌的半胱氨酸蛋白酶也可以诱导白介素4参与抑制宿主的Th1型免疫应答，降低了宿主对寄生虫的免疫能力。以上表明寄生虫蛋白酶具有降解抗体和调节细胞免疫应答的功能，进而通过这种机制阻止宿主对寄生虫的免疫反应。有报道称半胱氨酸蛋白酶还可协助虫体进行新陈代谢、生长发育、组织皮层的更新等，以此确保抗原的不断变化帮助虫体逃避宿主的免疫监视。由于半胱氨酸蛋白酶拥有以上性质，因此使寄生虫获得免疫逃避能力。由于重组半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗不仅可诱导机体产生Th1型细胞免疫应答，还可以刺激机体的体液免疫应答，持续产生特异性抗体，与半胱氨酸蛋白酶形成紧密复合物，封闭了酶的活性中心而影响其本身的催化活性来抑制该酶的作用。基于核酸疫苗的这种特性，人们便可实现对寄生虫感染的有效防护。

2一些寄生虫半肤氨酸蛋白酶核酸疫苗研究进展

对寄生虫半胱氨酸蛋白酶研究的深人揭示出该酶对于免疫防治具有重要价值。无论是从生物学特性还是从化学性质上来看，半胱氨酸蛋白酶都具备作为化学治疗靶物质的特点，通过抑制该酶的活性便可以达到阻断寄生虫入侵、繁殖、营养等诸多重要生理环节。采用核酸疫苗使宿主能够产生针对该酶的特异性抗体进而实现对寄生虫的防治是一种新颖而巧妙的方法，目前已经有相关基因与蛋白酶的研究，但多数停留在试验阶段，有待于进一步发展。

2.1变形虫可引起人类肠炎与腹泻，使易感性小鼠与抗性小鼠分别产生Th2与Th1型免疫反应。何光志等人使用半胱氨酸蛋白酶基因( EhCP112)制成抗溶组织阿米巴重组疫苗接种仔猪后，发现对宿主产生了显著的保护性。这种半胱氨酸蛋白酶是溶组织阿米巴感染细胞和造成组织损伤时的重要物质。虽然接种核酸疫苗后的宿主并没有产生显著的抗体反应，但却使宿主得到了很强的免疫保护，这表明在寄生虫感染时细胞免疫具有很重要的地位。因此针对细胞免疫设计特异性表达的核酸疫苗来治疗感染将会事半功倍。

2.2鞭毛虫半胱氨酸蛋白酶基因和制成的抗利士曼原虫重组蛋白与重组质粒在小鼠体内进行了实验，结果发现可以给予宿主部分保护能力，并使Th2型应答转变为Th1型应答。但是CPA和CPB基因单独接种并不能产生保护力，只有联合接种才能产生效果。应用墨西哥利士曼原虫的CPB基因、金属蛋白酶基因、同源蛋白激酶受体基因和亚马逊属膜糖蛋白基因(GP64)制成一种复合核酸疫苗，也获得与上述相似的结果鲤隐鞭虫金属蛋白酶与半胱氨酸蛋白酶重组核酸疫苗接种鲤鱼后，发现前者增强了鲤鱼的保护力，而后者则诱发宿主的易感性。这说明半胱氨酸蛋白酶对于宿主的免疫影响具有多物质协同性，如果抑制其中任何相关元素都可能导致寄生虫毒力的减弱甚至消失。因此构建核酸疫苗的同时需要考虑相关协同物质的表达。

2.3吸虫小鼠接种了肝片吸虫样半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗后，体内虫卵的数量明显减少。斯普拉一道来氏大鼠接种了华支肇吸虫半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗后呈现出显著的保护性。小鼠感染曼氏血吸虫45d后接种该虫天冬酞胺转肤酶(SM32)核酸疫苗，并没有明显降低宿主体内的虫体数量，但是却发现可以降低虫体的繁殖能力，其中钙蛋白酶大亚基sm-p80蛋白疫苗为小鼠提供了39%的保护力，配合佐剂使用后保护力提升到44%并使宿主体内虫卵含量降低了29%-39%。最近研究表明编码sm-p80基因的重组核酸疫苗能降低宿主体内59%的虫体含量和84%的虫卵含量。这些结果揭示了不同类型的半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗对宿主均能产生一定的保护性，然而高效的核酸疫苗仍然需要佐剂的配合，筛选更具有保护性的基因与佐剂将成为热点。

2.4粘抱子虫碘泡虫属的脑粘体虫分泌一种具有很强免疫原性的半胱氨酸蛋白酶，基因诱导虫体表达一种样组织半胱氨酸蛋白酶，该酶可引起鱼类患婆婴病。通过实时荧光定量PCR检测发现在感染鱼的体内各种组织均有该酶的表达，并通过免疫学分析发现阻止该酶的表达可以缓解病程，这为鱼类抗粘抱子虫核酸疫苗的研制提供实验基础。

综上所述，前人实验结果均充分表明了半胱氨酸蛋白酶是寄生虫寄生机制的重要组成成份，也是其毒力的主要影响因素。由于该酶对宿主的毒性常具有多物质协同性，通过人工方法干扰该酶的活性或抑制相关物质的分泌都可以影响寄生虫的生存，因此构建经过优化的核酸疫苗通过主动免疫宿主调节其Th免疫应答类型，使宿主获得较强的保护性，证明了半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗应用的可行性。

蛋白酶体篇10

钙蛋白酶是一种胞内Ca2+依赖性的、水解半胱氨酸的蛋白酶家族[12]，通过特异性蛋白水解酶作用调节多种酶和蛋白质的功能，包括信号传导分子和细胞骨架蛋白等，在细胞活动、信号传导、稳定细胞骨架结构等方面发挥作用。钙蛋白酶在神经系统广泛分布，阿尔茨海默病(AD)是一种慢性进行性神经系统退行性疾病，临床特点为进行性痴呆，表现为智力、记忆力、定向力、推理和判断能力等不可逆性退化;主要病理改变为大量的β淀粉样蛋白(βamyloid protein，Aβ)沉积形成的神经炎性斑块、过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)以及选择性的神经元丧失。近期研究表明，钙蛋白酶功能失调可能在AD的发病过程中发挥重要作用。笔者就钙蛋白酶的结构、活性调节以及在AD的NFT和Aβ病理形成中的作用做一综述。

1钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的结构

1.1钙蛋白酶的结构至今已证实钙蛋白酶家族成员有14个[3]。钙蛋白酶Ⅰ和钙蛋白酶Ⅱ是研究最多的2类钙蛋白酶超家族成员，它们的区别主要在于体外激活时所需Ca2+浓度不同，后者在纯化状态下，需要毫摩尔浓度Ca2+才有最佳活性，而前者在微摩尔浓度Ca2+即可有最佳活性。钙蛋白酶由1个大亚基(80 kD)和1个小亚基(30 kD)组成异二聚体。大亚基有4个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ):结构域Ⅰ位于N末端，Ca2+与酶结合后，结构域Ⅰ可发生自我水解，引起蛋白酶构象改变;结构域Ⅱ是蛋白酶活性区，有木瓜蛋白酶样的结构，由Cys105、His262、Asn286 3个氨基酸残基组成酶的活性中心;结构域Ⅲ是抑制蛋白或激活蛋白结合的部位;结构域Ⅳ是Ca2+结合的部位。小亚基有2个结构域，结构域Ⅰ富含甘氨酸和疏水氨基酸，是酶与细胞膜结合的部位;结构域Ⅱ与大亚基结构域Ⅳ结构相似，也含有Ca2+结合位点。

1.2钙蛋白酶抑制蛋白的结构钙蛋白酶抑制蛋白是一特异性内源性抑制剂蛋白，与钙蛋白酶共存，构成钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白系统，起负性调节作用。典型的钙蛋白酶抑制蛋白分子有5个结构域，Ⅰ区为氨基末端，Ⅱ~Ⅴ区均含有同源性序列ThrIleProProXTyrArg(X代表任何一种氨基酸)，是对钙蛋白酶起抑制作用的关键部位，为抑制区。

2钙蛋白酶活性的调节

钙蛋白酶以一种无活性的酶原形式存在，构成酶活性中心的氨基酸残基(cys105，his262，asn286)彼此分离，无法形成酶活性中心，蛋白酶的激活需要通过构象的改变，使残基相互接近形成酶活性中心。

2.1钙蛋白酶的激活钙蛋白酶活性受到严格调控，其中Ca2+的作用最为重要。细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高使钙蛋白酶大亚基结构域Ⅰ自我水解，构象改变，形成酶活性中心，表现出蛋白酶活性[45]。

钙蛋白酶在膜上的定位也是调节其活性的重要机制，早期研究认为，钙蛋白酶一旦与质膜结合，即可由非活性状态转变成活性状态，然而其他研究表明，钙蛋白酶Ⅰ与钙蛋白酶Ⅱ在自我水解前即有活性。通过与膜相互作用使钙蛋白酶在膜上被活化，钙蛋白酶即进入胞质并能抵御钙蛋白酶抑制蛋白的抑制作用。活化的钙蛋白酶可在膜上或胞质降解底物蛋白[68]。

钙蛋白酶自我水解所需的Ca2+浓度与表现酶蛋白水解活性所需要的Ca2+浓度相近却比活细胞中[Ca2+]i水平要高得多。如何启动激活钙蛋白酶？解决矛盾的办法在于发现了磷脂的存在。在磷脂酰肌醇存在情况下，激活钙蛋白酶所需的Ca2+浓度大为降低。

2.2钙蛋白酶的磷酸化调节研究表明，钙蛋白酶序列内含有许多磷酸化作用位点，钙蛋白酶Ⅰ有9个磷酸化位点，钙蛋白酶Ⅱ有8个磷酸化位点，这些磷酸化位点均位于80 kD亚基上[9]，并主要集中于两个区域:结构域Ⅰ和Ⅱ结合处(Ⅱa)及结构域Ⅱ氨基末端(Ⅱb)。上皮生长因子(EGF)刺激细胞通过Erk/MAP激酶信号通路来激活钙蛋白酶[10]，通过上皮生长因子信号通路激活的钙蛋白酶又可被蛋白激酶A的磷酸化作用所抑制[1112]。

2.3钙蛋白酶活化蛋白与活性的负调节1987年Pontremoli报道，isovalerylcarnitine可降低钙蛋白酶Ⅱ发挥最大催化活性所需的Ca2+浓度，同时可使其活性增加1.5倍，但不降低钙蛋白酶Ⅰ发挥最大催化活性所需的Ca2+浓度或者增加活性。此后Melloni等从小鼠的骨骼肌细胞中分离得到一也具有相似作用的热稳定多肽calpain activator。此后研究表明calpain activator是相对分子质量30 kD的二聚体，其氨基酸顺序及功能均与羊肝脏蛋白UK114一样。

钙蛋白酶抑制蛋白可识别钙蛋白酶与钙结合形成的构象变化，并与之特异结合。当钙蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在，后者将与钙蛋白酶特异结合而抑制其活性，从而保证钙蛋白酶对底物只进行特定部位的水解。钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶的结合需要Ca2+，并且这种结合是可逆的，即在无钙离子时重新分离。

3钙蛋白酶与AD

AD的病因、病理非常复杂，涉及遗传、环境，生物、物理、化学等诸因素，因而迄今为止，其发病机制仍不清楚，钙平衡紊乱是发病机制的重要假说之一[1314]。

3.1钙蛋白酶的激活促进细胞骨架的瓦解和NFT的形成在AD发病早期，与钙平衡紊乱相关的钙蛋白酶系统就已被激活，在轴突丧失、神经元退化以及tau蛋白异常磷酸化出现之前，特定区域的钙蛋白酶的活性就已升高。此外，在AD病人的脑组织中观察到活性形式的钙蛋白酶就位于NFT和神经毡丝处[15]，因此在AD中钙蛋白酶早期活化很可能促成了细胞骨架的裂解和神经纤维缠结的形成。

3.1.1钙蛋白酶的激活直接参与微管相关蛋白的降解微管相关蛋白在神经元细胞骨架中通过与微管蛋白的相互作用，影响微管的聚合、稳定以及微管的动力学特性，微管相关蛋白(microtubuleassociated proteins，MAP)依据相对分子质量的大小划分为:高相对分子质量蛋白MAP1A、MAP1B、MAP2a和MAP2b，中相对分子质量蛋白MAP2c和tau。MAP2、tau都是钙蛋白酶的特异性底物。Fifre等在原代培养皮层神经元中加入Aβ证实了活化的钙蛋白酶可以降解MAP2a、MAP2b、MAP2c[15]。Fang等分别用不同浓度CaCl2溶液孵育Wistar大鼠脑皮质匀浆液，并用蛋白质印迹和定量图像分析技术检测不同亚型钙蛋白酶对tau蛋白的降解作用，发现一定浓度的Ca2+可同时激活钙蛋白酶Ⅰ和钙蛋白酶Ⅱ，这两种亚型钙蛋白酶均参与降解tau蛋白，但钙蛋白酶Ⅱ的作用比钙蛋白酶Ⅰ更强[16]。

3.1.2钙蛋白酶的激活与细胞骨架的过度磷酸化NFT是AD特征性的病变之一，其主要成分是双螺旋丝(paired helical filaments，PHF)，而过度磷酸化的tau蛋白是PHF的主要亚单位，活化的钙蛋白酶可以通过调节激酶活性或者信号传导通路引起tau、NF(neurofilaments)等细胞骨架蛋白的过度磷酸化。过度磷酸化的tau蛋白无法结合微管蛋白，从而阻断微管蛋白的组装，抑制微管聚集，使微管解体及细胞骨架破坏。同时过度磷酸化的tau蛋白对钙蛋白酶的水解具有高度的拮抗能力。福建医科大学学报2007年5月第41卷第3期林智颖等：钙蛋白酶与阿尔茨海默病关系的研究进展

钙蛋白酶通过tau蛋白激酶Ⅱ(tau protein kinaseⅡ，TPKⅡ)/细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase5，CDK5)途径使tau蛋白过度磷酸化。TPKⅡ/CDK5是脯氨酸依赖性的丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，调节亚基非周期素蛋白p35是其特异的激动剂。在兴奋性刺激(如脑缺血、H2O2、兴奋性氨基酸)、Aβ、自由基、氧化应激及其他应激刺激下，经过钙蛋白酶作用，p35能在羧基末端第208位裂解成p25和另一大小为10 kD片段，p25具备激活CDK5的功能。由于p25/CDK5缺乏膜锚定信号基序，致使p25/CDK5在细胞内定位发生改变，持续性地磷酸化其适宜底物，引发病理性改变[1719]。

此外，钙蛋白酶可以通过Erk/MAPK途径使细胞骨架蛋白过度磷酸化。Veeranna发现在原代培养的海马和小脑颗粒神经元中，Ca2+内流活化了钙蛋白酶和Erk1、2并使NF磷酸化增加，抑制Erk1、2活性或特异性地抑制它上游激酶MEK1、2可明显地减少NF的磷酸化[20]。用钙蛋白酶的抑制剂calpeptin可阻断Erk1、2活化和NF的过度磷酸化，由此可以证明钙蛋白酶是Erk1、2通路的上游激动剂并很可能部分介导了NF和tau蛋白的磷酸化。

3.2钙蛋白酶与Aβ的沉积Aβ在脑内沉积形成神经炎性斑块是AD的病理特征之一。Aβ是由β淀粉样前体蛋白(βamyloid precursor protein，APP)经内源性蛋白水解产生的。β和γ分泌酶参与淀粉样酶切过程，β分泌酶首先在Aβ结构域的N端进行切割，释放出较长的可溶性APP片段(soluble APPβ，sAPPβ)，而C端的片段(Cterminal fragment，CTF)仍然与膜结合，随后γ分泌酶水解CTFβ，产生了一系列长短不等的Aβ(39~43个氨基酸)和CTFγ，其中有病理意义的是Aβ40和Aβ42。另外，α分泌酶和γ分泌酶参与非淀粉样酶切过程，α分泌酶在Aβ结构域之内水解APP，阻断了完整的Aβ生成。由于αβ和γ分泌酶均与钙蛋白酶无关，故认为钙蛋白酶并未直接参与β淀粉样蛋白的生成。然而在AD病人脑组织中发现Ca2+、钙蛋白酶Ⅱ浓度均增高，由钙蛋白酶Ⅰ水解生成的76~78 kD片段也明显增多，因此也有人推测异常活性的钙蛋白酶可能通过PKC途径影响Aβ的分泌[3]。

3.3钙蛋白酶与AD神经元凋亡的调控AD中神经元的丧失与凋亡有关，钙蛋白酶可能参与神经元凋亡的调控。Ray等用H2O2及A23187诱导细胞氧化应激及Ca2+增高可使PC12细胞凋亡，而用选择性钙蛋白酶抑制剂可阻断68 kD神经纤维蛋白的降解及细胞凋亡的发生，表明钙蛋白酶参与了PC12细胞的凋亡[21]。

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钙蛋白酶可能通过水解钙调磷酸酶（calcineurin，CaN）使之活化参与凋亡基因的调控。Ray等用H2O2及A23187诱导PC12细胞凋亡时，Bax mRNA的表达无显著变化，而Bc12 mRNA表达水平下降，导致Bax/Bcl2比率增高，而用细胞膜通透性选择性钙蛋白酶抑制剂MDL28170可抑制Bax/Bcl2比率增高，表明钙蛋白酶可能通过提高细胞内Bax/Bcl2表达的比率，促进细胞凋亡[21]。此外，Wang等实验表明钙调磷酸酶可以使BAD去磷酸化，去磷酸化BAD从胞质转移至线粒体，并在此与Bcl2、Bclx结合促进细胞色素C释放，从而激活caspase途径导致细胞凋亡[22]。那么由它们各自调节的凋亡通路之间是否有关联？Liu等发现AD脑中钙调磷酸酶的A亚基在lys501位置可被钙蛋白酶水解而激活[23]。Wu等在用海人藻酸(KA)和谷氨酸诱导的2种神经兴奋性模型中发现激活的钙蛋白酶可以裂解cain/cabin1(钙调磷酸酶的一种内源性抑制剂)，从而激活钙调磷酸酶的活性，并引发钙调磷酸酶介导的细胞凋亡[24]。以上研究结果说明，钙蛋白酶可以通过水解钙调磷酸酶使之活化，并可能在兴奋性毒性所致的神经细胞凋亡中起关键作用。

钙蛋白酶以酶原形式存在，只有在其他调节因子作用下，改变酶自身构象才能被激活。在生理状态下，钙蛋白酶通过特异性水解修饰调节多种酶的活性，从而发挥自己在细胞活动、信号传导、稳定结构等方面的作用。但是当其功能异常时，可以导致多种疾病的发生。在AD，钙蛋白酶在细胞骨架的裂解和NFT的形成中起重要作用，并可能与神经炎性斑块的形成有关，因此针对钙蛋白酶及其调节因子的药物有望在治疗AD中发挥有效作用。

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