南极鱼抗冻蛋白功能和进化研究

在6500万年前的新生代时期,南极大陆开始缓慢移动,同时其温度逐渐降低,到大约2000万年前温度降到0℃以下。随着海水温度的降低,多数鱼类由于无法适应而灭绝[1]。部分鱼类发生了适应性进化,适应了极端寒冷环境而生存下来,形成了现在的南极鱼类。据统计,占地球海洋总面积约10%的南大洋拥有的鱼类包括50个科,322个种,仅占地球鱼类总数的1.3%。其中硬骨鱼南极鱼亚目(Notothenioids)鱼类达120多种,占南大洋所有鱼类的46%,而在南极洲周围海域南极鱼亚目比例高达90%[2]。南极鱼常年生活在稳定的、极端寒冷和氧气充足的南极海域中,在生化和生理功能等方面发生了许多适应性改变和新的性状以适应南极的极端环境,其中抗冻蛋白是南极鱼适应极端寒冷环境的最重要特征之一[3-4]。20世纪60年代,科学家首次在南极冰鱼(Nototheniidae)血液中发现抗冻糖蛋白(antifreezeglycoprotein,AFGP)[4]。目前已知大多极地鱼类和冷水鱼体内都可以产生抗冻蛋白(antifreezeprotein,AFP)或抗冻糖蛋白,这些蛋白质可以把鱼类体液的冰点降低,从而在环境水域冰点之下仍能保持体液的流动性,避免冷冻损伤的发生[5]。近年来研究发现,其他极地物种包括昆虫、植物、微生物也可以产生抗冻蛋白[6]。随着对抗冻蛋白认识的不断深入,科学家渐渐把抗冻蛋白应用在农业、医药、食品和工业等多个领域。

1南极鱼类抗冻蛋白分子特征和适应性进化

目前至少1种抗冻糖蛋白和4种抗冻蛋白已经被鉴定出来,它们分布在多种分类地位相差很远的极地鱼类中。这些抗冻蛋白的氨基酸序列和空间结构都不相同,但都具有结合冰晶并抑制冰晶生长的功能。最初在南极冰鱼(Nototheniidae)中发现AFGP,由一个糖三肽(Thr-Ala-Ala)基本结构单位重复组成,Thr残基上可以连接双糖基团(β-D半乳糖基,1,3-α-N-乙酰氨基半乳糖),糖基上发生化学修饰会降低AFGP的抗冻活性。鱼类可以合成一系列大小不一的AFGP分子,由不同数量的糖三肽单位聚合而成。根据糖三肽单位重复数目不同,AFGP可分为8个类别,重复数为4~50,分子量从2.7~32kD[7]。鱼类的AFP也根据氨基酸组成和结构差异进行分类。I型抗冻蛋白(AFPI)存在于北极和北大西洋的扁鱼(Pleuronectespp.)和杜父鱼(Myoxoce-phalusspp.)中,是3.5~4.5kD的小分子肽。AFPI分子中富含丙氨酸(Ala),形成一个几乎规范的alpha螺旋结构[8]。II型抗冻蛋白(AFPII)是分子量1417kD的多肽,富含半胱氨酸(Cys),分布范围较窄,目前仅在大西洋鲱(Clupeaharengus)和美绒杜父鱼(Hemitripterusamericanus)等几种鱼中发现AFPII[9]。III型抗冻蛋白(AFPIII)是研究最为广泛的一种抗冻蛋白,主要分布在极地海域和大西洋的几种绵鳚亚目(Zoarcidae)的鱼中,包括断线真狼绵鳚(Lychodyichthysdearborni)和北极狼绵鳚(Locodespolaris)[10]。目前已经从南极大头鳗鲡(Lycodichthysdearborni)的血浆中分离出8种AFPIII成分,包括3种主要成分(RD1、RD2、RD3)和5种少量成分[11-12]。AFPIV是从多棘床杜父鱼(Myoxocephalusoctodecimspinosis)血清中分离到的一种抗冻蛋白(LS12)[13],分子量约12.3kD,含108个氨基酸残基,其中17%是谷氨酰胺,N末端被焦谷氨酰基团所封闭。AFPIV广泛分布于硬骨鱼类中,具有降低冰点和冰晶修饰等AFP的特征性功能[13]。抗冻蛋白的进化是南极鱼寒冷适应的一个重要机制,其中南极鱼的AFGP从头进化机制是近年来的重要发现。南极鱼类的AFGP基因由功能上不相关的胰蛋白酶原基因(trypsinogen)演化而来。trypsinogen第一内含子和第二外显子交接处的编码Thr−Ala−Ala的9核苷酸序列在5′端微卫星DNA序列的引导下扩增,首先形成一个trypainogen−AFGP中间分子,随后经历了大部分trypsiongen编码区序列缺失而形成独立的AFGP编码基因,并进一步通过分子内大规模扩增形成一个庞大的AFGP基因家族[14]。北极鱼类的AFGP蛋白在氨基酸序列上与南极鱼类的AFGP几乎没有区别,但经过研究却发现北极鱼类的AFGP蛋白在基因进化上与trypsinogen毫无关系[4]。有研究发现来自于南极大头鳗鲡的AFPIII基因起源于一个唾液酸合成酶(SAS)基因拷贝[15]。IV型AFP与其他类型的鱼类AFP相似度较低,被鉴定并归类为新的IV型AFP,并且这种蛋白质被认为是从载脂蛋白进化而来的[13]。抗冻蛋白基因起源的发现揭示了一种新基因起源的进化机制,同时也把分子进化、环境适应和物种分化紧密地联系在一起。

2抗冻蛋白的作用机制

抗冻蛋白作用机制在于可以结合微小的冰晶并抑制冰晶的继续生长。抗冻蛋白以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点(meltingpoint,MP)影响甚微,从而导致水溶液的熔点(MP)和冰点(freezingpoint,FP)之间出现差值,这个差值称为热滞活性(thermalhysteresisactivity,THA)[16]。THA已被用于定量描述AFP的活性(图1),对于大多数鱼类AFP,观察到的THA约为1℃。在冬季(–1.9℃),这种温度差距可以为海水提供足够的缓冲,使极地鱼在寒冷的环境中生存[17]。抗冻蛋白的第二个功能是冰重结晶抑制(icerecrystal-lizationinhibition,IRI)。冰重结晶(IR)解释了一个热力学上有利的过程,其中较大的冰晶的形成以牺牲较小的冰晶为代价。较大的冰晶对于冷冻保存的细胞以及栖息在极地或寒冷地区的生物体可能是致命的,而抗冻蛋白可以在非常低的浓度下抑制冰重结晶,冰晶晶体之间界面处的AFP可以与冰粒表面结合并抑制其生长过程,其依赖AFP的冰重结晶抑制机制仍不是很明确[18-19]。将含AFP的溶液与30%蔗糖以1∶1的比例混合。将混合溶液点在两个盖玻片之间并快速冷冻。然后,将样品置于–6℃,并在特定时间段内观察变化。如图1所示,较大的冰粒以较小的冰晶为代价而增长,而在AFP存在的情况下,在较低的面板中停止生长[20]。冰重结晶抑制更可能是耐寒生物在极冷环境中生存的关键属性,冰重结晶抑制被认为可以保护细胞膜免受冻伤。图1使用改良的激冷板实验检测AFP的冰重结晶抑制功能[20]Fig.1IcerecrystallizationinhibitionassayofAFPusingmodifiedsplatassay[20]热滞活性(THA)和冰重结晶抑制(IRI)均基于AFP对冰的亲和力。然而,THA并不总是与IRI活性成正比(图2),较低THA活性的AFP可以表现出较高的IRI活性[20]。Olijve等[21]证明了AFPⅢ及其突变体显示出不同的THA值,但具有几乎相同的IRI活性。与中度热滞活性的抗冻蛋白LeIBP相比,高热滞活性的抗冻蛋白FfIBP却在IRI中表现出较低的活性[22]。这些结果提示,抗冻蛋白的THA并不能够直接转化为生物样品的冷冻保存效率,因此不能仅靠THA来考虑AFP在冷冻保存中的应用。

3抗冻蛋白在医学领域的应用研究

抗冻蛋白的热滞活性(THA)和冰重结晶抑制(IRI)活性使其在冷冻保存中具有重要作用。冷冻保存可用于在极低温度下储存各种类型的细胞、组织和器官、鲜冷食品等,已成为生命科学、医药卫生、食品、农业等领域的关键技术。冷冻保存中最重要的是避免冰晶形成导致的细胞损伤。目前常用的冷冻保存剂(如二甲基亚砜和甘油)可以减少冰的形成,但高浓度的冷冻保存剂对细胞具有毒性[23]。解冻期间的冰再结晶也是冷冻保存对细胞损伤的重要因素,而AFP在抑制冰再结晶,提高冷冻保存效率方面具有良好的应用潜力。3.1在生殖医学领域中的应用冷冻保存是生殖医学领域的关键技术之一,可以解决不孕不育、延迟生育等问题。AFP可应用于精子、卵子和胚胎等组织器官的冷冻保存[24]。研究报道极地鱼类来源的抗冻蛋白AFPIII对小鼠卵母细胞的冷冻保存具有显著的保护作用。使用抗冻蛋白明显降低了小鼠卵母细胞冷冻保存−复苏后的损伤,ROS的产生、DNA双链断裂程度和细胞凋亡的程度明显降低,复苏后卵子的发育完整性增强,使用抗冻蛋白冷冻保存的受精卵发育水平明显高于对照组[25-26]。在牛的卵子玻璃化冷冻保存研究中发现,抗冻蛋白AFGP-8的加入也明显降低了冷冻损伤的发生,提高了冷冻卵母细胞复苏后正常发育的水平[27]。在鱼类的胚胎冷冻保存实验中也发现,用加入含有AFPI的冷冻保存液进行显微注射或孵育的鱼胚胎,在低温(4℃或–10℃)冷却后存活率显著提高[28-29]。哺乳动物精子的冷冻保存技术比较成熟,但也有研究报道AFP和AFGP在精子冷冻保存中发挥重要作用,可明显降低冷冻损伤,提高精子的活力和浆膜的完整性[30-32]。这些研究表明AFP在精子、卵子、胚胎冷冻保存中具有广泛的应用价值。3.2在外科中的应用冷冻手术是目前肿瘤治疗的一项关键技术,研究报道手术前将少许AFP注射到待切除组织中,可以提高手术成功率,减少冷冻手术后的目标组织发生冷冻损伤问题[33]。AFP也被用于器官移植手术的组织、器官的冷冻保存,AFP在器官冷冻储存中的保护效果受多种因素的影响,包括AFP的浓度、冷冻保护液的成分等。如有研究发现较高浓度的AFGP对低温储存的心脏没有保护作用[34]。同时有报道AFP可以保护低温保存的大鼠心脏,用含有AFP的保存液保存的心脏在移植手术后具有更高的存活率、表现出更好的血流动力学参数和更低的细胞凋亡水平[35-36]。目前对AFP在组织、器官低温储存中的作用机理和应用潜能方面的研究较薄弱,该方面的基础研究对AFP在医学领域的应用开发是急需开展的。

4抗冻蛋白在食品领域的应用研究

抗冻蛋白作为食品添加剂可以抑制冰晶生长,改善冷冻食品的品质[37]。添加有AFP的冰激凌,冰碴的产生显著减少,而未加AFP的冰淇淋样品中冰晶较大且不均匀,AFP添加改善了冰激凌的质量和口感[38]。抗冻蛋白还可以应用在冷鲜、冷冻食品的储存和运输环节。研究发现AFP在肉类的冷冻保存中,可以减少肌肉细胞内冰晶的产生,可以保持肌球蛋白ATP酶的活性,从而提高冷冻肉类的品质和口感[39-40]。在羔羊屠宰前注射AFPG,宰后肉在–20℃冻藏2~16周后解冻检测产品质量发现:屠宰前注射AFPG均可显著降低冰晶的体积和液滴的数量[41]。速冻果蔬容易出现汁液流失、软烂、失去原有形态。运用基因工程的方法将异源高活性抗冻蛋白基因导入果蔬中,能够有效改善这种状况。美国DNA工程公司把抗冻蛋白基因导入番茄中,这种新的转基因番茄耐寒性能增强,可以在–6℃生存几个小时,而且果实冷藏后不变形[42]。

5抗冻蛋白在农业中的应用研究

5.1抗冻蛋白转基因技术提高动植物的耐寒能力。低温冷害是农业生产的一个重要危害,每年因低温冷害造成巨大的经济损失,提高动植物的耐寒能力是解决这一问题的关键。近年来,随着转基因技术的不断成熟,抗冻蛋白基因被引入植物和动物物种,以扩大其地理适应范围,增加低温生存的能力。目前科学家已经生产出多种能够合成抗冻基因的转基因物种,包括烟草,番茄和马铃薯植物等,初步观察发现这些转基因植物中获得了增加的抗冻能力[43-44]。而表达外源AGFP的小鼠对于低温引起的冻伤具有更好的抵抗力[45],同样表达外源AGFP的果蝇也具有更强的低温耐受能力[46]。抗冻蛋白转基因作物的推广,将有效地帮助农业生产避免恶劣天气带来的损失,扩展作物的栽种范围和生长季节,提高农作物的产量和质量。此外,抗冻蛋白转基因农作物还有望在后续的运输、低温储藏和加工等多个环节更加有效和便利,抗冻蛋白在农业和食品行业极具应用前景。5.2抗冻蛋白转基因能有效提高水产经济鱼类的耐寒能力。每年因低温冷害造成的渔业损失巨大,将抗冻蛋白基因转入温度敏感经济鱼类,可以提高这些鱼类的抗寒能力,改善这些鱼类的养殖区域。20世纪90年代,科学家发现将抗冻蛋白转基因罗非鱼显示出增强的耐寒能力,但当时由于转基因技术还不成熟,抗冻蛋白的表达水平比较低[47]。直接显微注射南极鱼抗冻蛋白到斑马鱼受精卵,斑马鱼发育成熟后表现出强的耐寒能力[29]。美国AquaBountyTechnologies公司拥有世界上首个被批准上市的转基因鱼,他们研发的转基因三文鱼AquAdvantage被转入了两种基因:太平洋奇努克三文鱼的生长激素基因和大洋鳕的抗冻蛋白基因,使其可以在大西洋寒冷的底部也能快速持续生长[48]。由于来自极地鱼类的抗冻蛋白属于长期被人类食用的天然蛋白,在食品安全方面没有问题,容易被大众接受。

6南极鱼抗冻蛋白研究和应用开发所存在的问题

尽管南极鱼抗冻蛋白在医药、食品、农业等领域都有良好的应用前景,但是目前在生产成本和产业化等方面还存在一些限制和不足,生产仅限于研究和专门的应用。因此,如何低成本地生产高活性的抗冻蛋白是其应用开发的技术关键。目前有学者通过原核或真核表达系统成功表达和纯化了重组的南极鱼AFP[49-50],但上述研究仍停留在实验室阶段,有待于进一步提高表达量和规模化生产。此外,也有研究报道通过混合使用多种AFP或表达多种AFP的融合蛋白来增加AFPs与冰晶结合的能力,以提高AFP的热滞活性[51]。AFP的应用开发需要解决以下几个问题。首先,应建立AFP的基因工程产业体系,大规模生产AFP,降低其成本;其次,充分研究AFP在冷冻介质中的行为和作用机制。高浓度的冷冻剂,如DMSO、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等,可能使AFP不稳定,甚至功能丧失;第三,应该设计和开发高活性的AFP,以克服天然AFPs的局限性。如有研究表明,含有三个结构域的AFPIII抗冻活性明显高于一个和两个结构域的AFPIII[52]。杨敏等[53]报道人工合成含有4个结构域的AFPIII抗冻蛋白(LD4)具有更强的抗冻、抗寒活性。LD4由4个AFPIII分子通过9个氨基酸的linker串联而成,具有4个与冰晶结合的活性平面。LD4不仅具有抗冻功能,而且具有在非冰冻温度下抵抗低温伤害的抗寒功能,转LD4基因的斑马鱼细胞可获得强的耐寒特性。天然AFP无法穿透细胞膜,有报道进行细胞内化或穿透AFP的研发,这样有利于AFPs在组织、胚胎等的冷冻保存中更好地发挥作用,从而减少冷冻液中冷冻剂的使用量,提高冷冻保存的效率[20]。

总之,如何获得大量的高效抗冻蛋白,降低抗冻蛋白的成本,是实现其广泛应用的关键。

作者:张俊芳 陶筱帆 韩兵社 单位:上海海洋大学