蛋白质范文10篇

蛋白质范文篇1

1质谱分析的特点

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

2质谱分析的方法

近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：

①电喷雾电离质谱；

②基质辅助激光解吸电离质谱；

③快原子轰击质谱；

④离子喷雾电离质谱；

⑤大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛。

3蛋白质的质谱分析

蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。

3.1蛋白质的质谱分析原理以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。

3.2蛋白质和肽的序列分析现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDITOFMS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据。

3.3蛋白质的质谱分析方式质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。

3.3.1蛋白消化蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。

3.3.2基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOFMS)简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。

3.3.3电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry，ESI-MS)。

蛋白质范文篇2

[关键字]生物大分子分子伴侣蛋白质的折叠识别结合

生物大分子的结构与功能的研究是了解分子水平的先象的基础。没有对生物大分子的结构与功能的认识，就没有分子生物学。正如没有DNA双螺旋结构的发现，就没有遗传传达传递的中心法则，也就没有今天的分子生物学。结构分子以由第一分子进入对复和物乃至多亚基，多分子复和体结构研究。同时，过去难以研究的分子水平上的生命运动情况也随着研究的深入和技术手段的发展而逐渐由难点变为热点。蛋白质晶体学研究已从生物大分子静态（时间统计）的结构分析开始进入动态（时间分辨）的结构分析及动力学分析。第十三届国际生物物理大会的25个专题讨论会中有一半以上涉及蛋白质的结构与功能，而“结构与功能”又强调“动力学（Dynamics）”，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系，以及对大分子相互作用的贡献。

蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能，是极富挑战性的工作。研究蛋白质折叠，尤其是折叠早期过程，即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明中心法则的一个根本问题，在这一领域中，近年来的新发现对新生肽段能够自发进行折叠的传统概念做了根本的修正。这其中，X射线晶体衍射和各种波谱技术以及电子显微镜技术等发挥了极其重要的作用。第十三届国际生物物理大会上，Nobel奖获得者Ernst在报告中强调指出，NMR用于研究蛋白质的一个主要优点在于它能极为详细的研究蛋白质分子的动力学，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系。目前的NMR技术已经能够在秒到皮秒的时间域上观察蛋白质结构的运动过程，其中包括主链和侧链的运动，以及在各种不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程。蛋白质大分子的结构分析也不仅仅只是解出某个具体的结构，而是更加关注结构的涨落和运动。例如，运输小分子的酶和蛋白质通常存在着两种构象，结合配体的和未结合配体的。一种构象内的结构涨落是构象转变所必需的前奏，因此需要把光谱学，波谱学和X射线结构分析结合起来研究结构涨落的平衡，构象改变和改变过程中形成的多种中间态，又如，为了了解蛋白质是如何折叠的，就必须知道折叠时几个基本过程的时间尺度和机制，包括二级结构（螺旋和折叠）的形成，卷曲，长程相互作用以及未折叠肽段的全面崩溃。多种技术用于研究次过程，如快速核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色）。

一、新生肽段折叠研究中的新观点

长期以来关于蛋白质折叠，形成了自组装（self-assembly）的主导学说，因此，在研究新生肽段的折叠时，就很自然的把在体外蛋白质折叠研究中得到的规律推广到体内，用变性蛋白的复性作为新生肽段折叠的模型，并认为细胞中新合成的多肽链，不需要别的分子的帮助，不需要额外能量的补充，就应该能够自发的折叠而形成它的功能状态。

1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。九十年代一类具有新的生物功能的蛋白，分子伴侣（Molecularchaperone）的发现，以及在更广泛意义上说的帮助蛋白质折叠的辅助蛋白(Accessoryprotein)的提出，说明细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。

二、蛋白质分子的折叠和分子伴侣的作用

蛋白质分子的三维结构，除了共价的肽键和二硫键，还靠大量极其复杂的弱次级键共同作用。因此新生肽段在一边合成一边折叠过程中有可能暂时形成在最终成熟蛋白中不存在不该有的结构，他们常常是一些疏水表面，它们之间很可能发生本不应该有的错误的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自组装学说，每一步折叠都是正确的，充分的，必要的。实际上折叠过程是一个正确途径和错误途径相互竞争的过程，为了提高蛋白质生物合成的效率的，应该有帮助正确途径的竞争机制，分子伴侣就是这样通过进化应运而生的。它们的功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构的，与之结合，生成复和物，从而防止这些表面之间过早的相互作用，阻止不正确的非功能的折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，这样必然促进折叠向正确方向进行。（从哲学的观点说，似乎很容易驳斥自组装学说，它违背了矛盾的普遍性原理，试想，如果蛋白质的每一步折叠均是正确的，充分的，必要的，岂不是在无任何矛盾的前提下，完成了复杂的最稳定构象的形成，即完成了由量变到质变的伟大飞跃，从无活性的肽链变成有活性的功能蛋白，这显然是违背哲学基本原理的。换一个角度想，生物进化的过程本来就充满着不定向的变异，这些变异中有适应环境的，也有不适应环境的，“物竞天择”，自然的选择淘汰了那些不适应的，保留了那些适应的。蛋白质分子的折叠不也与此类似吗？我想，蛋白质的一级结构只是肽链折叠并形成功能蛋白的特定三维结构的内因，实际上，多肽链在形成活性蛋白的每一步，都有潜在的可能形成“不正确”的折叠，如果没有象分子伴侣或其它帮助蛋白等外部因素的作用，多肽链也永远不能折叠成为活性蛋百。）

三，分子伴侣的作用机制

分子伴侣的作用机制实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。有的分子伴侣具高度专一性，如一些分子内分子伴侣，还有细菌Pseudomonascepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴侣”。它是由基因limA编码的，与酯酶的基因LipA只隔3个碱基，可能是进化过程中发生的基因分裂造成的。而一般的分子伴侣识别特异性不高，它是怎样识别需要它帮助的对象的呢？现在只能说分子伴侣识别非天然构象，而不去理会天然的构象。由于在天然分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能暴露出来，或者在新生肽段的折叠过程中，会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水表面，因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合，如硫氰酸酶（Rhodanese）分子α-helix的疏水侧面。但是只有β-sheet结构的蛋白质才可为分子伴侣识别。

最近关于识别机制有较大的进展。Bip是内质网管腔内的分子伴侣，用一种affinitypanning的方法检查Bip与有随机序列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hymotif与Bipj结合最强，Hy最多的是Trp、Leu、Phe，即较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够进行结合。还有一种较普遍的说法是分子伴侣识别所谓熔球体结构（moltenglobule）。另一方面，分子伴侣本身与肽结合部位的结构分析最近也有些进展。譬如，PapD的晶体结构表明，多肽结合在它的β-sheet区。GroEL中，约40kD的153-531结构域是核苷酸的结合区。

分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。非常盛行的一种模型认为分子伴侣常常以多聚`体形式而形成中心空洞的结构，用电子显微镜已经观察到由二圈层圆面包圈形组成的十四体GroEL分子和一个一层圆面包圈的七体GroES分子协同作用形成中空的非对称笼状结构（cagemodel），推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。但是不久前一个日本实验室发现GroEL的一个亚基，甚至其N端去除78个氨基酸残基的50kD片段，已经不能再组装成十四体结构，都有确定的分子伴侣功能。由此，我想:也许环状分子伴侣并非每个部位都是有效的结合部位，也就是说，该二层圆面包圈组成的十四体GroEL分子只有一个或若干个部位能够与疏水残基或所谓的熔球体结构结合，而其余部位起识别作用，就像一个探测器一样，整个十四体GroEL分子以圈层或笼状结构”包裹”在多肽链的主链上，以旋进方式再多肽链的链体上运动，一旦环状多聚体的某一识别部位发现疏水结构或所谓的熔球体结构等新生肽链折叠过程中暂时暴露的错误结构，经信号转导，多聚体的结合部位便与之结合，生成复合物，抑制不正确的折叠。以上完全是我个人的猜想，是基于上述两个试验现象的矛盾而试图作一番解释。至于为什么假设以旋进方式在多肽链上运动，我并没有相应的根据，只是觉得这应该是一个动态过程，因此作了一番狂妄的假想,另外，我觉得也许可以用X射线衍射来探测一下分子伴侣GroEL和GroES组成的笼状结构，看看它的a×b×c是否足以容纳多肽链的某一段，或者它的内部和外部的疏水性质和其他一些物化性质如何，也许可以找到支持或驳斥上述假设的证据。

以上谈的都是蛋白质的分子伴侣。不久前又出现了一个新名词“DNAchaperones”，DNA分子伴侣，这种分子伴侣是与DNA相结合并帮助DNA折叠的。在这种复合物中，DNA分子包围在蛋白质分子的表面，既是高度有序的，又是在一定程度上结构已有所改变的。DNA与蛋白的这种相互作用对DNA的转录，复制以及重组都十分重要;或如在核小体中，对DNA的包装是必须的。DNA在溶液中的结构有相当的刚性，必须克服一个能障才能转变成它的蛋白复合物中的结构，分子伴侣的作用就是帮助DNA分子进行折叠和扭曲，从而把DNA稳定在一个适合于和蛋白结构的特定构型中。这种结合是协同的，可逆的在形成复合物之后便解离下来。因此，不论是DNA分子伴侣还是蛋白分子伴侣，都与DNA和蛋白的相互作用有关，与基因调控有关，看来，分子伴侣确实与最终阐明中心法则当前主要问题有密切关系。

四、分子伴侣和酶的区别

与分子伴侣不同，以确定为帮助蛋白质折叠的酶目前只有两个，一个是蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI);另一个是肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。以PDI为例，众所周知，蛋白质分子中的二硫键与新生肽段的折叠密切相关，对维系蛋白质分子的结构稳定性和功能发挥也有重要作用。PDI定位在内质网管腔内，含量丰富，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应。同时，它是目前发现的最为突出的多功能蛋白，除了二硫键的异构酶的基本功能外，它还是脯氨酸-4-羟化酶的α亚基;又是微粒体内甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基，还是一种糖基化位点结合蛋白(gkycisylationsitebindingprotein)等。其中，最引人注目的还是它有与多肽结合的能力，可以结合具有不同序列，长度和电荷分布的肽，特异性较低，主要是与肽的主链相作用，但对巯基尚有一些偏爱。按照分子伴侣的定义，一般认为PDI和分子伴侣是两类不同的帮助蛋白，但是我国上海生物物理研究所最近提出不同的看法，认为蛋白质二硫键异构酶也具有分子伴侣的功能。

蛋白质分子中天然二硫键的形成要求这些在肽链上往往处于不相邻位置的巯基，首先通过肽链一定程度的折叠，才能相互接近到可以正确形成二硫键的位置。肽链的自身折叠是一个慢过程，而蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质天然二硫键的形成却是一个快过程。另一方面，蛋白质二硫键异构酶具有低特异性的与各种不同肽链相结合的能力，在内质网中以极高的浓度存在，又是是一个钙结合蛋白，是一个能被磷酸化的蛋白，这些都已经符合了分子伴侣的条件。因此他们推测蛋白质二硫键异构酶很可能首先通过它与伸展的，或部分折叠的肽段的结合，阻止错误的折叠途径，促进正确的中间物生成，帮助肽链折叠是相应的巯基配对，从而是正确的二硫键得以形成;然后催化巯基的氧化或二硫键的异构而形成天然二硫键。他们认为蛋白质二硫键异构酶的酶活性与它的分子伴侣功能不是相互排斥，而是密切相关，协调统一的。分子伴侣与帮助新生肽链折叠的酶之间，大概不应该，也不能够划一条绝对的分界线。我想:酶的最主要特性就是催化生化反应，分子伴侣的主要作用是与新生肽段的错误构象结合，从而阻止肽链不正确的非功能的折叠途径，促使其向正确的折叠方向反应，这难道不可以理解成间接的催化肽链的折叠吗?从表观上看，抑制不正确的折叠途径等于加快了正确反应的速度。所以，我本人也很赞成他们的观点。最近的试验已经为这一假说提供了很好的证据。PDI明显抑制变性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在复性股过程中的严重聚合，有效的提高它的复性效率，与典型的分子伴侣GroE系统对甘油醛3-磷酸脱氢酶复性的效应极其相似。

五、分子伴侣的结构

目前唯一解出晶体结构的分子伴侣是E.coli的PapD，帮助鞭毛蛋白折叠的分子伴侣。还有HSP70的N端结构域，即ATP结合域也以有晶体结构。用电子显微镜已经清楚的看到了GroEL的十四聚体和GroEL的七聚体的四级结构，象两个圆形中空的面包圈叠在一起，用NMR以及各种溶液构象变化是研究分子伴侣作用机制的有效手段。

六、分子伴侣研究的实际应用

分子伴侣的研究成果必然会大大加深我们对生命现象的认识，同时也一定会增加我们与自然斗争的能力和自身生存的能力。由于分子伴侣在生命活动的各个层次都具有重要作用，它的突变和损伤也必定会引起疾病，因此可以期望运用分子伴侣的知识来治疗所谓的”分子伴侣病”。另一方面，利用对分子伴侣的研究成果从根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必将对大幅度提高人类生活水平起重要作用。

[参考书目]

1.李宝健主编，面向21世纪生命科学发展前沿，广东科技出版社，1996年11月第一版：93-104页

蛋白质范文篇3

关键词：蛋白质，质谱分析，应用

前言：

蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。

1．质谱分析的特点

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

2．质谱分析的方法

近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。

3．蛋白质的质谱分析

蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。

3.1蛋白质的质谱分析原理

以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。

3.2蛋白质和肽的序列分析

现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDITOFMS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一[5]。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。

3.3蛋白质的质谱分析方式

质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。

3.3.1蛋白消化

蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。

3.3.2基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOFMS)[7]

简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便，敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。

3.3.3电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8]

同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan-demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。

4．蛋白质质谱分析的应用

1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析，更大分子量的多肽和蛋自质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋自质最早一例是HillenKramp等[9]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质，精确度开始只有0.5%，后改进到0.1-0.2%。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11],三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[15]等。

结束语：

在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。

参考文献

1．吴世容,李志良,李根容,等.生物质谱的研究及其应用.重庆大学学报,2004,27(1):123-127.

2．成海平,钱小红.蛋白质组研究的技术体系及其进展.生物化学与生物物理进展,2000,27:584588.

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14．黄珍玉,于雁灵,方彩云,等.质谱鉴定磷酸化蛋白研究进展.质谱学报,2003;24(4):494-500.

蛋白质范文篇4

关键词：蛋白质，质谱分析，应用

前言：

蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。

1．质谱分析的特点

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

2．质谱分析的方法

近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。

3．蛋白质的质谱分析

蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。

3.1蛋白质的质谱分析原理

以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。

3.2蛋白质和肽的序列分析

现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDITOFMS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一[5]。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。3蛋白质的质谱分析方式

质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。

3.3.1蛋白消化

蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。

3.3.2基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOFMS)[7]

简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便，敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。

3.3.3电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8]

同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan-demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。4．蛋白质质谱分析的应用

1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析，更大分子量的多肽和蛋自质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋自质最早一例是HillenKramp等[9]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质，精确度开始只有0.5%，后改进到0.1-0.2%。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11],三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[15]等。

结束语：

在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。

参考文献

1．吴世容,李志良,李根容,等.生物质谱的研究及其应用.重庆大学学报,2004,27(1):123-127.

2．成海平,钱小红.蛋白质组研究的技术体系及其进展.生物化学与生物物理进展,2000,27:584588.

3．陈绍农,潘远江,陈耀祖.多肽及蛋白质质谱分析新进展.质谱学报,1995,16(3):15-21.

4．陈晶,付华,陈益.质谱在肽和蛋白质序列分析中的应用.有机化学,2002,22(2):81～90.

5．解建勋,蒲小平,李玉珍,等.蛋白质组分析技术进展.生物物理学报,2001,17:19-26.

6．刘慧敏,赖志辉,黎军,等.碎片结构分析在MALDITOFMS法测定多肽序列中的应用.生物化学与生物物理学报,2000,32:179-182.

7．Lay.JOJr.MALDI-TOFmassspectrometryofbacteria.[J].MassSpectromRev,2001;20(4):172-194.

8．HarveyDJ.Identificationofprotein-boundcarbohydratesbymassspectrometry[J].Proteomic,2001;1(2):311-328.

9．KARASM,HILLENKAMPF.Laserdesorptionionizationofproteinswithmolecularmassesexceeding10000daltons[J].Anal.Chem,1988,60:2299-2301.

蛋白质范文篇5

1.掌握蛋白质的结构和性质，了解蛋白质的用途，并初步了解酶的特性及其用途。

2.培养学生通过观察实验现象，进行分析、推理，得出结论的思维能力。

3.让学生初步了解蛋白质是生命最基本的物质基础，树立辩证唯物主义思想。

教学过程

一、蛋白质

师;蛋白质广泛存在于生物体内，是组成细胞的基础物质。请列举生物体内哪些器官含蛋白质较多?

生：动物的肌肉、皮肤、血液、乳汁、毛发、蹄、角等含蛋白质较多。

生：植物的各种器官，尤其是种子含蛋白质最多(例如麦粒中含18%)。

师：由此可见，生命是蛋白质存在的一种方式。这种跟生命现象密切相关的蛋白质，它的组成是怎样的呢?让我们先通过实验分析。

【实验】1.分别抽取两根棉布条和毛料纤维，放在火焰上灼烧、闻味。

师：由上述实验现象能得出哪些结论?(经议论后回答。)

生：根据可燃且有焦臭味，说明棉布和毛料除含有碳、氢、氧元素外，还含有其它元素。

师：蛋白质里含有氮元素，还普遍含有硫元素。

蛋白质的相对分子质量很大，是天然有机高分子化合物，它的分子量可达几万、几十万乃至上千万。例如，核蛋白的分子量就超过两千万。我们在生物课上已经知道，如此庞大的高分子化合物，也是由基本结构单元构成的，即氨基酸。蛋白质水解的最终产物是α一氨基酸。请列举生物课中已熟悉的几种简单的氨基酸。

〔评注：利用学生已学过的生物学知识，不仅简捷自然，也有利于化学学科与其它相关学科的联系，开阔学生视野。〕

生;甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸等。

(通过投影介绍几种重要的α-氨基酸，并对α-碳原子加以说明。)

师：请根据氨基酸分子的结构特点推论它的主要化学性质。

生：氨基酸分子中既有氨基(一NH2)，又有羧基(-COOH)，因此它既能跟酸反应，又能跟碱反应，具有两性。

师;现在从动植物体内蛋白质水解产物中分离出来的氨基酸有几百种。但是，构成主要蛋白质的氨基酸只有20多种。

【练习】请完成下列化学方程式，指出生成物是什么，并标出肽键。这个反应跟学过的哪类反应类似?

这个反应跟酯化反应类似。两个氨基酸脱去1分子水，缩合成二肽。n个氨基酸脱去n-1个水分子，缩会成多肽。

师;2O多种氨基酸跟蛋白质的关系，好像字母跟单词的关系，它们可以形成无数种蛋白质。不同的蛋白质，组成的氨基酸种类和排列顺序各不相同，所以蛋白质的结构是很复杂的。研究蛋白质的合成和结构，从而进一步探索生命的本质，是科学研究的重要课题。1965年我国科学家在世界上第一次人工合成有生命活力的蛋白质——结晶牛胰岛素。1971年又合成猪胰岛素，在人类揭开生命奥秘的伟大历程中作出了重要的贡献。

蛋白质是α-氨基酸缩聚的产物。蛋白质分子中还存在残留的氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，蛋白质也具有两性。此外，蛋白质还有一些重要性质，我们一起通过下面的实验来认识。

【实验】1.用聚集的小手电筒观察鸡蛋白溶液的丁达尔现象。

【思考】蛋白质溶液属于哪种分散系?为什么?

2.盐析(边实验、边观察。)

【思考】(1)什么叫盐析?它的特点是什么?

(2)盐析有哪些应用?

(经实验、阅读后回答。)

生：蛋白质在浓无机盐溶液中因胶体凝聚而析出，叫做盐析。

盐析是可逆的，表示如下：

师：采用多次盐析法，可以分离和提纯蛋白质。

3.变性

【思考】1.什么叫蛋白质变性?这个过程的特点是什么?除实验涉及之外，还有哪些因素能引起蛋白质变性?

2.蛋白质变性有哪些应用?

(1)医疗上高温消毒杀菌的原理是什么?

(2)有人误服重金属盐，如铅盐、铜盐、汞盐等，应该怎样急救?

(3)为什么注射针剂前要用卫生酒精对皮肤消毒?

(4)为什么40%的甲醛溶液(俗称福尔马林)可用作制生物标本的常用药剂?

(经思考、议论后回答。)

由蛋白质变性引起的蛋白质凝结是不可逆的。教案二：蛋白质公式05src="file:///C:\DOCUME~1\epfwy\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image005.jpg">

师：蛋白质变性凝结后丧失可溶性，还失去生理活性。

生：(1)医疗上高温消毒杀菌，就是利用加热使蛋白质凝固，

从而使细菌死亡。

(2)误服重金属盐，可以服用大量牛乳、蛋清或豆浆，以吸收重金属盐解毒，免使人体蛋白质变性中毒。

(3)用卫生酒精擦洗皮肤，能使皮肤表面附着的细菌(体内的蛋白质)凝固变性而死亡，达到消毒杀菌，避免感染的目的。

(4)甲醛使蛋白质凝固变性，使标本透明而不浑浊，说明甲醛溶液能长期保存标本，不影响展示效果。

4.颜色反应

【实验】可从课本任选一二。

师：蛋白质可以跟许多试剂发生颜色反应。这种反应能用于蛋白质的检验。

蛋白质的应用(指导学生阅读教材后自行归纳)。

(1)重要的营养物质——生命的物质基础

(2)工业上的应用

①纺织工业——蚕丝、羊毛

②皮革工业——动物毛皮经鞣制后作原料

③感光材料工业——动物胶(白明胶)是制感光材料的片基

④塑料工业——制酪素塑料

〔评注：在教学中应十分重视联系实际，以便学生更好地理解和运用化学知识。此处结合生活和生产知识得当，不仅提高了学生学习化学的兴趣，同时进行了“学以致用”的教育。〕

二、酶简介

【实验】

【投影】酶是有生物活性(生物催化作用)的蛋白质。它有高效专一的催化活性。

【练习】1.下式表示某蛋白质分子结构的一部分，用箭头和(A)、(B)、(C)、(D)标出分子中不同的化学键。当蛋白质水解时，断裂的键是()。

答案：(C)

2.含有下列结构片断的多肽，在胃里水解时不可能产生的氨基酸是()。

(C)H2N—CH2COOH(D)

答案：(D)

【布置作业】

A、B两种有机化合物，分子式都是C9H11O2N。

(l)A是天然蛋白质的水解产物，经光谱测定显示，分子中不存在甲基(—CH3)。

(2)B是分子式为C9H12的芳香烃经硝化后的唯一产物(硝基连在芳环上)。

①写出A、B的结构简式。

②通过本题的分析讨论，就有机化合物的结构异构方面，你能作出什么推论?试列举l～2个实例。

(2)碳数相同而结构相似(或含一个苯环)的一元氨基酸和一元硝基化合物互为同分异构体。除本题A、B外，实例还有乙氨酸(CH2NH2——COOH)和硝基乙烷(CH3CH2NO2)。它们的分子式都是C2H5O2N。丙氨酸(CH3CHNH2——COOH)和硝基丙烷CH3CH2CH2NO2或(CH3)2CHNO2，它们的分子式都是C3H7O2N。

教学说

选学(课本中的小体字)部分，可根据学生的接受能力灵活处理。

蛋白质范文篇6

[关键字]生物大分子分子伴侣蛋白质的折叠识别结合

生物大分子的结构与功能的研究是了解分子水平的先象的基础。没有对生物大分子的结构与功能的认识，就没有分子生物学。正如没有DNA双螺旋结构的发现，就没有遗传传达传递的中心法则，也就没有今天的分子生物学。结构分子以由第一分子进入对复和物乃至多亚基，多分子复和体结构研究。同时，过去难以研究的分子水平上的生命运动情况也随着研究的深入和技术手段的发展而逐渐由难点变为热点。蛋白质晶体学研究已从生物大分子静态（时间统计）的结构分析开始进入动态（时间分辨）的结构分析及动力学分析。第十三届国际生物物理大会的25个专题讨论会中有一半以上涉及蛋白质的结构与功能，而“结构与功能”又强调“动力学（Dynamics）”，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系，以及对大分子相互作用的贡献。

蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能，是极富挑战性的工作。研究蛋白质折叠，尤其是折叠早期过程，即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明中心法则的一个根本问题，在这一领域中，近年来的新发现对新生肽段能够自发进行折叠的传统概念做了根本的修正。这其中，X射线晶体衍射和各种波谱技术以及电子显微镜技术等发挥了极其重要的作用。第十三届国际生物物理大会上，Nobel奖获得者Ernst在报告中强调指出，NMR用于研究蛋白质的一个主要优点在于它能极为详细的研究蛋白质分子的动力学，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系。目前的NMR技术已经能够在秒到皮秒的时间域上观察蛋白质结构的运动过程，其中包括主链和侧链的运动，以及在各种不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程。蛋白质大分子的结构分析也不仅仅只是解出某个具体的结构，而是更加关注结构的涨落和运动。例如，运输小分子的酶和蛋白质通常存在着两种构象，结合配体的和未结合配体的。一种构象内的结构涨落是构象转变所必需的前奏，因此需要把光谱学，波谱学和X射线结构分析结合起来研究结构涨落的平衡，构象改变和改变过程中形成的多种中间态，又如，为了了解蛋白质是如何折叠的，就必须知道折叠时几个基本过程的时间尺度和机制，包括二级结构（螺旋和折叠）的形成，卷曲，长程相互作用以及未折叠肽段的全面崩溃。多种技术用于研究次过程，如快速核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色）。

一、新生肽段折叠研究中的新观点

长期以来关于蛋白质折叠，形成了自组装（self-assembly）的主导学说，因此，在研究新生肽段的折叠时，就很自然的把在体外蛋白质折叠研究中得到的规律推广到体内，用变性蛋白的复性作为新生肽段折叠的模型，并认为细胞中新合成的多肽链，不需要别的分子的帮助，不需要额外能量的补充，就应该能够自发的折叠而形成它的功能状态。

1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。九十年代一类具有新的生物功能的蛋白，分子伴侣（Molecularchaperone）的发现，以及在更广泛意义上说的帮助蛋白质折叠的辅助蛋白(Accessoryprotein)的提出，说明细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。

二、蛋白质分子的折叠和分子伴侣的作用

蛋白质分子的三维结构，除了共价的肽键和二硫键，还靠大量极其复杂的弱次级键共同作用。因此新生肽段在一边合成一边折叠过程中有可能暂时形成在最终成熟蛋白中不存在不该有的结构，他们常常是一些疏水表面，它们之间很可能发生本不应该有的错误的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自组装学说，每一步折叠都是正确的，充分的，必要的。实际上折叠过程是一个正确途径和错误途径相互竞争的过程，为了提高蛋白质生物合成的效率的，应该有帮助正确途径的竞争机制，分子伴侣就是这样通过进化应运而生的。它们的功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构的，与之结合，生成复和物，从而防止这些表面之间过早的相互作用，阻止不正确的非功能的折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，这样必然促进折叠向正确方向进行。（从哲学的观点说，似乎很容易驳斥自组装学说，它违背了矛盾的普遍性原理，试想，如果蛋白质的每一步折叠均是正确的，充分的，必要的，岂不是在无任何矛盾的前提下，完成了复杂的最稳定构象的形成，即完成了由量变到质变的伟大飞跃，从无活性的肽链变成有活性的功能蛋白，这显然是违背哲学基本原理的。换一个角度想，生物进化的过程本来就充满着不定向的变异，这些变异中有适应环境的，也有不适应环境的，“物竞天择”，自然的选择淘汰了那些不适应的，保留了那些适应的。蛋白质分子的折叠不也与此类似吗？我想，蛋白质的一级结构只是肽链折叠并形成功能蛋白的特定三维结构的内因，实际上，多肽链在形成活性蛋白的每一步，都有潜在的可能形成“不正确”的折叠，如果没有象分子伴侣或其它帮助蛋白等外部因素的作用，多肽链也永远不能折叠成为活性蛋百。）转三，分子伴侣的作用机制

分子伴侣的作用机制实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。有的分子伴侣具高度专一性，如一些分子内分子伴侣，还有细菌Pseudomonascepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴侣”。它是由基因limA编码的，与酯酶的基因LipA只隔3个碱基，可能是进化过程中发生的基因分裂造成的。而一般的分子伴侣识别特异性不高，它是怎样识别需要它帮助的对象的呢？现在只能说分子伴侣识别非天然构象，而不去理会天然的构象。由于在天然分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能暴露出来，或者在新生肽段的折叠过程中，会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水表面，因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合，如硫氰酸酶（Rhodanese）分子α-helix的疏水侧面。但是只有β-sheet结构的蛋白质才可为分子伴侣识别。

最近关于识别机制有较大的进展。Bip是内质网管腔内的分子伴侣，用一种affinitypanning的方法检查Bip与有随机序列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hymotif与Bipj结合最强，Hy最多的是Trp、Leu、Phe，即较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够进行结合。还有一种较普遍的说法是分子伴侣识别所谓熔球体结构（moltenglobule）。另一方面，分子伴侣本身与肽结合部位的结构分析最近也有些进展。譬如，PapD的晶体结构表明，多肽结合在它的β-sheet区。GroEL中，约40kD的153-531结构域是核苷酸的结合区。

分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。非常盛行的一种模型认为分子伴侣常常以多聚`体形式而形成中心空洞的结构，用电子显微镜已经观察到由二圈层圆面包圈形组成的十四体GroEL分子和一个一层圆面包圈的七体GroES分子协同作用形成中空的非对称笼状结构（cagemodel），推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。但是不久前一个日本实验室发现GroEL的一个亚基，甚至其N端去除78个氨基酸残基的50kD片段，已经不能再组装成十四体结构，都有确定的分子伴侣功能。由此，我想:也许环状分子伴侣并非每个部位都是有效的结合部位，也就是说，该二层圆面包圈组成的十四体GroEL分子只有一个或若干个部位能够与疏水残基或所谓的熔球体结构结合，而其余部位起识别作用，就像一个探测器一样，整个十四体GroEL分子以圈层或笼状结构”包裹”在多肽链的主链上，以旋进方式再多肽链的链体上运动，一旦环状多聚体的某一识别部位发现疏水结构或所谓的熔球体结构等新生肽链折叠过程中暂时暴露的错误结构，经信号转导，多聚体的结合部位便与之结合，生成复合物，抑制不正确的折叠。以上完全是我个人的猜想，是基于上述两个试验现象的矛盾而试图作一番解释。至于为什么假设以旋进方式在多肽链上运动，我并没有相应的根据，只是觉得这应该是一个动态过程，因此作了一番狂妄的假想,另外，我觉得也许可以用X射线衍射来探测一下分子伴侣GroEL和GroES组成的笼状结构，看看它的a×b×c是否足以容纳多肽链的某一段，或者它的内部和外部的疏水性质和其他一些物化性质如何，也许可以找到支持或驳斥上述假设的证据。

以上谈的都是蛋白质的分子伴侣。不久前又出现了一个新名词“DNAchaperones”，DNA分子伴侣，这种分子伴侣是与DNA相结合并帮助DNA折叠的。在这种复合物中，DNA分子包围在蛋白质分子的表面，既是高度有序的，又是在一定程度上结构已有所改变的。DNA与蛋白的这种相互作用对DNA的转录，复制以及重组都十分重要;或如在核小体中，对DNA的包装是必须的。DNA在溶液中的结构有相当的刚性，必须克服一个能障才能转变成它的蛋白复合物中的结构，分子伴侣的作用就是帮助DNA分子进行折叠和扭曲，从而把DNA稳定在一个适合于和蛋白结构的特定构型中。这种结合是协同的，可逆的在形成复合物之后便解离下来。因此，不论是DNA分子伴侣还是蛋白分子伴侣，都与DNA和蛋白的相互作用有关，与基因调控有关，看来，分子伴侣确实与最终阐明中心法则当前主要问题有密切关系。四、分子伴侣和酶的区别

与分子伴侣不同，以确定为帮助蛋白质折叠的酶目前只有两个，一个是蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI);另一个是肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。以PDI为例，众所周知，蛋白质分子中的二硫键与新生肽段的折叠密切相关，对维系蛋白质分子的结构稳定性和功能发挥也有重要作用。PDI定位在内质网管腔内，含量丰富，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应。同时，它是目前发现的最为突出的多功能蛋白，除了二硫键的异构酶的基本功能外，它还是脯氨酸-4-羟化酶的α亚基;又是微粒体内甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基，还是一种糖基化位点结合蛋白(gkycisylationsitebindingprotein)等。其中，最引人注目的还是它有与多肽结合的能力，可以结合具有不同序列，长度和电荷分布的肽，特异性较低，主要是与肽的主链相作用，但对巯基尚有一些偏爱。按照分子伴侣的定义，一般认为PDI和分子伴侣是两类不同的帮助蛋白，但是我国上海生物物理研究所最近提出不同的看法，认为蛋白质二硫键异构酶也具有分子伴侣的功能。

蛋白质分子中天然二硫键的形成要求这些在肽链上往往处于不相邻位置的巯基，首先通过肽链一定程度的折叠，才能相互接近到可以正确形成二硫键的位置。肽链的自身折叠是一个慢过程，而蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质天然二硫键的形成却是一个快过程。另一方面，蛋白质二硫键异构酶具有低特异性的与各种不同肽链相结合的能力，在内质网中以极高的浓度存在，又是是一个钙结合蛋白，是一个能被磷酸化的蛋白，这些都已经符合了分子伴侣的条件。因此他们推测蛋白质二硫键异构酶很可能首先通过它与伸展的，或部分折叠的肽段的结合，阻止错误的折叠途径，促进正确的中间物生成，帮助肽链折叠是相应的巯基配对，从而是正确的二硫键得以形成;然后催化巯基的氧化或二硫键的异构而形成天然二硫键。他们认为蛋白质二硫键异构酶的酶活性与它的分子伴侣功能不是相互排斥，而是密切相关，协调统一的。分子伴侣与帮助新生肽链折叠的酶之间，大概不应该，也不能够划一条绝对的分界线。我想:酶的最主要特性就是催化生化反应，分子伴侣的主要作用是与新生肽段的错误构象结合，从而阻止肽链不正确的非功能的折叠途径，促使其向正确的折叠方向反应，这难道不可以理解成间接的催化肽链的折叠吗?从表观上看，抑制不正确的折叠途径等于加快了正确反应的速度。所以，我本人也很赞成他们的观点。最近的试验已经为这一假说提供了很好的证据。PDI明显抑制变性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在复性股过程中的严重聚合，有效的提高它的复性效率，与典型的分子伴侣GroE系统对甘油醛3-磷酸脱氢酶复性的效应极其相似。

五、分子伴侣的结构

目前唯一解出晶体结构的分子伴侣是E.coli的PapD，帮助鞭毛蛋白折叠的分子伴侣。还有HSP70的N端结构域，即ATP结合域也以有晶体结构。用电子显微镜已经清楚的看到了GroEL的十四聚体和GroEL的七聚体的四级结构，象两个圆形中空的面包圈叠在一起，用NMR以及各种溶液构象变化是研究分子伴侣作用机制的有效手段。

六、分子伴侣研究的实际应用

分子伴侣的研究成果必然会大大加深我们对生命现象的认识，同时也一定会增加我们与自然斗争的能力和自身生存的能力。由于分子伴侣在生命活动的各个层次都具有重要作用，它的突变和损伤也必定会引起疾病，因此可以期望运用分子伴侣的知识来治疗所谓的”分子伴侣病”。另一方面，利用对分子伴侣的研究成果从根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必将对大幅度提高人类生活水平起重要作用。

[参考书目]

蛋白质范文篇7

【关键词】益智健脑颗粒；SAMP8小鼠；海马；双向凝胶电泳；质谱分析

益智健脑颗粒是董克礼教授多年临床实践治疗阿尔茨海默病(AD)的中药处方，临床上用于治疗AD之肾虚血瘀型,取得满意疗效〔1〕，动物实验研究能改善SAMP8小鼠的学习记忆能力〔2〕。本研究则在临床观察及前期动物实验的基础上，应用蛋白质组学技术鉴定益智健脑颗粒干预前后P8品系快速老化小鼠(SAMP8)海马组织的差异表达蛋白质，试图从蛋白质组水平探讨中药益智健脑颗粒治疗AD的作用机制，为临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物及分组选用6月龄20只雄性SAMP8小鼠，随机分为治疗组和对照组,每组各10只，由天津中医学院附属第一医院动物部提供。

1.2药物、试剂与仪器益智健脑颗粒由淫羊藿、锁阳、川断、田七等组成，其水提浓缩液，相当于1ml含3g生药，由湖南德康制药有限公司加工制成。双向凝胶电泳试剂：2DQuantKit蛋白定量试剂盒，尿素，硫脲，NP40，TritonX100，二硫苏糖醇，碘乙酰胺，固相pH梯度干胶条（pH3～10，24cm），IPG缓冲液（pH3～10），两性电解质（pH3～10），覆盖液，双向凝胶电泳标准蛋白质，考马斯亮蓝G250,溴酚蓝均为瑞典AmershamBiosciences公司产品；琼脂糖，过硫酸氨,丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，CHAPS和十二烷基硫酸钠，碳酸氢铵，三氟乙酸、乙腈和基质α氰基4羟基肉桂酸均为美国SigmaAldrich公司产品。胰蛋白酶，美国Promega公司产品。PDQuest双向凝胶图谱分析软件是美国BioRad公司产品，MascotMS/MS数据库查询软件是英国Matrixscience公司产品，IPGphor等电聚焦仪，Imagescanner扫描仪均为瑞典AmershamBiosciences公司产品，DataExplorer质谱分析软件，VoyagerDESTR4307MALDITOFMS质谱仪是美国AppliedBiosystem公司产品。

1.3方法

1.3.1动物喂养及标本收集治疗组和对照组小鼠喂养于层流室，温度18～22℃，湿度55%～58%，饮水及饲料高温蒸汽灭菌。小鼠灌胃剂量每天30g/kg计算。治疗组给予中药益智健脑颗粒浓缩液灌胃，1次/d。对照组给予相同体积的双蒸水灌胃，1次/d，持续8w。8w后，迅速断头处死治疗组和对照组小鼠，置于冰上，剥出脑组织，用冷生理盐水冲洗干净，除去血渍，取出所需的海马，置于EP管中，迅速置于液氮中保存。

1.3.2海马组织总蛋白的提取及浓度测定将海马组织从液氮中取出，立即放入预先称重的EP管中进行称重。然后根据50mg样品组织加入约400μl组织裂解液的比例加入组织裂解液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲，2%NP40，1%TritonX100，0.5mmol/LEDTA，40mmol/LTris，4%CHAPS，100mmol/LDTT，5mmol/LPMSF）混合后，用研磨工具使海马组织充分研磨裂解，室温下静置孵育1h，间或涡旋混匀，然后1200r/min，4℃离心1h，吸取上清即为组织的总蛋白质。取少许（5μl）上清液（组织总蛋白质）测定蛋白质浓度。采用AmershamBiosciences公司专门针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提设计的2DQuantKit定量试剂盒测定蛋白质浓度。

1.3.3双向凝胶电泳每块胶的上样量1500μg。将胶条槽放置于平台上，将样品加入胶条槽中，取出IPG干胶条（pH3～10）置入含蛋白质样品的胶条槽中，再将胶条槽平行放置于IPGphor等电聚焦仪上进行第一向电泳。等电聚焦电泳结束后，将胶条先后放在平衡缓冲A液(平衡缓冲贮液10ml＋DTT100mg)和平衡缓冲B液(平衡缓冲贮液10ml＋碘乙酰胺250mg)中各平衡15min。然后将胶条转移至12.5%的PAGE分离胶上端，进行第二向电泳。

1.3.4图像染色与扫描将凝胶从玻璃板上剥离下来，双蒸水清洗干净后用考马斯亮蓝G250的蓝银染色方法进行蓝银显色，通过扫描仪及扫描软件进行扫描获取图像，使用PDQuest图像分析软件进行凝胶图像分析。

1.3.5质谱分析将蛋白质点从凝胶上切取下来，脱色、酶解后对样品萃取、点样。用MALDITOFMS质谱仪中进行分析，获得肽质量指纹图谱（PMF），再利用NCBI数据库进行检索。

2结果

得到背景清晰、分辨率高、重复性好的2DE图谱各3张。每张2DE图谱约有900个蛋白质点，大多数蛋白质点在位置和丰度上是一致的，主要分布在pH4～8的范围内。选择差异在两倍以上的16个蛋白质斑点作为差异表达的蛋白质点进行质谱分析，最后得到鉴定的差异表达蛋白质点为13个(各个蛋白具体在凝胶上的分布见图1)。这些蛋白质的功能分别涉及到细胞骨架蛋白、代谢相关酶类、信号传导和激素等多个方面。在治疗组中表达上调的有8个，分别为1、2、4、5、9、10、11、13号蛋白，表达下调的有5个，分别为3、6、7、8、12号蛋白。每个蛋白的具体情况见表1。表1差异表达蛋白质信息

3讨论

AD发病机制现存在多种假说：能量代谢障碍、激素缺乏、细胞凋亡、淀粉样蛋白神经毒性作用、炎症、自由基损伤等。本实验鉴定的13种蛋白质点，分别涉及到能量代谢、细胞凋亡、细胞骨架、激素等多个方面。肽酰脯氨酰顺反式异构酶A(Pin1)属于微小菌素蛋白的一种酶，Pin1蛋白是一种相对大分子量(18kD)的肽酰脯氨酰异构酶。Pin1与磷酸化的微管相关蛋白(tau)蛋白结合，而磷酸化的tau蛋白聚集形成神经元纤维缠结，这样就使Pin1过多结合于纤维结上，使可利用的游离Pin1减少或缺乏，从而诱导神经元凋亡，这可能是AD发病机制之一〔3～5〕。有研究表明，外源性Pin1的加入可以恢复tau蛋白使微管聚集的生物学特征，即加入的Pin1与磷酸化的tau蛋白结合，使其异构化，成为磷蛋白磷酸酶2A型(ProteinPhosphatase2A,PP2A)的最适底物，PP2A使tau蛋白去磷酸化，从而恢复tau蛋白使微管蛋白聚集的生物学功能，减少神经纤维缠结的形成〔6〕。磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解的关键酶，PGK基因发生突变会导致智力减退〔7〕，这个酶是一个有重要价值的、具有潜力的药物设计的靶标〔8〕。

近年研究发现，雌激素可通过多种途径和环节影响AD的发生和发展〔9，10〕。流行病学调查表明，绝经后妇女AD的发病率较同龄男性高1.5～3.1倍，原因与绝经后妇女丧失了雌激素的保护作用有关〔11〕。接受雌激素治疗的患者脑血流量增加,尤其是在海马、海马沟回、颞叶等与认知功能相关的脑区〔12〕。大脑的海马区与记忆和学习的关系密切，在此区域发现了大量的雌激素受体(ER)。雌激素α受体主要在海马锥体层神经元中表达，雌激素α受体阳性神经元主要分布在CA3和CA4亚区，而在CA1区较少。AD病理学上的一个重要特征为CA1区较CA3区更易发生神经退变，雌激素α受体分布与AD病理变化部位的高度重合提示雌激素可能参与了AD的发病〔13〕。

中药益智健脑颗粒是由淫羊藿、锁阳、川断、刺五加、柏仁、水蛭、田七等药物组成的复方，适用于肾虚血瘀型的老年痴呆。本实验发现，中药益智健脑颗粒通过改善能量代谢、抑制细胞凋亡、构成细胞骨架、增加激素等多途径、多靶点治疗AD。

【参考文献】

1董克礼,宋治.益智健脑颗粒治疗早老性痴呆64例临床观察〔J〕.湖南中医杂志，1999；15(4):56.

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3LuPJ，WulfG，ZhouXZ,etal.TheprolylisomerasePinlrestoresthefunctionofAlzheimer′sassociatedphosphorylatedtauprotein〔J〕.Nature,1999;399(6738)：7848.

4GoedertM.Alzheimer′sdisease.Pinningdownphosphorylatedtau〔J〕.Nature，1999;399(6738):73943.

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7ColetteValentin，HenrikBirgens，CraescuCT.Aphosphoglyceratekinasemutant(PGKHerlev,D285V)inaDanishpatientwithisolatechronichemlyticanemia:mechanismofmutationandstructurefunctionrelationships〔J〕.HumanMutation，1998;12（4）:2807.

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nosemes〔J〕.AnnuRevMicrobiol,1987;41:12751.

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10杨华，武成斌，屈秋民.雌激素与阿尔茨海默病〔J〕.中国临床康复,2004;8(1)：14850.

11BieberEJ,CohenDP.Estrogensandhormonereplacementtherapy:istherearoleinthepreservationofcognitivefunction〔J〕.IntJFertilWomensMed，2001;46(4):2069.

蛋白质范文篇8

关键字：蛋白质组心血管应用

心血管疾病是疾病蛋白质组研究的重要领域，当前，研究者已从基因水平向蛋白质水平深化，这是医学研究发展的必然趋势。因蛋白质组学的广泛应用和潜在价值，其被称为跨越基因组与临床应用之间鸿沟的桥梁。1.概述

蛋白质是心脏功能的重要体现，蛋白质参与心肌细胞的各种功能和调节，无论心脏处于正常还是急、慢性疾病状态。因此，其在心血管疾病中的作用也愈来愈受到人们的关注。在心血管疾病的发病机制中，蛋白质组的变化表现在多方面，如蛋白质在病变前后在数量上的增多、减少或不变，在密度上的增多、减少或不变，在氨基酸组成或顺序上的变化等。寻找差异性蛋白质成为近几年来各国研究者关注的焦点，这有助于阐明发病机制，发现新的蛋白质。其逐渐发展成为一门新兴学科—差异蛋白质组学。

蛋白质组的变化主要是由于蛋白质在疾病状态中的降解、合成、重修饰等因素造成的。如在心力衰竭模型中的热休克蛋白丰度增加，在心肌顿抑时肌钙蛋白减少等。正常心肌细胞可以分离出1176-1288个蛋白点。有研究者采用2-DE技术和计算机辅助的图像分析方法，对用去甲肾上腺素处理的应激心肌细胞与正常心肌细胞的蛋白质组进行分离和比较，发现有11种蛋白质在去甲肾上腺素诱导后发生明显的变化，包括质和量的变化，其中有一种只是在应激后才表达。

2.常用的蛋白质组数据库

1982年，Celischuan创建立了第一个人类2DPAGE数据库(biobasc.dk/cgi-bin-celis)，如今已包含三千多条蛋白质目录，可以方便地链接到midline(www.ncbi,nlm.nih.gov/pubmed)、SwissProt(expasy.hcuge.ch/sprot/sprottop.html)、PDB(www,embl-heidelberg.de/pdb)等网站。因此，一旦一种蛋白质得到鉴定，就可以方便地从数据库中获取全部信息。其他重要的蛋白质数据库有:expase.hcuge.ch/sport/sport-top.html、www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein、userpage.chemie.fu-berlins.de/pleiss/dhzb.html。目前，心肌蛋白质组2-DE数据库和人类心脏蛋白质联合二维电泳数据库(www.expasy.ch/chid/zd-index.html)已经建立，目前已鉴定出几百种心脏蛋白质。另外还有一些就某一专业方向而建立的数据库，如心力衰竭相关基因和蛋白质数据库:。借助于相关的电子数据库，研究者可以更方便地从事其领域的研究。

3.蛋白质组技术在心血管疾病研究中的其他应用

运用蛋白质组技术不仅有助于鉴定与疾病相关的生物标记分子，阐明心血管疾病的发病机制，还可以通过分析2-DE图像，比较蛋白点的变化，检测药物对心血管疾病的作用和疗效，以利于临床用药和新药物的研制、开发。如有研究者通过建立新西兰家兔高血脂导致的动脉粥样硬化模型，用2-DE技术检测其蛋白质组的变化，分析比较得到的2-DE图像，观察辛伐他汀对各蛋白点的回调作用，得出结论:其能明显改善肝脏对脂肪的代谢功能，但未能有效修复高血脂引起的动脉血管壁损伤。

随着蛋白质组学技术的不断发展，越来越多的研究者将蛋白质组学运用到心血管疾病的研究中，对心血管疾病的分子机制给予独特的解释。与此同时，各种心血管疾病相关模型和蛋白质组数据库也随之出现，这将大大方便更多的蛋白质组的研究。将干细胞定向诱导分化为心肌细胞治疗心血管疾病是一种新兴的、有效的治疗手段。在诱导干细胞向心肌细胞定向分化机制的研究中，蛋白质组技术亦必将发挥重要作用。

参考文献：

[1]ArrellDK,Neveroval,VanEykJE.CardiovascularProteomics;evolutionandpotential[J].CircRes,2001,88（8）:763-773.

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[3]段海峰，钱令嘉，应万涛等.应激心肌细胞蛋白质组双向凝胶电泳分析[J]，中国生物化学与分子生物学报，2002,18(2):234-239

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蛋白质范文篇9

关键词:生物药物研发;蛋白质工程;技术应用

生物工程技术自从上世纪70年代兴起以来，已经发展了将近50年的时间。到了21世纪，生物工程技术特别是其中的蛋白质工程技术的迅猛发展，正推动这生命科学的不断进步。利用蛋白质工程技术，我们可以对分子进行设计，对DNA进行重组，以生产我们需要的但自然界中不存在的蛋白质。蛋白质工程技术已经成为生物药物生产中不可或缺的一个重要的组成部分。

一、生物药物

生物药物是综合了生物学、生物化学以及医学的极高融合度的产物，生物药物的生产主要是在生物体内，利用生物体的组织细胞和体液等进行。生物药物的种类繁多，按照药物的功能大致可分为治疗药物、预防药物和诊断疫苗。由于生物药物大多产自于生物体内，因此生物药物具有普通药物不具备的优越的药理学性质，生物药物的药理活性比普通药物更高;治疗肿瘤、艾滋病等的治疗药物其比普通药物的针对性更高，毒副作用小，会减少药物对于体内正常细胞的损伤。除了应用于医疗行业，生物药物还被广泛应用于保健品行业和化妆品领域，具有较为广泛的应用领域。根据上述的分析，生物药物具有十分广泛的应用，在国内国外也拥有着广阔的市场。但是由于我国的生物药物行业起步较晚，生物药物的制造生产相对欧美等发达国家较为落后，但由于市场的刺激，我国的生物药物行业发展十分迅速，生物药物的制造技术和水平得到了大幅度的提高。

二、蛋白质工程技术在生物药物研发中的优势

近年来蛋白质工程技术的发展，对于生物药物生产起了极大的推动作用，蛋白质工程技术能够极大地减轻药物研究从业者的工作量和工作难度。在实际应用的过程中，蛋白质工程技术能够在基因尺度上对DNA进行设计重组，这样就可以通过转录翻译等生理过程制造出自然界不存在，但具有优越药理性能的蛋白质。还可以利用定点突变、体外定向等等技术实现对于氨基酸的改造，使药物呈现出更加优越的药理作用。总之，蛋白质工程技术在新型药物的研发领域和生产方面具有巨大的优势，而且随着蛋白质工程技术的不断精进和技术的不断革新，这样的优势将会不断扩大。

三、蛋白质工程技术在生物药物研发中的应用

(一)定点突变技术。定点突变技术是指根据生物医药所学的结构或功能对基因进行特殊的改造，在特定的DN段或特定的核苷酸序列进行删除或者添加，从而实现对于合成蛋白质的氨基酸序列的改变，进而改变药品的药性。在生物学上，这种对于特定DN段或特定核苷酸的删除或添加属于基因突变，这样的定点突变技术对于生物药物的编码序列和一级结构具有很好的修饰作用。相比于传统使用的利用自然因素或化学药物进行的诱导突变而言，定点突变技术所产生的突变的特异性和可重复性更强。通过自然因素或化学药物进行的诱导突变所产生的突变基因片段具有极大的不确定性，其往往是不可重复的。通过对于DN段或者核苷酸的删除、添加所产生的蛋白质药物的活性更高。以纳豆激酶为例，纳豆激酶是纳豆枯草杆菌所产生的蛋白酶，其具有很强的溶解纤维蛋白的一种酶，被广泛的应用于质量心脑血管疾病当中。但是根据研究表明，传统的由纳豆谷草杆菌所分泌纳豆激酶其第222位的蛋氨酸非常容易被过氧化氢所氧化，进而导致整个酶失去活性，严重影响药物的药效。而通过定点突变技术将丝氨酸和丙氨醛替换到原有的第220位苏氨酸和第222位的蛋氨酸，经过定点突变技术改造得到的纳豆激酶经过抗氧化活性测试的结果表明:经过定点突变技术改造的纳豆激酶的抗氧化性明显优于油油的野生纳豆激酶，具有是非优良的抗氧化性。(二)体外定向进化技术。体外定向进化技术与定点突变技术有一定的相似之处，二者同样都是对DN段或核苷酸进行改变，以产生具有医药价值的药物。但是两者也存在着巨大的不同。首先，定点突变技术主要应用于一些自然界中已经存在的蛋白质的个别位点进行删除或添加，蛋白质自身更高级的结构并没有改变，只是对于自然界中已经存在的蛋白质进行进一步的优化。而体外定向进化技术是在生物体外，利用PCR扩增技术或体外DNA对大量的位点进行处理，对于药物的某一特征进行持续高通量的筛选。通过这样的方式来获得自然界中不存在的具有高价值的药物。体外定向进化技术相比于定点突变技术也存在一定的弊端，在利用PCR技术进行高通量的体外扩增时，会产生碱基对错配的情况，这一点与生物体相类似且无法避免。因此在利用PCR技术扩增之后，还应进行筛选。筛选的过程较为复杂，需要通过多轮次的重复筛选，最后才能获取有益的突变基因。这种经过体外定性进化技术获取的有益突变基因虽过程复杂，但人类已经基本掌握该项技术，并且取得了一定的成果。例如，1，3-丙二醇就是通过体外定向进化技术通过不断地定向筛选而得到的具有更强的氧化还原活性的氧化还原酶。

四、结语

科学技术不断进步推动着人们医疗水平的不断提高，当前蛋白质工程技术在生物药物研发工作中已经起到了极大的推动作用，提高了生物药物研发的效率，减轻了药物研发人员的负担。通过蛋白质工程技术对特定的DN段或特定的核苷酸片段进行添加或删除，已经生产出许多具有新结构、新功能的药物，造福人类。

参考文献:

［1］张新国，陈文洁，曾艳龙，etal．蛋白质工程技术及其在生物药物研发中的应用［J］．药学进展，2011，35(12):529-536．

［2］茹炳根．蛋白质工程及其在生物制药中的应用前景［C］．全国生化药物及药用动植物资源开发研究会议，2007(03):24-25．

［3］宋鹏辉．生物药物研发应用蛋白质工程技术探讨［J］．科学中国人，2016(24):19+21．

蛋白质范文篇10

[关键词]蛋白质与酶工程；生物技术；教学改革；应用型人才；课程思政

蛋白质与酶工程是高校生物技术专业的一门重要课程，很多高校的生物技术专业作为一门专业核心课程讲授[1]。近年来，随着生命科学与技术的迅猛发展，生物技术在医疗、医药、健康及环保等产业中占据越来越重要的地位。而蛋白质工程和酶工程作为生物技术的重要组成部分，在上述这些产业中占据极其重要的地位。尤其是在全球新冠疫情的大背景下，市场对检测试剂、疫苗及抗病毒药物的需求猛增，而这些检测试剂、疫苗及药物的研发及生产正是蛋白质工程和酶工程的重要内容之一。在这一形势下，对相应的蛋白质及酶工程生物技术人才需求会增加，要求也会进一步提高。高校作为我国科技人才培养的重要组成部分，培养出适应新形势下市场需求的人才是高校的重要任务之一[2-3]。因此，为了更好地适应市场需求，培养出高质量的应用型人才，以培养具备实践能力的应用型人才为导向，对我校本科生蛋白质与酶工程课程教学进行了改革与探索。

1教学内容的整合与优化

蛋白质与酶工程课程实际上可以分为蛋白质与酶工程两大模块[1]。二者既有相通之处，又有各自的侧重点。在很多院校，蛋白质工程和酶工程是作为两门独立的课程分别设课。我校依据两门课程的特点，将二者整合为一门课程。蛋白质工程与酶工程都是涉及到大量专业基础知识和其他学科知识综合运用的课程，包括有机化学、生物化学及分子生物学等。二者涉及到的知识繁多复杂，难度较大。将二者整合为一门课程进一步增大了课程的难度。如何在有限的总课时量下将课程的核心知识传授给学生是本课程面临的第一个挑战。为了更好地切合应用型人才的培养目标，结合地方性院校学生的实际，对课程的大纲进行了调整，对教学内容进行了优化，对蛋白质工程和酶工程两个模块的内容进行了深度的整合。增加了课程中与应用和实践结合更加紧密的内容的学时比例，更加强调课程的应用性。例如弱化了蛋白质工程中蛋白质理性设计中的理论及计算内容，这些内容涉及到大量艰深的物理及化学理论知识，对于本科生来说难度过大。整合了蛋白质工程中蛋白质的修饰和酶工程中酶分子修饰改造的内容。对整个课程中涉及到其他课程的知识进行了梳理，将学生在其他课程中学过的知识进行了精简，以突出课程的核心内容。例如课程涉及到的蛋白质与酶的基础知识，学生基本上在生物化学及分子生物学等前置课程中学过，在教学的时候，以课前自学和课堂提问的方式，让学生回顾这些内容。课程还涉及与基因工程、细胞工程和发酵工程等课程交叉的内容，在制订教学内容时，将重复的内容进行了精简。通过这些措施，让整个课程思路脉络更加清晰，重点突出，教学内容也更加贴近应用性实践性的要求。

2教学方法的改革与探索

蛋白质与酶工程相比于一些生物技术专业的基础课程，内容难度较大，抽象度高，学习难度较大。尽管课程安排在大三年级，学生有了一定的有机化学、生物化学及分子生物学的基础，但是从历年的教学经验来看，学生掌握好这一门课程存在一定的难度，对知识的掌握也往往停留在机械性的记忆水平上，无法做到灵活运用所学的知识去分析解决实际问题。为了更好地落实地方高校向应用型转型发展的要求，培养具备实践能力的应用型人才，有必要对既往的教学进行改革和探索。(1)注重课程的应用性，理论联系实际，丰富课堂教学的内容，激发学生的学习兴趣。在以往的教学过程中，采用传统的讲解结合PPT演示。由于教学内容抽象且难度较大，学生很难集中注意力，教学效果差。为了改变这一问题，在讲授内容时，穿插科学研究的故事和实际案例，增加教学内容的趣味性。例如在讲解蛋白质凝胶色谱技术时，介绍了通用电气公司的经典凝胶色谱产品Sephadex系列诞生的故事，源自于一位年轻科学家的意外错误。在讲解蛋白质药物的时候，以胰岛素这一经典药物为例，介绍了几十年来各个医药公司在胰岛素研发和修饰改造上的竞争和市场化案例。这些故事及案例充分调动了学生的兴趣和积极性。蛋白质与酶工程是一门应用性较强的课程，其最终目的是运用蛋白质和酶的理论知识去指导实践，更好地改造和运用蛋白质或酶去造福人类。在以往的过程教学过程中，往往容易忽略这一点，很多教学内容陈旧，和当前的工业应用脱节。在培养应用型人才的导向下，在课堂中增加了大量的蛋白质工程和酶工程的实际案例，例如知名的国际蛋白质与酶制剂产业巨头诺维信，赛默飞世尔等企业的案例，工程蛋白药物的研发与市场开发案例，国内新兴蛋白质药物、酶制剂公司崛起的案例，让学生了解到当前蛋白质工程和酶工程产业的蓬勃发展，提高了学生对蛋白质与酶工程产业未来发展的信心，让学生有了主动学习的动力。结合学生最关心的就业问题，让学生通过互联网主动去了解蛋白质和酶工程目前的行业发展状况，就业情况等。这种把课程学习和学生切身利益结合在一起的方法，大大提高了学生主动学习的积极性，取得了良好的学习效果。(2)改进课堂教学方式，促进学生主动学习。在蛋白质与酶工程课程中，部分章节内容较为抽象，单一的教师讲授方法往往很难取得好的教学效果，也无法激发学生的学习兴趣。为此，在教学过程中，引入了一些新的教学模式，督促学生主动学习，提高学生自学的能力。蛋白质与酶工程课程内容繁多，仅靠课堂上的36个学时很难将课程知识掌握好。在教学过程中，每次课后都会留下一个课程相关的问题，让学生课后去查找资料。下次课时就这一问题让学生给出答案。最初学生寻找答案的过程会遇到各种困难，例如最典型的问题就是很多学生观念不正确，寻求答案往往只限于教材，如果教材没有就无法完成问题了。面对这一问题，首先破除了学生固化的观念，教材上没有的，指导学生主动去图书馆、互联网数据库去检索资料获。蛋白质与酶工程作为一个朝气蓬勃的新兴产业，近年来发展速度很快，仅靠教材是很难获得最新知识的。引入激励机制，主动去查找资料获得合理的答案可以获得课程平时分加分。通过这一方法训练学生搜索资料自主学习的能力，养成自主学习的习惯。在一些涉及前沿领域应用领域的章节，展开了分小组的团队学习模式。例如在蛋白质和酶分子修饰改造这一部分，和2018年诺贝尔奖“酶的定向进化”及“噬菌体展示技术”密切相关，而这些技术在当前新冠病毒药物及疫苗研发中发挥重要作用。这一热点紧扣时事，具有较好的实践意义。因此以酶的定向进化及噬菌体展示技术为主题，让各个小组任选其中一个技术，利用图书馆及互联网数据库等资源查找文献资料，撰写学习总结制作PPT，并在课堂上利用多媒体作小组报告，其他组成员点评。教师给每个小组的报告作出点评，指出报告中出现的一些问题。通过这种学生自主参与学习的过程，大大加强加深了学生对所涉及章节知识的理解，拓展了学生的视野，更好地了解的学科最前沿的知识和行业状况；教师在点评总结过程中也容易发现学生存在的问题，增强了教师与学生间的互动。(3)充分挖掘课程思政元素，加强课程的思政教育功能建设。2020年6月，教育部在《高等学校课程思政建设指导纲要》中明确提出课程思政建设要在所有高校、所有学科专业全面推进[4]。在纲要的指导思想下，在课程改革中充分挖掘思政元素，发挥课程的育人作用[5]。例如在课程的绪论部分，为了让学生理解蛋白质工程中解析蛋白质结构对于蛋白质工程的重要性，给学生介绍了人们在蛋白质结构解析工作上的艰辛历程。从最初的蛋白质结晶X射线衍射法、核磁共振法，到现在的冷冻电镜方法，一直到最新的基于人工智能引擎AlphaFold2预测的方法。通过这一案例让学生认识到科学的进步离不开艰难的探索，也激发了学生进一步学习的兴趣。充分地在蛋白质与酶工程课中融入了课程思政，让学生认识到探索未知、追求真理、勇攀科学高峰的责任感和使命感。在讲解蛋白质工程技术在蛋白药物及疫苗研发中的应用的时候，结合当前全球新冠疫情的背景，介绍了我国科学家在解析新冠病毒蛋白质结构、研发抗病毒抗体及疫苗方面所作的贡献，以及我国在抗击疫情方面的努力和成效，树立了学生的民族自豪感和自信心，也激发了学生运用所学的生物技术知识为国家为社会作贡献热情。(4)以应用型人才培养为导向，加强实践能力的培养。蛋白质与酶工程是一门应用型实践性极强的学科，因此在教学过程中特别强调了实践能力[6]。例如在蛋白质工程及酶工程模块中，都涉及到蛋白质或者酶制剂的生产问题，这一问题非常贴合生产和应用实际，对于培养应用型人才来说至关重要。以往的教学往往只是简单地讲解生产的原理及流程，比较抽象，学生也并未了解实际的生产过程。为了更好的突出实践性，将酶的生产流程分为酶的发酵过程，酶的提取及分离纯化和酶制剂三部分，其中酶的发酵生产将在发酵工程这一门课中重点学习。酶的分离纯化和酶制剂作为教学的重点，在讲解的过程中充分发挥任课教师个人的科研方向优势，将任课教师的科研课题中酶的分离纯化的科研过程以及一些纯化设备使用等分享给学生，既激发了学生的科研兴趣，也让学生了解到了真实的科研及生产过程。课后留给学生一些酶纯化的问题，让学生查询资料自主完成酶纯化工艺的设计。当然，实践性的内容仅仅依赖课堂教学是远远不够的，还需要实验课让学生能动手操作。然而在笔者所在的地方性院校，由于实际条件的限制，以往的课程中并没有加入实验课，显然这是一个短板。在接下来的教学改革中，加入课程实验是必然的。在实验项目的设置上，以切合生产实际为原则，设置一些综合性的、多流程的大实验，让学生能够完整地体验蛋白质或酶的生产过程。例如将蛋白质与酶工程实验设计和上游的基因工程实验、发酵工程实验对接，将多学科的知识综合起来，形成一个蛋白质或酶生产的完整流程，为学生未来进入相关行业从事实际生产打下良好的基础。(5)完善课程的考核评价方式，强化学习过程的考核。考核是对学生学习效果评价的重要方式。然而仅仅采用考试的方式对学生考核无法对学生的学习效果作出客观全面的评价，对学生平时的学习也难以起到督促作用，所以一般采取平时表现加上期末成绩进行综合性考察。以往的考核中，平时成绩的考核并未做到细化，主要依据学生考勤及小作业等方式评价，平时考核仅浮于形式，很难起到督促作用。为了真正做到对学生学习过程的监督与考核，强化了学习的过程考核。首先制订了详细的平时考核标准，更加注重学生平时学习的参与度，将平时成绩在总成绩中的占比由原来的30%提高到了40%。学生在课堂上主动回答问题，参与小组讨论并发言，作为课堂表现加分；课后积极参与小组学习，查找资料撰写小组学习报告作为平时学习的加分；课后作业改为更加注重应用和实践能力大作业，包括蛋白质及酶工程前沿技术的专题报告、酶纯化及酶工程应用的工艺流程设计、蛋白质和酶工程相关产业的市场调查等。尽管这些作业难度很大，但是对作业的评价更加注重学生检索和搜集资料的过程。通过这些举措，学生平时学习的积极性得到了提高。期末闭卷考试占总成绩比例由原来的70%调整为60%，在期末试题的命制上也进行了大量的优化，向实践和应用方向倾斜。大部分试题考查学科的基本知识点，难度控制适中，需要学生理解或者运用知识点解决一些小问题，避免死记硬背。同时也加入了一些与实践应用联系较为紧密的综合性试题和实验设计题，例如设计一套基于离子的交换方法对特定蛋白质分离纯化的流程，或者从基因工程开始设计一套利用His-tag标签纯化目标蛋白质的流程，考查学生对知识灵活运用能力和实践能力。通过这些考核方式的改革，更加全面地反映学生对知识的掌握情况。

3结语