蛋白质组学十篇

蛋白质组学篇1

为迎接更全面的生命科学的发展，提高生物科学专业学生适应学科发展的需要的能力，我们学院专门开设了针对生物科学专业的限选课程――蛋白质化学与蛋白质组学。本课程在介绍蛋白质化学基本内容的同时，兼顾学科发展动态，使学生掌握蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和生物信息学在蛋白质组学及蛋白质工程方面的应用及典型的研究实例，力求增长生物科学专业学生的专业知识与技能，为完成毕业论文设计及今后从事生命科学相关工作打下坚实基础。课程开课几年来，笔者及同教研室课题组对蛋白质化学与蛋白质组学课程的教学理念、教学内容、教学方法，教学效果评价方式进行了积极的实践与探索。

一 教师本身要努力提高教学质量

蛋白质化学与蛋白质组学的授课对象是生物科学专业本科三年级的学生。该阶段的学生面临毕业论文设计及准备考研两大难题，对此，本课程的教学目标应该是养成学生的科研思维，提高实验设计水平，培养其动手能力。这就要求教师必须更新教育理念，改变以往理论课单向授课的方式，要认识到此时的教学课程必须以学生为中心。因此，教师在精心准备教案讲义，认真制作多媒体课件的同时，应当思索如何灵活地运用各种教学方法，引导学生的兴趣，并使学生参与到教学过程中来。提高教师自身的理论水平和科研能力，改革教师课堂教学方法和教学结构，认真研究学生的认识规律和学习方式，培养学生的学习兴趣，充分调动学生的主观能动性是提高教学质量所必需的。在教学过程中，教师扎实的理论基础、丰富的科研经验、熟练的实验操作水平是引导教学成功的先决条件。

二 教学理念要转变，教学方式要灵活

“以学生为中心，以能力培养为导向”这一理念近年来备受教师关注和学生欢迎[2]。这一理念强调由教师引导，确定教学目标，学生为中心和主导，根据教学目标，主动收集整理资料，自主探究相关知识，发现问题，分析问题，解决问题，最后由教师总结，将学习的主动权真正交还给学生。这样，教师与学生在发现分析解决问题的过程中，各自完成教学任务，效率和认知度远超过以往单向的教授方式。

由于该门课程为限选课，选课学生维持在25～40人左右，因此，教师从备课开始就应以灵活的方式与学生去沟通。在课堂上，我们在进行多媒体教学的同时，增加与学生的互动，及时掌握学生的兴趣点与理解程度，可以充分调动学生的积极性。实践证明，教师更新教学理念，提高教学质量，对于端正学风，提高学生的积极性有着积极的作用。

生命科学是一门实践性很强的科学，因此理论与实践相结合是完成教学任务的必经之路。因此，笔者根据课程的教学内容和学生的理论水平及兴趣点，经常开展各种课间讨论，促进学生深刻并灵活地掌握知识。笔者常采用以下方式：首先，生命科学是一门发展迅速的科学，与医学、社会学等学科有交叉，且与我们的生活生产密切相关。因此，灵活地举例对于培养学生的学习兴趣显得十分重要。例如，北京蛋白质组学研究中心是我国蛋白质组学国家重点实验室，作为国际人类肝脏蛋白质组计划实行总部，目前该中心已成功鉴定人类肝脏蛋白质13000余种，并绘制了高可信度的肝脏蛋白质互作图谱，发现了58种潜在的肝脏疾病候选基因等。像常见的脂肪肝、肝炎病毒感染、肝癌癌变及转移等标志蛋白质陆续被发现，为今后肝脏相关疾病的预防及治疗打下了坚实的基础。通过这一举例，既能够增强学生对蛋白质组学的认可度，且因为该项目为我国自主研究项目，能够为学生提供今后科研的方向，也能增强学生的科研信心。其次，安排学生参加教学实验或科研实验，引导学生有意识地学会科研思维，激发学生学习兴趣，培养其分析问题和解决问题的能力。例如，通过让学生参与笔者主持或参与的科研课题，了解科研实验的实施过程，在此过程中理解并掌握所学知识。再次，指导学生进行实验设计和科研设计，培养其科研能力。例如，让学生根据需解决的科研问题和掌握的实验方法等，指导其通过参考文献等方法进行初步的实验设计及课题研究报告的撰写。近年来，笔者已指导学生撰写科研课题研究报告多项，并获学校及学院立项，极大地提高了学生的信心和兴趣。此外，为了提高课程的实用性，提高学生的动手能力和解决问题的能力，笔者所在学院开设了开放实验课程，我们鼓励学生主动地进行实验设计，习得相应的实验技能。

三 考核方式和教学效果评价方法要改进

高校的选修课程普遍采用平时成绩和期末成绩综合评价的方式进行考核。以往的课程其平时成绩部分通常以出勤率或者答题的方式为参考，对于评价学生的学习效果并不适用，而期末成绩仅凭一张理论考试试卷也难以评价学生的科研思维和能力。生命科学是一门实践性很强的学科，而蛋白质组学的教学目的，是通过本课程培养学生的科研思维，培养学生的科研能力。因此，在考核方式上，也应当实施多种考核方式，综合评价学生能力。考试方式主要由平时成绩、综述写作及期末理论考试成绩组成。以探究式教学方法教学，重点在于灵活地考查学生运用理论知识探究科学问题的能力。因此，在平时，我们让学生以小组或个人形式，自由地进行发挥。如，进行课题设计，讨论实验思路，撰写研究论文，演讲PPT及答辩等方式进行评分，借此改变单独理论考试的单一形式，建立更科学的多元化评价方式，引导学生进行探究式学习，注重对学生能力的培养。此外，综述的写作有助于学生形成对某一科研领域的综合认识，期末理论考试主要考白质组学相关概念和理论的掌握程度，同时结合实验分析题也可以一定程度上了解学生对某些重要蛋白质组学技术的掌握程度。

蛋白质化学与蛋白质组学这门课程作为生物科学专业学生的限选课程，在国内院校开得并不多，该课程在我校已开设多年，以探究式的教学方式为主要教学方法受到了学生的欢迎和肯定。对于需要进行毕业论文设计和今后即将进入医院或科研机构的生命科学专业学生来讲，这门课程在一定程度上让他们初步形成了科研思维，并且得到了一定的训练，对于今后进入实验室有着较好的铺垫作用。此外，毕业论文设计的指导老师也普遍认为学生具有一定的科研思维能力，知识较全面，因此也充分显示了该课程教改的优势和效果。

四 教师应当以身作则，培养学生求真的科学态度

伟大的教育家陶行知曾说：“千教万教教人求真，千学万学学做真人”。科研探索是用于发现问题、分析问题和解决问题的，在此过程中，需要对每次的实验结果进行多次论证，力求结果的真实及科学性。孔子云：“其身正，不令而行。其身不正，虽令不从。”因此，教师自身良好的教学态度和科研精神起到了楷模示范的作用。由于学生理论及实验水平有限，在课外指导学生进行实验设计或论文撰写时，教师必须直接参与并监督实验的实施与完成，在此过程中，教师需要一丝不苟，严谨求真，坚韧不拔，同时，也应严格要求学生在实验前做好各项准备工作，实验过程中规范操作，对实验结果进行独立思考和分析，杜绝造假及人为疏忽。

在处理与学生的关系时，一定要真诚平等，这一点十分重要。教师传授知识，学生学习知识，师生关系融洽是完成教学任务的一项重要保证。教师如能自律，一丝不苟，真诚平等地对待每一位学生，那么学生也会以真诚的态度对待课程，如此才会有良性循环。

综上所述，蛋白质化学与蛋白质组学的教学过程中应时刻把握“以人为本，以学生为中心”的教学理念。将探究式教学方式贯穿课程的教学过程，能够提高学生的科研思维和创新能力，在此过程中，学生自主或相互合作，与教师共同参与教学过程，激发了学生的学习兴趣，充分地调动了其主观能动性，因而直接提升了教学质量，对于面对即将进行毕业论文设计，即将考研或即将实习的生物科学专业学生而言，受益匪浅。

当然，该门课程属于新开课程，碰到许多难题。首先，在教材的选择上，我们选择很久，教育部没有正式出版的专门针对蛋白质化学与蛋白质组学的规划教材，因此，我们选择何华勤主编的《简明蛋白质组学》作为授课教材，该书内容全面且简明扼要，并以利布莱尔主编的《蛋白质组学导论――生物学的新工具》、Wilkins主编的《蛋白质组学研究：概念、技术及应用》为参考书要求学生阅读。第二，学生前两年以修学分为主，理论课程较多，实践时间较少，因此对本课程很多稍微复杂点的实验内容，如亲和柱层析、DIGE等缺乏深刻理解;此外，课程中讲解到的各种实验仪器，如双向电泳系统、质谱仪等由于价值不菲，对本科生的开放程度有限，因此，学生即使掌握理论，但无法形成深刻认识;最后，生物信息学内容专业复杂，学生的认知度与课程要求有落差，限制了教学的效果。但是笔者与同课题组成员课余开放本研究所现有的双向电泳平台，力求为学生创造条件。

生命科学学科发展日新月异，高校人才培养观念和体系也要不断与时俱进，教师需要不断修正教学方案，及时总结教学规律，才能提高教学质量，这样才能真正做到以学生为中心，以能力培养为导向，努力而有效地培养出适应社会和经济发展需求的生命科学学科专业人才。

参考文献

蛋白质组学篇2

1蛋白质组学常用研究技术

蛋白质组学技术主要包括基于二维电泳(two-dimensionelectrophoresis,2DE)、高效液相色谱(highperfoemanceliquidchromatography,HPLC)等蛋白质分离技术;与数据库搜索相结合的同位素标记定量质谱(isotope-codedaffinitytag)、荧光差异凝胶电泳(differenceingelelectrophoresis,DIGE)表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,SELDI-TOFMS)、电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)等蛋白质定量和鉴定技术[6]。近年来蛋白质组学技术在疾病研究方面表现出了独特的优越性并取得了显著的成绩。

2蛋白质组学在动物细菌性疾病研究中的应用

蛋白质组学在动物细菌性疾病中研究范围涉及细菌在不同环境下蛋白表达谱的变化、筛选疫苗候选蛋白以及鉴定与细菌的致病及耐药机制相关蛋白质蛋白质[7]。在完成羊种布鲁菌强毒株16M蛋白质组表达图谱的基础上,比较了牛源布鲁菌强毒株和疫苗株蛋白质组差异。结果表明,强弱毒菌株在铁代谢、糖结合、脂代谢及蛋白合成等方面有一定差异,从分子水平上解释了强弱毒菌株在代谢途径上的关键区别[8]。陈焕春等以2006年引起人发病死亡的2型猪链球菌(SS2)的四川分离株SC-21为研究对象,利用蛋白质组学技术研究了其在37℃(对照条件)和42℃(模拟发病猪的体温)培养条件下的分泌蛋白图谱的差异,并鉴定了5个差异蛋白,为揭示SS2的致病机理、筛选药物靶标以及新型疫苗的研究提供了部分依据[9]。刘国勇等[10]利用蛋白质组学技术分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,共发现了34差异蛋白质点,鉴定出其中的7个蛋白点,分析后认为滑动蛋白K、腺酐甲硫氨酸合成酶和膜蛋白可能是柱状黄杆菌的毒力因子。TavernaF等[11]建立了奶牛炎病原金黄色葡萄球菌细胞表面可溶性蛋白2-DE参考图谱,为比较金黄色葡萄球菌不同菌株对奶牛的致病性和分析鉴定疫苗候选抗原奠定了重要基础。ZicbandtAK等[12]对两株不同的金黄色葡萄球菌RN6390和Col株研究发现发现葡萄糖激酶和脂肪酶蛋白质点存在于RN6390菌株中,而IgG结合蛋白、肠毒素、白细胞毒素D、肠毒素B等9种蛋白质点只存在于Col菌株中存在,为深入研究金黄色葡萄球菌的耐药机制和致病机制奠定了分子基础。

3蛋白质组学在动物病毒性疾病研究中的应用

蛋白质组学在动物病毒性疾病中的研究主要集中在病毒感染后诱导宿主细胞蛋白质组改变以及病毒感染的宿主血清/血浆差异蛋白质组研究等方面,如为揭示PK-15细胞感染CSFV后蛋白质组的变化,利用蛋白组学技术从感染48h的细胞中寻找并鉴定了35个差异表达蛋白质点。Westernblot分析证实了膜连蛋白2上调表达,甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)下调表达[13]。这些差异表达的蛋白是PK-15细胞对CSFV感染的特征性反应,有助于进一步研究CSFV的感染机理。进一步对感染CSFV猪血清进行了差异蛋白质组分析,鉴定了14种差异表达蛋白,其中的急性期蛋白接联珠蛋白(haptoglo-bin)、补体成分C4a、载脂蛋白A-1(apolipoproteinA-1)已被鉴定为其他疾病如乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染或相关癌症的潜在生物标记[14]。同样,鉴定的这些蛋白具也有作为CS-FV感染生物标记的潜能。DhingraV等[15]研究发现,野生型狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)感染能诱导与离子平衡有关的蛋白H+ATP酶和Na+/K+ATP酶上调表达,而Ca2+ATP酶下调表达,这些参与突触泡与突出前膜对接或融合的相关蛋白下调表达会导致细胞内Na+和Ca2+浓度降低和感染鼠的前联会积聚大量突出泡,而弱毒RV感染没有类似现象,这可能是野生型RV致神经机能障碍的机制。另外还发现,弱毒RV感染介导凋亡相关蛋白上调表达,而野生型RV没有这种现象,这一发现解释了仅有弱毒RV感染才能诱导细胞凋亡的分子机制。王娜[16]利用蛋白质组学技术分析了猪繁殖与呼吸综合征病毒071030株和福州株接种Marc-145细胞后蛋白质组学差异,为进一步研究PRRSV毒株间的致病力差异提供了分子基础。ZhangX等[17]用蛋白质组学相关技术发现在PCV-2感染PK15细胞后α微管蛋白、β肌动蛋白、及细胞角蛋白8发生了变化,为进一步理解PCV-2与宿主的相互作用奠定了基础。

4蛋白质组学在动物寄生虫病研究中的应用

蛋白质组学用于动物寄生虫病研究主要集中于对不同生活史阶段发育相关蛋白图谱以及发现药物靶蛋白和疫苗候选蛋白等方面。近年来,蛋白质组学在以血吸虫为代表的重大疾病研究中得到广泛应用。利用蛋白质组学技术,分离、鉴定出日本血吸虫天然分子质量31ku~32ku抗原组分,发现其中3个蛋白点与这些天然分子中起保护性的有效分子相关[18-19]。DvorkJ等[20]对日本血吸虫进行蛋白质组学分析,鉴定了361个蛋白质,其中15种为蛋白酶,并且组织蛋白酶B2能够消化宿主的表皮和结缔组织。YangLL等[21]利用蛋白质组学技术分离、鉴定日本血吸虫正常尾蚴及紫外线致弱尾蚴虫体间差异蛋白,分析得出20个差异表达蛋白,分别于细胞代谢、递呈、酶促反应等血吸虫生命活动相关。GardnerMJ等[22]应用蛋白质组学技术分别研究了恶性疟原虫在孢子期、裂殖体期、滋养体期和配子体期的蛋白质组变化。鉴别了恶性疟原虫1289种蛋白质,其中包括无性生殖期714种、配子体期931种和配子期645种。CohenAM等[23]以对数生长期刚地弓形虫为研究对象,用pH4~7和pH6~11分离到1000余种多肽,分离到3000~4000种多肽。

5蛋白质组学在动物其他疾病及相关领域研究中的应用

随着蛋白质组学技术的发展,该技术也在动物营养代谢疾病以及克隆动物研究领域中逐步得到应用。如EdvardssonU等[24]以高三酰甘油、高血糖和高胰岛素血症的小鼠作为临床肥胖症和胰岛素抵抗模型,给予PPAR-α特异性颉颃剂。结果表明,治疗后1周血浆三酰甘油、高血糖和高胰岛素水平明显降低,蛋白质组学分析发现至少有16个蛋白质位点表达上调,其中有14种为过氧化物酶体脂肪酸代谢有关的蛋白质。ChaeJI[25]等利用蛋白质组学技术分析了体细胞核移植技术克隆的成年猪胰脏蛋白质组的变化发现了69种差异蛋白质。在体细胞核移植样本中,与细胞调往相关的膜连蛋白,核纤层蛋白,热休克蛋白都发生了上调表达。而抗氧化蛋白和过氧化氢酶发生了下调表达。Westenblot鉴定结果显示抗氧化蛋白酶和抗凋亡蛋白也发生了下调表达,而凋亡蛋白酶却发生了上调表达。该结果提示克隆成年猪胰脏中活性氧自由基的积累导致了细胞凋亡的发生。

蛋白质组学篇3

关键词：蛋白质组学；心血管疾病

2000年6月26日，由六国合作研究的人类基因组工作草图基本完成，已给制出人体97%的基因组，基中85%的基因组序列得到了精确测定，包含了人体约30亿个碱基对的正确排序。此后，科技工作者们开始将目光转向蛋白质组学（proteomics）、功能基因组学的研究，研究的重心也从简单地揭示遗传信息转移到外界因素下的生物功能研究，蛋白质组学也由此应运而生。

1 蛋白质组学的定义

蛋白质组（ Proteome）的概念，最早见诸于1995年7月的"Electrophoresis"杂志上，它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。早期定义为：微生物基因组表达的整套蛋白质，在多细胞微生物中，整套蛋白质指一种组织或细胞表达的蛋白质，后来定义为：一个基因组所表达的蛋白质。

蛋白质组学（Proteomics）是以蛋白质组为研究对象的新的研究领域。它可分为：①表达蛋白质组学（expression proteomics： 即把细胞、组织中的蛋白，建立蛋白定量表达图谱，或扫描EST图。该方法依赖2-D凝胶图和图像分析技术，而且在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路，以及疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性；②细胞图谱蛋白质组学（cell-map proteomics）：即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置；通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等，来确定蛋白质-蛋白质的相互作用。

2 蛋白质组学在心血管疾病中的应用

心血管疾病严重威胁人类的健康，其发生和发展涉及动态、复杂、精细的细胞内过程。作为细胞的基本功能单位，蛋白质是生命活动的执行者，广泛参与细胞的功能与调节，在病理条件下发生改变，决定细胞、组织和器官的表型[1]。基因表达产物--蛋白质异常是疾病发生发展中的重要因素。目前，蛋白质组学技术已经广泛应用于肿瘤、血液性疾病、自身免疫病等方面的研究，并且取得了一定进展。

2.1蛋白质组学在冠状动脉粥样硬化中的研究应用 冠状动脉粥样硬化样心脏病（coronary heart disease，CHD，简称冠心病）是一种遗传和环境危险因素共同作用而发病的多基因遗传性疾病。CHD的发生主要涉及脂质代谢障碍、血管内皮细胞损伤、单核细胞迁移并分化为巨噬细胞、平滑肌细胞从中膜迁移至内膜并增殖、泡沫细胞的形成、细胞坏死和脂质沉积等许多过程。You SA等[2]将蛋白质组的方法运用于寻找冠状动脉粥样硬化发病的生物标志物的研究。他们发现，冠状动脉病患者的铁蛋白轻链的表达量显著增加。随后的DNA印迹和PCR进一步证实了铁蛋白轻链表达水平的升高，并推测增加的铁蛋白轻链通过氧自由基的产生调节血管壁内脂类的氧化状态，加速冠状动脉病的产生。Buscemi等[3]叫利用二维凝胶电泳技术分离蛋白质，利用分行质谱技术（MALDI-TOF）鉴定Rac1转基因心肌肥厚小鼠模型中肌酸激酶M・链蛋白的变化，结果显示，该种蛋白含量比正常组高，因此，监测肌酸激酶M.链蛋白的变化可以用来诊断心肌肥厚，并判断病情的变化。杨鹏远等[4]分离大鼠冠状动脉总蛋白，检测出2626个蛋白质斑点，并且得到不同条件下的蛋白质组的差异图谱，对比分析了正常组和动脉粥样硬化模型组心肌组织的差异蛋白，发现33个蛋白质斑点只在正常大鼠心肌蛋白检测到表达，46个蛋白点在两种细胞中表达量上有显著差异。

2.2蛋白质组学在扩张型心肌病中的研究应用 扩张型心肌病 （dilated cardiomyopathy，DCM）是心肌疾病的一种类型，其特征为左或右心室或双侧心室扩大，并伴有心肌肥厚。心室收缩功能减退，伴或不伴充血性心力衰竭。室性或房性心律失常多见。病情呈进行性加重，死亡可发生于疾病的任何阶段迄今为止，病因未明，DCM是利用蛋白质组学研究最为深入的一类心血管疾病。研究发现有100多种心肌蛋白质在DCM的心肌细胞中明显减少，这些蛋白质许多已经被鉴定，其中包括细胞骨架蛋白即肌纤维蛋白，与线粒体及能量产生相关蛋白，与应激反应相关蛋白等[5]。Pleissner等[6]的研究发现，DCM患者的52种右心房心肌蛋白的表达水平与正常人相比发生了明显变人，其中肌球蛋白轻链2（Mt，C-2）的蛋白丰度增加到336%，而HSP27降低到59%，这两种蛋白被认为是DCM的右心房的特征性标记蛋白。Weekes等[7]对牛先天性DCM 心肌进行2-DE分析。证实其存在线粒体相关蛋白表达的改变，共35个相关蛋白质点，24种蛋白质表达下降，11种蛋白质丰度增高， 降低的蛋白质包括线粒体和能量代谢表达的蛋白，包括：肌酸激酶M、细胞色素C氧化酶、细胞色素b5、肌红蛋白、3，2-transenoyl-CoA转移酶。

2.3蛋白质组学在心力衰竭中的研究应用 心力衰竭的临床表现有左心室泵血功能降低、射血分数下降、心脏扩大、神经体液反应活化，在细胞水平出现心肌细胞形态和收缩功能的变化。应用双向电泳技术研究其蛋白质组变化，有助于了解心衰时心肌细胞功能障碍及代偿作用的分子机制。Heinke等[8]以右室起搏（245 bpm，34w）诱发犬心力衰竭，取左心室肌组织进行二向电泳和MALDI-MS质谱分析，发现在pH 3～10的范围内分离的蛋白质分子量为10～150 kDa，有31种蛋白质发生明显变化，其中21种数量减少，10种增加。发生变化的蛋白质相对分子量在15～68 kDa之间，等电点为4.6～9.02，有60%的蛋白质等电点大于6.5，目前已鉴定出其中的23种包括：线粒体应激70相关蛋白（属热休克蛋白HPS70家族）数量增加，肌酸激酶M链、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶、3，2-transenoyl-CoA转位酶、细胞色素C氧化酶、细胞色素b5数量减少；磷酸甘油酸变位酶、磷酸丙糖异构酶增加，血红蛋白、肌红蛋白均减少，半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystationC减少，Ras相关蛋白增加。以上变化普遍存在于不同种属生物的心衰过程中。

2.4蛋白质组学在心肌缺血/再灌注损伤中的研究应用 心肌缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion iniury，I/R）包括从轻微缺血时的可逆性损伤到严重缺血时不可逆性细胞坏死。研究该过程中蛋白质组的变化，是理解这一病理过程的基础。目前研究重点主要集中于细胞骨架、肌原纤维、信号转导分子等蛋白组分的改变。Coma等[9]采用免疫组化和Western Blotting方法研究成年豚鼠在常氧、缺血、缺血/再灌注、钙反常等情况下细胞内钙超载对心肌细胞内肌钙蛋白T（TnT）免疫反应性修饰的影响：正常与单纯缺血组呈阴性反应，缺血再灌注和钙反常心肌细胞呈TnT免疫反应阳性。Western Blotting显示，缺血再灌注和钙反常心肌细胞中TnT出现240～260 kDa、65～66 kDa的反应性多肽片段。Arrell等[10]采用腺苷（100/Zmol/L）预处理成年兔心肌细胞，经分步提取蛋白、双向电泳分离后发现，在生理pH条件下提取低丰度胞浆蛋白时可见约800个斑点，有3个条带迁移。酸性条件下提取高丰度肌丝蛋白，银染后可见蛋白多集中于pH 5.0左右。Westem Bloting显示该组蛋白质为磷酸化MLC1（myosin light chain 1），其中腺苷预处理组MLC1中有（34.04～2.7）%发生单磷酸化，（25.74～1.6）%发生双磷酸化，其磷酸化程度高于对照组[（28.94～2.4）%与（5.14～1.0）%，P

2.5蛋白质组学在心肌细胞线粒体功能中的研究应用 由于心脏做功需要提供足够的能量，心肌细胞内富含大量的线粒体，当线粒体出现病变时，心脏功能会受到影响。Taylor等 用高度纯化的正常人心脏组织的线粒体编辑了线粒体蛋白质组目录。通过双相电泳共产生了615个清晰的蛋白点，将所有蛋白质都标出了pI值、分子量范围和疏水性等特征参数。线粒体膜内的已知氧化磷酸化的蛋白质亚组的覆盖率>90%。不过，其中19%的被鉴定蛋白质的生物化学信息尚未明确。肌酸激酶（CK）对于维持高能磷酸盐内环境稳定至关重要。对CK基因双敲除（DbKO-CK）而缺失MM（muscle mitochondria1）和ScMit（sarcomeric mitochondriM）CK亚型小鼠研究表明，骨骼肌收缩功能严重受损，而心肌功能基本未发生显著变化。通过蛋白质组技术研究发现，MM-和ScMit-CK亚型的缺失并未引起心肌线粒体蛋白质很大程度的变化 。

总之，蛋白质组学是对全套基因组所编码的蛋白质的组成、结构和功能，以及蛋白质之间的相互作用进行整体研究的一门新兴学科。对蛋白质组进行研究的最终目的在于：找到具体的分子靶点，并以此为突破口，最终攻克如心血管疾病这样的人类重大疾病。通过功能蛋白质组学的研究，可能揭示蛋白质修饰究竟是某一疾病的起因还是结果，从而达到诊断和治疗疾病的目的，为我们下一步的医疗卫生事业作出贡献。

参考文献：

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蛋白质组学篇4

性，有所提高，本文就蛋白质组学在药物研究中的作用做一综述。

1 药物蛋白质组学

由于蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者， 因此蛋白质不仅是多种致病因子对机体作用最重要的靶分子，而且也成为大多数药物的药靶乃至直接的药物。蛋白质组学正是近年来新发展起来的、强有力的发现药靶的技术平台， 这是一个新的学科发展领域。以药物发现为起点， 基因组学与蛋白质组学间的相互协调运作， 将有助于阐明疾病的发生、发展机制、鉴定新的药靶， 以及新的生物标志物， 并用于指导临床试验。一项科学统计表明：在90 年代中期， 全世界制药业用于找寻新药的药靶共283个， 它们主要是蛋白质(受体占45%， 酶占28%等)； 而当时全世界正在使用的药物总数大约有2 000 种， 其中85%都是针对上述483种药靶。从功能基因组学的角度看，人们认为每种疾病平均与10种左右基因相关， 而每种基因又与3~10种蛋白质相关。如果以人类主要的100~150种疾病进行计算， 则将有3 000~15 000种的蛋白质可能成为药靶。

药物蛋白质学研究的内容，在临床前应包括：发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物有人称此为化学基因组学(chemogenomics)，也应包括应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学[3]；在临床研究方面应包括：药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。类似于基因组和蛋白质组，药物蛋白质组的成功将不仅需要综合的技术和计算机的发展，而且也将需要药物发现过程在制药工业中发生根本的变化。朝向这个目标的任何研究进展都将可能产生大量的、可专利的药物分子。

许多公立和私立机构都在实施结构蛋白质组计划。公立的计划现在德国、加拿大、日本和美国展开，总共投入了约10亿美元的基金。现在，已有将近15 000 个蛋白的3D结构已经公开并且可以很方便地使用。未经处理的粗糙的数据和细化的同源性模型工具能预示大量的药物相关蛋白靶的结构和潜在的配体结合位点的形式，及其物理特性。对于制药工业，在蛋白质组规模了解结构信息有以下几个方面的重要性：①结构信息可用于解释功能，因而揭示新的潜在靶点；②能通过分析与共同的小分子结合的其它已知蛋白的同源性，来辅助验证靶，而那些只有结构特性，但不与药物结合的蛋白不能确认为靶；③用基于结构的方法，设计先导化合物，完善结构预示的计算方法，这些最终将使科学家能从序列预示结构和功能；④利用结构信息，对已知的化合物数据库和天然产物数据库作初步筛选，将提高先导化合物的产出效率，降低高通量生物学筛选的成本。

随着后基因组时代的到来和科学技术尤其是蛋白质组学，生物信息学等的发展，蛋白质组学在药物开发中的作用会越来越明显，通过蛋白质组学开发的药物也会越来越多[4-7]。

药物蛋白质组学就是应用蛋白质组学的方法对基因表达水平上的疾病和药物作用效果进行分析[3]，目前虽然蛋白质组学应用于新药研究还处于初级阶段，但其蕴涵的巨大潜能已被药品研究人员看好，在药物发现阶段，大量合成的有机化合物和分离得到的天然产物有效成分，在有效的药理模型上利用自动化的筛选技术进行随机筛选，发现具有进一步开发价值的化合物，称为先导化合物[4-6]。药物发现阶段对创新药物的研究具有决定性的意义，筛选效率的提高将大大缩短新药发现的周期，蛋白质组学技术能促进靶点的发现、筛选模型的建立和中药的研究开发具有重要的意义。

2 靶点的发现

2．1 疾病相关蛋白质 蛋白质组学可以提供一种发现和鉴定在疾病作用下表达异常蛋白质的方法。这种蛋白质可以作为药物筛选的靶点。还可以对疾病发生的不同阶段蛋白质的变化进行分析，发现一些疾病不同时期的蛋白质标志物，这不仅对药物发现具有指导意义，而且还可以形成未来诊断学、治疗学的基础理论[7-8]。癌症被称为当今人类的一大天敌，因而抗肿瘤药物的开发也成了科学家研究的重点。现今大多数抗癌药物都伴随着严重的不良反应。特别是对晚期癌症进行单一化疗或联合放疗、过热疗法时，经常伴随着癌细胞对细胞抑制剂的耐药性的发生。如果能发现耐药细胞体系中表达异常蛋白或者与细胞密切相关的蛋白质，就可以以此蛋白为靶点设计出用于联合用药的药物，也可以此信息为参考，设计避免耐药性或毒副作用的药物[9-11]。另外造成癌症患者死亡率极高的另一个原因是肿瘤细胞的转移。现在国内一些实验室已经开始采用蛋白质组学技术，通过对高低转移的细胞株蛋白的比较，来寻找与肿瘤转移相关的蛋白质，同样也可以以高转移株异表达的蛋白为靶点，开发抑制肿瘤转移的新药[12]。

2．2 新型抗生素 由于传染病是死亡的主要原因，因而抗感染药仍然是各国新药开发的热点之一。但面对抗生素的耐药问题以及不断出现的新的微生物感染性疾病，老的方法已经束手无策，其根本的原因是在于对药物的作用机制缺乏透彻的认识。蛋白质组学技术可以人们更清楚的了解细菌内哪些蛋白质会在抗生素的作用下发生改变，以及发生何种改变。根据这些变化，并以蛋白质为新药设计的靶点，筛选出新一类的抗生素。同时还可以取一些耐药菌株，考察起耐药性。另外二维电泳技术还可以让人们了解在细菌的不同生长阶段、不同生理与代谢机制下，蛋白质的表达谱，进而全面掌握不同条件下的细胞内的调节，将这些信息归档在数据库，可有助于建立微生物的细胞模型[13-15]。

2．3 信号传导分子 靶向信号传导分子的治疗概念是近几年提出来的。由于许多疾病与信号传导异常有关，因而信号传导分子有可以作为治疗药物设计的靶点。信号传递过程涉及到成千上万的蛋白质。蛋白质-蛋白质的相互作用发生在细胞内信号传递的所有阶段。而且，这种复杂的蛋白质作用的串联效应可以完全不接受基因的调控而自发产生。通过与正常细胞的比较，掌握与疾病细胞中某个信号途径活性增加或丧失有关蛋白的改变，将为药物设计提供更为合理的靶点。

2．4 分子药理筛选模型采用分子水平的筛选模型的大规模药物筛选已经被普遍用于第一步初选，其优点为特异性强，灵敏度高，微量快速。蛋白质组学技术应用于筛选模型构建的一个最大的优势就能更清楚、更详细的阐明分子药理机制，提供更为有效、合理的药理模型。根据现有的蛋白质组学的研究结果表明：蛋白质基因表达的调控构成了真正的药物作用机制。有关这方面的文献很多，例如在黄曲霉素诱发的肝癌细胞中加入dithioethiones，通过与对照组细胞的双向电泳图谱比较，可以清楚的看到，在它的作用下，使一种名为黄曲霉素B1还原酶的蛋白质得以表达，表明这种蛋白质具有使黄曲霉素失去毒性的作用。因而，基因表达水平的改变是用来反应疾病和药物作用机制的分子印记。Anderson 等[3]组建了两个蛋白质数据库。一个是分子解剖学和病理学数据库，另一个是药物的分子效应数据库。前者主要用来界定蛋白质在不同组织的表达模式和在各种疾病的表达改变，而后者则着眼与药物蛋白质作用基理的阐明。这些数据库将成为新药发现的指南针，同时亦引领人们进入分子药理学的新纪元。

3 展望

在不久的将来，药物蛋白质组学还可以在靶点的优化和先导化合物的鉴定和优化发挥重要的作用主要表现为① 靶点的优化-如果涉及小分子抑制剂、抗体、抗原的一些技术手段结合蛋白质组技术体系中，将不仅有助于人们更好的了解疾病过程中蛋白质的功能发挥和疾病产生的各种轨迹，还可以提供一种评价手段，考察作为靶点的蛋白质是否为待筛选药物的最佳选择;②先导化合物的鉴定和优化-利用蛋白质组学还可以反过来在蛋白质层面上考察待筛选化合物的药效学，加速先导化合物的鉴定和优化;③蛋白质组学的发展为中药的研究提供了契机。因为蛋白质的作用靶点和作用用途大多是通过蛋白质来体现的，如果利用蛋白质组学相关技术研究中药对细胞蛋白表达谱的影响，就可以建立蛋白质组学和生物信息学等技术平台，利用此平台将中药复方多组分、多靶点、多途径作用特点与基因蛋白表达关联起来，比较各自不同的表达差异谱，确定不同配伍组方对应的蛋白表达靶点，从而阐明药物作用的物质基础及内在的配伍规律。这种结合不仅对中医药基础理论现代化研究具有重要的理论意义，而且对中药的研究开发走向世界具有重要的意义.

参 考 文 献

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蛋白质组学篇5

关键词：蛋白组学；脾虚证；研究思路

中图分类号：R2－03

文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2008)01－0018－02

传统中医理论认为，脾为后天之本，主运化，为气血生化之源，脾主肌肉四肢，开窍于口。现代研究认为，脾(胃)是以消化系统为主的多系统、多器官的综合功能单位，涉及现代医学消化吸收、水盐代谢、能量转换、神经、内分泌、免疫、血液、运动功能等。由于脾(胃)功能的重要性以及脾虚证涉及众多的疾病和复杂的病理变化，脾虚证作为证候学研究的重要课题一直是中医临床和基础研究的重点。

1　脾虚证的研究概况

脾虚证是中医临床最为常见的证候之一，脾虚证的现代研究一直是中医基础理论研究中的重要内容。近几十年来脾虚证的本质研究取得了显著成果，关于脾虚证候发生发展的机理有人提出许多学说，涉及到70余项生化指标的变化。

1.1　脾虚证与消化道各种异常改变有关专家们认为。脾虚证与消化道的病理改变、消化功能下降、胃肠道黏膜保护性屏障作用减弱及胃肠道激素水平紊乱等密切相关。如彭成等研究发现，脾虚模型组大鼠空肠上皮细胞微绒毛肿胀、脱落、数量减少、排列紊乱，这可能是导致小肠吸收功能低下的原因所在。王洪海等采用游泳劳倦加饮食失节法造模，发现脾虚大鼠造模3周后可出现多种胃肠激素如生长抑素、血管活性肠肽(VIP)、B－内啡肽(B－EP)、神经肽Y(NPY)水平的异常变化。严茂祥等研究发现脾虚证大鼠结肠组织中生长抑素(ss)含量较正常组明显增高，胰高糖素(Glu)含量较正常组明显降低，神经肽Y(NPY)、血管活性肠肽(VIP)及P物质(SP)与正常组无显著差异，认为胃肠激素的改变对脾虚证的发生可能起着重要的直接或问接作用。宋述财等运用“胃肠电检测系统”观察脾虚湿困及其它脾胃虚实证的胃电频谱变化，分析胃动力改变，结果发现脾胃气虚证患者胃电减弱。进餐反应延迟。李燕舞等在探讨大黄脾虚模型大鼠即时分离的胃壁细胞电镜下可见明显扩张的分泌小管，小管内可见增长密集的微绒毛，但囊泡状结构少见。程学仁等采用细胞形态立体计量学的方法，对脾虚证患者十二指肠吸收细胞的线粒体进行研究，发现脾虚证与十二指肠吸收细胞线粒体的改变有一定关系。宋于刚等对慢性胃病为主的脾虚患者胃窦黏膜进行研究，发现其分泌的G、D细胞数均减少，D细胞面积缩小，G／D细胞数和细胞面积比值均增高，因而认为G、D细胞的变化可能是慢性胃病脾虚证胃肠功能障碍的一个重要病理机制。

1.2　脾虚证与免疫功能低下有关专家们研究后认为脾虚证患者及动物模型均存在不同程度的非特异性免疫、细胞免疫功能低下，体液免疫功能紊乱，消化道局部免疫功能下降等异常。林心舜等在实验中测定了脾虚模型小鼠免疫器官重量和吞噬细胞功能的变化，结果发现，与正常小鼠相比，脾虚小鼠脾、胸腺重量以及全血白细胞、腹腔巨噬细胞的吞噬功能显著低下，提示脾虚的发生与免疫功能低下有着密切关系。王洪海等采用复合病因(过度劳倦加饮食失节)造模法，造成脾虚证大鼠模型，造模3周后大鼠的体重、胸腺、脾重量明显降低，恢复1周后未见明显恢复，血清细胞因子水平出现了白细胞介素－1B(IL－1B)降低、白细胞介素6(IL－6)、白细胞介素－2(IL－2)、TNFa的紊乱变化现象。丁洁实验证实。脾虚证患者外周T淋巴细胞的分化增殖能力下降，末梢血中T淋巴细胞总数、辅T淋巴细胞明显减少，抑制性T淋巴细胞相对增多，说明脾虚患者细胞免疫功能降低，免疫调节机制紊乱。章梅等采用化学发光测定和分析的方法，证明脾虚证小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和细胞免疫功能下降，经四君子汤治疗后腹腔巨噬细胞吞噬功能和细胞免疫功能明显恢复和增强。温庆祥等研究发现，脾虚证患者血清白细胞介素一4(IL－4)、白细胞介素－8(IL－8)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(1gA)水平不同程度降低，其免疫功能下降，经四君子汤治疗后均较治疗前明显升高。

1.3　脾与证与基因改变基因技术是近10年来发展最快的科研手段之一，在中医“证”实质的研究中得到了广泛应用。王肃等应用基因芯片技术研究利血平脾虚证大鼠模型大脑皮层基因表达谱的变化，发现筛选出两张芯片上4096条靶基因中，脾虚证模型基因差异表达一致的基因145条，占检测基因的3.54％，其中已知基因表达上调的有27条，表达下调的有20条。初步分析后认为，模型大鼠大脑皮层的基因表达改变涉及免疫、细胞骨架运动、能量代谢、蛋白合成和细胞内信号转导等多个方面，提示脾虚证实质涉及大脑皮层的基因表达谱改变。钱会南等采用苦降泻下、饮食失节和劳倦过度法建立脾虚大鼠模型，以免疫组化和原位杂交法检测下丘脑腹侧核、海马CAl区、前额叶皮层AVP水平和基因表达变化，结果发现模型组上述脑区AVP免疫阳性反应物水平明显降低，治疗组明显升高；模型组海马CAl区、前额叶皮层AVPmRNA表达显著下降。提示脾虚模型大鼠学习记忆及脑内对学习记忆有促进和增强作用的SP、VIP明显下降。杨传标等在探讨大肠癌脾虚证与bcl－2基因表达的相关性及中药健脾康复汤的调节作用的实验研究中，发现大肠癌脾虚证患者酸刺激后的唾液淀粉酶活性显著下降，组织标本bcl－2基因表达阳性率明显升高。

另外，研究表明脾虚证尚涉及血液动力降低、酶学改变、代谢功能改变、神经功能紊乱、自由基代谢异常等。由于现代蛋白质组学研究技术的发展，脾虚证与蛋白质组学的关系研究受到重视。

2　脾虚证蛋白组研究的价值与研究思路

蛋白质作为生物体最重要的结构，但同时又是生命活动的直接执行者，它的组成远比基因庞大和复杂，具有相对独立的代谢过程，对生物机体内部和外部因素具有产生反应的能力。而且蛋白质之间存在着活跃、广泛的相互作用，因此蛋白质组是基因组研究的逻辑发展。与具有同源性和普遍性的基因相比，蛋白质组具有动态性、时间性、空间性、特异性等特征。这与同样具有整体性、动态性、时相性、复杂性等特点的中医“证”有着惊人的相似，也正是这个特点，使蛋白质组在脾虚证的研究中具有极为重要的价值，如前述所，脾虚证的研究虽然已经取得了不少成果，但由于涉及的指标多、系统广，具有特异诊断功能的指标极少，有许多指标的变化不仅在脾虚证中可见，在其它证候中也可出现类似的变化，毫无疑问，如在脾虚证研究中引入蛋白质组学，将无论对脾虚证的微观诊断和临床用药产生重要影响。

蛋白质组学篇6

关键词 蛋白质组学；双向电泳技术；植物

中图分类号 Q75；Q945.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）20-0013-02

研究表明遗传信息通过基因携带，但基因结构的相对稳定性、数量的有限性，与生命现象的多变性、复杂性存在明显的差异[1]。为此，研究认为在所有生物体的细胞、组织、细胞器中，各种代谢反应、生理功能的维持均由各组成部分的表面、内部的蛋白质来完成。蛋白质组是Wilkin S等在1994年第1次提出的。1997年蛋白质组的定义被其创造者重申为：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质。”2000年人类基因组序列草图的完成标志着“后基因组时代”的到来。蛋白质组学（proteomics）的概念最终被定义为“一个基因组、或一个细胞、组织在特定的生理和病理条件下表达的所有蛋白质”。蛋白质组具有特殊性和多样性，其研究的三大核心技术分别是双向电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、生物质谱技术和生物信息学[2-3]。其中，2-DE作为蛋白质分离的重要手段，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离上万个蛋白质的方法，且分离纯度可达90%以上。

1 双向电泳技术的历史

双向电泳技术自诞生以来，一直在不断的发展、改进。1975年O`Farrell对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究中首次采用了双向电泳技术，称为ISO-DALT（等电点-道尔顿）。其第一向是将载体两性电解质（CA）添加到丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的pH梯度进行等电聚焦；第二向是聚焦后的凝胶在含有SDS的缓冲液中平衡后，用琼脂糖包埋到垂直板SDS凝胶的浓缩胶上，形成不连续的SDS梯度凝胶电泳[4]。这种双向电泳蛋白质由于上样量低，溶解性较差，可能会造成负性部分碱性蛋白丢失。另外，两性电解质在凝胶中扩散相对较容易，形成不够稳定的pH梯度，造成分辨率低，重复性差，此为经典双向电泳技术。

为克服经典双向电泳技术中出现的问题，Gorg A 等于1985年研究出固相IPG-DALT（pH梯度-道尔顿）系统双向电泳技术，该技术以固相pH梯度为基础，使双向电泳技术有了质的飞跃。固相pH介质是一类丙烯酰胺化合物，与聚丙烯酰胺共价结合后可形成一定范围的pH梯度。与传统的双向电泳相比，IPG-DALT系统双向电泳技术具有上样量大、不产生阴极漂移、重复性较好、pH梯度稳定、分辨率高等优点。目前，IPG-DALT系统双向电泳技术在各国应用广泛。

荧光双向电泳技术（fluorescent two dimensional differ-ential gel electrophoresis，DIGE）在近年出现，是双向电泳技术的又一次飞跃，是一种对不同样品间蛋白质差异表达进行系统分析的技术。主要用于大样品蛋白质的差异鉴定。

2 双向电泳技术的原理及步骤

2.1 双向电泳技术的主要原理

双向电泳技术是目前蛋白质组研究中最常用的蛋白分离平台，是最高效、最直观的复杂蛋白质组分离技术。它利用各种蛋白质具有不同的分子量、等电点（pI）分离复杂蛋白质组，分辨率、灵敏度较高。其原理为：首先通过电荷分离蛋白质，利用一向等电聚焦将蛋白质沿pH梯度分离至各自等电点；然后沿垂直的方向通过非连续十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量大小差别来达到分离的目的。所得的蛋白双点是基于电荷分离和分子质量大小分离的正交组合，从而分布于整个二维凝胶图谱上，每个点代表其中一个或数个蛋白质，而蛋白质的分子量、等电点在样品中的含量也可显现出来 。

DIGE的原理是将需要比较的样品在电泳前用不同的荧光染料进行标记，被差异标记蛋白的等电点和相对分子质量基本不受影响，然后将其混合到一块胶内进行分离，并用相应波长来检测不同的荧光标记蛋白，最后用全自动蛋白质表达分析软件进行分析。它的出现有效地提高了双向电泳技术的重复性和定量的准确性。

2.2 双向电泳技术的主要操作步骤

双向电泳技术的体系较为复杂，通过多次摸索才能找到适合体系。IPG-DALT双向电泳技术的主要操作步骤如下。

2.2.1 蛋白质的提取。蛋白质提取的质量直接影响双向电泳试验最终结果，不同植物、不同组织蛋白应采取不同的提取方法。

2.2.2 蛋白浓度的测定。采用Bradford法测定蛋白质浓度。

2.2.3 第一向IEF电泳。在进行一向等电聚焦前应将相应的蛋白质与水化液加入样品槽，IPG胶条覆盖在样品上，最后覆上甘油。胶条水化时间应不少于12 h。

2.2.4 第二向SDS-PAGE。配制相应的凝胶电泳进行二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。注意：等电聚焦电泳结束后应将其放入平衡液Ⅰ中，缓慢震荡15 min。第1次平衡结束后，取出胶条，擦干净背面的液体，然后放入平衡液Ⅱ，缓慢震荡15 min。凝胶应在前一天晚上配，使其充分凝固；压胶条时应避免胶条与凝胶之间产生气泡。

2.2.5 显色。SDS-PAGE电泳跑完后可用考马斯法或银染法染色。银染法虽然分辨率高，但由于操作方法比较复杂，掌握较困难，且对后续质谱分析等产生影响。考马斯亮蓝法分辨率较低，但操作简单，应用者比较容易掌握，是一种传统的蛋白质染色法。综合考虑，考马斯亮蓝法比较常用。

3 双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用

3.1 双向电泳技术在玉米蛋白质组学研究中的应用

Von Wiren等通过比较铁摄取缺陷型、野生型突变体玉米的蛋白质双向电泳图谱，从中发现4个与铁离子跨膜运输有关的多肽。李冠军等对干旱胁迫下玉米叶片蛋白质经行了双向电泳分析，选出在3个时段下的干旱处理中均有诱导表达的3个差异蛋白点，经过对比分析，3个点的数据库对比结果均达到显著，最后得出结论，玉米可能通过叶组织的木质化，降低水分的散失量，使细胞膨压得到维持，从而提高玉米的耐旱性。王彦玲等[4]利用双向电泳技术对郑单958及其亲本在缺磷条件下进行蛋白质组学分析，得出郑单958可能在磷胁迫的环境适应方面有杂种优势。付忠军等利用双向电泳技术对亲和性转换前后花丝与花粉差异表达蛋白质经行分析，首先摸索到了适合自己的双向电泳体系。最后得到了9个在不同亲和阶段表达差异的蛋白质点。朱畇昊[5]以玉米花粉为材料，建立了相应的玉米花粉双向电泳体系，然后选择成熟的花粉和离体萌发1小时花粉经行双向电泳，得到28个差异显著的蛋白点。

3.2 双向电泳技术在水稻、小麦蛋白质组学研究中的应用

王经源[6]对汕优63及其双亲苗期第3叶蛋白质组进行定量比较，得到1 667个以上的蛋白质点。发现有23个蛋白质点在3个品系间存在显著差异。丁 伟等用双向电泳对水稻叶片全蛋白经行鉴定，发现与干旱等胁迫相关蛋白，且有4个是首次发现。陈卫卫等对耐高温性差异明显的3个品种作为研究材料，经双向电泳分析及质谱鉴定，得出可能为水稻苗期耐高温相关的鉴定蛋白。

朱 宏等以普通小麦叶片为试验材料，通过优化双向电泳的关键步骤，在小麦叶片可溶性蛋白的分析中获得满意的双向电泳图谱。刘 丽等利用SDS-PAGE、2-DE和MALDI-TOF-MS分析LMW-GS组成，建立了LMW-GS亚基的标准命名系统。孙正娟等以太谷核不育小麦不同时期的幼穗为材料进行双向电泳，得出的结果表明不同时期表达的与育性相关的蛋白不同。

3.3 其他作物蛋白质组学中双向电泳技术的应用

Kubis等基于DIGE蛋白质组学，阐明了前蛋白质输入叶绿体的机制。Sybille在分离制备拟南芥叶绿体时，运用荧光差异凝胶电泳分析突变型、野生型植物叶绿体中蛋白的差异性。通过比对多种TOC易位子亚基的野生型和突变性拟南芥的叶绿体蛋白，探究各种易位子复合物对输送蛋白类型的特异性。林金科等研究了茶树芽叶蛋白质提取纯化及双向电泳技术的改进，探索出一种重复性好，清晰度高的蛋白双向电泳技术体系，并发现一种辨别茶树蛋白质样品质量好坏的简便方法。郭春芳等应用差异蛋白质组学方法分析了铁观音茶树幼苗在聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）胁迫下叶片蛋白质组的变化。

黄华宏等应用双向电泳蛋白质组学对矮化杉木的突变机理进行研究，得到29个差异蛋白质可能与杉木矮化的突变有关。张小静等在深入研究块茎蛋白质发育过程中的差异表达中，建立了马铃薯块茎蛋白质的双向电泳技术体系，并对与其发育相关蛋白质的进行了分析。

综上所述，双向电泳技术在植物发育过程中蛋白质的数量、组成的检测上应用广泛，可为研究者提供不同发育阶段基因表达和调控的特点。

4 面临的问题及展望

双向电泳技术通过研究生物与非生物、植物器官、组织的胁迫蛋白质变化，探讨其病理或生理变化，从而对蛋白质组学的发展研究产生了明显的推动作用。另外，通过与其他蛋白质组技术进行互补、整合，从而进一步拓宽了生命科学研究的途径[7-8]。目前，关于不同条件下植物蛋白表达谱的研究逐渐增加，使大量与逆境、基因发育、突变、植物与微生物互作的新蛋白被发现，但关于这些蛋白质的功能研究目前比较少。因此，在今后一段时间内，植物蛋白质组学的主要研究方向之一为运用生物化学、功能基因组学、生物信息学等方法证实新蛋白质的功能。

近年来，许多新型技术方法被应用到植物差异蛋白质组学研究中，比如荧光差异双向电泳、同位素亲和标记等。荧光双向电泳技术现已得到应用，并且已经成为商品化，但其价格仍然很高，还不能成为一种普及性的技术。综上所述，通过分析双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用现状，发现植物蛋白质学研究中的主要发展趋势是技术手段的多样化、分析层次的多元化，并与其他学科的紧密融合。

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蛋白质组学篇7

【关键词】  蛋白质组； 方证相关

            随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。蛋白质组学作为功能基因组研究的重要支柱，在20世纪90年代中期应运而生［1］。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。结合本课题组的研究，本文就“方证相关”的研究现状及存在的问题、蛋白质组学技术在“方证相关”研究中的可行性及本课题组的研究思路作一简单介绍。

1  “方证相关”的研究现状及存在的问题

    基于临床现实中一方用于多病（证）取得疗效和一病（证）允许多方治疗的事实，方证关系正由原来理解的“一方一证”或所谓的“牢固的对应关系”［2］转变为方与证之间的适配性和关联性，即“方证相关”［3］。“方证相关”是中医学辨证论治的核心问题。

    “方证相关”的“方”是指具有特定药味、药量、剂型、用法等内容的用药形式，“证”则是指特定方剂所针对的具体病证。

    目前，“方证相关”的科学内涵正在成为中医药现代研究的热点领域之一。近年来，围绕“方证相关”的理论研究、实验研究、临床研究3方面研究取得了很大进展。

    在理论研究方面，谢鸣［4］较早提出，不同方剂对同一病证与同一方剂对不同病证效应差异的相关性分析是研究“方证相关”的重要切入点。认为“方证相关”的研究可以从方药不同配伍的角度，考察不同方剂对同一对象的差异性作用;也可以从证的角度，考察同一方剂对不同状态下的机体的影响，来揭示中医治疗学原理。为“方证相关”研究提供了很好的研究思路，也为开展“方证相关”的“同方异证”“异方同证”研究模式提供了理论来源。李喜悦等［5］认为要突出中医学思维特征与现代科学设计融合的研究思路，以方剂干预的治疗效果作为参照标准，用蛋白质组学技术为研究手段，应能从蛋白水平上找到“方证相关”理论的物质基础。

    在实验研究方面，一方面是对“方”的研究，另一方面是对“证”的研究，力求揭示“方证相关”的原理及证的实质。陈艳芬等［6］通过黄连-吴茱萸药对“方证相关”的研究，表明左金丸与反左金不同效应体现了不同的“方”治疗对应不同的“证”。

    在临床研究方面，也有诸多文献报道［7，8］。张兰凤等［9］对63例冠心病心绞痛的临床研究证实，血府逐瘀汤与生脉二号对冠心病心绞痛气阴两虚证及血瘀证进行干预，四组均有一定的疗效，但两者不仅疗效有差异，而且所改变的理化指标不同。从中医的角度看，生脉二号主要干预了气阴虚，而血府逐瘀汤则干预了血瘀气滞。为“方证相关”的“同方异证”“异方同证”研究提供了方法学上的借鉴。

   

但是，目前的“方证相关”研究还存在着思路、技术、观察指标等方面的问题：①在思路上，现代方证领域的研究主要还是定位在对“方”或对“证”的探索上，较少考虑到“方”与“证”之间的内在联系。②在技术上，众所周知，疗效高低是判断方证之间关联性大小的唯一依据。疗效高低的评价，通常涉及到中医临床和实验研究两个方面。其中，临床疗效的评价主要是以证候改善为依据的，而证候具有一定的主观和模糊性，其疗效的客观评价有一定困难。同时，出于伦理上的考虑，临床上不太可能因研究需要而安排与证无甚关联的方药进行实验。实验疗效的评价主要以证的模型动物经方药干预后某些实验室观测指标改善为依据。由于目前人们还没有找到能准确反映证的特异性指标，其疗效指标的选定仍具有不确定性。同时，中医学证的动物模型也缺少“病证结合”模型。③在观察指标上，通过观察几个有限基因、蛋白的变化来认识证的本质或方剂的作用机制，容易陷入捉襟见肘的窘境。

    要解决上述问题，就需要引进新技术、探索新思路,并将其运用到“方证相关”研究中来。

2  蛋白质组学在“方证相关”研究中的可行性分析

    蛋白质组学研究方法，与中医理论对疾病认识的整体观有很多共同之处［10］，其在“方证相关”研究中的应用，具有很强的可行性。

    中医强调的整体观,恰好与当代生命科学前沿的系统生物学理论目标有着极大的相似之处。而系统生物学包括人功能基因组学、蛋白质组学和代谢组学的各个层面,是研究生命活动最有效和全面的方法。

    蛋白质组学研究方法的整体性和系统性与中医基础理论的整体观和系统性相似。任何一种疾病的发病都是一个多途径、多环节的复杂过程,因此治疗疾病必然存在着复杂性。中医治疗疾病从整体角度入手,注重气血阴阳、脏腑协调,在辨证施治方面具有极大的灵活性。同病异治或异病同治,表明治疗亦是一个多靶点、多通道的过程。蛋白质组学是对机体或细胞的全部蛋白质的表达和功能进行研究,因而与中医基础理论的整体观和系统性相似。

   

蛋白质组学技术与中医证候的“即时性”极其相似。任何事物都有其物质基础。几乎所有人类疾病的发生、发展都直接或间接与基因有关,是基因与外界环境相互作用的结果。但同时,真核细胞生物基因复杂,基因不是生物功能万能的执行体,它总要表达为相应的蛋白质,蛋白质是基因功能的执行体,即生命过程的本质是蛋白质的过程。生物体在生长、发育和适应环境的过程中,蛋白质始终处于动态的变化过程,采用对基因组的表达产物——全套蛋白质的研究对于中医现代化具有重要的意义。细胞必须适时的对基因表达做出调整,开放一些基因,关闭一些基因,基因表达在质和量上,受到细胞精确的调节与控制,多细胞生物结构上的复杂性形成了多层次的复杂的信息传递和调控系统,细胞内一整套蛋白质始终处于不断的变化之中。这一动态特点与中医证的“即时性”有惊人的相似性。证候代表一种功能状态,中医证是疾病发生发展过程中某一阶段、某一时刻所具有的病理状态的综合。证“即时性”的特点决定了利用蛋白质组学技术研究的可能性。

   

蛋白质组学技术将为中医的辨证分型及用药提供客观依据。蛋白质组学技术可以直接研究中医证候的特征与细胞蛋白质整体动态变化之间的内在联系,因而克服了蛋白质表达和基因之间的非线性关系。蛋白质组学技术通过从整体上比较不同疾病、同病异证之间的蛋白质图谱差异,探索蛋白质表达图谱与疾病中医分型之间系统的、有规律的联系。寻找复杂的多因素疾病证候的共同本质,使疾病的辨证分型及用药具有客观性、准确性和可重复性。

3  本课题组的研究思路及相关研究基础

    基于上述现状，我们在以往工作的基础上，以临床确有疗效的不同方剂（药物血清）作为干预手段，以高血压病不同证候血管内皮细胞损伤模型作为干预对象，比较、分析干预前后的蛋白质组差异表达，寻找和发现方剂治疗的相关蛋白。通过对不同方剂——高血压病不同证候的“同方异证”“异方同证”的方、证关联性研究，并结合“病证结合”的原则，我们可以揭示其分子生物学基础；方、证关系的阐明，也有利于指导临床据证选方或组方。这也是本课题组研究的基本思路和指导思想。

    张兰凤等［9］的研究为“方证相关”的“同方异证”、“异方同证”研究提供了方法学上的借鉴；临床上中药复方治疗高血压病的成功［11，12］，为药物干预实验提供了可靠的治疗学基础；我们在以往的工作中，进行了“病证结合血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究”（国家自然科学基金，no.30572289；广东省自然科学基金，no.5006019），建立了“病证结合”血瘀证血管内皮细胞损伤模型，王奇等［13］证实活血化瘀复方血府逐瘀汤药物血清能改善内皮细胞的损伤情况，为“方证相关”的研究工作奠定了良好的工作基础；多项相关课题“血管内皮细胞粘附分子表达与血瘀证形成关系的研究”（国家自然科学基金，no.30070909）、“益气活血复方对自发性高血压大鼠心室重构的影响”(广东省中医药局课题，no.1050116)、“益气活血复方对血瘀证血管内皮细胞损伤的保护作用”(广东省中医药局课题，no.101087)、 “益气活血复方对血瘀证血管内皮细胞粘附分子表达的影响”（ 广东省千百十人才基金，no.q02062）的开展，也为我们开展这项研究积累了宝贵的经验。

该项研究，为开展“方证相关”的“同方异证”“异方同证”的蛋白质组学研究，将提供方法学上的借鉴，也为开展“病证结合”的“方证相关”研究提供范式。

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蛋白质组学篇8

【摘要】 人工构建镉盐污染源，选用差速离心结合双向凝胶电泳（2DPAGE）法，高效提取、分离和筛选牙鲆（Paralichthys olivaceus， PO）受镉盐胁迫后的肝脏全蛋白和差异蛋白质。实验结果表明: 选用直接裂解法提取牙鲆肝（PO liver POL）全蛋白质且用2DPAGE分离，可获得约800个蛋白斑点，其中镉盐诱导了11个差异蛋白斑点。以相对离心力为1000×g、12000×g和100000 ×g 的差速离心法，分别制备了3种沉淀蛋白和1种胞浆蛋白，称为POL组分Ⅰ、POL组分Ⅱ、POL组分Ⅲ和POL组分Ⅳ（胞浆蛋白），蛋白斑点数目分别为380、550、500和850个，总计2280个，明显高于直接裂解法。比较分析法发现，差速离心结合2DPAGE分离技术可获得牙鲆肝脏受镉盐胁迫后表达的54个差异蛋白质，并适合于用肽质量指纹(peptide mass fingerprint，PMF)图谱技术鉴定。本实验所建立的差速离心结合蛋白质组学技术可高效提取、分离和鉴定组织全蛋白或差异蛋白，并能有效地筛选出蛋白指示物。

【关键词】 牙鲆肝，蛋白质组学，差速离心，镉污染，蛋白指示物

Abstract Both total proteome and differential proteins were effectively extracted， separated and selected by a combined approach of both differential centrifugation and 2DPAGE in liver of Paralichtys olivaceus( POL) under the stress of cadmium chloride as an artificial pollution source. Approximately 800 spots for extraction of whole protein separated with 2DPAGE were obtained by direct lysis in the POL. In addition， approximately 11 differential proteins in POL were also obtained under the stress of cadmium chloride. The differential centrifugal were used to prepare three sedimentation and a plasmolysis proteins， called POL component Ⅰ， POL component Ⅱ， POL component Ⅲ， and POL component Ⅳ(plasmolysis protein)， respectively. Total protein spots for each gel were calculated to have 380， 550， 500， and 850， respectively， approximately 2280 spots in sum， while total spots are much higher than those by direct lysis approach. Using the comparison method， approximately 54 differential proteins in POL were obtained by a combined technology of both differential and two dimensional polyacylaminde gel electrophoresis(2DPAGE) methods under the stress of cadmium chloride. In addition， these differential proteins can be further identified by peptide mass fingerprint(PMF). Here， these combined techniques can be effectively used to extract， separate and identify the whole proteins and the differential proteins including protein markers in the biological tissue.

Keywords Paralichthys olivaceus liver， proteomics， differential centrifugation， cadmium contamination， protein marker.

1 引 言

建立高效提取与分离动植物及微生物组织细胞中的全蛋白，且可鉴定蛋白质的方法，是目前开展蛋白质组学研究所面临的技术难题之一[1，2]。双向凝胶电泳（2DPAGE）和双向液相色谱分离（2DLC）技术是目前开展蛋白质组学研究的常用分离技术，但前者易受细胞组织内干扰物影响，例如核酸、多糖和脂类物质[3]；而后者在分离过程中，易丢失部分蛋白质，难获取全蛋白[4]。目前，组织细胞全蛋白的常用破碎技术有丙酮沉淀法、裂解法、冻溶法和酶解法等[1～4]。针对生物材料来源不同，优化提取组织细胞全蛋白和减少内外干扰物是开展蛋白质组学必须克服的难题。至今，相关的研究已有大量且详细的研究报道[5，6]，但尚未建立一套较为成熟、重复性高和广谱性好的细胞组织全蛋白质提取方法。环境蛋白质组学是目前环境毒理学中最有挑战性和前瞻性的领域之一，相关的研究仅仅处于起步阶段。环境蛋白质组学能同时筛选与鉴定出由各类重金属和有机污染物，在单一和联合胁迫效应环境中所诱导的多种蛋白指示物[7，8]，为揭示复杂的毒理机理和评价危害性提供实验证据[1，2，9]。

本实验以牙鲆肝脏组织为材料，选用差速离心和双向凝胶电泳非在线联用技术，高效提取和优化分离受镉盐胁迫前后的牙鲆肝脏全蛋白，为后续选用蛋白质组学技术筛选及鉴定监测镉污染程度及危害性的蛋白质标志物提供可信度较高的结果。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

双向电泳仪(北京六一仪器厂)；REFLEX 型MALDITOF质谱仪（德国Bruker公司）；各类冷冻离心机（贝克曼公司）。载体两性电解质（Amersham公司），pH 3～10；胰蛋白酶(Promega公司)；基质α氰4羟肉桂酸（美国ICN生物医学公司）;碘乙酰胺(Sigma 公司)；丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺等试剂均购自上海生物工程技术有限公司；匀浆缓冲液：0.25 mol/L 蔗糖，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L TrisHCl，1 mmol/L PMSF (pH=7.4)；样品裂解液：7 mol/L 尿素，4% CHAPS，2 mol/L 硫脲，60 mmol/L DTT，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，0.5% 载体两性电解质，0.0002% 溴酚兰。分装，－20 ℃保存待用；双向电泳和银染方法中所需试剂均参考文献[1，10]。

实验所需的牙鲆均购于厦门人工养殖场。使用前，牙鲆需在实验室驯养一周。实验前72 h开始停止喂食，防止饲料中微量重金属影响牙鲆的正常代谢。随机选择牙鲆10只，并随机分为实验组和对照组。实验组牙鲆置于人工模拟构建的CdCl2（10 mg/L）的污染环境中，继续饲养72 h。对照组牙鲆置于在人工海水中继续饲养。实验前，选用剪断脊椎处死方式处理牙鲆，并迅速解剖，获取牙鲆肝脏，用预冷的磷酸盐缓冲液直接冲洗，并保存在－80 ℃以备使用。

2.2 差速离心提取牙鲆肝脏蛋白质

取实验组（受镉盐胁迫）5条牙鲆的肝脏（POL）各20 g，混合后共100 g。对照组的POL取法同上。加入等体积匀浆缓冲液，在冰浴条件下研磨制成匀浆。随后，以 400×g 的相对离心力离心10 min，去除未磨碎的组织和细胞，收集上清液Ⅰ，备用。选用下列差速离心技术，分步收集蛋白沉淀物，并选用2DPAGE进行有效分离，具体实验步骤（始终维持在4 ℃环境下）：（1）1000×g 沉淀分离：以1000×g 的相对离心力离心上清液Ⅰ10 min，收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。该沉淀物主要是细胞核，用匀浆缓冲液洗涤两次，最后收集沉淀样品备用（－20 ℃保存，下同）；（2）12000×g 沉淀的分离：以12000×g的相对离心力离心上清液Ⅱ 30 min，收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。选用匀浆缓冲液洗涤该沉淀蛋白两次，最后收集沉淀样品备用；（3）100000×g 沉淀的分离: 以100000×g的相对离心力离心上清液Ⅲ 30 min，收集沉淀蛋白质和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多数蛋白是胞浆蛋白，收集样品，冻干备用；(4) 上述所有收集的蛋白组分分别充分溶解于裂解液中，并选用100000×g的相对离心力离心蛋白样品 10 min，分别收集上清液，称为POL蛋白组分Ⅰ（1000×g 沉淀蛋白）、POL蛋白组分Ⅱ（12000×g 沉淀蛋白）、POL蛋白组分Ⅲ (100000×g 沉淀蛋白)和POL蛋白组分Ⅳ（胞浆蛋白），并用于双向电泳分离。

2.3 双向凝胶电泳分离条件

2.3.1 等电聚焦电泳

在上样之前，参考文献[10]先进行预电泳。预电泳结束后，换上样品液，在用Bradford法测定样品液的总蛋白浓度后，以150 μg 总蛋白上样，然后进行等电聚焦电泳。

2.3.2 凝胶电泳

按照SDS均一胶的配方配置11%胶浓度的凝胶。将平衡后的胶条转移到SDS凝胶上，并在胶条上覆盖一层含有溴酚兰的0.5%琼脂糖，在140 V的恒定电压下进行电泳。待溴酚兰前沿到达凝胶底端时，停止电泳。

2.4 银染、图像分析及蛋白鉴定

参照文献[10]的银染方法进行蛋白质染色。染色后，利用扫描仪对SDS凝胶板进行透射扫描。选用Melanie 4 Trial软件进行凝胶电泳图谱中的蛋白质总数和差异斑点分析与统计。用REFLEX 型MALDITOF质谱仪获得各蛋白的肽质量指纹图，采用反射模式、正离子谱测定。激光波长为337 nm，质谱信号单次扫描累加200次，用 BRUKER 肽混合物作外标。选用常规PMF和数据库比对技术直接鉴定差异蛋白质[11] 。数据库选择MSDB，检索基本条件参照文献[10]。

3 结果与讨论

3.1 直接裂解法POL全蛋白分离

图1是牙鲆受金属镉胁迫后，采取直接裂解法提取POL全蛋白质的2DPAGE图谱。从图1可看出，实验组和对照组的蛋白质斑点分布趋势基本一致，具有较好的重现性。

采用Melanie 4 Trial软件进行蛋白质斑点数目统计与分析，对照组和实验组2DPAGE图谱中的蛋白质斑点数目约为800个，其中多数蛋白质斑点的pI 范围集中在 4.5～9.0之间，蛋白质亚基的分子量在25～100 kD之间，具有较高的分辨率，适合于后续蛋白质鉴定。

通过比对分析，可获得11个差异蛋白质斑点，其中高表达蛋白2个（A6和A11）；上调蛋白6个（A1、A4、A7、A8、A9和A10）；下调蛋白3个（A2、A3和A5）。这些差异蛋白斑点均与受镉盐诱导有关，推测是牙鲆肝脏产生的应激蛋白质。

3.2 优化建立差速离心法分离POL全蛋白质技术

肝脏是动物代谢的重要场所之一，具有各类复杂代谢途径和含有丰富的蛋白质。借鉴文献［12］，选用2DPAGE分离法可获得约近千个鼠肝脏全蛋白斑点数的实验结果。

本实验选用直接裂解法提取POL全蛋白，但只获取约800个蛋白斑点的2DPAGE图谱。显然，图1中的全蛋白质斑点数偏少，不太适合进一步深入开展POL蛋白质组学研究，尤其不适合研究镉盐毒理学和筛选连续监测流动水体镉污染程度的蛋白指示物。在系列比对实验基础上，建立了差速离心法高效提取牙鲆肝脏全蛋白技术，具体实验步骤见图2。图2显示了选用差速离心法使牙鲆肝脏中不同沉降系数的蛋白质得到粗分离，减少高丰度蛋白的干扰和提高低丰度蛋白富集的效果，有助于开展牙鲆肝脏全蛋白组学研究和筛选差异蛋白质。

目前，常用于动物肝脏全蛋白质提取技术且适合于开展蛋白质组学研究方法有TCA/丙酮酸沉淀法、缓冲液法、裂解法及“鸟枪”蛋白质组分析法[13，14]等。但这些方法获取肝脏全蛋白种类大都低于1500种，明显少于本实验建立的差速离心提取技术。

3.3 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅰ的差异蛋白

图3是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅰ全蛋白和差异蛋白图谱。采用Melanie 4 Trial软件对图解中的蛋白质斑点数目进行统计与分析，可在亚细胞组分Ⅰ中获得约380个蛋白质斑点。比较图3A（实验组）和图3B（对照组），可获得11个差异蛋白斑点。其中A1、A2、A3、A4、A6、A7和A8为上调蛋白，而A5、A9、A10和A11为下调蛋白。

3.4 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ的差异蛋白

图4是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ全蛋白和差异蛋白的2DPAGE图谱。经统计与分析后，发现亚细胞组分Ⅱ中获得约550个蛋白斑点。

比较图4A（实验组）和图4B（对照组）蛋白斑点分布和差异特性，可获得13个差异蛋白斑点，其中的A1和A4斑点为上调蛋白；A2、A3、A6、A7、A8、A9、A11和A12斑点为下调蛋白；A5、A10和A13为高表达蛋白（high expression proteins）。

3.5 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅲ的差异蛋白

图5是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅲ的全蛋白和差异蛋白质的2DPAGE图谱。经分析与统计，可获悉图5显示出约500个蛋白斑点。比对图5A和图5B结果，可进一步获悉两图之间约有14个差异蛋白斑点。其中的A10、A11和A14斑点为上调蛋白；A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A12和A13斑点为下调蛋白。

3.6 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅳ的差异蛋白

通常认为，细胞破碎液经100000×g的相对离心力离心后所获得的蛋白上清液视为细胞的胞浆蛋白。根据 3.2 节所描述的实验步骤和离心率可获悉，牙鲆肝脏组分Ⅳ属于胞浆蛋白质。在镉盐胁迫下，所获得牙鲆肝脏组分Ⅳ的差异蛋白质，视为金属镉胁迫牙鲆肝脏表达的差异胞浆蛋白。从图6中可看出牙鲆肝脏组分Ⅳ含有约850个蛋白斑点，其胞浆蛋白质种类明显高于其它牙鲆肝脏组分的蛋白质种类，说明了牙鲆肝脏含有丰富的胞浆蛋白质。比较图6A和图6B中的差异蛋白斑点分布情况和规律可获悉， 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏表达了16种差异蛋白，其差异蛋白总数目多于其它POL组分。其中高表达的蛋白质为A1、A2、A4和A9；上调蛋白为A5、A6、A7、A10、A11和A14；下调蛋白为A3、A8、A12、A13、A15和A16。

进一步选用肽质量指纹（PMF）图谱和数据库比对技术对上述54个差异蛋白进行鉴定.结果发现，有3种同类差异蛋白，即共有51个不同的差异蛋白。在鉴定结果中发现了一些文献[15，16]中已报道的与镉盐胁迫有关的蛋白（见表1）。表1 牙鲆肝脏中表达的与镉盐胁迫有关的差异蛋白的质谱鉴定（略）

总结图3～6中所显示的蛋白斑点数目可获悉，选用差速离心法分离牙鲆肝脏的全蛋白种类约2280个，明显高于直接裂解法（800个蛋白斑点）的结果。虽然选用不同离心力分离POL亚细胞蛋白组分之间含有同一类蛋白，但只发现存在少量同类蛋白质，说明了选用差速离心法所获取的POL全蛋白中只含有少量的同类蛋白质，推测所获得的蛋白种类应高于2000种，适合于开展POL蛋白质组学研究。在镉盐胁迫下，同样也获取54种差异蛋白，其中只有3种同类差异蛋白，即镉盐胁迫牙鲆肝脏表达了51种差异蛋白，这也适合于筛选潜在的可用于研究金属镉毒理学和监测流动水体重金属污染的蛋白质指示物。显然，差速离心结合双向电泳技术显著提高了牙鲆肝全蛋白的分离效率和差异蛋白的检出率。

由于动物组织、细胞及卵等中蛋白质种类间存在丰度差异[17]，现有的全蛋白提取与分离技术不易通过单一的2DPAGE方法同时显示高低丰度不同的蛋白质。而本实验所建立的差速离心技术结合蛋白质组学技术，不仅降低蛋白之间产生沉淀现象，而且还使许多低丰度蛋白得以富集和鉴定，从中获取更多的蛋白种类。在蛋白的分离效率上明显高于现有的全蛋白提取与分离技术，如直接裂解法，适合开展蛋白质组学研究和筛选与鉴定差异蛋白质组学。前人研究已发现，热激蛋白质70S（HSP70）和过氧化氢酶均可作为监测金属镉污染或氧化损伤的指示蛋白[15，16]。从表1所鉴定的差异蛋白质种类中也含有这两种蛋白。此外， V型ATP酶和细胞骨架相关蛋白（例如：Bete 微管蛋白和actin）等均与镉代谢和受镉抑制表达有关。这说明，选用蛋白质组学及相关分析技术可筛选并鉴定许多潜在的适合作为蛋白质指示物且可用于开展镉毒理学机理、污染程度的关键指示蛋白质[18～20]。

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蛋白质组学篇9

关键词：蛋白质组学；非生物胁迫；生物胁迫；双向电泳；质谱

中图分类号：q946.1；q945.78 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）22-5403-06

随着生命科学的日益发展，对基因功能的研究已不仅仅局限在核酸水平。蛋白质是基因功能的执行者，是生命现象的直接体现者。要深入了解生命的复杂活动，就需要从蛋白质的整体水平上进行研究。蛋白质组学是指研究蛋白质组的科学，本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于组织变化、细胞代谢等过程的整体而全面的认识[1]。近些年来，蛋白质组学发展迅速，并得到了广泛的应用，成为生命科学研究的核心内容之一。

植物在生长发育过程中会遭遇高（低）温、干旱、水涝和高盐等非生物胁迫以及病原菌侵染和虫害等生物胁迫。植物感受逆境信号后，可以通过信号转导调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，从而调整自身的生理状态或形态来提高对逆境的耐受能力。在蛋白水平，对发生变化的蛋白质进行定性和定量测定，探讨植物在逆境胁迫条件下的调控机制，是研究植物抗逆性的重要手段之一，并已在多种植物的研究中取得了一定的成果。

1 蛋白质组学研究技术

过去，许多科学家都致力于蛋白质组的大规模定性分析，而现在，如何系统地识别和定量一个蛋白质组则是蛋白质组学研究的主要目的之一[2]。由于蛋白质的浓度在很大程度上影响了其功能的实现，因此，对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量也就变得至关重要。目前，比较成熟的蛋白质定量方法主要分为两类，一类基于传统双向凝胶电泳及染色，另一类基于质谱检测技术。

1.1 基于凝胶的定量蛋白质组学技术

双向电泳（two dimensional electrophoresis，2de）技术是由o’farrell于20世纪70年代建立的[3]，具有高分辨率的特点，通常能分辨出1 000～3 000个蛋白点[4]。该技术自诞生以来，一直在不断改进和优化。目前，应用比较广泛的双向电泳技术主要是双向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2d-dige）。但双向电泳本身也存在着一些弊端：试验重复性差；对蛋白质的分离受到蛋白丰度、等电点、相对分子质量和疏水性等的限制；自动化程度低；操作起来费时费力等，这些都在一定程度上限制了该技术的应用。

1.2 基于质谱的定量蛋白质组学技术

基于质谱的蛋白质组学定量技术可以分为两大类：标记定量技术（labeling quantitation）和非标记定量技术（label-free quantitation）[2]。此外，标记或非标记的鸟枪蛋白质组学策略也是基于质谱技术的常用方法。

1.2.1 标记定量技术

1.2.1.1 同位素代谢标记法

同位素代谢标记以同位素元素或同位素标记氨基酸形式掺入到细胞培养基中，在细胞生长代谢过程中完成蛋白质同位素标记。此方法的显著优点是蛋白质在样品制备的初期被标记，由此减少了试验操作造成的误差，从而提高了准确度。目前比较常用的方法包括15n体内代谢标记和细胞培养中稳定同位素标记氨基酸（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，silac）方法。

1）15n体内代谢标记法。采用含有15n（或14n）作为惟一氮源的培养基来培养植物组织（植株），依靠掺入合成蛋白质的15n实现定量[5]。这项技术适用于多种蛋白提取物的蛋白质定量，包括那些需要进行大量纯化步骤、蛋白产量易发生改变的[6]。其优势还在于可应用于水培植物，使得植物对养分的吸收得到更好的控制。

2）silac方法。依靠在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸（如赖氨酸或精氨酸等）实现对蛋白质的定量，已经广泛用于高等动物细胞蛋白质的鉴定及定量[5]。silac法标记效率高、损失小；标记误差低，可靠性高。然而，由于植物细胞本身可以合成这些

必需氨基酸，导致只有部分蛋白质被标记。并且，此方法成本较高，导致其在植物蛋白质组学研究中的应用受到了一定的限制。

1.2.1.2 同位素化学标记法

1）同位素亲和标记法。比较典型且已商业化的一项技术是同位素亲和标记技术（isotope coded affinity tages，icat）。icat 无需繁冗的双向凝胶电泳技术，标记策略灵活多变，可对低丰度、难溶性蛋白进行分析。近些年来，该技术与不同的质谱技术联合应用得到了广泛的研究。但icat适用于含半胱氨酸或半胱氨酸存在修饰的蛋白质。

2）酶催化18o-同位素标记法。酶催化18o-同位素标记法是通过加入h218o，在蛋白酶催化作用下将羧基上的2个16o替换成18o，从而对肽段进行标记。该技术有以下优点：操作简单；标记效率高，准确率高；应用范围广，可用于多种不同类型的蛋白质；可标记所有酶解的肽段，使相对定量所有的蛋白质成为可能；反应条件温和、副产物少；便于与磷酸化肽段富集方法联用，适于低丰度磷酸化肽段的定量标记肽段；在蛋白质水解分裂的同时被标记上，避免了人为因素的干扰。但由于标记后的蛋白质样品过于复杂，该技术还有待进一步的完善。 　3）相对和绝对定量同位素标记法。相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantitation，itraq）技术是美国应用生物系统公司在 2004 年推出的一项新的体外同位素标记技术[7]。该技术使用8种（或4种）不同的同位素试剂来同时标记和比较8种（或4种）不同的蛋白质样品。如今该技术的应用越来越广泛，其优越性也逐步在许多生物体和组织研究中得到了证明，已成为目前蛋白质组学定量方法中一个十分重要的技术。

itraq技术有如下特点：①样本量大。可对多达4个样本同时相对量化，大大降低了试验过程中所引入的技术误差；②定性分析结果可靠。可以同时给出每一个组分的相对分子质量和丰富的结构信息；③灵敏度、准确度高。将离子抑制效应、背景噪音和仪器条件等系统误差的影响降到最小，获得的变异系数在9%的范围；④分离能力强，分析范围广。作为标记的反应不在活细胞，适合任何类型的蛋白质样品，包括高相对分子质量蛋白质、酸性蛋白质、碱性蛋白质、不溶性蛋白质（eg.膜蛋白）等；⑤分析时间快，自动化程度高。

当然，itraq标记技术也有自己的局限性。对全组蛋白质而言，它只能对相对丰度进行比较，因此只能提供相对的定量；数据的复杂度更高，因此需要开发更多的信息学工具；高丰度蛋白质干涉了低丰度蛋白质的检测和鉴定；每次试验，研究人员都必须鉴别全部的蛋白质组[8]。

1.2.2 非标记定量技术 非标记定量法（label-free）是一种新兴的蛋白质定量方法，包括基于色谱峰面积定量法及利用二级离子信号的强度进行mrm（多反应监测）检测等。与标记定量法相比，非标记定量法不需要花费大量时间准备同位素化合物，也不需要使用非常昂贵的试剂，但该技术比较依赖于仪器的状态、样品的复杂性以及一些未知因素，其灵敏度和精确度都不及标记定量法。要得到广泛的应用，非标记定量技术还需要进一步的优化和改进。

1.2.3 鸟枪蛋白质组学策略 鸟枪法首先采用标记或非标记的方法将蛋白质混合物降解成肽段的混合物，利用质谱进行分析测序，然后利用计算机技术描绘出肽段在蛋白质上的位置图谱，从而确定该混合物中的蛋白质成分。其代表方法是mudpit。

2 蛋白质组学在植物逆境生物学研究中的应用

自然界中有多种非生物和生物因子都会对植物的生长发育造成不利影响，严重时甚至会导致植物的死亡。植物对这些逆境胁迫都有很强的响应机制，可通过一系列从细胞到生理水平的应答反应来适应这些不利的环境条件。应用蛋白质组学技术研究在逆境胁迫下植物蛋白质种类及表达量的变化，将有助于人们从整体和动态的蛋白质水平了解胁迫因子的伤害机制以及植物的适应机制。

2.1 非生物胁迫的植物蛋白质组学研究

2.1.1 温度胁迫 温度是影响植物生长发育和农作物产量的重要环境因子。目前的研究较多集中于温度胁迫下差异表达蛋白质的鉴定和植物响应高温、低温分子机制的解析。

ganmulla等[9]将24日龄水稻秧苗的叶片分别在5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）的低温和28 ℃（36 d）、36 ℃（44 d）的高温环境下处理3 d，并检测其蛋白质组变化。采用无标记的鸟枪法，对每个处理组的3个生物

学重复进行了蛋白质定量分析。结果表明，在一个或多个处理组中被鉴定出来的蛋白，有超过400个都对温度胁迫进行了响应。其中，分别有43、126和47个蛋白专一地出现在了5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）和36 ℃（44 d）处理组中。并且，与其他温度处理相比， 12 ℃（20 d）处理后的水稻叶片蛋白质组发生的变化更显著。另外，该试验还鉴定出了20个新的胁迫响应蛋白。

为了检测在成熟的硬质小麦子粒中热胁迫对非醇溶谷蛋白积累所产生的影响，laino等[10]将意大利栽培种svevo进行了2个不同的温度处理（热胁迫和对照）。通过检测非醇溶谷蛋白的2-d模型，鉴定出了在灌浆期受热胁迫影响的多肽。这项研究共发现了132个表达发生变化的多肽，其中有47个（包括hsps和胁迫相关蛋白）是通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（maldi-tof）和基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱（maldi-tof-tof-ms）鉴定出来的。很多热诱导的多肽被认为会引起敏感植株的反应。

2.1.2 水分胁迫 近年来，研究人员利用蛋白质组学，已鉴定出一些水分胁迫响应关键因子，并揭示出植物应答水分胁迫所涉及到的多个代谢通路。

ford等[11]在2011年首次采用鸟枪蛋白质组策略研究了小麦（triticum aestivum l.）栽培种在干旱胁迫下的蛋白丰度变化。对不耐旱种kukri、耐旱种excalibur和耐旱种rac875在温室中进行周期性干旱处理，处理结束后从叶片中提取蛋白，共鉴定出5 125个肽段，并分析出1 299个蛋白。从中选择了159个在所有时间点都有表达的蛋白用itraq技术进行相对定量。在不同时间点，3个栽培种的蛋白组变化反映了它们对干旱胁迫的不同生理响应。结果显示，在胁迫处理前期，excalibur没有明显的蛋白组变化，而rac875的蛋白组发生了显著变化。这3个栽培种的蛋白组变化都与它们的氧化胁迫代谢和活性氧清除能力相一致，表现为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的增多以及参与光合作用和卡尔文循环的蛋白的减少。

祁建民等[12]以鉴定出的耐旱性红麻品种ga42为材料，在5叶期设置正常供水与控水比较试验，运用双向电泳分析红麻在干旱胁迫和正常供水条件下叶片蛋白质组的动态变化。在干旱胁迫下出现65个差异表达蛋白质点，选择表达量明显上调的9 个蛋白质点，通过maldi-tof-tof ms分析和数据库检索，鉴定出6个差异表达蛋白，分别是2个核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶或其大亚基、1个rubisco活化酶、1个二甲基萘醌甲基转移酶、1个推测的胞质型谷氨酰胺合成酶以及1个atp合酶β亚基。试验证明，红麻ga42表现出较强的耐旱性与上述6个差异表达蛋白质点明显上调有关。 　komatsu等[13]将发芽2 d的大豆在水涝胁迫下处理2 d，从大豆的根系和下胚轴中提取蛋白质。经sd-page和cbb染色后，在每张凝胶上得到具有可重复性的蛋白点约803个。水涝胁迫引起了21个蛋白点的表达量升高，其中有定位/贮存相关蛋白（11个）、能量相关蛋白（3个）、信号转导相关蛋白（2个）、初生代谢相关蛋白（2个）、细胞结构相关蛋白（1个）、病害/防御相关蛋白（1个）以及转运蛋白（1个）。同时，7个蛋白点的表达量在水涝胁迫处理后降低，包括4个定位/贮存相关蛋白和3个病害/防御相关蛋白。

2.1.3 盐胁迫及渗透胁迫 土壤盐分过多是影响植物生长发育、导致农业减产的主要因素之一。盐胁迫对植物的危害主要体现在渗透胁迫和离子胁迫等方面。

barkla等[14]对植物质膜在盐胁迫下的作用进行了研究，鉴定出了参与调控液泡中na+隔离的蛋白质。对盐胁迫处理的冰叶日中花和对照进行的双向差异凝胶电泳分析表明，质膜包括质膜h+-atpase 和v-atpase的亚基，都与醛缩酶和烯醇酶这两个糖降解酶相关。利用免疫共沉淀证实糖降解酶与v-atpase的b亚基vha-b存在相互作用。体外试验证明，醛缩酶可以通过吸引atp来激活v-atpase的活性。采用拟南芥烯醇酶突变体进行生物学功能验证，发现这些突变体对盐胁迫敏感，并且在其质膜中，醛缩酶激活v-atpase水解活性的能力减弱。糖降解蛋白与质膜的这些联系直接上调了质子泵的活性。

bandehagh等[15]对油菜盐胁迫响应机制进行了研究，分析了耐盐的油菜栽培种hyola 308和不耐盐的栽培种sarigol的第二片新叶和第三片新叶中蛋白的表达。对处于营养生长期的植株分别进行0、175和350 mmol/l的nacl处理。与第二片新叶相比，第三片新叶中的na含量较高且生长势较弱。不耐盐植株中na的积累比耐盐

植株中更加显著。2-de凝胶检测出了900多个蛋白点，其中有44个和31个蛋白的表达量分别在耐盐和不耐盐的基因型中发生了变化。聚类分析发现，根据第二片新叶的盐含量可明显区分出这两种不同的基因型。ms分析鉴定出了46个蛋白，包括参与氧胁迫响应、能量供应、电子转运、翻译和光合作用的蛋白。

skirycz等[16]研究了拟南芥叶片在缓和而持久的渗透胁迫下的适应能力。通过15n代谢标记法分析了蛋白变化。结果表明，质体的atpase、卡尔文循环和光呼吸都被下调了，但线粒体的atp系统被上调了。这说明线粒体在植物遭受水分胁迫时对保护质体起到很重要的作用。此外，胁迫下的转录组和蛋白组数据非常一致，但很多蛋白与蛋白合成和降解相关，推测其受到了转录后水平的调控。

张恒[17]用不同浓度的na2co3对星星草（puccinellia tenuiflora）进行处理，研究了其在盐胁迫下的应答机制。应用itraq标记法对蛋白质组进行定量分析，发现叶绿体中68种na2co3应答蛋白质，它们主要参与捕光复合体、光系统ⅱ、光合电子传递链和光系统ⅰ的形成、能量代谢、卡尔文循环、光合色素代谢、基础代谢、胁迫防御、转录、蛋白质合成与命运，以及信号转导等过程。

2.1.4 营养胁迫 为了解水稻对磷缺乏的适应性，torabi等[18]分析了亲本株系nipponbare与其近等基因系nil6-4（在第12条染色体上携带一个主要磷吸收的qtl）的根系在1和100 mmol/l磷浓度下生长的蛋白质组。2-de检测到669个蛋白点，两种基因型中有32个蛋白有明显差异。其中，两种基因型在胁迫条件下有17个蛋白表现不同。质谱鉴定出参与适应磷缺乏途径的26个蛋白，包括活性氧清除剂、柠檬酸循环、信号转导和植物防御反应蛋白，还有一些未知功能蛋白。这说明不仅有一条控制适应磷缺乏能力的信号途径，可能还存在着不同途径间的相互作用。

visioli等[19]对黑杨的一个高度抗钙胁迫的未定种进行了蛋白组变化分析。运用2-d液相色谱技术分离出126个蛋白。其中，有20个蛋白被鉴定为受到了钙胁迫的影响，并通过maldi-tof进行了指纹图谱分析。在胁迫处理的样品中，丰度较高的蛋白集中在叶绿体和线粒体中，说明这两个细胞器在植物对钙胁迫的响应中扮演了重要角色。

李坤朋[20]对两种不同基因型的玉米在富磷或缺磷条件下的蛋白质组变化进行了双向凝胶电泳分析，分别鉴定出79个和108个差异表达蛋白，功能解析表明，这些蛋白可能在调控玉米根系形态发育、细胞周期以及感知环境磷浓度变化等方面发挥了重要作用。

2.1.5 其他非生物胁迫 其他非生物胁迫如臭氧、重金属、机械损伤等对植物的影响，也在蛋白质组水平上取得了一定的进展。

肖清铁等[21]以抗镉水稻品种pi312777和镉敏感水稻品种ir24为材料，在不同镉离子浓度的条件下水培处理7 d。与对照相比，不同浓度镉胁迫下，pi312777中热激蛋白、谷胱甘肽还原酶、蛋白酶体α亚基6型、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶、硫氧还蛋白和dna重组修复蛋白均上调表达；而ir24中热激蛋白、谷胱甘肽还原酶、蛋白酶体α亚基6型的表达无显著差异，但果糖-1，6-二磷酸醛缩酶和硫氧还蛋白表达下调。此外，dna重组修复蛋白仅在镉胁迫的pi312777叶片中表达。这些差异表达的蛋白质很可能是水稻pi312777比ir24具有更强镉抗性的生物学基础。

fuhrs等[22]研究了豇豆蛋白质组对锰胁迫的响应，发现锰胁迫后豇豆叶绿体中与co2固定和光合作用相关的蛋白丰度下降，说明锰胁迫对豇豆的能量代谢产生抑制作用。

乐寅婷等[23]对比了油菜（brassica napus cv. westar）在机械损伤前后可溶性总蛋白的含量变化，发现损伤后蛋白表达量增高。双向凝胶电泳分析表明有8个蛋白质点发生了明显的上调或下调，质谱鉴定出rubisco小亚基前体、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶和粪卟啉-3-氧化酶，这些蛋白质可能在油菜叶片应答机械损伤过程中起关键作用。 　ahsan等[24]用双向凝胶电泳法检测了在o3胁迫下大豆中蛋白质的变化，分别在叶片和叶绿体中鉴定出20个和32个差异表达蛋白。其中，参与光合作用（包括光系统ⅰ/ⅱ和碳素同化）的蛋白都在胁迫后表达量降低，而与抗氧化剂系统和碳代谢相关的蛋白表达量增高。参与糖代谢的酶活性在胁迫后增强，淀粉减少而蔗糖增加。试验表明在光合系统经受o3胁迫时，可能通过淀粉降解为三羧酸的循环功能，使碳分配受到了影响。

2.2 生物胁迫的植物蛋白质组

学研究

2.2.1 病原菌侵染 病原菌侵染时植物局部会发生坏死并诱导产生一些抗病蛋白质。

maserti等[25]以柑橘属（citrus l.）的果树为材料，对二斑叶螨（tetranychus urticae）侵染后和茉莉酸甲酯处理后的叶片进行了蛋白表达差异分析，分别检测出了110个和67个蛋白质点。应用液相色谱—串联质谱技术鉴定出50个蛋白，大部分都属于光合和代谢相关蛋白。其中有5个与氧胁迫相关的酶，包括磷脂谷胱甘肽过氧化物酶、1个盐胁迫相关蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和锰超氧化物歧化酶。有7个防御相关蛋白，包括与发病相关的酸性几丁质酶、蛋白酶抑制剂类奇蛋白和低密度脂蛋白等。

采用双向电泳联用 moldi-tof-tof 质谱技术，张晓婷等[26]对水稻感病品种武育粳3号和抗病品种kt95-418感染水稻条纹病毒（rice stripe virus，rsv）前后的叶片进行蛋白质组学分析。结果显示，rsv基因组编码的病害特异蛋白（disease specific protein， dsp）在武育粳3号中的积累量明显高于kt95-418中。另外还鉴定出其他25个蛋白，包括rsv ns2蛋白，寄主中与光合作用、细胞氧化还原状态和离子平衡状态及蛋白的合成、转运与翻译后修饰等相关的蛋白。

钟云[27]选用广东主栽砧木资源——江西红橘的根系为材料，运用itraq技术，分析了其接种黄龙病病原后第50天的根系蛋白。鉴定得到差异显著蛋白78个。差异蛋白主要参与生物代谢、防御反应、抗氧化、转运和几丁质代谢等。与转录组关联性强的差异蛋白有36个，其中半数与抗病（逆）相关。植株感病后韧皮部筛管闭塞有关的筛管阻塞蛋白上调了1.67倍，这与防御黄龙病病原有关。另外，枯草杆菌样蛋白酶表达是对照的282.09倍，说明该酶参与了黄龙病病原菌的抵御及根尖分生区的保护。

2.2.2 虫害 魏哲[28]利用itraq技术筛选了水稻抗褐飞虱相关蛋白质。在褐飞虱取食96 h后的水稻叶鞘中，发现多种蛋白质表达量发生了显著变化。这些蛋白包括3个ja合成蛋白质（alpah-dox、aos和aoc），7个氧胁迫应答蛋白（cata、apx2和5个poxs），3个β-葡聚糖酶（gnsl、gns4和gns5），3个蛋白激酶（crks、crk6和atypicalrlk），1个蛋白网格蛋白，1个甘氨酸分解系统h蛋白，5个光合作用相关蛋白和4个水通道蛋白。其中aoc、cata、3个poxs、gnsl、gns5、3个蛋白激酶和网格蛋白更多地在易感性水稻株系中被诱导。

由于自然环境下植物时常遭遇多重逆境，因此，目前有不少针对植物逆境蛋白质组学的工作已不仅仅局限于单一胁迫，而是将相关性较高的几种胁迫进行整合研究。zhang等[29]对云南假虎刺（carissa spinarum）同时进行了42 ℃高温和干旱处理。在处理期和恢复期设置4个不同的时间点取叶片进行蛋白质组学分析，发现49个蛋白质点的表达量发生了变化。用ms和2-d凝胶法鉴定出30个蛋白，这些蛋白包括hsp、光合成相关蛋白、rna加工蛋白以及参与代谢机制和能量生产的蛋白。evers等[30]对马铃薯分别进行了冷胁迫和盐胁迫处理，并在转录水平和蛋白质组水平都进行了分析和研究。发现响应盐胁迫和冷胁迫的基因和蛋白有一致也有不同。在蛋白质组水平，大部分鉴定出的蛋白都在胁迫下表达增强了。大多数光合成相关蛋白的丰度在两种胁迫下都降低了。

3 展望

综上所述，作为后基因时代的一个重要研究手段，蛋白质组学已经在植物抗逆研究中广泛开展，获得了丰硕的成果，对传统的植物生理学及功能基因组学研究进行了补充。然而，植物对环境胁迫的响应是一个非常复杂的过程，人们对植物在逆境下产生的复杂的生物学反应都还知之甚少，在这方面的研究还处于初步阶段。随着越来越多植物全基因组测序的完成、est数据库的日益丰富，以及研究手段的不断改进，相信将会有更多的与抗性相关的基因和蛋白被挖掘，更全面地揭示植物抗逆性的本质，为植物抗胁迫品种的选择和培育奠定基础。

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蛋白质组学篇10

【摘要】

目的为开展针灸治疗胃溃疡的蛋白质组研究，建立并优化其蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术，提高其分辨率及重复性。方法对醋酸型胃溃疡大鼠进行针刺后取其胃部溃疡处组织，对组织蛋白质的提取方法进行改进，优化双向凝胶电泳的关键因素与环节，如样品的制备及预处理，第一向IPG等电聚焦的上样量及电泳参数，第二向垂直平板SDS凝胶浓度、染色方法等。利用PDQuest7.1软件分析获得的二维凝胶图像。结果以固相pH梯度-IPG胶条（pH3～10）进行第一向等电聚焦，以SDS 均一胶（12.5%）的垂直电泳为第二向，成功地得到了两组大鼠胃组织斑点分布均匀、数目较多的双向凝胶电泳图谱。结论通过对蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及优化，获得了适合于研究胃溃疡高分辨率、高重复性的双向凝胶电泳图谱。

【关键词】 双向凝胶电泳 蛋白质组 SDS凝胶电泳

蛋白质组学是应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门重要学科，采用蛋白质组分析应用和技术可以识别及鉴定一种细胞或组织所表达的全部蛋白质及它们的表达模式，从整体蛋白质水平上在一个更加深入、更贴近生命活动本质的层次上去探讨一些重要的生理、病理现象的本质。典型的蛋白质组研究有两个关键的步骤：①细胞或样品组织中蛋白质的分离。目前最佳的分离方法是多维色谱技术和双向凝胶电泳(two-dimensinnal electrophoresis，2-DE)。②蛋白序列的鉴定。常用质谱仪鉴别出多维色谱和2-DE等分离出的差异蛋白是一已知蛋白，还是一新蛋白［1～3］。2-DE建立于1975年，三十余年的应用和发展使其技术渐于成熟，故在多维色谱出现后，2-DE仍被广泛采用，它是蛋白质组研究的基础，亦是当代研究的关键技术。

胃溃疡是一种世界性的常见病，人群中患病率高达5%～10%，亦有报告推测，每5名男人和10名女人中，可能有一人在他们的一生中患过本病，本病严重地危害了人们的健康［1］。针灸治疗本病取得了较好的疗效，并具有简便、经济、安全、并发症发生率低和不易复发等优势，但目前对于针灸治疗胃溃疡的疗效机制尚不清楚。运用蛋白质组学思维，以2-DE为技术手段研究针刺对醋酸型胃溃疡大鼠胃组织匀浆蛋白的影响，将有助于全面、真实地揭示胃溃疡发生的病理过程以及针刺治疗本病的效应机理。

1 材料与仪器

1.1 动物

Wistar大鼠60只（长春高新医学动物实验中心），雄性，清洁级，体质量（200±30）g。

1.2 仪器

电动玻璃匀浆机、低温超速离心机、电子天平、P20、P100、P1000型精密移液器、MP3 多功能微型垂直板电泳系统(Bio-Rad)、PROTEAN II xi Cell垂直板电泳系统(Bio-Rad)、Power Pac 200和1000电源(Bio-Rad)、GS-800光密度扫描仪(Bio-Rad)、IEF/SDS-PAGE图像分析软件PD Quest 7.3.1(Bio-Rad)、SZ-93型自动双重纯水蒸馏器、TY-B型多用脱色摇床。

1.3 试剂

17cm IPG3-10预制胶条、尿素、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、丙乙酰胺（Acr， A.R.）、N，N甲叉双丙乙酰胺（Bis，A.R.）、40%载体两性电解质(Bio-Lyte 3/10 ampholytes)、矿物油(Minal Oil)以上试剂均来自美国Bio-Rad；两性去垢剂CHAPS、四甲基乙二胺（TEMED， A.R.）、过硫酸胺（APS， A.R.）、十二烷基硫酸钠（SDS， A.R.）以上试剂均来自AMRESCO；低溶点琼脂糖(Agarose， Promega)、三羟甲基氨基甲烷（Tris， A.R.， BM）、氨基乙酸（Glycine， A.R.， BM）、丙三醇(Glycerin， A.R.， 上海化学试剂有限公司)、考马斯亮蓝R-250(CBB， R-250， A.R.， 上海化学试剂有限公司)、盐酸(HCl， G.R.，上海)、硝酸银(AgNO3， A.R.， 上海) 、无水碳酸钠(Na2CO3， A.R.， 上海) 、硫代硫酸钠(Na2S2O3， A.R.， 上海化学试剂有限公司)、牛血清白蛋白标准品(BSA， 上海)、苯甲基磺酰氟(PMSF， 上海)。

2 方法

2.1 设计将60只大鼠随机分为3组：正常对照组、模型组、针刺治疗组。采取乙酸涂抹法造模，术后24 h开始正常喂养，针刺治疗组对足三里、中脘进行毫针针刺，10 d为1个疗程。10 d后取3组胃组织进行观察与研究。

2.2 样品处理胃组织总蛋白的提取：于溃疡模型成功后处死大鼠，分别取出正常对照组与模型组观察溃疡形成情况，取针刺治疗组大鼠胃溃疡处组织进行处理，予冰盐水反复清洗干净，以去除血液， 并尽可能剪去多余的其他组织，滤纸吸去多余的液体，立即置液氮中速冻，后移至-80 ℃低温冰箱保存。将已处理过的标本从-80 ℃冰箱中取出，称取针刺治疗组大鼠胃组织。分别采取传统方法及改良方法，下面仅介绍改良方法，在讨论部分介绍二者区别。剪取约200 mg组织，加入2.0 ml细胞裂解液（8 mol/L的尿素，4%的CHAPS，100 mmol/L的DTT，40 mmol/L的Tris-base和0.5%的两性电解质），在冰水混合物中以1 500 r/min仔细制备匀浆，反复冻融3个循环，加入20 μg/ml DNase I 10 μl和5 μg/ml RNase A 10 μl，在冰浴中1 500 r/min匀浆10 min。转移至离心管，4℃作用15 min后，以15 000 r/min离心30 min，收集上清液即为蛋白质粗提物，-80℃冷冻保存待用。

2.3 样品浓度测定Bradford法［4］。

2.4 双向电泳

2.4.1 第一向固相pH梯度(IPG)等电聚焦参照Gorg A等［5］的方法略有改动。取上述蛋白质样品，按1 mg的上样量计算出蛋白质上样体积，依该体积加入蛋白质样品，加入样品缓冲液至终体积300 μl，在液体涡旋仪及手掌型离心机上分别混匀。取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17 cm pH 3～10），室温中放置10 min。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。将样本均匀加入胶槽中，胶面向下放入17 cm IPG干胶条，胶条的正极对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，避免气泡产生，然后滴加覆盖矿物油3ml，需缓慢地一滴一滴将矿物油加在胶条的塑料支撑膜上。对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置程序。自动程序电泳参数设置见表1。表1 等电聚焦的程序（略）

2.4.2 平衡等电聚焦后迅速取出IPG 胶条，在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。将胶条胶面朝上转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，并加入10 ml平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上平衡15 min。第1次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，将胶条胶面朝上转移至加有平衡缓冲液II的溶涨盘中， 继续在水平摇床上缓慢摇晃15 min。第2次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液。将IPG胶条从样品水化盘中移出，并完全浸末在1×电泳缓冲液中。

2.4.3 第二向垂直SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳配制12.5％的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶。用滤纸吸去SDS聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解(中火1 min左右)。将IPG胶条从1×电泳缓冲液中移出，胶条一端放上低分子量蛋白标记10 μl，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，避免在胶条下方产生气泡。而后在IPG胶条上注入加热溶解好的低熔点琼脂糖，待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。电泳参数：初始电压80 V约5 min，以后200 V直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止。

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2.4.4 考染显色将凝胶从玻璃板上剥离下来，放置在干净的染色盘中。采用Bio-Safe Coomassie stain染色法。考染步骤如下：将凝胶浸于去离子水中，摇床上漂洗2次，10 min/次；加入适量Bio-Safe考马斯亮蓝R-250以使凝胶完全浸没，摇床上1 h或过夜。最后将胶浸入去离子水中，摇床上脱色至底色脱去。

2.4.5 凝胶图象采集与分析应用GS800扫描仪器采集凝胶图象，用PDQuest二维分析软件对电泳图谱进行分析。

3 结果

3.1 针灸治疗组胃组织蛋白质的提取率和上样量 样品蛋白质浓度在5～5.5 g/L。双向电泳的上样量在185～195 μl。

3.2 针灸治疗组胃组织蛋白质2-DE的分辨率和重复性 平均含（350±50）个蛋白点，匹配率85.56％。

3.3 实验改进图片

选择宽pH 范围(pH 3～10)的固相线性17 cm 干胶条和12.5%的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶， 采用初始80V电压5 min，然后以200 V恒压电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳，可以得到斑点分布均匀、数目较多的双向凝胶电泳图谱。如图1 和2所示。

4 讨论

近年来对于胃溃疡的发病机制的研究取得了一定的进展，发现了许多与疾病发生、发展有关的因素及分子调控机制，尤其是基因组学的研究有了很大进展，但影响疾病发生、发展的重要机制是蛋白质分子种类和功能状态的改变。蛋白质组的研究可能为这些疾病发病机制的研究开辟一条新的道路，该方法改变了以往研究只能针对一种或一类蛋白质的限制，使研究机体复杂多变的蛋白质群体成为可能。特别是在研究针灸治疗疾病的机制方面，蛋白质组学的思路与中医的整体观念有着相似的观点。2-DE技术是蛋白质组研究的核心技术，该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质粗提物，构建特定组织或细胞的蛋白质“二维参考图谱”，分析特定时间与生理状态下蛋白质的表达情况，进行蛋白质组差异比较。通过这种差异的比较，可以为我们提供进一步的研究线索，从整体水平把握研究方向。

建立针灸治疗胃溃疡组织蛋白组学效应研究平台，为探索针灸疗效机制提供了新方法、新技术和新模式。对已有平台进行优化必将极大地加速研究进程，尽早地获得研究成果，有利于针灸理论发展和临床应用。

4.1 样品制备从组织中提取蛋白质的影响因素很多，寻找理想的方法尽可能完全地抽提细胞和组织中全部蛋白质一直是双向凝胶电泳标本预处理研究的热点和难点。本法将组织置于冰盐水中清洗干净，立即置-80℃冰箱中速冻保存，可以去除黏膜表面杂质、黏液和血细胞，保持蛋白的完整性，最大程度地减少蛋白降解和丢失。由于不同组织中疏水性蛋白质、亲水性蛋白质、低丰度蛋白质、高丰度蛋白质和极端等电点蛋白质同时存在，很难用单一抽提液和方法将不同组织细胞中的蛋白质完全制备出来。为提高组织蛋白质的溶解性，提高蛋白质的提取浓度，我们主要注意了两个环节：一是样品裂解液的选择；二是充分的组织匀浆、超高速离心。样品裂解液中较高浓度的尿素(8 mol／L)能破坏氢键，溶解并使蛋白质变性、解折叠。DTT通过断裂半胱氨酸的二硫键，打开蛋白质分子内键，从而促进蛋白质溶解。CHAPS在含有尿素的溶液中具有较好的水溶性，促进疏水性蛋白质的溶解。为去除其他干扰蛋白质溶解的物质，如核酸、脂肪酸和盐离子，尤其是核酸，与蛋白质结合后，会产生人工假象和条纹，所以在裂解液中加入微量的DNA酶和RNA酶，以减少干扰，消减背景。充分的组织匀浆、超速离心等都是利用机械力来对蛋白分子解聚。超速离心被用来去除溶液中干扰蛋白溶解的其它物质。通过上述步骤，可以提取出组织的绝大多数蛋白成分。

4.2 上样量选择提高上样量有利于低丰度蛋白质的检测。但上样量过高，高丰度蛋白质的斑点过大会影响其他蛋白质点的分离和分析，而且样本量过高，其在重泡胀液体系中所占体积过大，可能导致重泡胀不充分，影响IPG等电聚焦的效果。因此在样品处理后，选择合适的上样量对获得高质量的2-DE图谱尤为重要。我们研究发现在考马斯亮蓝染色的2-DE体系中上样量在lmg，可以得到较理想的2-DE图象。

4.3 固相pH梯度等电聚焦选择宽pH范围(pH 3～10)的固相化线性17 cm干胶条。IPG等电聚焦时初始电压缓慢递增，容易使样品进入凝胶，即使是不易分离的蛋白质分子在低电压持续作用下也能向其等电点缓慢移动。因此采用了初始电压为250 V，且逐渐递增至10 000 V的聚焦程序，从而使聚焦完全。

4.4 第二向垂直的SDS-PAGE电泳参数设置为80v约5 min，然后以200 V恒压电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳。对于分离胶的浓度，选择了12.5%，结果斑点分布均匀，数目较多。

4.5 蛋白质染色2-DE不同的染色方法对样本量的要求不同。传统的考马斯亮蓝染色技术由于其较低的成本、使用方便和与下游的蛋白质鉴定技术的良好相容性得到了非常广泛的使用，但其对样本量的要求较高，通常1 mg左右的上样量才能检测到100 ng级的蛋白质［6，7］。银染技术比考染灵敏度高，可检测到1 ng级的蛋白质。但银染步骤非常繁杂，胶与胶之间的重复性较差，有文献报告其差异可达20％［8］，而且银染由于需要加入醛类作为固定剂，所以干扰质谱分析的结果［9］，与蛋白质鉴定技术的相容性还有待改进。因而我们的实验体系选择Bio-Safe Coomassie stain染色法，它具有操作简单、省时、重复性较好、可检测到ng级的蛋白量等优势，便于为今后的工作提供有利条件。

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一，探索将其用于针灸治病机理的研究是时展的需要，更是中医药发展的需要。虽然我们采取了一系列措施来对针灸治疗胃溃疡蛋白质组学效应研究平台进行技术优化与策略分析，但在双向凝胶电泳图谱中仍依稀可见许多水平条文，故今后的重点是如何提高双向凝胶电泳的分辨率和重复性，以便开展大规模分析。我们的研究也尚处于初试阶段，优化技术平台只是基础工作，最终目的在于通过高分辨率和高重复性的双向电泳图谱进行差异蛋白的筛选和鉴定，以此为针灸治疗胃溃疡的机理研究提供理论依据和技术支撑。

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