蛋白酶抑制剂十篇

蛋白酶抑制剂篇1

【关键词】  蛋白酶体抑制剂；PC12细胞；帕金森病；细胞凋亡

    【Abstract】 AIM: To investigate the effect of proteasome inhibitor MG132 on the proliferation and apoptosis of dopaminergic PC12 cells. METHODS: PC12 cells were treated with MG132 at different concentrations for 3 d. The effect of MG132 on the proliferation of PC12 cells was analyzed through MTT assay and the effect of MG132 on the apoptosis of PC12 cells was analyzed through Giemsa staining and flow cytometry. RESULTS: Treated for a same period （3 d）, the inhibitory effect of MG132 on PC12 cell proliferation enhanced with the increment of the concentration of MG132（0, 1, 2.5, 5, 10, 20 μmol/L）. The inhibitory rate exceeded 40% when the MG132 concentration was 2.5 μmol/L, and the 50% inhibiting concentration （IC50）was 3.78 μmol/L. MG132 also induced the apoptosis of PC12 cells obviously. The apoptosis index of the cells treated by MG132 at 2.5 μmol/L for 3 d was 24.7% examined by Giemsa staining and 25.6% by flow cytometry, that of the control cells was 1.3% and 0% respectively.  CONCLUSION: MG132 can inhibit the proliferation of dopaminergic PC12 cells and lead to apoptosis. The disfunction of proteasome may do harm to the existence of dopaminergic cells.

    【Keywords】 proteasome inhibitor; PC12 cells; Parkinson disease; apoptosis

    【摘要】 目的： 了解蛋白酶体抑制剂MG132对多巴胺能细胞PC12增殖和凋亡的影响. 方法： 用不同浓度的MG132处理PC12细胞3 d，通过3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐（MTT）微量比色法检测MG132对PC12细胞增殖的影响，通过姬姆萨染色法和流式细胞术检测MG132对PC12细胞凋亡的影响. 结果： 在作用时间相同（3 d）的条件下，随着MG132浓度的增高（0， 1， 2.5， 5， 10， 20 μmol/L），对PC12细胞增殖的抑制作用逐渐增强. 当MG132浓度达到2.5 μmol/L时，对PC12细胞的抑制率超过40%, IC50＝3.78 μmol/L. 同时，MG132能够明显诱导PC12细胞凋亡： 姬姆萨染色显示，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d，细胞凋亡率为24.7%，而对照为1.3%；流式细胞术分析结果表明，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d，细胞凋亡率为25.6%，而对照为0%. 结论： 蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制多巴胺能细胞PC12的增殖并诱导细胞凋亡，蛋白酶体活性的丧失可能影响到多巴胺能细胞的生存.

    【关键词】 蛋白酶体抑制剂；PC12细胞；帕金森病；细胞凋亡

     0引言

    帕金森病（parkinsons disease, PD）是最常见的神经系统退行性疾病之一，严重危害患者身体健康和降低患者的生活质量［1-2］. PD的病因和发病机制至今不够明确. 越来越多的证据表明，多巴胺能神经元内蛋白质的损伤和功能异常蛋白的蓄积在散发性PD的发病过程中起着重要的作用［3］. 蛋白酶体是一种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解酶，在泛素蛋白酶体通路（ubiquitinproteasome pathway, UPS）中起催化作用［4-5］. 本研究以多巴胺能细胞PC12为研究对象，观察蛋白酶体抑制剂MG132对PC12细胞的增殖和凋亡的影响，以探讨蛋白酶体活性异常在PD发病过程中的作用，为阐明PD的发病机理提供新的实验依据.

蛋白酶抑制剂篇2

关键词 昆虫；丝氨酸蛋白酶抑制剂；免疫调节

中图分类号 R997.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）08-0245-01

Roles of Insect Serine Protease Inhibitors in Immunomodulation

YANG Wei-ke DONG Zhan-peng CHEN An-li LIAO Peng-fei

（Institute of Sericulture and Apiculture，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Mengzi Yunnan 661101）

Abstract Serine protease inhibitors（Serpins）are widely distributed protease inhibitor superfamily，which could restrict each other with serine proteases（SPs） mediating crucial physiological processes to form a dynamic and regulate many important life activities of the organism.In this paper，we mainly discussed the progress on immunomodulation of insect Serpins in recent years.

Key words insect；serine protease inhibitors；immunomodulation

丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitors，Serpins）是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂，属于一类超家族蛋白质，能够抑制丝氨酸蛋白酶（serine proteases，SPs）或半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CPs）的活性，广泛存在于动物、植物、真菌、原核生物和病毒等生物体中[1]。

1 Serpins的结构、作用机制及生物学作用

1.1 Serpins的结构与作用机制

Serpins一般是由350～500个氨基酸残基折叠成一个保守的三维结构，蛋白分子量一般为40～50 kD；由8～9个a螺旋、3个β折叠（折叠A、B、C）和1个约有20个氨基酸组成的活性中心环（reactiveeentreloop，RCL）构成[2]。Serpins对蛋白酶的抑制反应是不可逆的，RCL被靶蛋白酶识别后形成特异性复合物，近氨基端的氨基酸Pl与近羧基端的氨基酸Pl’受到活化的丝氨酸残基攻击，内部形成酞基酶介导的复合结构；随后RCL断裂，氨基末端插入β折叠A的中心部位形成了新的羧基尾S4A，这种构象转变被称为紧张型（S）转化为松弛型（R），此时构成复合物的抑制剂和蛋白酶结构都发生改变，蛋白酶失去催化活性[3]。

1.2 Serpins的生物学作用

Serpins是蛋白酶抑制剂中数量最多、分布最广的一个超家族，它主要通过调控丝氨酸蛋白酶（SPs）和半胱氨酸蛋白酶（CPs）的活性来发挥作用。其生物学作用主要是参与凝血、纤维蛋白溶解、补体激活、免疫调节及炎症反应、组织重建和肿瘤抑制等过程[4]。

2 昆虫Serpins在免疫调节中的作用

昆虫先天性免疫反应过程需要多种丝氨酸蛋白酶（SPs）的参与从而保证免疫信号的传递及扩大，而丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpins）在此过程中通过调控SPs的活性，使得免疫反应迅速剧烈地进行，并且把它限定到一定的程度与范围内，保护宿主自身免受伤害[5]。目前，对昆虫Serpins免疫作用的研究主要集中在果蝇和烟草天蛾上。

2.1 果蝇Serpins的免疫调节作用

果蝇基因组含有29个编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因，研究表明serpin27A、serpin43Ac和serpin28D等参与果蝇先天免疫反应。其中，serpin27A可以通过抑制前酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）活化酶（pro-PO-activating enzyme，PPAE）调控昆虫的黑化反应；细胞外的serpin43Ac会调节丝氨酸蛋白酶活性，最终通过Toll途径表达抗菌肽，抵御外源微生物的侵染[6]。serpin28D在果蝇受伤后被强烈诱导表达，在受伤位点调控黑化反应，参与细胞免疫反应[7]。

2.2 烟草天蛾Serpins的免疫调节作用

在烟草天蛾中，Serpins的研究主要集中于对黑化反应的影响。烟草天蛾serpin-1的一个反应位点变异体serpin-1J，在血淋巴中通过抑制前酚氧化酶激酶PAPs来抑制前酚氧化酶原PPO的激活，阻断黑化反应的进程[8]。在细菌刺激之后，烟草天蛾serpin-2、serpin-3、serpin-4和serpin-5的表达量均显著增加，其中serpin-3能有效地抑制酚氧化酶活性，间接调节昆虫的免疫防御反应；而serpin-4和serpin-5是通过与血淋巴中丝氨酸蛋白酶形成非共价复合物，在局部发生黑化反应，从而抑制多酚氧化酶原的激活，发挥其免疫防御功能[9-10]。

3 结语

丝氨酸蛋白酶SPs及其抑制剂Serpins和抗菌肽一起参与昆虫的免疫反应，对昆虫Serpins免疫调节作用的研究有助于完善昆虫的先天性免疫，为深入认识和拓展理解Serpins的作用有重要的科学意义。

4 参考文献

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蛋白酶抑制剂篇3

【关键词】 组蛋白去乙酰化酶抑制剂;抗肿瘤药物;SAHA;合成

[ABSTRACT] Objective: To improve the synthetic procedure of the histone deacetylase (HDAC) inhibitor SAHA. Methods： Suberic acid was selected as the start material， and the SAHA was obtained through condensation， activation and ammoniated. Results： The final product was synthesized in 3 steps. Conclusions： The modified synthetic procedure is with easily obtained material， mild conditions and convenient operation.

[KEY WORDS] HDAC inhibitor; Anticancer drug; SAHA; Synthesis

肿瘤严重威胁人类的生命与健康，传统的抗肿瘤药由于选择性较差而易引起较为严重的毒副反应。近年来，随着生命科学研究的飞速进展，与肿瘤致病和发病机制等相关的各种基本过程正在被逐步阐明。开发可选择性作用于肿瘤发生和发展过程中的特定靶标的抗肿瘤药物已经成为当前抗肿瘤药物研究的重要目标。

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)与肿瘤的发生和转移密切相关，对肿瘤细胞的生长调控具有普遍生物学意义，因此有可能成为广谱低毒抗肿瘤药物的作用靶点。目前已经发现了多种结构类型的小分子组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)，其中羟肟酸类组蛋白去乙酰化酶抑制剂受到了广泛的关注[1]。SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)是由默克公司开发的羟肟酸类组蛋白去乙酰化酶抑制剂[2]。在体内研究中，SAHA可在多种癌症模型中显示出抗肿瘤活性[3]。2期临床研究表明，SAHA可在患有实体瘤和血液恶性肿瘤的患者中显示出抗肿瘤活性[4，5]。SAHA已于2006年10月获美国FDA批准以商品名Zolinza上市，用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。

1 合成路线

目前文献报道的SAHA的合成路线主要是以辛二酸(1)为起始原料，与苯胺反应生成7苯胺甲酰基庚酸(2)，将2甲酯化后胺解可得到SAHA[6]。这种合成方法采用了具有高毒性和腐蚀性的氯化亚砜为反应试剂，且反应时间较长，需室温反应24h。

根据文献报道，本实验以辛二酸为起始原料，与苯胺反应生成7苯胺甲酰基庚酸(2)，将2用N羟基琥珀酰胺活化得到7苯胺甲酰基庚酸琥珀酰胺酯(3)，3胺解后可得到SAHA。改进后的合成工艺简便、条件温和、原料易得，且缩短了反应时间、提高了产率。具体合成路线见图1。

图1 SAHA的合成路线

2 实验部分

化合物熔点由显微熔点仪测定，温度未经校正;1HNMR光谱由日本JNMGX400核磁共振谱仪测定;FAB质谱由Zabspect高分辨质谱仪测定。

2.1 7苯胺甲酰基庚酸(2)的合成

将苯胺(4.09g，0.044mol)和辛二酸混合物于180℃加热10min后，冷却至室温。将反应液倒入4.0g KOH溶于50mL水的溶液中。过滤除去不溶物后，滤液用HCl水溶液酸化，过滤得到固体。将产物用水重结晶后得到4.06g白色固体，产率40.7%，mp128129℃。

2.2 7苯胺甲酰基庚酸琥珀酰胺酯(3)的合成

将4.06g(16.3mmol)7苯胺甲酰基庚酸、1.87g(16.3mmol)N羟基琥珀酰胺和3.36g(16.3mmol)N，N二环己基碳酰亚胺溶于40mL无水四氢呋喃，室温反应1h，过滤，滤液直接用于下一步反应。

2.3 SAHA的合成

将2.23g(32.3mmol)盐酸羟胺溶于20mL无水DMF中，加入3.26g(3.17mmol)三乙胺，搅拌下加入7苯胺甲酰基庚酸琥珀酰胺酯的无水四氢呋喃溶液。室温反应1h后，过滤，减压蒸除溶剂，产物用水稀释，析出固体，四氢呋喃重结晶，得白色固体2.92g，mp158159℃，产率68.0% (文献[7]:mp:159160.5℃，产率64.0%)。1HNMR(DMSOd6)，δ10.34(s，1H)，9.85(s，1H)，8.67(s，1H)，7.58(d，2H，J=7.8Hz)，7.28(t，2H，J=7.8Hz)，7.01(t，1H，J=7.5Hz)，2.28(t，2H，J=7.5Hz)，1.93(t，2H，J=7.3Hz)，1.54(m，4H)，1.27(m，4H)。FABMS m/z:265[M+H]+。

3 结果与讨论

文献报道的SAHA合成方法是以氯化亚砜为反应试剂将7苯胺甲酰基庚酸甲酯化后胺解得到目标产物[7，8]。本研究以N羟基琥珀酰胺为活化试剂，代替参考文献中的氯化亚砜，改进后的合成方法缩短了反应时间、提高了产率，且所采用的试剂无毒性和腐蚀性，对环境的污染较小。所合成的目标产物经核磁共振谱及质谱测试确证了化学结构。

参考文献

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3 Yin D， Ong JM， Hu J， et al. Suberoylanilide hydroxamic acid， a histone deacetylase inhibitor: effects on gene expression and growth of glioma cells in vitro and in vivo[J]. Clin Cancer Res， 2007， 13(3): 10451052.

4Duvic M， Talpur R， Ni X， et al. Phase 2 trial of oral vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid， SAHA) for refractory cutaneous Tcell lymphoma (CTCL)[J]. Blood， 2007， 109(1): 3139.

5Blumenschein GR Jr， Kies MS， Papadimitrakopoulou VA， et al. Phase Ⅱ trial of the histone deacetylase inhibitor vorinostat (Zolinza， suberoylanilide hydroxamic acid， SAHA) in patients with recurrent and/or metastatic head and neck cancer[J]. Invest New Drugs，2008， 26(1): 8187.

6 Stowell JC， Huot RI， Van Voast L. The synthesis of NhydroxyN'phenyloctanediamide and its inhibitory effect on proliferation of AXC rat prostate cancer cells[J]. J Med Chem， 1995， 38(8): 14111413.

蛋白酶抑制剂篇4

[关键词] 万珂；脑缺血再灌注；凋亡；细胞色素C

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）06（c）-0095-02

[Abstract] Objective To observe the effects of VELCADE on cell apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion and the level of mitochondrial changes and study on its protective effects to cerebral ischemia. Methods 15 laboratory rats from 2012 May to 2013 December were randomly divided into VELCADE groups and pseudo surgery group and saline group with 5 in each group. VELCADE groups received caudal vein injection of 0.2 mg/kg VELCADE and the control groups received saline injection of the same volume and experimental materials were collected after 24 h. Cyt C、Caspase-3 was detected by immunohistochemical and the neuronal apoptosis was detected by TUNEL. Results Fake surgery group apoptosis died cell also rare， occasionally Cyt c， and Caspase-3 immune reaction positive cell， VELCADE group Cyt c， and Caspase-3 immune reaction positive cell and the apoptosis died cell obviously reduced， saline group see large above cell， and two group above the data compared， differences significantly has statistics meaning， two group and fake surgery group above the data compared， differences also are has statistics meaning. Conclusion VELCADE is a proteasome inhibitor， and it has a protective function of mitochondria and can significantly inhibits the inflammatory response to peak form， reduces the volume of cerebral infarction and apoptosis， protects neural function.

[Key words] VELCADE； Cerebral ischemia-reperfusion； Apoptosis ； Cytochrome C

蛋白酶体抑制剂为新型的抗肿瘤药物，2003年已被FDA批准用于临床治疗多发性骨髓瘤，它可通过诱导异常分裂的肿瘤细胞凋亡起到抗肿瘤的作用，目前国外有研究结果显示，蛋白酶体抑制剂还可通过抑制炎症反应因子NF-κBp65、IL-1β的表达有显著的减轻炎症反应的作用[1]，而脑缺血再灌注后脑局部的炎症反应是造成再灌注损伤的重要原因之一，故国外学者将其应用于神经系统疾病的研究，并证实其通过抑制炎症反应，对脑缺血大鼠有减轻神经细胞凋亡的作用，但国内尚无此方面的研究。该实验将其用于脑缺血再灌注大鼠，已证实其可抑制细胞凋亡，减小脑梗塞体积，有很好的脑保护作用，但具体机制不祥，已知细胞凋亡途径有三种，该类药物是通过何种途径抑制凋亡尚不清楚，该实验在2012年5月―2013年12月期间选用15只大鼠为研究对象，欲采用万珂对脑缺血再灌注大鼠进行治疗，观察影响线粒体途径的指标，目的是进一步探讨该类药物的脑保护作用机制，为该类药物扩大临床适应症奠定理论基础，同时也为临床治疗开辟新的途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该实验在2012年5月―2013年12月期间选用15只普通级健康雄性Wistar大鼠， 鼠龄（3～4）个月，体重260～280 g，随机分为假手术组、生理盐水对照组、万珂治疗组每组5只。大鼠大脑中动脉缺血模型采用线栓法制作，脑缺血2 h再灌注即刻给予万珂0.2 mg/kg尾静脉注射，对照组以相同的生理盐水，在脑缺血2 h再灌注24 h取材，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射对大鼠进行麻醉，经心脏灌注固定、取材，将视交叉后脑组织2 mm层面多聚甲醛缓冲液固定24 h，梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切取同一层面5张切片，切片厚5 μm，用于检测Cyt C、Caspase-3及细胞凋亡。

1.2 检测方法

免疫组化法检测Cyt C、Caspase-3，TUNEL法检测神经细胞凋亡，采用显微镜进行观察，每只大鼠取5张切片选相同部位计数阳性细胞数（400倍），选择数码相机进行拍照。

1.3 统计方法

全部资料选择SAS 9.0版统计软件进行分析，所有计量资料以均数±标准差表示，用t检验。

2 结果

免疫组化法测Cyt C、Caspase-3与细胞凋亡：假手术组凋亡细胞亦少见，偶见Cyt C、Caspase-3免疫反应阳性细胞，万珂组Cyt C、Caspase-3免疫反应阳性细胞及凋亡细胞明显减少，生理盐水组见大量上述细胞，且两组上述各项数据对比，差异有统计学意义，两组与假手术组上述各项数据对比，差异均有统计学意义。见表1。

3 讨论

该研究充分证实脑缺血再灌注后及时应用蛋白酶体抑制剂万珂0.2 mg/kg具有明显的抑制炎症反应高峰形成，很大程度缩小了脑梗死体积，有助于减轻细胞凋亡，保护神经的作用[2]。研究显示在脑缺血时，ATP耗竭可影响蛋白质泛素化的级联反应，并且能够抑制蛋白酶体活性，致使蛋白酶体清除氧化应激蛋白的能力水平显著下降，与此同时氧化应激损害进一步促进对蛋白酶体活性的抑制[3]，这样的恶性循环，造成蛋白聚集及神经元死亡。除此之外依据相关研究显示短暂性脑缺血时大鼠海马CA1区神经元会出现泛素化蛋白聚集过程，线粒体膜上还会呈现出蛋白聚集[4]，因此万珂有助于蛋白聚集的程度，可以引领细胞凋亡过程发生。

线粒体是细胞内重要的细胞器之一，在细胞信号转导和细胞氧化还原状态以及渗透压调节中起非常突出的作用[5]。线粒体即可出现功能与结构的改变，这说明线粒体在早期的细胞凋亡过程中具有启动功能[6]，而细胞凋亡的早期事件是细胞色素C从线粒体释放的过程，CytC在细胞凋亡产生的信号传导过程中起作用是至关重要的。细胞凋亡的过程中信号转导通路的线粒体凋亡通路在细胞生存和死亡中发生了非常重要作用，目前认为凋亡过程的早期信号转导主要通过线粒体途径来完成的[7]。此项研究结果发现应用蛋白酶体抑制剂治疗过程中，Cyt C的释放明显减少，万珂组（34.21±1.82），生理盐水组（46.13±1.55），P

总之，此项研究还发现应用蛋白酶体抑制剂治疗过程中，Cyt C的释放明显减少，线粒体凋亡通路中Caspase-3蛋白的表达亦相应减少，同时凋亡的细胞也明显减少，其作用机制可能主要通过减少Cyt C的释放、减轻炎症反应过程，阻断了线粒体凋亡途径，抑制脑细胞凋亡，从而发挥大脑保护作用。

[参考文献]

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蛋白酶抑制剂篇5

【关键词】 翼状胬肉；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；增殖性细胞核抗原

［Abstract］ Objective To observe the expression of cyclin kinase inhibitor P16 in pterygium and to investigate its effects on the pathogenesis of pterygium.Methods The normal conjunctiva tissues and pterygium were detected for cell circle related kinase inhibitor P16 with immunohistochemistry.Results The expression rates of P16 in conjunctiva and pterygium were（88.47±0.73）％and（7.25±0.12）％，there was significant difference between them（P＜0.01）.The expressions of PCNA in conjunctiva and pterygium were （4.98±0.28）％ and （24.59±0.64）％（P＜0.01）.Conclusion The lower expression of cell circle related kinase inhibitor in pterygium may play an important role on proliferation and pathogenesis of pterygium.

［Key words］ pterygium；cyclin-dependent kinase inhibitor； PCNA

翼状胬肉是眼科常见疾病，其发病机制至今尚不清楚，尤其是翼状胬肉中细胞增殖失控是否与细胞周期紊乱有关，目前已有研究［1］表明，这种紊乱是否与其依赖性激酶及正调控亚基（cyclin）、负调控亚基（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）成员的表达失衡有关。本研究通过对翼状胬肉中细胞周期依赖性激酶抑制剂P16蛋白的检测，探讨翼状胬肉的发生及发展与细胞周期依赖性激酶抑制剂的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2005年4月~2006年4月取协和医院手术室行翼状胬肉切除的成人患者11例及外伤行眼球摘除患者的正常结膜标本3例。

1.2 方法 翼状胬肉头部立即用10％甲醛固定，常规逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡后包埋，5 μm连续切片。免疫组化染色：鼠抗人P16蛋白单克隆抗体来自北京中山生物技术公司。石蜡切片常规脱蜡复水，0.3％过氧化氢室温孵育，抗原修复，正常山羊血清封闭，滴加适当比例稀释的一抗，4 ℃过夜，滴加生物素标记的二抗工作液，滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，DAB显色。每批染色均设有阳性对照和阴性对照，其中阳性对照用已知阳性表达的乳腺癌标本，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。

1.3 P16表达检测 在光镜下观察免疫组化染色切片，P16抗体染色阳性的细胞胞核呈棕黄色粗大颗粒反应，染色阴性细胞胞核则无棕黄色染色。

1.4 结果判定 在400倍光镜下，每张切片随机计数500个细胞， 计算其阳性率，阳性率＝（所计数的500个细胞中阳性细胞数/500）×100％。

1.5 统计学方法 结果采用t检验进行统计学分析。

2 结果

P16正常结膜组在上皮细胞全层均有表达，见图1，而翼状胬肉组P16仅在上皮层见极少数细胞微弱表达；翼状胬肉中P16表达率为（7.25±0.12）％，而正常结膜组织中P16表达率则为（88.47±0.73）％，两组经统计学分析，差异有显著统计学意义（t检验，P＜0.01）。PCNA在正常结膜组织及翼状胬肉中表达分别为（4.98±0.28）％和（24.59±0.64）％，P＜0.01。

图1 P16在正常结膜上皮表达

3 讨论

虽然对翼状胬肉病因及发病机制进行了大量研究，但到目前为止，仍不十分清楚。有研究表明PCNA在翼状胬肉内呈现高表达，说明在翼状胬肉中存在明显活跃的细胞增殖［2］，而这种异常的细胞增殖源于细胞周期活动的紊乱。王勇等［1］ 研究显示细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P27在翼状胬肉中低表达，本研究发现在细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中另一成员P16也在翼状胬肉中的表达显著降低。

细胞周期中存在一些的控制，细胞周期的进展速度控制是由内特异性细胞周期依赖性激酶（cyclindependent kinase， CDK）、细胞周期依赖性激酶细胞正调控亚基及其负调节亚基 CDK抑制蛋白（CKI）共同完成的。已有较多的研究涉及肿瘤及增殖性疾病与细胞周期调控的关系［3］。宁宏等［4］通过检测家兔晶状体皮质吸除术后不同时间晶状体上皮细胞中的P27蛋白进行检测，发现随着术后时间的延长，P27阳性细胞数量显著增多。吴明星等［5］ 研究人类晶状体上皮细胞中CDK－E、CDK2、P21的表达，结果示在蛋白水平和转录水平都存在CDK－E、CDK2、P21的表达不平衡，从而推测术后晶状体后囊混浊（PCO）的发生可能是白内障术后特定的时限内存在CDK和CKI表达的失衡，而启动细胞增殖的过程，引起后囊膜表面的细胞增殖移行并导致其混浊。由此可见，CKI与白内障的发生有着密切关系。

本研究进一步表明CKI相关基因在翼状胬肉细胞中的失活，细胞周期紊乱，可能诱导其增殖失控，因此CKI相关基因在翼状胬肉细胞中的低表达及失活可能是翼状胬肉发生发展的重要原因。

参考文献

1 王勇，张明昌.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂在翼状胬肉的表达研究.眼科新进展，2005，25（1）：52.

2 龙心光，王映芬，黄应桂，等.翼状胬肉中增殖细胞核抗原的免疫组化研究.中华眼科杂志，1999，35（5）:327.

3 Pestell RG，Albanese C，Reutens AT，et al.The cyclins and cyclin-Dependent kinase inhibitors in hormonal regulation of proliferation and differentiation.Endocr Rev，1999，20（4）:501-534.

蛋白酶抑制剂篇6

【关键词】 ACEI TPK 尿微量白蛋白

为探讨如何能够更有效地延缓及逆转糖尿病肾病(DN)的发展，本研究对60 例早期DN患者临床观察，其中60 例使用依那普利联合胰激肽原酶(怡开)治疗早期DN，观察12周，通过检测尿微量白蛋白(UAER)，效果满意，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采集2005年10月—2006年12月住院患者，按照WHO(1999)糖尿病诊断标准，共纳入60 例超重体型2型糖尿病患者。用随机排列表法等分对照组30 例，联合治疗组30 例，两组患者年龄、性别、体重指数、FBG、HbALc、血压、UAER等基本匹配。主要观察指标为尿微量白蛋白。1周内检测3次以上(酶联免疫法)均在30～300 mg/24 h之间，全部病历均除外急慢性肾炎、泌尿系感染、发热、严重心肝脑疾患等其他引起蛋白尿的因素。一般情况比较见表1。表1 两组患者一般情况比较

1.2 治疗方法

所有被选患者均给予糖尿病常规综合治疗，包括饮食和运动治疗，并根据病情选用口服降糖药物或胰岛素强化治疗，使血糖控制在稳定水平(空腹＜7.0 mmol/L，餐后2 h＜11.1 mmol/L)，伴高血压者根据血压调整依那普利剂量，使血糖控制在＜130/80 mm Hg(1 mm Hg＝0.133 kPa)。对照组使用依那普利(扬子江药业集团有限公司)5～20 mg，每日2次口服，联合治疗组在对照组治疗的基础上加用怡开(常州生化千红制药有限公司)240 U，每日3次口服。疗程12周。

1.3 观察项目

治疗前后分别检测患者24 h尿微量白蛋白。

1.4 统计学方法

用SPSS软件完成计量治疗，以±s表示，组间差异以t检验测定P值，率间比较用χ2检验，P＜0.05为差异显著性。

2 结

果

对照组UAER由治疗前的(255.6±51.72) mg/24 h下降到治疗后的(105.50±36.82) mg/24 h(P＜0.01)，联合治疗组UAER由治疗前的(276.12±59.11) mg/24 h下降到治疗后的(69.10±29.91) mg/24 h(P＜0.01)，分别下降了37.6％0和66.30％，与对照组相比，联合治疗组效果更显著(P＜0.01)。治疗期间，使用依那普利有2 例咳嗽，但可耐受，未退出研究，尚未发现怡开毒副作用。

3 讨

论

糖尿病肾病是糖尿病患者主要的微血管并发症，发病机制包括多元醇通路的激活、蛋白非酶氧化和蛋白激酶的激活，血管活性物质的活性过度、激肽系统活性不足等［1］。其中肾内血流动力学和肾小球微循环与DN有着极为密切的关系，除了高血糖对肾脏的损害，激肽系统与肾素血管紧张素系统不同程度的异常改变［2］，使糖尿病患者体内肾素血管紧张素系统活性增高，其血管加压作用直接参与了肾脏的进行性损害。它通过影响全身及肾脏局部的血液动力学，升高肾小球内压力，使肾小球血浆流量增加，高灌注可导致肾小球入球小动脉扩张，肾小球超滤压增高，从而使蛋白漏出增加，并引起滤过膜增厚，肾小球毛细血管闭塞，肾小球硬化。多数研究证实血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)降低血液中AngⅡ水平，阻断AngⅡ在DN发生发展中的不良作用，特别是ACEI扩张出球小动脉作用明显超过入球小动脉，可降低肾小球内压，进而降低尿白蛋白的排泄，起到肾保护作用，且有不依赖于血压的降尿白蛋白效应［3］，通过抑制肾小球系膜细胞纤维母细胞的过度增生及肥大，减轻肾间质纤维化的过程［4，5］。ACEI同时可抑制激肽酶Ⅱ的活性，降低激肽的分解，增加激肽系统活性，增加肾血流灌注，改善肾脏功能。胰激肽原酶能够改善血管平滑肌使小血管和毛细血管扩展，增加毛细血管血流量，改善微循环，恢复肾毛细血管的正常功能，并且激活金属蛋白酶(原酶)水解肾小球系膜区和基底膜区的细胞外基质在系膜区和基底膜区堆积。水解胶原防止基底膜增厚，延缓糖尿病肾病的形成。本研究中两组治疗前后UAER均明显下降，但ACEI联合TPR疗效更加显著。基于激肽系统与肾上腺血管紧张素系统(RASS)系统的相互协调，共同维持肾脏血流动力学稳定和糖尿病时两系统不同程度的异常改变，故RASS系统的阻断及缓激肽原酶系统(KKS)系统活性的增加，使激肽的产生提高和降解减少，是ACEI和TKP肾保护的共同途径，加之ACEI和TKP各自特有的肾保护作用，得以早期DN有效控制，二者联合应用表现出稳定的协同效应。依那普利在使用中有2 例咳嗽，但可耐受，未退出研究，怡开无明显毒副作用。

参考文献

［1］杨永年.胰激肽原酶对2型糖尿病早期肾病的疗效［J］.中国糖尿病杂志，2001，9：2.

［2］史铁蘩.协和内分泌和代谢学［M］.北京：科学出版社，2000：1 370.

［3］姚合斌，潘长玉.激肽系统在实验室糖尿病肾病发展中的作用研究［J］.中国糖尿病杂志，2000，4：237.

蛋白酶抑制剂篇7

【Abstract】 AIM: To investigate the levels of urinary Cystatin C， β2microglubin and albumin in different stages of diabetes mellitus and to explore the diagnostic value of urinary Cystatin C in early diabetic nephropathy. METHODS: The urinary albumin andβ2microglubin were detected by radioimmunoassay (RIA) and Cystatin C was detected by enzyme immunoassay. RESULTS: With UAER

【Keywords】 diabetic nephropathy; urine; albumin；β2microglubin；cystatin C

【摘要】 目的： 通过检测糖尿病肾病（DN）患者不同临床分期尿中胱蛋白酶抑制剂C（Cystatin C， Cys C）的含量，与同时期尿中白蛋白（Alb）、β2微球蛋白（β2MG）含量比较，探讨Cys C在DN早期诊断中的价值. 方法： 用放射免疫法测定尿Alb，β2MG；酶免疫标记法测定尿Cys C. 结果： DN患者在24 h尿白蛋白排泄率（UAER）小于30 mg时，尿中Cys C升高至（0.28±0.09）mg/L，与正常对照组（0.15±0.08）mg/L比较差异非常显著（P

【关键词】 糖尿病肾病；尿；白蛋白；β2微球蛋白；胱蛋白酶抑制剂C

0引言

糖尿病肾病（DN）是糖尿病主要并发症之一，在糖尿病死因中占有较大比例，故早期诊断对其防治和预后具有较大意义. 目前对于DN的实验室诊断多以尿蛋白、肾功放射免疫检查、血尿素、肌酐等作为主要诊断指标. 孙相国等［1］及Poge等［2］报道胱蛋白酶抑制剂C（Cystatin C，Cys C）是检测肾小球滤过率良好而敏感的指标，检测尿中Cys C尚未见报道. 我们拟检测DN不同临床分期尿中Cys C，并与同时期尿中微量蛋白如白蛋白（Alb）、β2微球蛋白（β2MG）进行比较，探讨Cys C是否可以作为早期诊断DN的灵敏指标.

1对象和方法

1.1对象

正常对照组40（男23，女17）例，为健康体检人群，年龄35.6～65.4（56.4±10.4）岁，均无心、肝、肾、高血压、糖尿病等. 按WHO标准诊断即空腹血糖≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L的患者为糖尿病组，共100（男53，女47）例，年龄36.1～66.6（54.2±13.5）岁，均无肝脏及泌尿系统其他疾病. 根据DN尿Alb排泄率（UAER）又将其分为3组. 其中，A（无肾病）组30例，24 h UAER300 mg.

1.2方法

患者晨起排空尿，饮水500 mL，1 h后收集尿液，-20℃保存待测. 采用上海德波生物技术有限公司的试剂盒并严格按要求操作. 放射免疫法检测尿Alb和β2MG；酶免疫标记法检测尿Cys C.

统计学处理： 实验数据以x±s表示，以单因素方差分析进行数据处理，使用SPSS 10.0统计软件.

2结果

2.1尿中3种蛋白的检测与正常对照组比较，A，B，C 3组尿中Cys C，Alb和β2MG均呈逐渐增高趋势. A组中Cys C与正常对照组比较明显升高（P

2.2尿中3种蛋白的阳性率取对照组x±2 s作阳性界值，对照组数值均在正常范围. A组中Cys C， Alb和β2MG阳性率分别为53%（16/30），17%(5/30)和33%(10/30)；B组中CysC，Alb和β2MG的阳性率分别为71%（25/35），27%(9/35)和46%（16/35）；C组中三者的阳性率均为100%.

3讨论

DN是糖尿病常见而又难治的微血管并发症［3］之一，而早期DN又是一个隐匿的过程［4］，常规测定血中肌酐、尿素氮以及尿中蛋白含量无法早期诊断. ECT检查双侧肾小球滤过率是目前诊断肾功能受损的金指标，可以作为DN的早期诊断手段. 但由于价格较高，需要有一定的仪器设备，并有一定的放射性，难以作为常规的检测方法. 尿中微量蛋白等敏感指标检测有助于早期DN的诊断［5］，尿Alb，β2MG等指标已在临床上广泛应用，但仍有局限性，且受到一些肾性和肾外因素的干扰. 所以，寻找更灵敏、更实用的检测指标，有利于糖尿病患者的一级、二级预防，对于患者的生活质量及生存时间有非常重要的意义.

Cys C是1种低分子量的非糖化碱性蛋白，Mr 13 359，等电点9.3，是直接基因产物，由有核细胞产生，各组织生成率恒定，不受性别、肌肉量、饮食、炎症、胆红素、溶血等因素的影响［6，7］. Cys C几乎全部由肾小球滤过，不被肾小管重吸收和分泌，在近端肾小管上皮细胞被分解代谢. Mojiminiyi等［8］报道在DN早期，Cys C反映肾小球滤过功能较β2MG、肌酐等更敏感. β2MG也是1种分子量很低的蛋白质，容易通过肾小球滤过膜，由近曲小管重吸收并在肾小管细胞中降解，但在血循环中的水平不稳定，在感染等病理状态下，其生成速度会增快［9］. 尿中Alb也受环境温度、运动、感染等其他因素的影响.

本结果显示，糖尿病患者无肾病组，尿中Cys C，Alb及β2MG与正常对照组相比已明显升高，其中Cys C升高更明显. 早期DN组Cys C，Alb及β2MG与正常对照组相比升高更明显，提示Cys C与Alb，β2MG一样可以反映早期肾功能的损害，但他们反映肾功能的敏感性不同，由高到低依次为Cys C，β2MG和Alb. 因为Cys C，β2MG均由近端肾小管上皮细胞分解代谢，当肾小管功能受损时，其上皮细胞分解代谢能力下降，尿中Cys C，β2MG含量可明显增加，推测糖尿病患者由于高血糖的毒性作用以及高滤过期肾小管重吸收负担的加重，在糖尿病尚未发生肾小球滤过屏障损害时，肾小管功能已遭到损伤，也就是说，在DN早期时，肾小管损害要早于肾小球滤过膜的损害. 以往认为尿Alb是反映肾小球滤过功能的敏感指标. 而我们的研究资料显示，在无DN组中，只有17%患者的尿Alb增高，33%患者β2MG升高，而Cys C的阳性率高达53%. 在早期DN组尿Alb升高的比例也低于其他两种，表明Cys C对DN的早期诊断要优于β2MG和Alb，而DN早期的血清肌酐、尿素氮仍处于正常范围. 病程发展至临床DN期，3种蛋白的阳性率均达100%，此期出现持续性的非选择性蛋白尿，Alb的排出比例最高，临床上出现低蛋白血症、浮肿等，此结果与杨清萍［10］报道一致.

检测尿中Cys C，Alb和β2MG都可以作为早期DN的诊断指标，但Cys C较Alb及β2MG更敏感，同时由于它的代谢特点，表明它是一个可靠指标，且检测方法简便，价格便宜，具有良好的灵敏度，值得临床推广.

参考文献

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蛋白酶抑制剂篇8

P851-862

【摘要】目的 探讨急诊抢救室脓毒症（sepsis）、全身炎症反应总综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）与非SIRS患者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystainC, Cys-C)阳性检出率的差异； Cys-C与APACHE（acute physiology and chronic health evaluation）Ⅱ评分的相关性及对于死亡预后的意义。方法 选取2008年10月到2009年10月在北京朝阳医院急诊抢救室救治的患者250例，排除存活不足24 h者。将所有入选病例分为3组：非SIRS组（n=74）、SIRS组（n=121）及脓毒症组（n=55），检测3组病例的Cys-C水平并评估APACHEⅡ评分，计算Cys-C＞830 ng/ml的检出率并进行比较。统计3组病例的28d病死率，研究Cys-C、APACHE Ⅱ评分对于3组病例28d病死率的预测价值。结果 Cys-C的阳性检出率在脓毒症组与非SIRS组之间差异有统计学意义（41.38% vs. 13.57%，P=0.007），SIRS组与非SIRS组之间比较，差异具有统计学意义（32.79% vs. 13.57%, P=0.005），但在脓毒症组与SIRS组之间差异无统计学意义（41.38% vs. 32.79%, P=0.346）。脓毒症组、SIRS组患者28d病死率与非SIRS组比较,差异具有统计学意义（41.6% vs. 17.2%, P＜0.01；36.91% vs. 17.2%, P＜0.05）。脓毒症组患者Cys-C与APACHE Ⅱ评分有良好正相关（P＜0.0001）。Cys-C与APACHE Ⅱ评分是脓毒症组28d死亡的独立预测因素。结论 SIRS患者和脓毒症患者Cys-C阳性率较非SIRS患者明显升高，并且脓毒症患者Cys-C是预后不良的指标。

【关键词】半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；APACHE Ⅱ评分；全身炎症反应综合征；脓毒症;病死率

The positive detection rate of cystatin C in patients with sepsis and its prognostic significance WANG Jun-yu,LI Chun-sheng. Emergency Department, Beijing Chaoyang Hospital of the Capital Medical University，Beijing 100020，China

蛋白酶抑制剂篇9

关键词：芪参二莲汤；肝纤维化；细胞外基质；基质金属蛋白酶-1；金属蛋白酶抑制剂-1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.013

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）05-0052-05

Effects of Qishen Erlian Decoction on Serum MMP-1 and TIMP-1 in Liver Fibrosis Model Rats YUAN Xing-xing1， GUO Lei2， WANG Bing-yu1， YANG Lei1， LIU Chang-fa1， ZHANG Ya-li1 （1. Nangang Branch of Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin 150001， China； 2. Qiqihar Hospital of Traditional Chinese Medicine， Qiqihar 161000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Qishen Erlian Decoction on serum MMP-1 and TIMP-1 levels in thioacetamide （TAA） induced liver fibrosis rats； To discuss its mechanism of action. Methods Liver fibrosis model was created by the TAA gavage method. 120 SD male rats were randomly assigned to control group， model group， colchicine group， Qishen Erlian Decoction low-， medium- and high-dose group （20 in each group）. Each medication group was given relevant medicine for gavage. Control group and model group were given the same amount of normal saline for gavage， once a day for 5 weeks. HE staining and Masson trichrome staining were used to observe the pathological changes in liver tissue and liver tissue damage. Biochemistry， radioimmunoassay， and ELISA were used to detect the serum liver function， hepatic fibrosis index， MMP-1 and TIMP-1 levels. Results Compared with the model group， serum ALT， AST， TBIL， γ-GGT， HA， LN， Ⅳ-C and PCⅢ levels， MMP-1 and the ratio of MMP-1/TIMP-1 increased significantly and level of TIMP-1 decreased significantly in Qishen Erlian Decoction groups， with statistical significance （P

Key words： Qishen Erlian Decoction； liver fibrosis； extracellular matrix； MMP-1； TIMP-1； rats

肝纤维化是在体内有害因素的持续刺激下，肝脏内弥漫性细胞外基质（ECM）的合成和降解失去平衡的一种病理变化，属于肝损伤后组织修复过程中的一种代偿反应，也是肝硬化发展的必经阶段。而基|金属蛋白酶类（MMPs）和金属蛋白酶抑制剂（TIMP）两者的平衡在ECM的合成与降解中发挥重要作用。有研究发现，通过对MMPs/TIMPs平衡的干预，可抑制ECM合成，促进其降解，故其已成为逆转肝纤维化的重要方法[1]。芪参二莲汤为黑龙江省中医药科学院著名肝病专家张雅丽教授治疗肝纤维化经验方，具有益气扶正、活血解毒、化痰通络的功效。我们前期研究发现，芪参二莲汤可通过减轻炎性细胞因子对肝细胞的直接损伤，抑制炎症向肝细胞浸润，具有明显的抗炎、保肝及调节免疫的功能，对肝纤维化具有一定拮抗作用[2-4]。为了进一步探究其对肝纤维的逆转作用，本实验采用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）灌胃法制备肝纤维化模型，通过检测大鼠肝功能、肝纤维化指标，监测ECM代谢因子MMP-1、TIMP-1水平及其比值变化，探讨芪参二莲汤对大鼠肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠120只，雄性，2月龄，体质量（200±20）g，黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号[黑动字第]P00102005。饲养于黑龙江省中医药科学院实验动物中心，室温18～25 ℃、相对湿度50%～60%、人工12 h昼夜循环照明环境，分笼饲养，自由摄食饮水。

1.2 药物

芪参二莲汤（黄芪15 g，茵陈蒿10 g，虎杖10 g，西洋参10 g，半边莲10 g，半枝莲10 g，猫爪草10 g，石见穿10 g，女贞子15 g，墨旱莲15 g，五味子15 g，甘草15 g），上述饮片购自黑龙江省中医药科学院中药房，本院煎药室制备并浓缩；秋水仙碱片，昆明制药集团股份有限公司，0.5 mg/片，批号201410213，用前研细粉过100目筛，用蒸馏水配成混悬液。TAA，上海麦克林生化科技有限公司，批号MFCD00008070。

1.3 主要试剂与仪器

丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号20142301、20141161；总胆红素（TBIL）试剂盒，上海荣盛生物药业有限公司，批号20140806107；γ-谷氨酰转酞酶（γ-GGT）检测试剂盒，桂林优利特医疗电子集团公司，批号25120784；透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20100514；大鼠MMP-1、TIMP-1 ELISA试剂盒，美国RapidBio Lab. Calabasas，批号分别为13070822、13070866；Masson三色染色试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司，批号20140514。石蜡切片机（RM2145，德国Leica），石蜡包埋机（EG1140，德国Leica），荧光显微镜（DM1L，德国Leica），酶标仪（Benchmark plus型，美国Bio RAD），全自动生化分析仪（日立7600-020，日本HITACHI），CO2培养温箱（3949型，美国Forma Scientific）。

1.4 分组、造模与给药

大鼠适应性饲养1周后，按体质量随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组和芪参二莲汤低、中、高剂量组，每组20只。除正常组大鼠常规饲养外，余组大鼠采用TAA灌胃法制造肝纤维化模型[5-8]，隔日1次，连续7周。药物组按照秋水仙碱（0.105 g/kg）和芪参二莲汤低（5 g/kg）、中（10 g/kg）、高（15 g/kg）剂量灌胃给药，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积均为8 mL/kg，每日1次，连续5周。

1.5 标本制备

实验结束后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（1 mL/100 g）麻醉，静脉取血，静置，5000 r/min离心7 min，收集血清，-80 ℃冰箱保存备用，于肝左叶距边缘0.5 cm处取2块1 cm×1 cm×0.5 cm大小组织块。

1.6 指标检测

1.6.1 肝组织病理形态 HE染色将肝组织切片经二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸馏水、苏木素染液、盐酸乙醇溶液、清水、清水、氨水溶液、伊红染液、蒸馏水、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通风橱封片。Masson染色切片将肝组织脱蜡、苏木素染、流水稍洗、1%盐酸乙醇分化、流水冲洗、丽春红酸性品红液染、蒸馏水、1%磷钼酸水溶液、2.5%亮绿液染色、1%冰醋酸、95%乙醇、100%二甲苯。镜下观察肝脏组织病理形态及肝损伤程度。

1.6.2 肝功能检测 采用全自动生化分析仪，对血清ALT、AST、TBIL、γ-GGT进行检测。

1.6.3 肝纤维化指标检测 放射免疫分析法检测血清HA、LN、PCIII、Ⅳ-C含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6.4 血清基质金属蛋白酶-1及其抑制剂测定 采用ELISA试剂盒及酶标仪测定大鼠血清MMP-1、TIMP-1含量，取出96孔板，设置标准品孔、空白孔、模型孔、秋水仙碱孔和芪参二莲汤低、中、高剂量孔，加入标准品50 μL预计的标准品浓度梯度；按照顺序在待测样本孔中加入待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL，重复洗板3次后加酶标工作液，然后按顺序每孔先加入显色剂A液50 μL，再加入显色剂B液50 μL，于37 ℃恒温箱中避光显色15 min。用酶标仪检测。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，采用方差分析，组间两两比较用LSD法检验，等级资料多组独立样本用秩和检验。P

2 结果

2.1 一般情况

正常组大鼠与芪参二莲汤高剂量组营养状况良好，饮食和体态正常，反应灵敏，眼光有神，皮毛密集伴有光泽，体质量自然增加。余各组大鼠一般情况差，饮食少，皮毛发黄黯淡无光，伴轻度脱毛，潮湿成缕，体形消瘦，反应迟钝，烦躁易激惹。实验过程中大鼠部分死亡，原因可能为灌胃损伤或对药物耐受性差异等，模型组大鼠死亡3只，秋水仙碱组和芪参二莲汤低、中剂量组各死亡2只。

2.2 芪参二莲汤对大鼠肝脏组织病理形态的影响

HE染色结果显示，正常组大鼠肝组织的肝小叶完整，肝细胞排列整齐，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无变性坏死，未见纤维组织增生；模型组肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，部分坏死，伴有炎性细胞浸润，纤维组织大量增生；各给药组肝脏损伤程度均较模型组明显减轻，肝小叶结构破坏减轻，肝脏胶原纤维增生减轻，肝细胞水肿好转，变性情况明显改善，炎细胞浸润减少，其中以芪参二莲汤高剂量组肝脏结构改善最为明显。结果见图1。

Masson染色结果显示，正常组大鼠肝细胞索排列整齐，在汇管区与间质的小血管壁上少量蓝色的胶原纤维分布；模型组胶原纤维明显增多，多分布在汇管区和血管周围，形成纤维间隔，破坏肝小叶结构；各给药组均较模型组减轻，胶原纤维组织增生均有不同程度的减少，纤维化程度有明显好转，部分较细的蓝色纤维走行于血管周围，其中以芪参二莲汤高剂量组肝脏结构改善最为明显。结果见图2。

2.3 芪参二莲汤对模型大鼠血清肝功能的影响

与正常组比较，模型组ALT、AST、γ-GGT、TBIL水平显著升高（P

2.4 芪参二莲汤对模型大鼠血清肝纤维指标的影响

与正常组比较，模型组HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平显著升高（P

2.5 芪参二莲汤对模型大鼠血清基质金属蛋白酶-1及其抑制剂-1水平的影响

与正常组比较，模型组MMP-1、MMP-1/TIMP-1比值显著降低（P

3 讨论

中医学认为，肝纤维化属“积聚”“Y瘕”范畴，其病机为络气不足，气虚血瘀，外感湿热久羁，凝聚成痰，发为本病证。故肝纤维化多为本虚标实，虚实夹杂。芪参二莲汤用药以益气扶正为主，兼以解毒化痰逐瘀。本方重用黄芪，其为补药之长，气充帅血，祛瘀散结；西洋参、五味子、墨旱莲、女贞子滋补肝肾、活血通络，养血以柔肝体；半边莲、半枝莲清利湿热；石见穿、猫爪草化痰散结，解毒化瘀；茵陈蒿、虎杖、甘草散瘀退黄，清血分肝络之毒。综观全方，扶正祛邪，扶正不助邪，逐瘀与化痰并行，共奏益气扶正、活血解毒、化痰通络之功。

本课题结合肝脏组织病理学、肝功能、肝纤维化四项检测，对芪参二莲汤治疗肝纤维化的疗效进行研究，通过HE与Masson染色联合对照观察。结果显示，正常组大鼠肝脏组织均无明显异常改变；模型组肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，部分肝细胞坏死，伴有中性粒细胞及淋巴细胞浸润，纤维组织大量增生，个别大鼠可见假小叶形成；各给药组肝脏损伤程度均较模型组减轻，而且芪参二莲汤能够明显改善肝纤维化大鼠ALT、AST、TBIL、γ-GGT及HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，其中以芪参二莲汤高剂量组疗效最佳。

肝脏的ECM过度沉积形成肝纤维化，而ECM在肝内过度沉积不仅仅是由于ECM合成增多，更大程度上是由于ECM降解减少[9]。然而，机体主要是通过MMPs与TIMPs的动态平衡来调节ECM的生成和降解，MMP-1能降解纤维化肝组织中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原，而ECM主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积[10]。TIMP-1可抑制MMP-1的活性，导致ECM降解减少。当MMP-1和TIMP-1比例失调时，导致胶原酶活性减弱，使肝组织内胶原代谢紊乱，Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少而沉积，造成肝纤维化的进一步恶化[11]。史玉岭[12]使用ROC曲线评估TIMP-1诊断肝纤维化的敏感度、特异性，结果显示其明显高于肝纤维化标志物HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN，提示血清TIMP-1诊断肝纤维化有较高的敏感度和特异性，其水映肝纤维化程度。本研究结果显示，TAA诱导肝纤维化模型大鼠较正常组大鼠血清MMP-1水平明显降低，TIMP-1较正常组明显升高，MMP-1/TIMP-1较正常组明显降低，与近年来肝纤维化形成过程中有关MMPs与TIMPs表达的相关研究结果一致[13]。而芪参二莲汤能显著提高MMP-1水平，降低TIMP-1水平，从而调整MMP-1/TIMP-1的平衡，达到逆转肝纤维化的目的。

综上，芪参二莲汤能明显改善肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化指标，促进MMP-1/TIMP-1平衡，从而达到防治肝纤维化的作用，且存在一定的量效关系。

参考文献：

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[10] 魏晓龙，蒋明德，曾维政，等.MMP-1过表达的骨髓间充质干细胞对肝纤维化的修复作用[J].中南大学学报，2014，39（3）：258-264.

[11] 段志军，李吉彦，丛振日，等.益气软肝法对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1/TIMP-1活性的影响[J].中国中医基础医学杂志，2002，8（9）：32- 34.

蛋白酶抑制剂篇10

【关键词】 胱氨酸蛋白酶抑制剂C；同型半胱氨酸；2型糖尿病肾病

近年来2型糖尿病（T2DM）的发生率增高， 且呈年轻化趋势。糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见的并发症之一， 是T2DM重要的致死因素， 然而糖尿病早期肾损伤具有可逆性[1， 2]。因此， 及时发现糖尿病早期肾损伤， 对于糖尿病肾病的预防、延缓或减慢疾病的进程十分关键。目前临床上使用的肾功能检测指标血清肌酐（Scr）只是在内生肌酐清除率（Ccr）低于50%时才出现增高， 不能发现早期肾损伤， 容易错过最佳治疗时期而导致肾衰， 因此临床早期全面诊断显得尤其重要。有报道血清中胱氨酸蛋白抑制剂C（CysC）较Scr能更好地反映肾功能损伤的程度[3]， 同时检测尿微量白蛋白（U-MA）可以早期诊断糖尿病肾小球损伤[4]。近年来研究表明同型半胱氨酸（HCY）与糖尿病微血管并发症具有相关性[5]。本文通过对健康者、糖尿病及糖尿病肾病患者CysC、HCY、U-MA、Scr、 FPG及BUN的水平进行同时检测， 并通过Scr含量计算出的Ccr， 探讨联合检测对DN早期诊断的应用价值与意义。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 收集2012年6月～2012年12月间经本院内分泌科确诊的门诊或住院患者。糖尿病组100例， 男66例， 女34例， 年龄35～80岁。其中分为单纯糖尿病（DM）组72例， 男45例， 女27例， 年龄41～80岁；糖尿病肾病（DN）组28例， 男17例， 女11例， 年龄35～73岁。健康组80例， 经本院体检中心确诊无心脑血管疾病和糖尿病的健康者， 男45例， 女35例， 年龄30～68岁。

1. 2 方法 ①标本收集：空腹12 h抽取静脉血， 以促凝管收集的标本测定CysC、HCY、Scr、 FPG及BUN， 收集随机尿测U-MA。②仪器与试剂：以免疫胶乳比浊法测定CysC（北京利德曼生化股份有限公司批号2092721）， 循环酶法测定HCY（北京万泰德瑞诊断技术有限公司批号ZL3102AA32）， 酶法测Scr（德赛诊断系统有限公司批号120081）， 谷氨酸脱氢酶法测定BUN（德赛诊断系统有限公司批号00000138）， 免疫比浊法测U-MA（德赛诊断系统有限公司批号17174）和免疫比浊法测FPG（中生北控生物科技股份有限公司批号201203）， 以上检测均在全自动生化分析仪（日立7600-010）上进行。所有检测均受控于室内质控和卫生部室间质量质控计划。③Ccr计算公式：Ccr（ml/min）=uCRE×uV×1.73/ Scr×体表面积（uCRE为尿肌酐， Scr为血肌酐， uV为尿量）

1. 3 统计学方法 所有数据均以SPSS11.1系统处理， 以 （x-±s）表示， 组间比较采用两样本均数t检验， P

2 结果

2. 1 各组指标的检测结果 表1中可见DN组各指标显著高于健康组， 各组间比较差异具有统计学意义（P

2. 2 各指标相关性分析 DM组中HCY与CysC呈正相关（r=0.887， P

2. 3 糖尿病不同病史阶段CysC、HCY、Scr、BUN、Ccr的阳性率分析分别以CysC>1.25 mg/L， HCY>15.0 μmol/L， Scr>133.0 μmol/L， BUN>8.1 mmol/L， Ccr

3 讨论

糖尿病肾损害是糖尿病严重的慢性微血管并发症， 也是糖尿病患者的主要死因之一， 有超过30%的患者发展为肾功能衰竭及需要肾透析。相关专家认为与其他指标相比， CysC检出糖尿病肾病的灵敏度为40%， 特异性为100%， 因此有必要在诊断糖尿病而无证据有肾病患者中定期检测CysC浓度变化以观察其与糖尿病微血管病变的关系。而HCY作为一种血管损伤性氨基酸也与糖尿病肾病损害相关， 认为高HCY血症是DN的一个独立危险因素[5， 6]。联合检测血HCY与CysC可早期预测糖尿病肾损害的程度， 从而可从不同角度、更安全地评价糖尿病早期肾损害[7]。也有研究提示， 2型糖尿病在确立诊断时即应检测尿微量白蛋白。本研究同时对CysC、HCY、U-MA、Scr、 FPG及BUN进行检测， 探讨联合检测对DN早期诊断的应用价值与意义。

本研究结果显示在糖尿病患者中， 当Ccr下降时， CysC、HCY的升高比血Scr更快、更早。本文研究结果显示DN组血清CysC和HCY水平明显高于对照组， 差异具有统计学意义（P

本研究同时对糖尿病不同病史阶段CysC、HCY、Scr、BUN、Ccr的阳性率进行了分析比较， 结果提示在DM的疾病过程中， CysC和HCY几乎同时且较早出现异常， Ccr的异常也出现较早但阳性率低于CysC和HCY， Scr、BUN的异常则出现较晚， 提示CysC、HCY对于糖尿病早期肾损伤的诊断有重要意义。建议在常规糖尿病治疗过程中定期检测CysC、HCY， 及时发现糖尿病早期肾损伤， 这对糖尿病肾病的预防、延缓或减慢疾病的进程具有重要的临床意义。

参考文献

[1] 刘志红.糖尿病肾病.中华肾脏病杂志， 2000，16（2）：126-131.

[2] Ozkan Y， Ozkan E， Simesk B. Plasma total homocysteine and cysteine levels as cardiovascular risk factorsin coronary heart disease. Int J Cardiolardiol， 2002， 83（8）： 267-277.

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[4] 张秀明，沈琪琳，郭杰.尿中微量白蛋白测定技术的研究进展.国外医学临床生物化学检验学分册， 1996，17（5）：219-222.

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