蛋白质工程十篇

蛋白质工程篇1

一、 教学目标

1、知识方面

（1）举例说出蛋白质工程崛起的缘由。

（2）简述蛋白质工程的原理。

2、情感态度与价值观方面

（1）关注蛋白质工程的发展。

（2）认同蛋白质工程的应用促进生产力的提高。

3、能力方面

尝试运用逆向思维分析和解决问题。

二、 教学重点和难点及解决策略

1、教学重点

（1）为什么要开展蛋白质工程的研究？

解决策略：复习基因工程有关知识，由基因工程的市值及基因工程的成果（蛋白质类的药物）产生问题矛盾，水到渠成。

（2）蛋白质工程的原理。

解决策略：以旧促新——“中心法则”的逆推。

2、教学难点

蛋白质工程的原理。

“问题 探讨”式。不能直接改变蛋白质的原因？ 改造基因为什么能改造蛋白质？根据什么去改造基因？等问题。

三、教学方法：

采用“提出问题—思考、探究—再提出新问题—再探究”的教学模式。

四、学法：

以旧促新，逆向思维的锻炼。

五、教具

POWERPOINT课件

六、 教学过程

（一）导入：

复习导入法。

让我们先来复习一下有关基因工程的知识吧！

1、Powerpoint课件：表格“有关基因工程的知识”

2、基因工程硕果累累，例如大肠杆菌为人类生产出了胰岛素；牛的乳腺生物反应器为人类制造出了蛋白质类药物；烟草植物体内含有了某种药物蛋白。

3、峰回路转

但基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而这些天然的蛋白质不一定符合人类生产和生活的需要。那么，我们人类如何解决这一矛盾呢？

人们就要对现有的蛋白质进行改造，制造出从天然蛋白质中找不到的蛋白质，即非天然的蛋白质。

这样一来，蛋白质工程就应运而生了。

板书 1.4 蛋白质工程的崛起

预知内容

在这个小专题中我们主要研究三个问题：1、蛋白质工程崛起的原因是什么？2、蛋白质工程怎么做？即蛋白质工程的基本原理。3、蛋白质工程进展如何？

板书1、崛起原因：2、基本原理3、进展和前景

（二）教学目标的达成：

1、蛋白质工程崛起的缘由

首先我们来回答第一个问题：崛起的原因是什么？

引导学生回答（生产符合人类需要的非天然蛋白质）

2、蛋白质工程的基本原理

（1）下面我们大家一起分享蛋白质工程的两个成果：

Powerpoint课件展示：“干扰素的耐贮存性”和“lys含量高的玉米”简要过程。

（2）提出问题：上述的两个例子是对蛋白质分子的直接操作吗？

大家看P26左侧第二个问号（《？》），希望它能给你带来很大的帮助。（四人一组）

引导学生回答（不能，第一，改造过的蛋白质无法遗传；第二，改造蛋白质难度大，不易操作）

（3）再提出问题：改造基因为什么就能使蛋白质得以改造呢？基因与蛋白质之间有什么关系？基因如何决定蛋白质的？你还记得吗？

（4）学生讲述基因表达的过程教师板演

由此可见，蛋白质的合成过程是按中心法则进行的。

刚刚我们大家讨论过：要获取人类所需要的非天然的，就要先改造决定它的基因。这个目的基因是什么？怎么知道？依据什么去合成我们所需要的目的基因呢？

大家想一想，讨论一下

（5）引导学生回答，中心法则的逆推过程（板书）

及时的鼓励，同学们的思路，正是科学家们的思路

（6）小小结 其实在蛋白质工程操作过程中一共进行了两次中心法则。但一个假的（中心法则的逆推过程）；一个是真的（为人类生产所需要的非天然的蛋白质）大家看黑板，蛋白质的功能是由DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质或非天然的蛋白质，就要改造DNA，

（7）因此，蛋白质工程的实质是？（对编码蛋白质的基因改造）

（8）原理应该是？（中心法则的逆推）

（9）P27讨论题。

有利于学生对学习内容的理解，也能锻炼学生的思维。Powerpoint课件展示“遗传密码子表”

（10）通过以上的分析和讨论，你能否给蛋白质工程下一个定义呢？

Powerpoint课件以提示

（11）对现有的蛋白质的改造或制造心的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成来实现，因此蛋白质工程最终还是要回到基因工程上来，所以，可以说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。（板书）

3、蛋白质工程的进展和前景

同学们回味一下，基因工程和蛋白质工程的产生和发展离不开人类的需要，离不开社会生产力的需要，离不开理论和技术的支撑。可以说蛋白质工程的前景是光明的，道路是曲折的。

学生齐读P26第一自然段和P28课文，总结蛋白质工程的理论支撑、成果、困难。

尽管路漫漫其修远兮，但吾将上下而求索

七、小结

你有什么收获？

如果你是一个出题者，分值最多的应该分布在哪？（指出重点）

八、巩固练习（见课件）

九、作业：P28“思考与讨论”第2题

十、板书设计

1.4 蛋白质工程的崛起

1、崛起的缘由：

生产符合人类需求的非天然的蛋白质

2、基本原理：

（1）原理：

中心法则的逆推

（2）实质：

改造编码蛋白质的基因

（3）流程：

3、进展和前景：

（1）理论与技术的支撑

（2）现状

蛋白质工程篇2

【摘要】 目的 检测软骨修复组织中蛋白聚糖相关代谢指标，初步探讨在软骨修复过程中基质蛋白聚糖的代谢变化以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)和蛋白聚糖酶(aggrcanases)的作用。方法 松质骨骨基质明胶(bone matrix gelatin， BMG)复合同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨，体内植入修复兔膝关节骨软骨缺损。术后6个月取材检测蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs裂解表位BC-4 以及aggrcanases裂解表位BC-13的表达情况。结果 在修复组织中，蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表达增加，MMPs及其裂解表位BC-4表达减低，而aggrcanases裂解表位BC-13表达阴性。结论 利用蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13的表达情况可以初步了解修复软骨组织中蛋白聚糖的代谢变化，修复软骨组织蛋白聚糖的合成大于分解，MMPs在兔关节修复软骨基质蛋白聚糖的基础代谢和重塑中具有重要作用。

【关键词】 组织工程；修复；软骨基质；蛋白聚糖；基质代谢

ChinaABSTRACT: Objective To examine matrix proteoglycan metabolic markers and probe into the turnover of matrix proteoglycan and enzyme-mediated role of matrix metalloproteinases (MMPs) and aggrecanases in reparative tissues with tissue engineering cartilage. Methods Tissue-engineered cartilage was constructed by cancellous bone matrix gelatin (BMG) with allogeneic chondrocytes in vitro for 2 weeks， then implanted to repair osteochondral defects of rabbit knee joint. Samples were obtained 6 months later to explore the expressions of 3-B-3(-) epitope， MMPs， MMP-generated epitope BC-4 and aggrecanases-generated epitope BC-13. Results In repaired tissues， the expression of 3-B-3(-) epitope increased， but that of MMPs and MMP-generated epitope BC-4 reduced. There was no expression of aggrecanases-generated epitope BC-13. Conclusion Expressions of 3-B-3(-)， MMPs， BC-4 and BC-13 can help probe into the matrix proteoglycan turnover in reparative cartilage tissues. Anabolism exceeds catabolism in the repaired tissues. MMPs play an important role in the conservative baseline turnover of proteoglycan and remodeling of the graft tissues.

KEY WORDS: tissue engineering; repair; cartilage matrix; proteoglycan; matrix turnover

关节骨软骨损伤的治疗一直是骨科临床的难题之一。软骨下钻孔、骨膜以及软骨膜移植效果都不理想，组织工程软骨移植治疗骨软骨损伤取得了良好的效果，修复组织主要为透明样软骨[1]。但是新生组织的功能较正常关节软骨差，这主要是由于新生软骨组织没有达到正常关节软骨基质的组织结构和生物化学性能。软骨基质是软骨特有生理功能的基础，在正常成熟的关节软骨，软骨细胞外基质分子的合成与分解处于动态平衡，以保证软骨组织结构和功能的完整性，因此弄清修复软骨形成过程中基质分子代谢的机制对调控关节软骨的再生和重塑，改善修复软骨质量，促进形成透明软骨，使其更接近或达到正常关节软骨的性能具有重要的意义[2]。目前对软骨修复过程中基质分子机制的研究还很少，软骨基质分子的不同代谢状态可以被不同的抗体特异性识别，如在Ⅱ型胶原的代谢中，CⅡC1R160抗体可特异性地识别软骨细胞新合成的Ⅱ型胶原前体，而Col2-3/4m则可识别降解的胶原片断[3-4]。蛋白聚糖代谢的不同状态也有不同的抗体识别，3-B-3(-)识别软骨细胞新合成的未成熟的蛋白聚糖[5]，BC-4和BC-13分别识别基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)和蛋白聚糖酶(aggrecanases)在蛋白聚糖球间区羧基端的裂解位点[6]。利用这些特异性抗体就可以了解修复过程中软骨基质大分子代谢的变化。关节软骨基质主要由蛋白聚糖和Ⅱ型胶原组成，成人关节软骨内基质胶原10年更新一半[7]，有报道股骨头处胶原的更新大约要400年[8]，而蛋白聚糖大约每年更新一半，在软骨生长期或组织修复过程中代谢会更快，因而蛋白聚糖在修复早期能很好地反映软骨基质代谢的变化。本实验通过构建组织工程软骨移植修复兔膝关节骨软骨缺损，检测细胞外基质蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs裂解表位BC-4以及aggrcanases 裂解表位BC-13的表达情况，初步了解在组织工程修复软骨过程中细胞外基质蛋白聚糖代谢改变以及两种相关调节酶在修复软骨基质重塑中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器和材料

新西兰兔(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，光学显微镜(Nikon，日本)，荧光显微镜(Olympus，日本)，DMEM-F12培养基、胰蛋白酶、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)标记山羊抗小鼠IgG(Gibco，美国)，胎牛血清(北京，元亨圣马)，正常山羊封闭血清液、DAB显色液、山羊抗小鼠IgG-HRP(北京中山金桥)，碘化丙啶(Sigma，美国)，MMP(Chemicon， 美国)，硫酸软骨素酶ABC、单克隆抗体3-B-3、BC-4、BC-13 (英国加的夫大学Bruce Caterson教授提供)。

1.2 松质骨骨基质明胶的制备

取4～5月龄新西兰兔长骨干骺端以及髂骨处松质骨，按文献[9]方法制备松质骨骨基质明胶(bone matrix gelatin， BMG)。将制备的松质骨修成直径约3mm、厚3mm的圆柱状，环氧乙烷灭菌后存于-30℃备用。

1.3 组织工程软骨移植修复膝关节骨软骨缺损

取28d新西兰幼兔1只，无菌条件下分离肱骨、股骨和胫骨关节面软骨，体外单层原代培养[10]后收集细胞，制成107/mL的细胞悬液，按106/管接种到已经放有松质骨BMG的10mL离心管内，静置2h后加入4mL含150mL/L胎牛血清的DMEM-F12培养液，培养2周后移植修复兔股骨内侧髁骨软骨缺损(直径3mm，深3mm；n=6)，术后兔子笼内自由活动。

1.4 组织学染色

手术后6个月取股骨髁修复组织标本，甲醛溶液固定24h，EDTA脱钙1月左右，系列乙醇脱水，石蜡包埋，5μm切片，进行苏木苏-伊红(HE)、甲苯胺兰(TB)、天狼猩红、蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs降解表位BC-4、aggrecanases降解表位BC-13的染色。

1.4.1 3-B-3(-)、BC-13、BC-4免疫荧光染色

石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。于2mL/L Triton X-100室温下25min；加入0.1u硫酸软骨素酶ABC 37℃孵育45min(3-B-3无此步骤)；加50mL/L山羊正常血清封闭液以消除非特异性染色，室温45min，吸去多余液体，不洗；滴加一定比例稀释的一抗(3-B-3、BC-13、BC-4)，4℃过夜(18h以上)；37℃复温45min后加入1∶100稀释的FITC标记的二抗，37℃孵育45min；加碘化丙啶复染细胞核，5min。上述各步间均用PBS缓冲液浸洗3次，每次5min。碳酸盐-甘油封片剂封片，荧光显微镜下观察。

1.4.2 MMPs免疫组织化学染色

石蜡切片，常规脱蜡和水化后，2mL/L Triton X-100室温25min；3mL/L H2O2(甲醛配制)室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；1g/L胰蛋白酶37℃湿盒孵育30min；50mL/L山羊正常血清封闭液37℃ 45min，吸去多余液体，不洗；滴加1∶1000稀释的MMP单克隆抗体，4℃过夜(大于18h)；37℃复温45min后加入1∶100稀释的HRP标记的二抗，37℃孵育45min。上述各步间均用PBS缓冲液浸洗3次，每次5min。滴加新鲜配制的DAB，室温显色10min，蒸馏水洗。苏木素复染，水性封片剂封片，光学显微镜下观察。

2 结 果

2.1 形态学观察

松质骨BMG复合软骨细胞移植体内修复同种异体兔膝关节骨软骨缺损，术后6个月肉眼观察显示修复组织与周围正常软骨已愈合，修复组织表面基本平整，颜色与周围正常软骨组织近似(图1A)。HE染色显示修复交界区整合良好，不易辨认。修复组织为透明样软骨组织，深层细胞柱状排列，软骨细胞存在软骨陷窝内，重建了软骨下骨板(图1B)。基质染色显示修复组织基质蛋白聚糖(图1C)和胶原(图1D)表达接近周围正常软骨，分布均匀。

2.2 蛋白聚糖代谢改变

修复组织中下层3-B-3(-)表达阳性，细胞浆染成绿色，显示修复组织合成新的蛋白聚糖(图2A)。BC-13在修复组织和周围正常软骨染色都为阴性(图2C)。MMPs主要存在于修复组织的中下层，部分细胞质染成棕黄色(图2D)。MMPs裂解表位BC-4染色阳性，细胞质染成绿色，中下层染色重(图2F)。

3 讨 论

关节软骨没有血液供应和神经支配，损伤后自身修复能力有限，许多学者尝试用组织工程化软骨来修复关节缺损，获得了较为满意的效果，修复组织主要为透明样软骨。但是新生软骨的功能差于正常关节软骨，这可能是由于新生软骨组织尚未达到正常关节软骨基质的组织结构和生物化学性能，而软骨基质是软骨特有生理功能的基础，所以临床上要想重建关节软骨，恢复关节的功能，修复软骨组织基质分子代谢的机制研究就显得很重要。本实验应用4种单克隆抗体3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13，初步探讨组织工程修复软骨基质中蛋白聚糖的代谢及两种相关调节酶MMPs和aggrecanases的作用。

蛋白聚糖是软骨基质的主要成分之一，填塞于Ⅱ型胶原所构成的网状结构中，单体由一条核心蛋白与一至上百条氨基聚糖链组成。蛋白聚糖含有许多酸性基团，能吸纳大量的水分，从而保证关节软骨良好的黏弹性，完成抵抗压力的功能。

3-B-3(-)是指在利用3-B-3作为一抗孵育前，不用硫酸软骨素ABC酶对样本进行预处理。3-B-3(-)识别的位点是一个由饱和的己糖醛酸和一个N-乙酰半乳糖胺构成的二糖单位，该位点位于完整的CS链末端，在有3-B-3(-)表达的地方，说明此处存在有新合成的蛋白聚糖。利用3-B-3(-)进行的一系列研究发现：其主要表达于未成熟和处于生长、重构期的关节软骨组织，正常成年关节软骨肥大细胞区[5]。3-B-3(-)的表达常被视为蛋白聚糖合成的标志，在修复软骨组织中，新合成蛋白聚糖意味着软骨细胞试图修复、重塑软骨组织。本研究中修复组织3-B-3(-)表达位于修复组织中下层，显示修复组织合成新的蛋白聚糖。

MMPs和aggrecanases是调控软骨细胞外基质蛋白聚糖代谢最主要的两种酶。MMPs降解蛋白聚糖时最重要的裂解位点位于核心蛋白(interglobulin domain， IGD)Asn341～Phe342之间，酶切这一肽键可以产生C-末端序列为VDIPEN的新表位，是 BC-4特异性的识别位点；aggrecanases降解蛋白聚糖时最重要的裂解位点位于IGD区Glu373～Ala374之间，酶切这一肽键可以产生C-末端序列为NITEGE的新表位，可以被BC-13特异性识别[12]。研究显示在人的软骨组织代谢中，MMPs和aggrecanases两种酶在正常关节软骨基质蛋白聚糖的基础代谢、软骨损伤蛋白聚糖的降解以及修复软骨组织重塑中都具有重要作用[13-14]。但在动物体内外实验研究显示，MMPs和aggrecanases在基质蛋白聚糖代谢中的作用不同。

体外培养兔[15]、猪[16]的软骨组织发现，aggrecanases降解片段表达阴性，而MMPs降解片段表达阳性，当用炎性因子IL-1刺激后，aggrecanases活性明显增强，降解片断增加，而MMPs活性表达不变，或改变不明显。鼠关节炎关节软骨中aggrecanases的降解片段表达明显增加，而敲除aggrecanases基因，可以明显减轻或阻止鼠关节炎的发生[17-19]。以上结果显示MMPs 在基质蛋白聚糖的基础代谢中起重要作用，而aggrecanases的主要作用是在软骨受到损伤时降解蛋白聚糖。本实验中，MMPs及其降解片段BC-4在体内修复组织和正常软骨组织表达阳性，而aggrecanases的降解片段BC-13表达阴性，显示MMPs在兔软骨基质蛋白聚糖基础代谢以及修复重塑中起重要作用，与文献报道一致，而aggrecanases主要作用是在软骨受到损伤时降解蛋白聚糖[15，20]。

关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，软骨细胞合成并分泌蛋白聚糖和胶原在内的多种基质成分，同时也合成多种降解基质的酶。生理情况下，成熟软骨组织细胞外基质的合成和分解之间相互制约，相互作用，维持着代谢的动态平衡，从而保证软骨组织结构和功能的完整性[2，21]。在骨关节炎(osteoarthritis， OA)及急性关节损伤等病理状态下，这种动态平衡被打破，各种损伤因素可以引起肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)、白细胞介素1(interleukin-1， IL-1)升高，组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase， TIMP)和ɑ-2巨球蛋白(ɑ-2 macroglobulin， ɑ2M)表达下降，MMPs和aggrecanases表达增加，活性增强，细胞外基质蛋白聚糖和胶原分解大于合成，关节软骨受损，功能减弱[22-23]。

在关节软骨损伤过程中蛋白聚糖与胶原的代谢变化以及和相关调节分子之间的关系已有了一定的了解，而在修复过程中这些分子的表达状况及其关系研究的很少。FRISBIE[24]和BARNEWITZ[25]用构建的组织工程软骨移植修复关节骨软骨缺损，在缺损处形成透明样软骨，但是修复组织质量差于正常关节软骨。软骨组织代谢比较慢，修复的软骨组织是否会随着时间的推移发生重塑，接近或达到正常关节软骨的生物性能？要回答上面的问题，软骨修复过程中基质分子代谢机制的研究就很重要。JAMES等[26]体外构建的组织工程软骨，在生理机械力作用下IL-1、MMP-1、aggrecanases等表达下降，转化生长因子-β表达上升，胶原和糖氨聚糖合成增加。根据相关研究[26-27]推测，在软骨修复过程中，参与细胞外基质合成代谢的大分子(TIMP、ɑ2M等)表达增多、活性增强，而参与分解代谢的大分子(MMPs、aggrecanases等)则相对表达降低、活性减弱，胶原和蛋白聚糖合成大于分解，才能修复软骨缺损。在本研究中，软骨修复组织蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表达增加，而MMPs及其降解表位BC-4表达降低，修复组织合成代谢大于分解代谢，修复损伤的软骨组织，这与生长期软骨组织的合成代谢大于分解代谢相似[2]。软骨组织代谢比较慢，随着时间的推移修复软骨组织的合成与分解代谢是否会达到平衡，是否会成功重塑、再生损伤的软骨，使其接近或达到正常关节软骨还需要做进一步的长期研究。

参考文献

[1]CHUNG C， BURDICK JA. Engineering cartilage tissue [J]. Adv Drug Deliv Rev， 2008， 60:243-262.

[2]AIGNER T， SOEDER S， HAAG J. IL-1 and BMPs interactive players of cartilage matrix degradation and regeneration [J]. Eur Cell Mater， 2006， 12:49-57.

[3]AURICH M， MWALE F， REINER A， et al. Collagen and proteoglycan turnover in focally damaged human ankle cartilage [J]. Arthritis Rheum， 2006， 54(1):244-252.

[4]FRASER A， FEARON U， BILLINGHURST RC， et al. Turnover of type II collagen and aggrecan in cartilage matrix at the onset of inflammatory arthritis in humans [J]. Arthritis Rheum， 2003， 48(11):3085-3095.

[5]LIN PM， CHEN CT， TORZILLI PA. Increased stromelysin-1 (MMP-3)， proteoglycan degradation (3B3- and 7D4) and collagen damage in cyclically load-injured articular cartilage [J]. Osteoarthritis Cart， 2004， 12(6):485-496.

[6]JANUSZ MJ， LITTLE CB， KING LE， et al. Detection of aggrecanase- and MMP-generated catabolic neoepitopes in the rat iodoacetate model of cartilage degeneration [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2004， 12(9):720-728.

[7]THOMPSON RC Jr， ROBINSON HJ Jr. Articular cartilage matrix metabolism [J]. J Bone Joint Surg Am， 1981， 63A(2):327-331.

[8]EYRE D. Collagen of articular cartilage [J]. Arthritis Res， 2002， 4(1):30-35.

[9]LI XD， JIN Li， BALIAN G， et al. Demineralized bone matrix gelatin as scaffold for osteochondral tissue engineering [J]. Biomaterials， 2006， 27:2426-2433.

[10]魏西秦，曹峻岭，熊咏民. 兔软骨细胞培养方法研究 [J]. 中国地方病学杂志，1987， 6(2):89-92.

[11]HUANG K， WU LD. Aggrecanase and aggrecan degradation in osteoarthritis:a review [J]. J Int Med Res， 2008， 36(6):1149-1160.

[12]HAYES AJ， HUGHES CE， CATERSON B. Antibodies and immunohistochemistry in extracellular matrix research [J]. Methods， 2008， 45:10-21.

[13]STRUGLICS A， LARSSON S， PRATTA MA， et al. Human osteoarthritis synovial fluid and joint cartilage contain both aggrecanase- and matrix metalloproteinase-generated aggrecan fragments [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2006， 14(2):101-113.

[14]ROBERTS S， HOLLANDER AP， CATERSON B， et al. Matrix turnover in human cartilage repair tissue in autologous chondrocyte implantation [J]. Arthritis Rheum， 2001， 44(11):2586-2598.

[15]SABATINI M， THOMAS M， DESCHAMPS C， et al. Effects of ceramide on aggrecanase activity in rabbit articular cartilage [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2001， 283(5):1105-1110.

[16]HUGHES CE， LITTLE CB， BUTTNER FH， et al. Differential expression of aggrecanase and matrix metalloproteinase activity in chondrocytes isolated from bovine and porcine articular cartilage [J]. J Biol Chem， 1998， 273(46):30576-30582.

[17]GLASSON SS， ASKEW R， SHEPPARD B， et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis [J]. Nature， 2005， 434:644-648.

[18]MAJUMDAR MK， ASKEW R， SCHELLING S， et al. Double-knockout of ADAMTS-4 and ADAMTS- 5 in mice results in physiologically normal animals and prevents the progression of osteoarthritis [J]. Arthritis Rheum， 2007， 56(11):3670-3674.

[19]LITTLE CB， MEEKER CT， GOLUB SB， et al. Blocking aggrecanase cleavage in the aggrecan interglobular domain abrogates cartilage erosion and promotes cartilage repair [J]. Clin Invest， 2007， 117(6):1627-1636.

[20]SANDY JD. A contentious issue finds some clarity: on the independent and complementary roles of aggrecanase activity and MMP activity in human joint aggrecanolysis [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2006， 14(2):95-100.

[21]HENDREN L， BEESON P. A review of the differences between normal and osteoarthritis articular cartilage in human knee and ankle joints [J]. Foot， 2009， 19:171-176.

[22]ROWAN AD. Cartilage catabolism in arthritis:factors that influence hemeostasis [J]. Expert Rev Mol Med， 2001， 3(17):1-20.

[23]ABRAMSON SB. Osteoarthritis and nitric oxide [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2008， 16 (2):15-20.

蛋白质工程篇3

关键词：黔式腊肉；木瓜蛋白酶；中性蛋白酶；风味物质

中图分类号：TS251.6 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）08-0016-05

黔式腊肉作为我国传统肉制品的重要组成部分及典型代表，因其色泽美观、香气浓郁、味道独特而著称。传统工艺由于加工工艺落后、生产周期长、受季节限制大等问题[1]，正逐渐被现代腊肉加工工艺代替，但是现代工艺生产的腊肉风味不及传统工艺浓郁。为此，研究人员对低盐处理、紫外辐照和臭氧处理等工艺进行了研究，以期促进腊肉风味的形成及改善[2-3]。

生物酶对腊肉风味的形成有着重要的作用，它能够促进蛋白质水解以及脂肪的水解及氧化，生成肽、游离氨基酸、游离脂肪酸等重要的风味前体物质。由于内源酶作用机理较复杂，影响因素较多[4-9]，多数研究者从外源酶着手研究其对肉制品风味的影响。Fernández等[10]将胰脂酶添加到发酵香肠中，发现其可以促进风味的形成，还可以缩短成熟时间；罗等[11-12]分别将木瓜蛋白酶、胰蛋白酶添加到腊肉中，提高了游离氨基酸和风味物质的含量；闫文杰等[13]从猪肉中提取组织蛋白酶和脂肪酶添加到腊肉原料肉中，大部分风味物质都有所增加；田怀香等[14]采用Protaxnex和Flavourzyuie酶组合水解金华火腿制备提取物，得到产品风味较佳；穆建稳等[15]将中性蛋白酶添加到腊牛肉中，促进了蛋白质的降解。但是关于向黔式腊肉中添加酶制剂还未见研究，本研究向黔式腊肉中添加木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，并进行优化组合，在较短时间内使蛋白质降解，促进腊肉独特风味的形成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪肉 贵州黔五福食品有限公司；木瓜蛋白酶（酶活105U/g）、中性蛋白酶（酶活105U/g） 北京索莱宝科技有限公司；其他实验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ZSJ型盐水注射器、GR50型真空滚揉机 诸城市双春包装机械公司；KYXX型烟熏炉 嘉兴市凯斯不锈钢机械制造有限公司；FA2004N型电子天平 上海菁海仪器有限公司；78-1型磁力搅拌器 金坛市华峰仪器有限公司；L-8800型氨基酸自动分析仪 日本日立公司；HP6890-5975C型GC-MS联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 黔式腊肉加工工艺

鲜肉切块腌制（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶溶解于盐水，注射到猪肉中，真空滚揉30min后干腌3d）烘烤、烟熏（70℃烘烤3h后烟熏24h）自然风干（24h）真空包装得成品。

1.3.2 取样

在腊肉生产过程中分别于原料肉（A样）、腌制结束（B样）、熏烤结束（C样）、自然风干24h后的成品（D样）工艺点随机取相同质量的样品，每次每个工艺点取样500g，取出的样品待用。

1.3.3 总氮、非蛋白氮、氨基态氮及挥发性盐基氮的测定

总氮测定（total nitrogen，TN）：参照GB 5009.5―2010《食品安全国家标准：食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；非蛋白氮的测定（non-protein nitrogen，NPN）：参照赵改名等[16]的方法；氨基态氮（amino nitrogen，AN）的测定：参照文献[17]；挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen）测定：参照GB/T 5009.44―2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法。

1.3.4 游离氨基酸测定

称取样品1.00g加入到50mL水中，振荡混匀，取出4mL溶液，加入到4mL 100g/L磺基水杨酸溶液中沉淀12h，10000r/min离心25min，取一定体积的上清液调至pH2左右，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上机用自动氨基酸分析仪测定。

色谱条件：离子交换柱：2.6mm×150mm；可见光检测器：波长570nm、440nm；流动相：柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液；流速：0.225mL/min；进样量：50μL。

1.3.5 挥发性风味物质的测定

称取样品10g，切碎后置于50mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在85℃顶空萃取30min取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250℃）中，热解吸3min进样。

气相色谱条件：色谱柱为ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane（30m×0.25mm，0.25μm）弹性石英毛细管柱，柱温45℃（保留2min），以4℃/min升温至220℃，保持2min；汽化室温度250℃；载气为高纯He （99.999%）；柱前压53kPa，载气流量1.0mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1.5min。

质谱条件：离子源为（electron ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1216V；接口温度280℃；质量范围m/z 20～450。

1.3.6 感官评定

由实验室10人组成感官评定小组。以色泽（表面、内部以及整体）、质地（表面、内部）、口感（咸度、甜度及硬度）和风味（烟熏味及腊香味）作为感官评定的指标。采用九点标度法[18]，满分9分，9=极好，8=良好，7=好，6=次好，5=一般，4=一般以下，3=差，2=很差，l=极差。

2 结果与分析

2.1 黔式腊肉酶解工艺优化

图 1 各单因素对黔式腊肉风味的影响

Fig.1 Effect of different dosages of papain and neutral protease， salt content and hydrolysis time on the sensory score of Guizhou bacon

分别对木瓜蛋白酶添加量、中性蛋白酶添加量、食盐添加量和酶解时间进行单因素试验，结果见图1。由单因素试验结果初步确定，选择木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量4%、酶解时间36h。

在单因素试验的基础上，结合感官评定得分以及氨基态氮含量，确定两种蛋白酶添加量（g酶/g肉）、食盐添加量和酶解时间，进行正交试验，结果如表1所示。以黔式腊肉中氨基态氮含量为评定指标，由极差分析可得出影响其酶解的因素主次顺序为：A木瓜蛋白酶添加量>B中性蛋白酶添加量>C食盐添加量>D酶解时间，最优酶解条件为A3B3C2D3，即木瓜蛋白酶添加量0.005%、中性蛋白酶添加量0.005%、食盐添加量4%、酶解时间48h。经实验验证，此时氨基态氮含量为318.72mg/100g。以感官评定得分为评定标准，经极差分析得出黔式腊肉最优酶解条件为A2B2C3D3，即木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量6%、酶解时间48h。虽然食盐在腊肉加工储藏过程中具有抑菌防腐作用，添加蛋白酶能促进蛋白质水解，但是盐分含量过高对健康不利，蛋白酶添加量过高产品感官欠佳并且会提高经济成本。综合考虑影响黔式腊肉酶解的因素，最优酶解条件为A2B2C2D3，即木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量4%、酶解时间48h。在此条件下所得黔式腊肉产品整体色泽鲜明、口感和质地较好、腊香味明显。

2.2 酶解工艺优化腊肉与未加酶处理腊肉的比较分析

2.2.1 非蛋白氮含量比较

非蛋白氮是除蛋白质以外的多肽、短肽及游离氨基酸等小分子含氮物质，是重要的风味前体物质，能够直接反映出腊肉中蛋白质的降解程度。由图2可看出，未加酶与加酶的样品，非蛋白氮含量在加工过程中都呈上升趋势，由原料肉的0.55%分别上升到1.53%和3.02%，这是黔式腊肉加工过程中蛋白质发生降解的结果。未加酶的样品在腌制结束后非蛋白氮含量下降，是由于腌制阶段非蛋白氮随着盐水的渗出而流失。添加蛋白酶的样品非蛋白氮的含量高于未添加蛋白酶的样品，并且差异显著（P

图 2 黔式腊肉加工过程中非蛋白氮变化

Fig.2 Change in NPN content during Guizhou bacon production

2.2.2 氨基态氮含量比较

氨基态氮主要来自于蛋白质和多肽的降解，在一定程度上也能够反映出蛋白质的水解程度，水解产物氨基酸是腊肉中重要的风味前体物质，对腊肉的风味有重要影响。由图3可知，在黔式腊肉加工过程中，未加酶与加酶样品氨基态氮均呈上升趋势。加酶后氨基态氮含量由原料肉的150.24mg/100g上升到成品的281.51mg/100g，增加了1.87倍，比未加酶成品的含量高57.86mg/100g。在腌制阶段，未加酶样品氨基态氮含量随盐水流失而下降，加酶样品中氨基态氮虽有流失但含量依然显著增加，这是由于添加蛋白酶的样品在腌制阶段蛋白质剧烈水解，之后的过程中外源蛋白酶活性逐渐降低。

图 3 黔式腊肉加工过程中氨基态氮变化

Fig.3 Change in AN content during Guizhou bacon production

2.2.3 挥发性盐基氮含量比较

挥发性盐基氮是蛋白质分解生成的氨及胺类等碱性含氮物质，其含量标志着肉及肉制品的腐败变质程度。由图4可看出，两种样品在加工过程中，挥发性盐基氮都在不断上升，未加酶和加酶样品的挥发性盐基氮由原料肉的6.26mg/100g分别上升到成品的16.54mg/100g和20.42mg/100g，并且腌制阶段上升速率较快。在整个加工过程中，加酶样品的挥发性盐基氮含量均高于未加酶样品，这是由于添加蛋白酶加快了氨基态氮和多肽氮的生成速度，在一定程度上促进了挥发性盐基氮的产生[19]。

图 4 黔式腊肉加工过程中挥发性盐基氮变化

Fig.4 Change in TVBN content during Guizhou bacon production

2.2.4 游离氨基酸比较

腊肉样品中添加蛋白酶，能够促进蛋白质降解生成游离氨基酸，游离氨基酸又可以进一步反应形成挥发性风味物质[20]。因此游离氨基酸含量能反应出腊肉中蛋白质降解程度以及风味特征。由表2中未加蛋白酶的样品与添加蛋白酶的样品游离氨基酸含量对比可知，添加外源蛋白酶后，游离氨基酸的总含量增加，比未加蛋白酶的样品增加了30.98%。大多数游离氨基酸的含量都有所增加，其中以组氨酸增加最多，其次是酪氨酸、谷氨酸和赖氨酸。此外，添加蛋白酶样品中检测出缬氨酸，且含量较高（120.6mg/100g），这在未加蛋白酶样品中未检测到。天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸和组氨酸的含量与肉制品的风味密切相关，添加外源蛋白酶后，这几种游离氨基酸的含量都有所增加，有利于黔式腊肉风味的形成。添加蛋白酶后，必需氨基酸由6种增加到7种，总含量415.04mg/100g增加到640.69mg/100g，腊肉产品的营养价值也有一定程度的提高。

2.2.5 风味成分比较

经SPME-GC-MS检测分析，得出黔式腊肉未加酶与加酶样品挥发性风味物质成分及相对含量结果见表3。未添加蛋白酶与添加蛋白酶样品的主体风味物质为醇类、烃类、酚类、酯类和羰基化合物，添加蛋白酶样品中共鉴定出65种挥发性风味物质成分，比未添加蛋白酶样品多10种，这说明添加外源蛋白酶促进了蛋白质降解，生成更多的游离氨基酸，进而促进挥发性风味物质的形成。

挥发性风味物质种类及相对含量分析结果见表4。添加蛋白酶后，风味物质种类除烃类和羰基类化合物外，都有所增加。其中，酚类、醇类和其他类化合物增加3种，酸类增加2种，酯类增加1种。对风味物质相对含量而言，烃类、酚类和醇类分别增加了3.87%、3.72%和2.76%，酯类减少了10.11%，羰基类、酸类和其他类化合物变化不大。

3 结 论

3.1 由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组合酶解正交试验结果得出黔式腊肉最优酶解条件为：木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量4%、酶解时间48h。

3.2 添加蛋白酶样品，非蛋白氮、氨基态氮、挥发性盐基氮的含量以及游离氨基酸种类和总量均高于未加酶样品，加入蛋白酶促进了蛋白质降解以及风味物质的形成。

3.3 添加蛋白酶样品中共鉴定出65种挥发性风味物质成分，比未添加蛋白酶样品多10种。添加蛋白酶后，风味物质种类除烃类和羰基类化合物外，都有所增加。烃类、酚类和醇类相对含量增加，酯类相对含量减少，羰基类、酸类和其他类化合物变化不大。

参考文献：

[1] 周光宏， 赵改名， 彭增起. 我国传统腌腊肉制品存在的问题及对策[J]. 肉类研究， 2003， 17（1）： 3-7.

[2] 冯彩平， 任发政， 高平. 低盐腊肉的研制及其贮藏性能的研究[J]. 食品与发酵工业， 2004， 30（5）： 131-133.

[3] Talon R， MONTEL M C， GANDEMER G， et al. lipolysis of pork fat by Staphylococcus warneri， S. saprophyticus and Micrococcus varians[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 1993， 38（5）： 606-609.

[4] Huan Yanjun， Zhou Guanghong， Zhao Gaiming， et al. Changes in flavor compounds of dry-cured Chinese Jinhua ham during processing[J]. Meat Science， 2005， 71（2）： 291-299.

[5] 谢婷， 李诚. 内源性蛋白酶在宰后猪肉成熟过程中的作用[J]. 肉类研究， 2008， 22（6）： 11-14.

[6] Garcia-Garrido J A， Quiles-Zafra R， TaPiador J， et al. Activity of cathepsin B， D， H and L in Spanish dry-cured ham of normal and defeetivetexture[J]. Meat Science， 2001， 56（1）： l-6.

[7] Toldrd F， Aristoy M C， Flores M. Contribution of muscle aminopeptidases to flavor development in dry-cured ham[J]. Food Research International， 2000， 33（3）： 181-185.

[8] 赵改名， 周光宏， 徐幸莲. 肌肉内源蛋白酶及其在干腌火腿加工过程中的作用[J]. 食品与发酵工业， 2003， 29（4）： 70-75.

[9] 陆瑞琪， 郇延军， 孙敬， 等. 金华火腿现代化生产过程中脂质及内源酶的变化特点[J]. 食品与机械， 2008， 24（3）： 17-20.

[10] Fernández M， de la HOZ L， Díaz O， et al. Effect of the addition of pancreatic lipase on the ripening of dry-fermented sausages-Part 2. Free fatty acids， short-chain fatty acids， carbonyls and sensory quality[J]. Meat Science， 1995， 40（3）： 351-362.

[11] 罗， 崔建云， 陈尚武， 等. 添加木瓜蛋白酶对腊肉风味的影响研究[J]. 肉类研究， 2005， 19（10）： 25-28.

[12] 罗， 崔建云， 陈尚武， 等. 胰蛋白酶对腊肉风味形成的影响研究[J]. 食品工业科技， 2006， 27（12）： 61-64.

[13] 闫文杰， 李兴民， 何立千， 等. 添加酶对快速腌制腊肉风味的影响[J]. 食品与发酵工业， 2008， 34（4）： 175-177.

[14] 田怀香， 王璋， 许时婴. 酶法提取金华火腿中的风味前体物质[J]. 食品与机械， 2005， 21（2）： 1-5.

[15] 穆建稳， 董全， 李洪军. 中性蛋白酶对腊牛肉加工中蛋白质影响的研究[J]. 食品研究与开发， 2012， 33（8）： 14-17.

[16] 赵改名， 周光宏， 柳艳霞， 等. 肌肉非蛋白氮和游离氨基酸在金华火腿加工过程中的变化[J]. 食品科学， 2006， 27（2）： 33-37.

[17] 黄群， 麻成金， 欧阳玉祝， 等. 传统湘西酸肉发酵动态与Nisin保鲜试验[J]. 食品与发酵工业， 2008， 34（4）： 167-170.

[18] 周明超， 张春晖， 郭伟. 磷酸盐对西式蒸煮火腿质构影响研究[J]. 食品研究与开发， 2000， 27（9）： 143-146.

蛋白质工程篇4

目的: 制备和鉴定抗his标签单克隆抗体（mab）, 初步建立检测和纯化带his标签融合蛋白的方法。方法: 用碳化二亚胺法合成his-tag完全抗原, 免疫balb/c小鼠, 采用杂交瘤技术进行细胞融合, 通过有限稀释法和间接elisa法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水, 用辛酸-硫酸铵法纯化, 并对纯化的mab进行特异性鉴定。结果: his-tag完全抗原偶联成功, 经细胞融合、 筛选及克隆化, 成功获得1株分泌his标签mab的杂交瘤细胞株。制备腹水测得腹水效价高于 1∶106, 且此株mab与其他融合蛋白标签无交*反应, 并在含his标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论: 成功制备了1株his标签mab, 为带his标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。 【关键词】 his标签 单克隆抗体 蛋白印迹

his-tag是由6个组氨酸(his-his-his-his-his-his)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化, his-tag 融合标签与其他标签相比有很多明显优势, 是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种［1］。利用 his标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。目前商品化his-tag的单克隆抗体(mab)种类不多, 且价格也十分昂贵。因此, 研制出 his-tag的mab, 在融合蛋白质的研究中具有非常广泛的应用前景。

1 材料和方法

1.1 材料 his六肽为西安蓝晶生物科技有限公司合成; 卵清白蛋白 (ova)、 牛血清白蛋白（bsa）、 兔抗小鼠 iga、 igg1、 igg2a、 igg2b、 igg3和igm抗体均购自sigma公司; hrp标记的羊抗鼠 igg由河南省生物工程技术研究中心提供; multiskan mk3酶标仪购自thermo公司; 3326型co2培养箱购自forma公司; 硝酸纤维素膜（nc膜）购自amersham公司; sds-page电泳仪购自bio-rad公司; balb/c纯系雄性小鼠（鼠龄6～8周, 体质量18～22 g）购自中国医学科学院动物研究所。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成 （1）免疫原的合成: 称取4.4 mg his-tag和5 mg ova溶于1 ml pb（0.05 mol/l, ph7.0）中, 充分溶解后, 将200 μl含有2.2 mg edc的pb溶液逐滴加入, 边滴入边混匀, 摇床100 r/min反应4 h, 4℃静置过夜, 用 0.01 mol/l, ph7.0 pbs透析 72 h, 存储于-20℃备用。（2）包被抗原的合成: 合成方法同免疫抗原的合成,载体蛋白为 bsa。

1.2.2 杂交瘤细胞株的建立 按本室常规方法免疫balb/c小鼠（20～30 μg /只）, 末次免疫后免疫小鼠血清效价达到 1∶10 000以上, 进行细胞融合, 并以间接elisa法筛选分泌抗 his-tag的阳性克隆。克隆化及腹水制备, 均按实验室常规方法进行。

1.2.3 mab特性鉴定 （1）效价测定: 以 bsa-his-tag（100 ng/孔）包被 elisa 板, 腹水从 1∶10 00 开始作10倍稀释。用间接 elisa法进行测定。（2）mab特异性鉴定: 用于抗体交*反应性研究的为常用蛋白标签, c-myc、 多聚精氨酸、 flag、 钙调蛋白结合多肽、 β-actin、 谷胱甘肽s转移酶 (gst)、 葡萄球菌蛋白a(spa)、 麦芽糖结合蛋白、 硫氧化还原蛋白及 ig的 fc段, 用间接 elisa法测定。（3）抗体蛋白纯度测定: 　抗体纯度测定采用 sds-page凝胶电泳分析。（4）ig类和亚类的鉴定: mab类型及亚类鉴定采用双向琼脂扩散试验［2］和用兔抗小鼠 iga、 igg1、 igg2a、 igg2b、 igg3和 igm酶标抗体的间接 elisa试验检测。

1.2.4 mab在检测带his-tag的融合蛋白中的初步应用 （1）酶标抗体的制备及活性测定: 酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法［3］。酶标抗体活性测定方法: 将包被抗原用包被液稀释成100 ng/孔包被96孔酶标板, 4℃过夜, 洗涤后分别加入梯度稀释的酶标抗体, 37℃温育 30 min, 洗涤; 加底物显色 20 min, 加终止液终止反应, 用酶标仪测吸光值。取a值为1.0左右时所对应的酶标抗体稀释倍数为其效价。（2）融合蛋白的检测: 采用蛋白印迹法对本基因工程实验室所纯化的带his-tag的基因工程蛋白进行检测［4］。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞株的建立及mab的特性鉴定 获得1株高亲和力、 高特异性杂交瘤细胞, 命名为 3a-3。此株细胞经过多次传代、 3次冻存及复苏, 杂交瘤细胞分泌抗体稳定。此株mab经检测, 腹水效价达到 2×10-6 ; mab经双向琼脂扩散试验和间接elisa法检测为: igg1; 各种融合蛋白标签与his-tag mab均无交*反应性; sds-page电泳结果显示: 抗体纯度≥90%。

2.2 酶标抗体活性测定结果 由酶标仪（双波长450 nm和630 nm）检测a值, 测得酶标抗体活性达106。

2.3 带his-tag的融合蛋白检测结果 western blot结果显示, 制备的mab与带his-tag的融合蛋白有较强的特异性反应（图1）。

图1 带his-tag的融合蛋白检测结果（略）

a, c: sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳; b, d: western blot检测结果.

图1b和图1d分别是图1a和图1c的对应。其中11是不带his-tag的阴性对照, 其余所用的12种蛋白均为本实验室纯化的带his-tag的基因工程蛋白。其中1、 10中his6-tag与 rgs—相连, 位于基因工程蛋白n端, 2、 4、 5、 6、 8、 12、 13中his-tag位于基因工程蛋白内部, 3、 7、 9中his-tag位于基因工程蛋白c端。结果表明, 此株mab与河南省生物工程技术研究中心基因工程实验室所有带his-tag的基因工程蛋白反应均呈阳性, 与不带his-tag的基因工程蛋白无反应, 故此株mab可以用于检测带his-tag的基因工程融合蛋白。

3 讨论

融合标签根据其相对分子质量(mr)大小可以分为两大类: 大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段（his-tag等）。虽然有些作用机制尚不明确, 但已证实融合标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、 控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、 使体内生物事件可视化、 提高重组蛋白质的产量、 增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等［5］。标签融合蛋白所具有的上述优越性, 使之成为后基因组时代的重要研究工具, 而抗标签蛋白的mab也将成为研究相应融合蛋白的主要方法之一。 his6-tag由于其mr小, 单独不具备免疫原性, 故需将其连接到蛋白质大分子上, 从而借助大分子的t细胞表位, 刺激机体产生特异性抗体免疫应答。本试验采用碳化二亚胺法制备出了人工抗原。从免疫效果来看, 该方法合成的his6全抗原免疫原性较好, 能使机体产生较强的免疫应答, 小鼠抗血清效价（elisa）达到106以上。应用淋巴细胞杂交瘤技术获得的此株抗his6-tag的mab, 经鉴定具有效价高、 特异性强、 亲和力高等特点。在含his6-tag融合蛋白的鉴定中, his6-tag的mab与n端、 内部、 c端带his6-tag的基因工程蛋白均能发生反应, 取得预期效果。此将为后基因组时代大量涌现的新分子的结构和功能研究提供重要的工具, 有很高的实用价值。

目前纯化带his-tag的基因工程蛋白多采用固定化金属螯合层析, 利用过渡态金属离子与组氨酸侧链之间的相互作用进而分离目的蛋白。虽然用此法纯化his6-tag融合蛋白与其他标签融合蛋白相比有很多明显优势, 但此法也有其缺点: 在金属离子存在的情况下, 多聚组氨酸倾向于形成一种hem-like的结构, 这是一种疏水性的结构, 因而与某些蛋白质融合后, 有被埋藏在融合靶蛋白质内部的可能性［5］; 用咪唑洗脱会导致蛋白质的聚集。另外, 带his-tag的基因工程蛋白的纯化率还有一定上升空间, 能否通过his亲和层析柱在尽量低损失的情况下来有效填补空缺, 仍需要进一步的实验摸索。

【参考文献】

［1］ terpe k. overview of tag protein fusions: from molecular and bio-chemical fundamentals to commercial systems［j ］. appl microbiol bio-technol, 2003, 60: 523-533.

［2］ 余冰宾. 生物化学实验指导［m］. 北京: 清华大学出版社, 2004: 123-124.

［3］ 杨利国, 魏平华, 郭爱珍, 等. 酶免疫测定技术［m］. 南京: 南京大学出版社,1998: 189-210.

蛋白质工程篇5

摘要：简要介绍了叶蛋白的应用现状，综述了叶蛋白各种提取方法，探讨了其今后的发展方向。

关键词：叶蛋白 提取 发展方向

0前言

随着世界人口的迅速增加，蛋白质资源匮乏，人类对在短期内不可能满足从动物食品中对优质蛋白的摄取，且动物蛋白中含有大量对人体生长发育不利的饱和脂肪酸和胆固醇，可导致动脉粥僵硬化等疾病的发生。

研究表明，绿色植物茎叶是一种含量很大的天然蛋白质资源，从中提取出的叶蛋白具有营养丰富、不含动物性胆固醇，且能防衰抗老、强身健体等有点而备受人们青睐。我国植物资源丰富，提取叶蛋白的原料有其来源主要有禾本科牧草、苋菜、苦荬菜、甜菜、萝卜等。以及新鲜幼嫩的树叶和水生植物等。叶蛋白的开发利用可以缓解当今世界蛋白质严重短缺的矛盾，对于增进人体健康有着十分重要的意义，也是当前叶蛋白研究的热点。本文简要介绍了叶蛋白的种类及其应用，综述了叶蛋白的提取方法，并对以后的发展趋势进行了探讨。

1叶蛋白的应用现状

1.1用于保健食品

从植物新鲜绿叶中提取的叶蛋白，因其营养价值高而受到食品生产者的重视。叶蛋白在叶中形成的初始蛋白，其蛋白分子链短、易被消化吸收，可将其用于食品如面食、糖果、奶粉等中作为添加剂。用来提高食品中的营养物质成分，具有很高的营养价值和食用效果，既满足人体对蛋白质、胡萝卜素、多酚等营养物质的需要，也对食品的口感风味和其工艺特性等副作用。法国教授D.c.Dillon研究认为，10kg体重的儿童如果每天摄入10g叶蛋白，就可满足对铁100％需求，对叶酸50％需求，对蛋白质40％需求，对VA3倍的需求。也可将叶蛋白单独制成保健产品，可以提高血液中血红蛋白的水平，缓解由于蛋白质摄入不足而引起的贫血等功能，具有很大的开发空间。叶蛋白含有不饱和脂肪酸、不含胆固醇，富含多种糖、维生素和矿质元素等优点。

1.2用于饲料工业

随着养殖畜牧业的迅猛发展，蛋白质饲料在我国严重短缺，饲料工业如果仅依靠现有的饲料资源，将不利于我国畜牧业的持续快速发展，应尽快找到丰富的蛋白质资源。

叶蛋白含有动物必需氨基酸，粗蛋白质含量，均大于或接近鱼粉、大豆粉、干脱脂乳，是猪、鸡、牛、羊的良好的蛋白质、维生素补充饲料。对家畜适口性好，且具有营养价值，明显增加体重、改善禽畜鱼蛋等产品品质、降低饲料消耗率和提高转化率等良好的饲养效果，所以可作为家畜饲料添加剂，也可直接制成叶蛋白饲料直接进行饲养。用作饲料是优良的蛋白源和天然添加剂，可代替鱼粉和豆粕。在很大程度上缓解了国内外蛋白饲料资源紧张的状况，不仅促进畜牧业的发展，为植物叶蛋白饲料规模化生产奠定了基础。作为当前牧草加工新技术的一种新产品，叶蛋白受到世界各国普遍重视。很多科研人员对其生产工艺及开发利用进行了研究，并取得了大量成果。

1.3其他方面应用

叶蛋白除了用于食品、药品和饲料外，还可用于化妆品、洗涤用品等日用化工用品和饮料、植物营养调节剂等之中。将叶蛋白的浓缩物作为原料进一步分离制得叶绿素、叶绿素铜钠、胡萝卜素、纯蛋白质、维生素E和K、汁液醇、食用纤维和某些活性酶等。如提取SOD，它可使超氧阴离子自由基发生歧化反应。如将其开发成高级保健饮料，具有抗衰老、抗肿瘤、治疗关节炎、心脑血管病、肺气肿、老年性白内障等功效。目前叶蛋白的应用领域将不断拓宽，叶蛋白的应用范围将从单一的叶蛋白粗制品向高档叶蛋白精制品和精细化工产品等方面发展，研究者正对此进行综合性的开发与利用。

2叶蛋白的提取

2.1酸(碱)热法

加热法通常也叫酸(碱)热沉淀法或酸(碱)沉法。是应用较早，也是目前最普遍的一种提取方法。具体步骤是把叶片破碎压榨并经打浆处理，然后将汁液直接进行加热一定温度使其成为含有蛋白质沉淀的絮凝物，在加热时加酸(碱)性溶剂，再经离心分离得到粗蛋白的方法。加热法提取中，加热时间、pH和加热温度是过程控制的关键因素，所以控制适宜的温度是提取叶蛋白的关键。溶剂的pH在提取过程中至关重要，酸热法一般调节到2.5～5.5，碱热法一般在7.5～9.5之间为宜。如赵希艳等采用紫花苜蓿叶为原料，酸(碱)加热法提取紫花苜蓿叶蛋白。采用单因素实验与正交实验相结合的方法确定了获得叶蛋白高产率的最优条件为：pH4.5，温度80℃，加热时间5 min，打浆时间9 min。

江洪波等对桑叶蛋白提取进行了研究，并探讨提取液不同pH叶蛋白对含量的影响。结果表明，pH在8.0时得到相应的蛋白质含量较高。可见，除温度外，酸碱度对蛋白质提取率有很大的影响。

综上所述，酸(碱)加热法的主要优点是流程短，操作方便，沉淀快，易于过滤收集等优点。但该工艺得缺点是由于加热法能耗高，耗时长，故生产成本较大。且蛋白质是热敏性物质，长时间在高温下会变性而影响其活性，所以在技术上并不十分完善。

2.2有机溶剂法

溶剂法是在压榨后的汁液中加入有机溶剂，降低蛋白质的介电常数和水分的活度，使其沉淀析出并通过分离得到粗蛋白沉淀物的方法。实验中常用乙醇或丙酮等作为有机溶剂，这些物质导致叶蛋白有不良味道和颜色，随着这些物质的去处，可获得色浅、异味少的食品叶蛋白。多酚类物质的去处能解决叶蛋白在干燥时变黑变硬的问题，更易干燥，便于干品制备。

韦吉等研究不同提取条件对热研号柱花草叶蛋白凝集的影响。试验中由于刈割后研磨压榨样品出现人工损耗，使得热研2号柱花草叶蛋白提取有较大损失，小于实际蛋白质含量。可知，提取热研2号柱花草叶蛋白的加热时间在7～9min最为适宜，提取叶蛋白溶液的pH应当控制在3～4。可以看出，溶剂提取溶剂的选择及质量分数、pH、加热时间和温度是过程控制的关键因素。

有机溶剂提取法是目前较为常见的提取叶蛋白的方法。其优点是沉淀快、絮凝物结构紧密，易过滤收集。且经有机溶剂脱色生产的脱色叶蛋白具有含糖量低、蛋白成分较为单一等高营养价值而用于抗癌、低糖营养保健食品的开发有较大实用意义。

2.3发酵法

发酵法包括直接发酵法和发酵酸法，直接发酵是将植物叶榨汁直接放入发酵罐中进行发酵，利用乳酸菌产生的乳酸等使叶蛋白絮凝，发酵酸法直接发酵的下游程序，可提高发酵法的效率。

随着发酵工业的快速发展，近年来对发酵法提取叶蛋白的研究也逐渐增多起来。如曾凡枝通过单因素和正交优化试验的综合使用，采用发酵法进行了苜蓿叶蛋白的提取试验，并测定了发酵温度、发酵时间、乳酸菌数对试验的影响。确定试验中各因素的适宜范围及苜蓿叶蛋白的最佳工艺参数为：每毫升苜蓿汁液接种乳酸菌数107个，34°密闭发酵8h：发酵酸法提取苜蓿叶蛋白的最佳工艺参数为：体积比(发酵酸 体积／滤液体积)2：1，发酵酸循环使用1次，沉淀时间10min。

发酵法提取叶蛋白的优点是使植物叶中对动物机体有害的物质失去活性，提高了蛋白质品质，且安全环保，是叶蛋白生产的一种节能环保的优良工艺。但其不利条件是沉淀时间长，叶蛋白絮凝物结构疏松，难以分离，工序较多且复杂，对这方面的理论研究尚不完善，有待于进一步的研究。

2.4其他方法

叶蛋白的提取方法还有电浓缩法、超滤法、结晶和重结晶法、盐析法等，也有将不同的提取方法综合在一起的。这些提取方法相比其他方法起步晚，技术还不是很成熟，使用不是很普遍。但这些方法优点突出，目前已凸现出一定的技术优势。

如周建建等以鲜繁缕叶为原材料，采用酸化和加热相结合的方法，在考虑料液比、滤布层数、加热温度和加热时间等单因素对叶蛋白提取率影响的基础上，进行了正交试验研究了提取鲜繁缕叶蛋白的最佳工艺条件。测得鲜繁缕叶蛋白的提取率为52.08％，得率为27.17％，取得了惊人的效果。

刘晓颖以黑麦草为原料采用酸加热和有机溶剂相结合的方法对其叶蛋白进行抽提，并进对其中的叶蛋白组分和微量元素等进行了分析，测得叶蛋白中粗蛋白质含量高32％～58％。可以看出，将有机溶剂提法和加热法相结合可得到含量较高的叶蛋白，为今后开发新型叶蛋白的提取工艺研究提供了理论依据。

可知看出，如果将两种或其以上的方法相结合提取蛋白质，可使两种方法的优缺点在一定程度上起到互补的作用。因此寻找一种有效、综合的提取分离技术是迫切需要解决的问题。

3结语

蛋白质工程篇6

关键词：酶分子；基因工程；蛋白质；前景

一、酶与酶的分子改造

（一） 酶

酶是指以蛋白质为主体的生物催化剂，具有在常温常压和近中性pH等温和条件下，高效率地进行区域或对映体选择性催化的特点。迄今为止，从生物界已发现和定性了近3000种酶，分属氧化还原、转移、水解、裂合、异构、连接六大类。由于酶具有反应专一性、催化效率高及反应条件温和等优点，因此在工业、农业、医药和环保等方面已经得到越来越多的应用。但总体还没有达到大规模应用的程度，其主要原因在于酶自身性质上的一些不足。因此，人们希望通过各种方法、按照需要定向地改造酶分子，甚至创造出自然界尚未发现的新酶，从而满足各行各业的需要。

（二）酶的改造

在酶的应用过程中，有时会因酶的稳定性差、活力不够理想及具有抗原性等缺点而受到一定的限制，为此常需对酶分子进行适当的改造和加工，以改善酶的性能。酶分子的改造以提高酶的稳定性和活性、增强酶的选择性、改变酶的表面特性为目标.

二、改造酶的方法

（一） 化学修饰法

酶分子的化学修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，其目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。

酶在进行化学修饰后，大多数酶的性质会发生一些变化，如热稳定性、抗各类失活因子能力、抗原性、半衰期、最适PH值等。

酶修饰中存在的问题是，随着酶与修饰剂结合率提高，酶活回收率将下降。克服的方法是采取一些保护措施，如添加酶的竞争性抑制剂，保护酶活性部位以及改进现有的修饰工艺，进一步完善酶的化学修饰法。

化学修饰酶的目标是提高酶活力，改进酶的稳定性，改变酶的特异性，提高催化过程的反应效率。

（二）生物酶工程法

酶的化学修饰法并非改造酶的惟一手段。随着人们对酶的深入研究以及氨基酸一级结构的测定、基因重组技术的应用等，可以彻底地改造、合成并且模拟酶。这也就是生物酶工程的主要内容。生物酶工程主要包括基因工程技术和蛋白质工程技术。

1.基因工程技术改造和生产酶

基因工程改造酶分子主要包括三方面内容：①用基因工程技术大量生产酶。②修饰酶基因，产生遗传修饰。③设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶。

自从 20 世纪 70 年代重组DNA技术的建立，使人们在很大程度上摆脱了对天然酶的依赖。近十年来，基因工程的发展使得人们可以较容易地克隆各种各样天然的酶基因，使其在微生物中高效表达，并通过发酵进行大量生产。目前已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。

2.蛋白质工程改造和生产酶

蛋白质工程改造和生产酶包括合理设计技术和定向进化技术。

合理设计技术是蛋白质工程最早使用的技术，现在也在广泛的使用。合理设计技术要做好三个方面的工作，首先要用结晶学技术来获得蛋白质结晶体，然后利用x射线技术对晶体进行测量、分析，确定蛋白质的三维结构。其次，借助计算机对蛋白质进行选择修饰，从氨基酸的化学结构预见空间结构，或通过人工智能等其它方法来确定蛋白质和功能的关系，找到要修饰的位点。第三，通过对基因序列的了解，运用定点突变技术来进行碱基替换。通过此法来改变蛋白质的功能，要想获得理想的蛋白质工程产物往往要经过多次分析，替换才能达到目的。

定向进化技术是蛋白质工程的新策略，它是在不需要事先了解蛋白质空间结构的情况下通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法。因此它能解决合理设计所不能解决的问题，在生产中的应用越来越受到重视。定向进化是在待进化蛋白质基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中引入突变，构建突变库，凭借定向选择方法，选出所需性质的蛋白质。定向进化实际就是随机突变加上选择，它与自然进化不同，整个过程都是在人为控制下进行的，并且还可以模拟真核细胞中DNA随机拼接这一蛋白质进化过程来加速蛋白质的优化。

酶的蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，而且仍需要应用基因工程的全套技术。所不同的是，酶的基因工程主要解决的是酶大量生产的问题，而蛋白质工程则致力于天然蛋白质的改造，制备各种定做的蛋白质，但也要用到基因工程的技术手段。

（三）酶分子的定点突变法

定点突变需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。然而，定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因而对酶功能的改造较为有限。

蛋白质工程篇7

关键词：肌原纤维蛋白；凝胶形成机制；功能特性；作用力

Abstract： Myofibrillar proteins are an important group of structural proteins in muscles， which play a significant role in the quality and characteristics of meat products. The gelation properties of myofibrillar proteins are a determinant of the unique texture properties， water holding capacity （WHC）， emulsifying properties and sensory characteristics of meat products. The gelation mechanisms and functional proerties affected by various factors of myofibrillar proteins are described in this paper with the aim of providing useful guidelines for further understanding of the processing performance of meat products.

Key words： myofibrillar protein； gelation； mechanism； features； force

中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）12-0019-04

肌原纤维蛋白质（myofibrillar protein isolate，MPI）是肌肉中一类重要的结构蛋白质群，由肌球蛋白、肌动球蛋白、肌动蛋白以及调节蛋白的原肌球蛋白、肌钙蛋白等组成复合体。在肌肉蛋白质中占50%～55%左右，除了参与肌肉的收缩、影响肌肉的嫩度外，对肉制品品质和功能特性有非常重要的影响。肉糜类制品在加工过程中，MPI受热形成的凝胶决定了产品产量、质构、黏着力及保水性等特性。本文介绍了肌原纤维蛋白的凝胶形成机制、功能特性及影响其特性的诸多因素等，为进一步了解肉制品加工特性提供一定的理论指导作用。

1 肌原纤维蛋白凝胶机制

肌原纤维蛋白凝胶的发生是经过一系列复杂的物理化学变化形成。作为一类结构蛋白质复合体，其中肌球蛋白是主要的凝胶蛋白质，其他几种蛋白质并不能形成凝胶，起到一定的辅助作用，但对凝胶的质构特性具有重要的影响。早在上世纪四五十年代就有学者展开关于凝胶形成机理的研究。Ferry[1]认为蛋白质形成凝胶是经过2个阶段形成的，首先是蛋白质受热变性展开，随后因为疏水作用展开的蛋白质形成较大分子的凝胶体蛋白质分子，并进行解聚和延伸，从而使反应基团暴露，特别是肌球蛋白的疏水基团，蛋白质之间的相互作用得到加强，从而使展开的蛋白重新凝集，最终交叉结合形成三维网状凝胶体。随着对肌原纤维蛋白微观结构研究的进一步细致，Yamamoto[2]发现肌球蛋白头部和尾部凝胶形成能力是有差异的，这种差异会使最终形成的凝胶有所不同，并且在凝集过程中是有一定规律的。将兔骨骼肌肌球蛋白溶液进行稀释，借助透射电镜（负染及旋转金属投影）观察其在30～60℃恒温加热后蛋白分子的聚集方式，发现肌球蛋白分子是以头-头凝集随后头-尾凝集最终尾-尾凝集的方式形成凝胶[3]。另外，不同来源的肌原纤维蛋白在凝胶机制上略有差异。Sano等[4]和Chan等[5]通过研究不同种类鱼肌球蛋白头部和尾部的凝胶能力，提出凝胶形成最先发生于肌球蛋白的尾部，先由尾部肽链解螺旋，形成中间蛋白复合体，再由头部凝集成大的蛋白质颗粒，最终形成网络结构。

2 肌原纤维蛋白功能特性

肌原纤维蛋白的功能特性主要包括凝胶特性、保水性（water holding capacity，WHC）和流变特性等3个方面。

热诱导凝胶特性是肌原纤维蛋白最重要的性质，0.5%的含量即可形成凝胶，对肉制品的质构、黏着力及保水性等性质有重要影响。影响肌原纤维蛋白质凝胶特性的因素可以概括为2方面：内在和外在因素。内在因素如蛋白浓度、成分[6-7]、变性程度和聚集速率[8]等。蛋白浓度越高，凝胶强度越大；肌动蛋白与肌球蛋白的比率不同，肌动蛋白对肌球蛋白凝胶具有协同或拮抗效应；当蛋白质聚集速率小时，蛋白质分子充分伸展，形成的凝胶有序；蛋白质的聚集速率较大时，则形成无序、不透明凝胶。外在因素如溶液pH值、离子强度、温度及添加物等[9-13]。pH值和离子强度能够影响蛋白质残基，改变蛋白质的溶解状态，任何影响溶液pH值和离子强度的因素均会影响凝胶性质，使凝胶过程中的蛋白质热稳定性、溶解度和蛋白质之间的相互作用发生改变；通常温度越高，时间越长，形成的凝胶强度越大；不同添加物的使用可以一定程度上改善凝胶特性。

保水性是衡量肉制品品质的一个重要指标，与肉制品的嫩度、性、色香味等密切相关，对产品的出品率和企业的经济效益有重大作用。肉类保水的条件是原料有水分存留的空间及维持水分存留的作用力。首先，肌原纤维蛋白间形成大量毛细管，构成网络结构，为搭建一个水分存留的间隙提供条件[14]。其次，水与蛋白质氨基酸残基之间形成的氢键和毛细管张力是肉制品中维持水分的作用力[15]。因此，添加物的加入即是通过与蛋白质相互交联从而固定住更多的水分。外界环境酸碱度对肌肉WHC的影响实质上是蛋白质分子的净电荷效应[9，16]：当环境pH值远离等电点时，净电荷增加，肌原纤维之间距离由于电荷斥力而增大，形成有序的凝胶网络结构，保水性较高；当环境pH值接近等电点时，净电荷减少，肌原纤维之间无斥力或斥力小，形成混乱、无序凝胶网络结构，保水性降低。

肌原纤维蛋白的流变学性能可以通过蛋白凝胶的黏度系数、流变指数和流动能参数来表征其在加热过程中分子形态的变化。将肌原纤维蛋白流变特性和蛋白微结构的研究结合起来，可以预测产品的质构品质，为产品配方、加工工艺和质量检测等研究提供重要手段。如在温度扫描中，可以观察到随着温度的上升，肌原纤维蛋白发生了从液态向凝胶态的转变，导致蛋白的流变特性也发生了相应的改变[17]。而不同添加物的使用会影响蛋白溶液的黏弹性，这主要是由于添加物与蛋白质发生相互作用，改变了蛋白凝胶储能模量的变化[12-13， 18]。

3 影响肌原纤维蛋白凝胶形成的因素

肌原纤维蛋白在凝胶形成过程中发生诸多变化，受外界影响很大，在不同温度、pH值、离子强度、肌肉类型及不同的添加物条件下，形成凝胶的能力和特性不同，所表现出的功能特性也不相同。

3.1 温度

加热的温度、时间及升温速率等参数显著地影响着肌原纤维蛋白的凝胶特性、保水性及流变特性。蛋白质分子结构由于受到加热的作用，原本包埋在内部的疏水基团暴露，形成疏水相互作用，促进二硫键形成。大量的疏水基和二硫键的存在，加强了蛋白质分子交联作用，形成热不可逆凝胶。李继红等[19]研究结果表明，在一定范围内，随着温度、盐浓度升高，凝胶强度增加，保水性提高。但当温度超过70℃，凝胶的硬度虽然继续增加，但保水性呈下降趋势。杨芳[20]观察了40～70℃不同温度条件下肌原纤维蛋白凝胶化过程，也得到了类似结论。此过程温度起主要作用，温度越高肌原纤维蛋白越易变性，巯基含量下降越快，蛋白质之间交联越容易，凝胶强度增加。70℃时凝胶的保水性最佳，而超过此温度，易导致肌球蛋白分子形成的网状结构失水，保水性能下降。Amity等[21]则发现凝胶强度随温度上升呈现波浪状，先增加再下降再上升，温度为85℃时凝胶强度最强。

肌球蛋白因加热而发生变性，但是不同来源的肌球蛋白其变性时的转变温度不同。从猪肉、鸡肉、牛肉和火鸡中提取的肌球蛋白，其转变温度一般在45～55℃，鱼类略低。某些来源的肌球蛋白的变性是多级转变的[22]，表明肌球蛋白分子随温度的变化构象发生了进一步变化，因而表现出不同的凝胶特性。

借助电镜技术对肌原纤维蛋白热诱导凝胶的微观形态进行观察有利于了解不同来源的肌球蛋白在不同温度条件下发生的形态变化。Boyer等[23]用透射和扫描电镜对兔腰大肌和半膜肌肌球蛋白进行比较观察，发现前者加热至48℃，肌丝融合，加热到70℃时，肌丝聚集；而后者加热至53℃才形成了肌丝交联，至70℃时形成的蛋白网络比前者更密集。

3.2 pH值

pH值对凝胶性质的影响主要是通过改变蛋白质氨基酸侧链电荷的分布状况，影响蛋白质的相互作用，改变肌球蛋白的凝集状态，从而影响蛋白的凝胶特性。在较高pH值条件下，蛋白分子相应地带负电荷，由于静电斥力使得蛋白分子的凝集不会发生，与水的相互作用增强，形成网络结构，提高了凝胶的保水性；当pH值靠近蛋白质的等电点时，蛋白分子不带电或带电很少，蛋白之间无斥力或斥力很小，疏水作用使得蛋白分子间的相互作用力达到最大，蛋白质分子无序聚集，与水的作用减弱，降低了凝胶保水性。因此，静电斥力是凝胶形成和保水性的主要因素。然而若pH值太大，分子间的静电斥力也越大，网络结构过于松散，对良好凝胶的形成也是不利的[24]。另外，不同pH值条件下提取得到的肌原纤维蛋白性质也略有不同，当pH4.5时，提取的肌原纤维蛋白质具黏性特征，却不形成凝胶网络结构，而pH5.5时提取的肌原纤维蛋白质热稳定性则较差[25-26]。

3.3 离子强度

肌原纤维蛋白本身为高离子强度蛋白，在盐溶液中会改变其蛋白质表面电荷，从而改变在溶液中的状态，凝胶的强度变化。Xiong Youling等[27]研究表明用低浓度的CaCl2和MgCl2处理鸡胸和鸡腿肉，肌原纤维蛋白的得率有较大提高，凝胶强度也增加。董秋颖等[28]认为，较高的离子强度能够增强蛋白质分子间相互作用力，帮助迅速聚集形成硬度较高的凝胶。董绪燕等[29]研究认为随离子浓度的增加，蛋白制品硬度增大，弹性降低。Boyer等[23]也研究了兔肌原纤维蛋白热凝胶中离子强度的影响，认为低离子强度（0.2mol/L KCl，pH6.0）蛋白质溶液形成硬度小的凝胶，逐渐增大离子强度（0.6mol/L KCl）凝胶硬度会逐渐增加。因此，盐浓度对凝胶形成的强度有直接的影响，并且还改变了蛋白质凝胶网络结构的形成方式。当肌原纤维蛋白质置于由低到高不同浓度缓冲溶液时，蛋白质分子从粗糙无规律的凝聚到成蛋白质短链，再到有网络形成且凝胶有黏性，直到蛋白质发生解离形成束状网络纤维[30]。低离子强度下是纤丝之间相互作用形成凝胶，高离子强度下是由蛋白质单体（或二聚体肌球蛋白分子）凝聚形成[31]。

3.4 磷酸盐

磷酸盐是在肉类加工中应用非常广泛的一类添加剂，其作用在于提高肉的离子强度，改变pH值，螯合肉中的金属离子及解离肌动球蛋白。磷酸盐通过改变离子强度，比氯化钠能够更加有效的改变蛋白质的静电荷力，影响蛋白凝胶的凝聚方式[32]。磷酸盐可提高蛋白pH值，增强磷酸盐与蛋白质之间的相互作用，在肉制品中是很好的肉片和水分黏合剂[33]。徐幸莲等[34]通过扫描电镜研究了焦磷酸盐、三聚磷酸盐和六偏磷酸盐对兔腰大肌和半膜肌肌球蛋白的聚集影响，认为焦磷酸盐、三聚磷酸盐使蛋白变性凝聚颗粒减少，倾向于形成长丝，并且使肌原纤维变粗，使肌原纤维发生膨润因而具有更好的持水力；而六偏磷酸盐主要是螯合金属离子，降低pH值，使蛋白质净电荷减少，促进了蛋白之间的聚合，使凝胶的硬度和保水性增大。磷酸盐和低盐可使肉糜具有蛋白质矩阵和大量小孔，具有更好的保水力[35]。

3.5 肌肉类型

不同来源肌肉类型的肌原纤维蛋白其功能特性差异很大[36]。猪肉、鸡肉、牛肉和火鸡中提取的肌球蛋白在差示热量扫描的观察下，具有截然不同的变性温度。然而，就其凝胶性质来说，不论肉的来源、蛋白质组成和介质条件如何，白肉中提取的蛋白质比红肉中提取的有更好的凝胶形成能力，但二者均受到环境pH值的影响。另外，不同部位的肉，其蛋白化学特性和组成也有差异，形成凝胶的能力也不同。Melody等[37]认为半膜肌、背部最长肌、腰大肌中盐溶蛋白热凝胶性质之所以不同在于肌球蛋白重链含量以及类型的不同。因此，在肉制品生产过程中，除了要注意温度、pH值和离子强度等的影响，对红肉和白肉的特性也要加以区别，以期获得良好的蛋白质功能特性。

3.6 非肉蛋白

非肉蛋白如乳清蛋白、蛋清蛋白、谷蛋白等的添加，既可以降低企业生产成本，对肉制品的感官品质如产品风味、保水性和硬度等也有较明显的改善。添加物的使用加强了与肌肉蛋白形成复合凝胶的能力，牢固了组分间的物理缔合，形成一个混合连续相。在鸡胸肉中添加小麦谷蛋白可以使鸡肉的凝胶弹性得到较大提高[38]。Diazda等[39]

还研究大豆蛋白对PSE （pale，soft，exudative）肉肌球蛋白构型和凝胶强度的影响，结果发现PSE肉的肌球蛋白与大豆分离蛋白混合物的凝胶强度及保水性得到了提高，当肌球蛋白和大豆球蛋白的质量比为3：1时形成的凝胶良好。

3.7 其他添加成分

淀粉、卡拉胶、亚麻子胶和海藻酸钠等[40-44]都是常见的亲水胶体，将它们加入到肌原纤维蛋白中均能显著地提高凝胶的保水性和凝胶强度。Verbeken等[42]研究表明，卡拉胶能增加肌原纤维蛋白凝胶的硬度、凝胶强度、保水性和贮能模量，但是影响程度取决于蛋白含量。壳聚糖也可显著提高猪肉肌原纤维蛋白的凝胶能力，随着壳聚糖浓度的增加，保水性和凝胶硬度随之增加[45]。由红外光谱结果得出壳聚糖凝胶与肌原纤维蛋白的之间作用力主要是静电引力。

4 结 语

肌原纤维蛋白作为一类重要蛋白质群在肉制品加工过程中发挥了重要的作用。对于其功能特性的研究伴随各种检测技术手段的更新发展在近些年来取得了较多进展，从微观的角度上对蛋白质分子天然状态到变性状态的转变有了更细致的认识，疏水相互作用、静电力、二硫键等如何参与变化，从而引起质构的变化。但是，肌肉是一个复杂的体系，肉制品的凝胶特性受多种因素的影响，并非理想状态下单一条件的摸索，并且要综合考虑肉制品加工和存放过程中产生的问题，如容易发生氧化、自由基和油脂氧化产物会氧化蛋白、可能会改变蛋白的聚集方式等。因此现阶段对肌原纤维蛋白的研究还不够全面，通过构建不同条件不同因素等组成的系统可能会更有助于了解肌原纤维蛋白的凝胶机制及结构与功能的关系，为肉制品的实际生产提供更有利的指导意义。

参考文献：

[1] FERRY J D. Protein gels[J]. Advances Protein Chemistry， 1948， 4（1）： 1-2.

[2] YAMAMOTO K. Electron microscopy of thermal aggregation of myosin[J]. Journal of Biochemistry， 1990， 108（6）： 896.

[3] SHARP A， OFFER G. The mechanism of formation of gels from myosin molecules[J]. Food Science， 1992， 58： 63-73.

[4] SANO T， NOGUEHI S， MATSUMOTO J， et al. Thermal gelation charaeteristies of myosin subfragments[J]. Journal of Food Science， 1990， 55： 55-58.

[5] CHAN J K， GILL T A， PAULSON A T. Thermal aggregation of myosin subfragments from cod and herring[J]. Food Science， 1993， 58： 1057-1069.

[6] NAKAYAMA T， SATO Y. Relationship between binding quality of meat and myofibrillar proteins.Ⅱ. Contribution of native tropomysin and actin to the binding quality of meat[J]. Agriculture and Biological Chemistry， 1971， 35： 208.

[7] DUDZIAK J A. FOEGEDING E A. Isolation of aetomyosin and myosin from post-rigor turkey breast and thigh[J]. Food Science， 1988， 53： 1287-1289； 1339.

[8] LEFEVRE F， FAUCONNEAU B， OUALI A， et al. Thermal gelation of brown trout myofibrils from white and red muscles： effects of pH and ionic strength[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2002， 82（4）： 452-463.

[9] 费英，韩敏义，杨凌寒， 等. pH对肌原纤维蛋白二级结构及其热诱导凝胶特性的影响[J]. 中国农业科学， 2010， 43（1）： 164-170.

[10] 陈立德. 肌原纤维蛋白凝胶作用力影响因素的研究[D]. 重庆： 西南大学， 2010.

[11] 陈昌. 鸡胸肉、腿肉混合肌原纤维蛋白热诱导凝胶特性的研究[D]. 南京： 南京农业大学， 2011.

[12] 吴满刚， 熊幼翎， 陈洁. 不同淀粉对肌原纤维蛋白流变学性质和凝胶持水性的影响[J]. 食品工业科技， 2010， 31（10）： 92-94.

[13] 吴振， 杨传玉， 孙京新， 等. 不同添加剂对鸡肉盐溶蛋白质热诱导凝胶性质的影响[J]. 中国食品学报， 2012， 12（8）： 60-66.

[14] WILLITING R C. Influence of various salts and water soul be compounds on the water and fat extudation and gel strength of meat batters[J]. Food Science， 1987， 52： 1130-1132.

[15] MILLMAN B M， RACEY T J， MATSUBAR I. Effects of hyperosmotic solutions on the filament lattice of intact frog skeletal muselet[J]. Biophysical Journal， 1981， 33： 189-202.

[16] 汪张贵. 肌肉蛋白与脂肪剪切乳化机理的研究[D]. 南京： 南京农业大学， 2010.

[17] WESTPHALEN A D， BRIGGS J L， LONERGAN S M. Influence of pH on rheological properties of porcine myofibrillar protein during heat induced gelation[J]. Meat Science， 2005， 70（2）： 293-299.

[18] 杨振. 魔芋粉、转谷氨酰胺酶和大豆分离蛋白对鲤鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响[D]. 哈尔滨： 东北农业大学， 2012.

[19] 李继红， 彭增起. 温度、盐浓度和pH对盐溶蛋白热诱导凝胶影响的研究[J]. 肉类工业， 2004（4）： 39-40.

[20] 杨芳. 阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白特性及其加工的研究[D]. 厦门： 集美大学， 2009.

[21] WESTPHALEN A D， BRIGGS J L， LONERGAN S M. Influence of muscle type on rheological properties of porcine myobrillar protein during heat-induced gelation[J]. Meat Science， 2006（72）： 697-703.

[22] 陈文博. 肌原纤维蛋白热诱导凝胶形成机制研究[D]. 南京： 南京农业大学， 2010.

[23] BOYER C， JOANDEL V， ROUSSILHES V， et al. Heat-induced gelation of myofibrillar proteins and myosin from fast-and slow-twitch rabbit muscles[J]. Journal of Food Science，1996， 61（6）： 1138-1142.

[24] KRISTINSSON H， HULTIN H. Role of pH and ionic strength on water relationships in washed minced chicken-breast muscle gels[J]. Journal of Food Science， 2003， 68（2）： 917-922.

[25] NAKAY R， KENNEY P B， SLIDER S， et al. Myofibrillar proteins solubility of model beef batters as affected by low levels of calcium， magnesium and zine chloride[J]. Journal of Food Science， 1998， 63（6）： 951-954.

[26] ISHIOROSHI M， SAMEJIMA K， YASUI T. Heat-induced gelation of myosin： factors of pH and salt concentration[J]. Food Science，1979， 44（5）： 1280-1284.

[27] XIONG Youling， BREKKE C J. Gelation properties of chicken myofibrils treated with calcium and magnesium chlorides[J]. Muscle Foods， 1991， 2： 21-36.

[28] 董秋颖， 杨玉玲， 许婷. 从质构学角度研究肌原纤维蛋白凝胶形成的作用力[J]. 食品与发酵工业， 2009， 35（5）： 45-49.

[29] 董绪燕， 孙智达， 谢笔钧. Zn、Cu、Pb、Cr、Cd对鲫肌动球蛋白和肌球蛋白加工特性的影响[J]. 农业工程学报， 2007， 23（8）： 236-240.

[30] SIEGEL D G， SCHMIDT G R. Ionic， pH， and temperature effects on the binding ability of myosin[J]. Journal of Food Science， 1979， 44（6）： 1686-1689.

[31] EGELANDSDAL B， FRETHEIM K， SAMEJIMA K. Dynamic rheological measurements on heat-indueed myosin gel： effect of ionic strength， protein concentration and addition of adenosine triphosphate orpyrophosphate[J]. Journal of Science of Food and Agriculture， 1986， 37： 915-926.

[32] BAUBLITS R T， POHLMAN F W， BROWN A H， et al. Effects of enhancement with varying phosphate types and concentrations at two different pump rates on beef biceps femoris instrumental color characteristics[J]. Meat Science， 2005， 71： 264-276.

[33] ROBE G H， XIONG Y L. Phophates and muscle fiber type influence thermal transitions porcine salt-soluble protein aggregation[J]. Food Science， 1992， 57： 1304-1308.

[34] 徐幸莲， 王霞， 周光宏， 等. 磷酸盐对肌球蛋白热凝胶硬度、保水性和超微结构的影响[J]. 食品科学， 2005， 26（3）： 42-46.

[35] BARBUT S， GORDON A ， SMITH A . Effect of cooking temperature on the microstructure of meat batters prepared with salt and phosphate[J]. Lebensm-Wiss U Technology， 1996， 29： 475-480.

[36] 杨速攀， 彭增起. 肌原纤维蛋白凝胶研究进展[J]. 河北农业大学学报， 2003， 26（5）： 160-166.

[37] MELODY J L， LONERGAN S M， ROWE L J， et al. Early postmortem biochemical factors influence tenderness and water-holding capacity of three porcine muscles[J]. Journal of Animal Science， 2004（82）： 1195-1205.

[38] RAMIREZ-SUAREZ J C， ADDO K， XIONG Youling. Gelation of mixed myofibrillar/wheat gluten proteins treated with microbial transglutaminase[J]. Food Research International， 2005， 38： 1143-1149.

[39] DIAZDA J L， RODRGUEZ-ROMERO A， HEMNDEZ-SANTOYO A， et al. Effects of soy glycinin addition on the conformation and gel strength of two pork myosin types[J]. Journal of Food Science， 2003， 68（9）： 2724-2729.

[40] 夏秀芳， 孔保华， 张宏伟. 肌原纤维蛋白凝胶形成机理及影响因素的研究进展[J]. 食品科学， 2009， 30（9）： 264-268.

[41] PARK S H， CHO S Y， KIMURA M， et al. Effects of microbial transglutaminase and starch on thethermal gelation of salted squid muscle paste[J]. Fisheries Science， 2005， 71： 896-903.

[42] VETHEKEN D， NEIRINEK N， MEEREN P V D， et al. Influence of j-ageenan on the thermal gelation of salt-soluble meat proteins[J]. Meat Science， 2005， 70： 161-166.

[43] CHEN Haihua， XU Shiying， WANG Zhang. Interaction between.axseed gum and meat protein[J]. Journal of Food Engineering， 2007， 80： 1051-1059.

蛋白质工程篇8

摘要目的　分析体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株的蛋白质表达差异。方法　运用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片(SELDI-TOF-MS)技术检测了常规体外培养的正常肾细胞株(HK-2)和肾癌细胞株(786-0)。两种细胞株均用IMAC3(固定金属亲和)和WCX2(弱阳离子交换)两种芯片检测。采用PBSIIC型蛋白质芯片阅读机读取数据，Ciphergen proteinchip3.1软件采集数据，Biomarker Wizard软件分析两种细胞株的蛋白差异。结果　SELDI-TOF-MS技术检测发现体外培养的肾癌细胞株与正常肾细胞株的蛋白质存在差异表达，共有15个蛋白质水平发生变化。IMAC3芯片发现差异峰6个，WCX2芯片发现差异峰9个。结论肾癌细胞株与正常肾细胞株之间的蛋白质谱表达有差异蛋白。

关键词　肾癌；发病机制；蛋白质组学；SELDI

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全身恶性肿瘤的3％。全世界肾癌的发病率每年增加2％，每年死于肾癌者近100000例。在我国肾癌发病率仅次于膀胱癌居泌尿系肿瘤第二位，近年来有逐年上升的趋势，是威胁人民健康的最重要肿瘤之一，同时也是成人肾脏最常见的恶性实体瘤。约50％的患者首次就诊时已属晚期，约40％的患者术后转移或复发，转移性肾癌预后较差，平均存活时间小于1年，3年存活率低于5％。但就是这样一种对人类威胁如此之大的疾病，我们对其发病机制并不是非常清楚。目前国内外对肾癌发生机制的研究大都是在基因水平，但基因的功能活动要靠蛋白质来体现。由于存在转录后剪切和翻译后的修饰加工，使得基因组DNA或mRNA的水平并不完全代表蛋白质的水平，也就是说基因的种类和数目不等于mRNA的种类和数目，mRNA的种类和数目也不等于蛋白质的种类和数目。因此，要对生物功能的执行者一蛋白质进行研究，从蛋白质整体水平来探讨肿瘤组织或细胞蛋白质结构功能关系及蛋白质间的相互作用，阐明其癌变的本质。本文应用SELDI-TOF-MS技术对体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株进行了蛋白质差异分析，建立了相应的蛋白质表达图谱，发现了一系列差异蛋白，从而为在蛋白质水平上研究肾癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础。

1　材料和方法

1．1 试剂及芯片　HPLC水，乙氰，尿素，Tris-cL，HEPES，CHAPS,TritonX-100，SPA，三氟乙酸均购自Sigma公司；蛋白质芯片(IMAC3，WCX2)购自Ciphergen公司；PRMI1640购自GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青公司。

1．2细胞来源　肾癌786-0细胞株购自上海生命科学研究所；正常肾细胞株HK-2由青岛大学分子生物实验室提供。

1．3细胞的培养

1．3．1肾癌786-0细胞株的培养　在长满肾癌786-0细胞的培养瓶中加入0.25％的胰酶消化液，37℃CO2孵箱中孵育2分钟，倒掉消化液，加入含10％胎牛血清的PBMI1640培养液反复吹打，1:2传代。置于5％CO2，37℃的培养箱中常规培养。

1．3．2正常肾HK-2细胞株的培养　在长满肾HK-2细胞的培养瓶中加入0.25％的胰酶消化液，37℃CO2孵箱中孵育4分钟，倒掉消化液，加入含15％胎牛血清的PRMI1640培养液反复吹打，1:2传代。置于5％CO2，37℃的培养箱中常规培养。

1．4细胞蛋白质的制备　细胞传代第二天，细胞生长旺盛，约占培养瓶80％。应用无菌刮刀刮取细胞，用预冷的PBS洗3遍，细胞计数。加入裂解液(8MUrea，4％CHAPS，40mM Tris-HCLPH7.4)按200μl/5.0×106个细胞加入。4℃剧烈震荡30分，14000nmp离心30分。上清采用蛋白核酸分析仪测定蛋白浓度，加入裂解液调节至所有样品浓度为2mg/ml，上清分装-86℃冰箱保存备用。分别采用IMAC3和WCX2芯片检测，每个样品至少在两个以上的同种芯片上检测。以排除同一种芯片之间的组间差异。

1．5 IMAC3蛋白芯片的实验步骤　a．将芯片装入蛋白工作平台，每孔加入5μl100mM硫酸铜，温盒内孵育15分钟，不要使芯片在空气中干燥b．重复上述操作一次。c．用流动的去离子水清洗芯片10秒以移去过多的铜。d．用大量的50Mm,PH4.0的醋酸钠．清洗芯片。e．再用流动的去离子水清洗一次。f．每孔加入5μl缓冲液(PBS中含250mM氯化钠和0.1％Triton X-100)。震荡孵育5分钟。g．将蛋白芯片放入蛋白工作平台，每孔加入200μl缓冲液。剧烈震荡，室温孵育5分钟。h．弃去缓冲液，每孔立即加入50μl：2稀释于缓冲液中的样品(蛋白终浓度1mg/m1)震荡孵育1小时。I．弃去样品，每孔加入200μl缓冲液洗涤2次，每次5分钟。j．每孔加入200μl水洗涤，立刻甩干。k．从蛋白工作平台中取出蛋白芯片，空气中干燥。1．每孔加入0.5μlSPA,重复一次。m．干燥后用蛋白质飞行质谱仪进行质谱分析。

1．6 WCX2蛋白芯片的实验步骤 a．将芯片装入蛋白工作平台，每孔加入200μl缓冲液(50Mm NaAc，PH4.0)，置于震荡器，室温孵育5分钟。b．重复上述操作一次。c．每孔中加入50μl 1:2稀释于缓冲液中的样品，剧烈震荡，孵育1小时。d．弃掉样品，每孔用200μl结合缓冲液洗涤2次，每次5分钟。e．弃去孔中液体，每孔加入200μl水洗涤，立刻甩干。f．从蛋白工作平台中取出蛋白芯片，空气中干燥。g．每孔加入0.5μlSPA，重复一次。h．干燥后用蛋白质飞行质谱仪进行质谱分析。

1．7数据采集和结果分析　蛋白质芯片采用PBSⅡC型读取数据，仪器用标准多肽校正，系统的质量偏差为0.1％。检测芯片时参数设置如下：激光强度210。检测敏感度10，优化分子质量范围为2000～10000Da，最高分子量为50000 Da，采用Cipher-gen proteinchip 3.1版本的分析软件自动采集数据，然后用Bio-marker Wizard软件分析样本细胞的蛋白质谱差异。两个蛋白峰比较时，差异蛋白定义为蛋白峰强度相差1倍以上。根据差异蛋白的分子量及等电点(WCX2芯片捕获的蛋白PI>4)，在Swiss蛋白数据库中搜索，以鉴定差异蛋白。

2　结果

2．1 WCX2蛋白芯片上肾癌细胞株和正常肾细胞株的蛋白质图谱　在相对分子量2000～30000Da的范围内，WCX2蛋白芯片

上共捕获82个蛋白峰，其中以4940和7820Da两个共有的蛋白质峰作为内参照来判断其他蛋白质的分子量。

WCX蛋白芯片上HK-2和786-0细胞株的蛋白质图谱(纵坐标为蛋白质峰强度，横坐标为蛋白质荷质比)

2．2IMAC3蛋白芯片上肾癌细胞株和正常肾细胞株的蛋白质图谱　在相对分子量2000～30000Da的范围内，IMAC3蛋白芯片上共捕获65个蛋白峰，其中以2662和7580Da两个共有的蛋白质峰作为内参照来判断其他蛋白质的分子量。

IMAC3蛋白芯片上HK-2和786-0细胞株的蛋白质图谱(纵坐标为蛋白质峰强度，横坐标为蛋白质荷质比)

a．11611.ODa在肾癌细胞株中高表达，b．5486.0Da在肾癌细胞株中高表达

WCX蛋白芯片发现的差异蛋白峰

a．5751.0Da在肾癌细胞株中高表达，b．15938.0Da在肾癌细胞株中高表达

IMAC3蛋白芯片发现的差异蛋白峰

2．3肾癌细胞株和正常肾细胞株之间稳定存在的蛋白质表达差异　在WCX2蛋白芯片上捕获的82个蛋白峰中，发现正常肾细胞株和肾癌细胞株之间的差异峰共9个，其中5486，7518，9320；11611Da在肾癌细胞株中高表达，而5056，6282，8982，11030，12782Da在肾癌细胞株中低表达。

在IMAC3蛋白芯片上捕获的65个蛋白峰中，发现正常肾细胞株和肾癌细胞株之间的差异峰共6个，其中5751，8392，15938Da在肾癌细胞株中高表达，而8102，10261，15827Da在肾癌细胞株中低表达。

2．4蛋白鉴定　将发现的差异蛋白峰在Swiss蛋白数据库中搜索()，发现WCX2芯片上11611Da蛋白峰与血清淀粉样SAA-1(serum amyloid alpha，MW11682)蛋白相符。其他的差异峰在数据库中没有发现与之相配的蛋白，可能为新的蛋白质。

3　讨论

肾癌的发生是在环境和遗传因素共同作用下，由多基因参与，经过多步骤、多阶段复杂的生物学演变过程而形成的疾病，是多基因、多阶段、多因子的动力学过程。在人类基因组计划的推动下，人们从基因水平对肾癌的发生发展进行了广泛的研究，先后发现了癌基因、抑癌基因等诸多肾癌相关基因。但是基因的功能活动最终要靠蛋白质来体现，由于翻译后的修饰、蛋白运输过程等原因常使基因表达水平和蛋白质表达的种类和数量并非一一对应，因此，即使我们了解了相关的基因，我们也没有办法全面了解肿瘤发生发展的全过程。目前研究认为肿瘤的发生发展的过程中，从组织增生产生原位癌到发生癌变，在分子水平上有不同的功能性蛋白质参与，并且功能性蛋白质很可能在各个环节相互协调共同表达，因此，目前利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地了解肿瘤的发生发展机理。

SELDI-TOF-MS技术是蛋白质组学研究中的一种全新的技术平台，其弥补了传统二维电泳对低丰度、低溶解度、极端等电点值、极大(相对分子量>200000)和极小(相对分子量

肾癌细胞是由正常肾小管上皮细胞转变而来，那么肾癌细胞所表达的蛋白质必然与其起源的正常肾小管上皮细胞有所相同也有所差异。它可能含有一些正常肾小管上皮细胞所没有的某些特异蛋白质或缺少正常肾小管上皮细胞所具有的某些特异蛋白质，也可能二者具有相同的蛋白质，仅是由于在表达水平或翻译后修饰加工上存在差别。而这些差异蛋白既可作为肾癌的药物开发的靶点，又可作为肿瘤标记物用于肾癌的诊断，尤其在研究肾癌的发病机理方面有重要的价值。本研究采用体外培养的肾癌细胞株和正常肾细胞株进行蛋白质差异分析，虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性，但它具有成分单一，均质性好，实验条件容易控制的优点，同时可避免由于组织或血液细胞成分复杂和异质性高所引起的结果不真实和不可靠。我们的实验结果显示体外培养的细胞株具有实验重复性好，敏感性高的优点。肾脏作为人体内的代谢器官，在发生癌变的过程中，肾癌细胞所产生的蛋白质必然要分泌入血形成血清中的蛋白质，也必然要有部分通过尿液而排出。所以，目前许多研究者对肾癌患者的尿液、血液和癌组织进行了深入的研究并且发现了许多有意义的蛋白质。本实验在IMAC3蛋白芯片上发现的肾癌细胞株中高表达的5751Da差异蛋白峰与张杰等应用SELDI-TOF-MS技术对肾癌组织的研究中发现的蛋白质峰5750.4Da可能为同一蛋白，此蛋白可能为肾癌的特异性蛋白，对于研究肾癌的发病机制和肾癌的靶细胞治有重要的临床价值。此外，国内外学者还应用SELDI-TOF-MS技术对肾癌患者的血液和尿液进行了差异蛋白表达分析，得到了许多有意义的蛋白质峰，但未发现与本实验有相同的蛋白质峰，这可能是由于样本的选择所造成，具体原因仍需进一步研究。

SAA是由同基因编码的一组多形性蛋白，代表一个相对分子量为12000的家族。其主要由肝细胞产生，且广泛存在与各种脊椎动物中。SAA家族包含急性期SAA(A-SAA)和结构性

SAA(C-SAA)。而SAA-1是一种急性期反应蛋白，属于A-SAA且决定总SAA的价值。目前研究发现SAA在肺癌，卵巢癌等肿瘤患者血液中的表达有不同程度的提高。在肾癌方面，Jonathan Tolson等应用SELDI-TOF-MS技术对肾癌患者的血液进行研究发现，SAA在肾癌患者的血清中表达也增高，而且随着病情的恶化，SAA的表达水平也随之增高。因此，SAA可能与肾癌的发病有密切的关系，且其可作为肾癌病情发展的检测和药物治疗的靶向。我们发现的11611Da蛋白峰很可能是SAA-1，但这只是从分子量的角度来看，要真正的鉴定还需要对蛋白进行纯化、分离后应用串联质谱分析或肽指纹分析技术进行进一步的研究。

蛋白质工程篇9

关键词：大豆 豆粕 粗蛋白 脱皮量 杂质 玉米

豆粕是世界上应用最广的畜用蛋白饲料，它可用于家禽作为无限制性的单一蛋白补充原料。豆粕在我国占动物用油料的90%以上，豆粕的主要用户是养禽业和养猪业。豆粕在猪禽饲料中得到如此广泛的应用，主要归功于豆粕丰富的蛋白质含量（42%～49%）以及其很高的氨基酸消化率和优良的氨基酸构成，其他饲料中蛋白质中的氨基酸构成则不尽完美。在饲料中增加脱皮豆粕可使动物的消化率吸收率大大提高。豆粕的能量水平取决于蛋白含量、残油、纤维及灰分的含量，根据美国家禽NRC报告，去皮豆粕的能量比带皮豆粕的能量要高879Kj/kg。参照全美油脂加工者协会（NOPA）豆粕质量规格（见表1），豆粕含有的营养素（见表2）。

表1 去皮豆粕与带皮豆粕质量规格（NOPA）

表2 去皮豆粕与带皮豆粕营养素

从表中可见，去皮豆粕的营养价值要高于带皮豆粕，所以在饲料加工过程中，高效、高热量的脱皮脱脂豆粕得到广泛应用。大豆约有8%的种皮，种皮中含蛋白质12.00%，油脂0.6%，粗纤维40%。为了生产高蛋白、低纤维的饲用豆粕，我们可以通过在生产加工过程中脱去一定比例豆皮的方法，来提高豆粕质量。

通常来说，豆粕中蛋白含量取决于大豆中蛋白含量和脱皮的效果。也就是说，在大豆加工过程中，我们习惯于根据大豆的粗蛋白含量，来调整具体的脱豆皮量，从而使豆粕达到需要的粗蛋白含量，即每多脱1.0%的豆皮，豆粕粗蛋白可以提高0.5%。一般情况，我们可以通过上面的办法，根据大豆蛋白含量和脱豆皮量，粗略测算出豆粕的粗蛋白含量。但有的时候，通过该方法推算出的理论豆粕蛋白值与实际豆粕蛋白值不符。

表3 1日～4日所生产的去皮豆粕加工情况

分析如下：该段时间豆粕蛋白和豆皮脱皮量相对不太稳定，在加工大豆量、大豆粗蛋白以及大豆杂质含量基本一致的情况下，班组之间的脱豆皮量差距很大，主要是因为加工大豆杂质中所含物质不同，有的班组杂质中玉米所占比例较高，杂质中90%以上为玉米，（玉米粗蛋白含量在4%左右，豆皮粗蛋白含量在12%左右，差距较大），有的班组加工大豆杂质中所含玉米则相对较少，筛下物、豆皮等杂质占比例相对较多（筛下物中，基本为碎豆皮、豆萁、豆豉和少量土杂，蛋白为10%～13%左右，与豆皮所含蛋白基本一致）。也就是说，加工大豆中每多1%的玉米，就需要在原有脱皮量基础上再多脱3%的豆皮，同理，豆粕中每多1%的筛下物杂质，就需要在原有脱皮量基础上再多脱1%的豆皮，否则豆粕蛋白就会达不到要求。

同时，因为玉米在大豆杂质中所占比例不均匀，时多时少，造成加工过程中，仍按以往的经验操作，单一的通过调整豆皮加工量达到调节豆粕蛋白的目的，即每多脱1%的豆皮，豆粕粗蛋白就会增长0.5%，而未考虑到杂质中玉米的具体情况，造成通过豆皮的脱皮量推算出理论豆粕蛋白值与豆粕实际蛋白值不符。

表4 10日～13日所生产的去皮豆粕加工情况

从上表分析可以得出，该段时间加工大豆杂质中，筛下物、豆皮等杂质占比例相对较多（筛下物中，基本为碎豆皮、豆萁、豆豉和少量土杂，蛋白为10%～13%左右，与豆皮所含蛋白基本一致）。此时，所产豆粕的蛋白实际值与通过脱出豆皮量推算出的理论值基本一致，豆粕蛋白和脱皮量则相对稳定。按照以往经验对脱皮量进行调整，即每多脱或少脱1%的豆皮，豆粕粗蛋白就会增长或降低0.5%。

结论，在加工大豆杂质中所含物质相对单一（筛下物、豆皮等），并且所占比例较为均匀，没有太大的波动时，根据大豆中的蛋白含量，对脱出豆皮量进行相应调整，豆粕蛋白含量的实际值与通过脱出豆皮的量所推算出的豆粕蛋白含量的理论值就会越接近。此时，我们就可以通过合理调节豆皮脱出量，就能够生产出较为理想的等级豆粕，即每多脱或少脱1%的豆皮，豆粕粗蛋白就会相应增长或降低0.5%。而随着玉米等蛋白含量较低物质在杂质中的比例增大，并且不均匀时，仍通过以往的经验，对脱出豆皮量进行调整，来调节豆粕蛋白，往往起不到预想的效果。

参考文献：

[1]徐国.如何提高豆粕质量[J].四川粮油科技，2000（1）.

[2]于向辉.大豆脱皮处理的几项优点[J].中国油脂，2002.27（1）.

[3]左青.大豆脱皮[J].西部粮油科技，2002（4）.

蛋白质工程篇10

【关键词】 K88；LTB；表达

肠毒素大肠杆菌是引起世界上发展中国家婴幼儿及到这些国家旅游者腹泻的主要致病菌，危害严重。现已知大肠杆菌定居因子和肠毒素与疾病密切相关，定居因子是大肠杆菌细胞表面菌毛，肠毒素是大肠杆菌产生的毒性分泌蛋白，有不耐热肠毒素和耐热肠毒素两种。当病原菌感染宿主后，大肠杆菌首先通过定居因子粘附到小肠粘膜上皮细胞刷状缘受体上，抵抗住肠道蠕动与肠内分泌物清洗，维持ETEC在肠道内生长繁殖。然后释放出肠毒素，与小肠细胞膜上的特异受体结合，引发细胞内水、电解质失衡，造成细胞吸收障碍，产生水样、脱水性腹泻。定居因子与小肠粘膜粘附和肠毒素致毒是大肠杆菌腹泻不可或缺的两个必要条件。

我们在前人研究工作基础上，构建了一种能表达大肠杆菌pQE30-K88-LTB融合蛋白的基因工程菌株，并计划把它转化到乳酸菌中进行表达，研制大肠杆菌基因工程活疫苗，利用乳酸菌作为载体，经口服途径进入胃肠道，将大肠杆菌基因表达在活乳酸菌的表面，刺激机体的胃肠道产生粘膜免疫和体液免疫，以期达到增加疫苗的安全性，提高疫苗免疫效果，为更有效地预防婴幼儿和旅行者腹泻，提供一种新型基因工程菌苗的候选菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒模板菌株和感受态细胞BL21、表达载体pQE-30，由本实验室保存；克隆载体pMD18-T, 购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 主要试剂、酶类限制性内切酶和其它工具酶为MBI公司产品； 弗氏完全(或不完全) 佐剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体为Sigma公司产品；其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 引物设计 根据已发表的K88和LTB基因设计两对引物，序列如下：

K88-上游引物：GGATCCTTTGGTAATGTATTGAATG

K88-下游引物：GGTACCTTACTCTTTGAATCTGTC

LTB-上游引物：GGTACCCTCCCCAGACTATTACAGAACTAT

LTB-下游引物：AAGCTTGTTTTTCATACTGATTGCCGC

1.1.4 测序DNA序列由上海生工生物技术服务有限公司测定。

1.2 方法

1.2.1 PCR 扩增

1.2.1.1 DNA模板的制备 用移液器无菌取少量大肠杆菌接种到5ml液体LB培养基中，过夜培养后，采用煮沸法制备模板DNA。

1.2.1.2 K88和LTB基因的PCR扩增 PCR反应体系为1μLDNA模板、2μLdNTP、2.5μL PCR缓冲液、上下游引物各1μL、Taq酶0.25μL，混和后加水至总量为25μL；反应的循环参数为94℃预变性10min；94℃变性1min；56℃退火1min；72℃延伸1 min，进行30个循环；72℃继续延伸10min。

1.2.2 pQE30-K88-LTB表达载体的构建质粒的提取和纯化、酶切反应、DN段的分离纯化、连接、质粒转化、菌株诱导表达等，参见分子克隆实验指南的方法。

1.2.3 蛋白电泳分析参见分子克隆实验指南。

1.2.4 重组pQE30-K88菌毛蛋白的纯化 纯化过程按照Qiagen蛋白质纯化试剂盒说明书进行。

1.2.5 重组蛋白抗血清的制备将含有纯化重组蛋白的缓冲液与弗氏完全(或不完全) 佐剂按照11充分混匀乳化好后, 按照100μg/kg抗原的剂量免疫新西兰大白兔。首次免疫2周后, 隔周加强免疫。末次免疫后一周, 颈动脉放血, 于4℃冰箱保存, 析出的透明、淡黄色上清液即为K88-LTB融合蛋白的抗血清。

1.2.6 蛋白质印迹分析 分别以K88、LTB单因子血清和自制的重组K88-LTB融合蛋白抗血清作第一抗体, 按1300 稀释；羊抗鼠抗体作第二抗体,按15 000 稀释使用。

2 结果

2.1 K88ac基因的扩增结果

图1: K88、LTB基因PCR扩增结果

1.3 DNA Marker DL2000; 2. K88基因的PCR产物;

4. LTB基因的PCR产物

2.3 重组K88-LTB 融合蛋白基因的表达 将鉴定正确重组质粒pQE30-K88-LTB导入到宿主菌中，诱导处理后, 进行SDS-PAGE分析。结果表明(图2)，重组K88菌毛蛋白亚基基因获得高效表达。

图2 SDS-PAGE电泳结果

1. 加IPTG诱导3h的重组菌;

2. 加IPTG诱导6h的重组菌;

3. 空载体; 4. 蛋白 Marker

2.4重组K88-LTB菌毛蛋白抗血清的免疫学检测自制的融合蛋白抗血清和K88、LTB单因子血清做一抗分别对重组工程菌株的总蛋白进行蛋白印记检测。结果表明(图3),均能检测到大小约

为31kDa的阳性反应条带。

图3 融合蛋白的蛋白印记结果

1,6.蛋白Marker; 2. 阴性血清对照; 3. K88单因子血清为一抗的蛋白印记结果;

4. 重组菌抗血清为一抗的蛋白印记结果; 5.LTB单因子血清为一抗的蛋白印记结果