水解蛋白十篇
时间：2023-04-04 19:55:31
导语：如何才能写好一篇水解蛋白，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
水解蛋白篇1
关键词：大豆蛋白 Alcalase 酶解
一、实验原理
水解蛋白质的反应式。大豆蛋白原料组成：蛋白质含量为91%；水分含量的测定采用常压直接干燥法，测得水分含量为7.35％。
二、Alcalase水解大豆蛋白
1.酶解反应
步骤如下：(1)将大豆蛋白在105℃下干燥至恒重，称取一定量上述原料加入反应釜，按照设计的底物浓度向反应釜中补充适量水。(2)连接反应釜和超级恒温水浴，然后启动磁力搅拌器和超级恒温水浴，使温度为控制温度下。(3)在反应釜上安装pH计电极，在搅拌下以一定方式加入蛋白酶进行水解。(4)在反应过程中不断进行搅拌，并滴加2mol/LNaOH维持pH值不变。(5)水解结束后，水解液经过高温灭活(95℃下加热5min)，在4000r/min的条件下离心10min，取适量上清液供分析用。
酶解效果评价：采用大豆蛋白的水解度指标评价酶水解效果，大豆蛋白水解度（HD）的测定是描述蛋白质水解程度的一个非常重要的量。测得的蛋白质相应含量就可以计算出1克水解大豆蛋白样相应的HD值：
HD=[0.01×V/（3×0.1）-0.33]/7.8
2.pH值定测
利用仪器校正后测量，将每组测取三个数据取平均值。
三、结果与讨论
1.大豆蛋白的酶解
酶解蛋白质通常是在维持体系pH值不变条件下进行的。蛋白质在酶解的过程中pH值一般呈明显的下降趋势，其根本原因是肽键打开后羧基的酸性造成的，可通过向水解液中加NaOH溶液维持pH值不变。
2.单因素水解条件的考察
2.1pH值对水解度的影响
水解条件：酶与底物比45
；底物浓度60g/L；水解时间2h；温度60℃。实验结果如图3-1所示。由图3-1可以看出，水解度随着pH值的增大先升后降，即存在着最佳的pH值， pH值为8.0时水解度最高。
2.2温度对大豆蛋白水解度的影响
水解条件：酶与底物比75
；底物浓度60g/L；水解时间2h；pH值8.0。在pH值为8.0的条件下水解大豆蛋白时，水解度随着温度值的增大先升后降，即存在着最佳的温度，温度为70℃时水解度最高。
2.3酶与底物比对大豆蛋白水解度的影响
水解条件：水解温度60℃；底物浓度60g/L；水解时间2h；pH值8.0。随着酶与底物比的增加，水解度呈上升趋势，但是当酶与底物比达到40 以后，再增加酶与底物比水解度的增加不是非常显著，这可能是因为酶与底物比高于40
以后酶在底物表面的吸附作用己达到饱和。故我们选择酶与底物比为40
。
底物浓度对大豆蛋白水解率的影响。水解条件：水解温度60℃；酶与底物比60 ，pH值8.0；水解时间2h。由图3-4可以看出，在较低的底物浓度时，随着底物浓度增加，蛋白质水解度逐渐增大，但底物浓度增加到一定程度后再继续增加，水解度下降，故Alcalase水解大豆蛋白的最适反应物浓度为50g/L。
3.正交试验确定大豆蛋白的最佳水解条件
考虑到各因素的相互依赖和相互制约，导致对酶解效果的影响，进行正交试验以确定各参数的最佳组合。按正交表L9(34)设计试验，以水解度测定指标，来考查4个因素对水解效果的影响，水解时间为2h。
从正交试验得到的最佳水解条件为：底物浓度50g/L，水解温度70℃，酶与底物比60
，pH值8.0。
在4个因素的极差值中，对于水解度与底物比最大，底物浓度其次，pH值最小，4个因素对水解度影响的大小顺序为：C>D>A>B，即酶加入量>底物浓度>温度>pH；
4.水解时间考查
影响酶解蛋白水解程度的另一重要因素为反应时间，在以上最佳水解条件下，考察了大豆蛋白水解度随时间的变化情况。随着水解时间的延长，水解度不断增加，但当水解时间为4h后，再延长水解时间，水解度增加较慢，所以水解时间可取为4h，此时水解度达到24.6%。
水解蛋白篇2
关键词：酶解 水解度 鲢鱼蛋白
低值水产蛋白资源主要包括低值鱼和水产加工副产品，这类原料的食用价值和加工价值都很低，因而鲜销价值不高。目前，对于低值水产蛋白质资源的利用只要是简单的加工成鱼粉，或者直接作为饲料，利用价值较低，随着经济鱼类产量的衰退，低值鱼产量的增加及鱼类加工业的发展，低值水产蛋白原料的总量在渔业中所占的比例越来越高[1]。
鲢鱼作为我国的四大家鱼之一，由于易饲养、成长快、成本低，一直受到渔民的青睐，但由于其肉薄、鱼刺多，风味不及其它淡水鱼，在市场上不很受欢迎，且价格较低，属于低值鱼。酶法降解蛋白质是低值蛋白质资源高值利用的最有效方法之一[2]。通过研究鲢鱼蛋白质的酶水解技术，不但对鲢鱼的深加工和高值化利用具有重要的理论和应用价值，而且可以减少资源的浪费和环境污染。本文通过对胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶的酶解工艺条件进行研究，为鲢鱼蛋白质酶解产物的高值化利用提供一定的理论基础。
1 试验材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 试验原料和试剂
原料：新鲜鲢鱼：购于武湖街菜场；
胰蛋白酶（250u/mg）：上海KAYON生物科技有限公司；碱性蛋白酶（200u/mg）：上海KAYON生物科技有限公司；胃蛋白酶 (3000u/mg)：北京鼎国生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（6000u/mg）：武汉市华顺生物技术有限公司。氢氧化钠（AR）：天津市博迪化工有限公司；甲醛溶液（AR）：湖北大学化工厂；盐酸（AR）：武汉市江北化学试剂有限公司。
1.1.2 实验仪器设备
MDS-6温压双控微波消解仪：上海新化微波化学科技有限公司；HH恒温水浴锅：江苏金坛市中大仪器厂；PHS-25型数显酸度计：杭州奥利龙仪器有限公司；85-2数显恒温磁力搅拌器：江苏金坛市大地自动化仪器厂；分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；电子天平：梅特勒-托多利（上海）；九阳料理机：九阳股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 鱼糜制备方法
新鲜鲢鱼去头尾、内脏、鱼鳞、鱼皮，以固液比1∶3用料理机绞碎，4℃冷藏。
1.2.2 实验方法
取鱼糜，调节不同的初始pH每份取20g鱼糜，分装入100mL小烧杯中预热加入调节好pH的不同酶液在不同温度下保温酶解数小时90℃加热10min使酶失活通过甲醛滴定法测定氨基肽氮含量。
1.2.3 总氮含量测定方法
精确称取1.000g鱼糜加入消解罐，加入10mL 3mol/L的HCl溶液，放入微波消解仪中，在表1条件下进行消解，冷却后通过甲醛滴定法测定氨基肽氮含量。
1.2.4 水解度测定方法
氨基氮的测定采用甲醛滴定法[3]，总氮含量测定采用微波消解法[4]结合甲醛滴定法。
蛋白质水解度DH（%）=氨基态氮含量/样品中总氮含量×100%
2 结果与分析
2.1 不同酶酶解时间对鲢鱼蛋白水解度影响的比较
五种酶按照表2条件进行酶解，其酶解结果如图1。
通过图1可以看出胰蛋白酶对鲢鱼蛋白的水解效果最好，五种酶的水解效果依次为胰蛋白酶＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞木瓜蛋白酶。通过5h内水解度变化的趋势可以看出五种酶在水解进行4h以后水解度上升变缓。
2.2 添酶量对鲢鱼蛋白水解效果影响
五种酶按照表3条件进行酶解，其酶解结果如图2。
通过图2可以看出，在五种酶中胰蛋白酶的水解效果最好，在添酶量达到3000u/g时继续添加酶对水解度的提高影响变小，五种酶水解效果依次为胰蛋白酶＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞木瓜蛋白酶。
2.3 初始pH对鲢鱼蛋白水解效果影响
考虑到胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果不佳，且鲢鱼蛋白在偏酸性环境中溶解与在等电点沉淀等因素，因此剔除最适pH在偏酸性环境的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
三种酶按照表4条件进行酶解，其酶解结果如图3。
通过图3可以看出胰蛋白酶在偏碱性环境下对鲢鱼蛋白的水解效果比较好，其水解度高于碱性蛋白酶和中性蛋白酶，但在中性环境受到较强抑制；碱性蛋白酶在pH9.5条件下有较高的水解度；而中性蛋白酶在pH7.0的条件下最适宜，在偏酸和偏碱环境下均受到抑制。
2.4 温度对鲢鱼蛋白水解效果影响
三种酶按照表5条件进行酶解，其酶解结果如图4。
通过图4可以看出三种酶中胰蛋白酶的酶解效果最好在50℃时水解度达到高峰，继续升高温度则酶活下降明显，高温对胰蛋白酶的抑制作用比碱性蛋白酶与中性蛋白酶要强。
3 结论
由添酶量、初始pH、温度以及酶解时间四个因素对5种酶进行研究表明，胰蛋白酶水解鲢鱼蛋白的效果最佳。由于它能水解与赖氨酸或精氨酸结合的肽键，因而可使大部分疏水性氨基酸位于肽链末端，而使蛋白水解液苦味值较低[5]；碱性蛋白酶仅次于胰蛋白酶水解效果；中性蛋白酶的水解度不是很高，而且为了达到比较理想的水解度需要比较大的添酶量，用于工业化生产的成本比较高。木瓜蛋白酶对鲢鱼蛋白的水解效果不佳，究其原因可能是因为鲢鱼蛋白的等电点（pI）在pH5.4[6]，接近于木瓜蛋白酶的最适pH。由于鲢鱼蛋白质变性，木瓜蛋白酶与作用位点无法充分接触，可能导致其无法充分发挥作用。胃蛋白酶是一种疏水专一性内切蛋白酶，水解效果易受pH值影响，水解度不高[7]。
实验表明，鲢鱼蛋白在偏碱性环境下的酶解效果优于中性和偏酸性环境。
参考文献
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水解蛋白篇3
脑蛋白水解物是由动物脑组织蛋白通过酶水解获得的多种氨基酸和低分子肽混合物的水溶液。脑蛋白水解物1mL相当于脑蛋白中的含氮物质1g。脑蛋白水解物是脑功能改善剂。50%～80%的游离氨基酸可通过血-脑脊液屏障进入脑神经细胞，分子量在1万以下的小分子肽也可透过血-脑脊液屏障并影响呼吸链。脑蛋白水解物具有抗缺氧作用，可改善脑细胞缺氧症状，增强脑对缺氧的耐受性。还能促进神经细胞的蛋白质合成，使已损伤但未变性的神经细胞恢复功能。同时可加速葡萄糖通过血-脑脊液屏障的运转速度，改善脑能量供应，增加腺苷酸环化酶的活性，催化其他激素系统，改善记忆功能。脑蛋白水解物中氨基酸的比例恒定，同正常脑组织相似。但应用与脑蛋白水解物成分相似的合成氨基酸混合物，却未发现与脑蛋白水解物有相似作用。
药理作用：脑蛋白水解物通过血脑屏障，能促进脑细胞蛋白质合成，并影响呼吸链，增强抗缺氧能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其他激素系统；提供神经递质、肽类激素及辅酶的前体。
作用与用途：脑蛋白水解物是无蛋白质的特异性氨基酸混合物的水溶液。内含游离氨基酸及低分子肽，包括各种必需氨基酸（异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸）及非必需氨基酸（丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸），此外还有谷酰胺、门冬酰胺、鸟氨酸、西瓜氨酸、γ-氨基丁酸和γ-氨基β-羟丁酸等。
禁忌：严重肾功能不良者禁用。孕妇、哺乳期妇女禁用。对本品过敏者禁用。
水解蛋白篇4
施普善(脑蛋白水解物注射液)是采用现代化技术经标准化酶解的猪脑蛋白水解物，含85%自由氨基酸和15%低分子肽，不含蛋白、脂肪及其他抗原性物质，每毫升施普善中含有215.2 mg猪脑蛋白水解物。体内和体外的一些实验中施普善都表现出良好的神经营养保护作用和可以使轴突生长〔1〕和减少细胞调亡〔2〕，还可以促进神经元前体物质的释放，促进神经生长〔3〕。在脑梗死的动物模型中，发现施普善可以减少50%双侧颈动脉闭塞老鼠的死亡率〔4〕，研究显示其可以减少梗死面积的60%，并减少实验动物59%的死亡率〔5〕。
1 缺血性脑梗死
施普善在缺血性脑梗死的临床应用研究较多，但各个研究涉及的施普善用量和观察的时间点略有不同。Ladurner的一项随机安慰剂对照的临床试验中，对于脑梗死早期的病人，78名病人组成的施普善组(50 ml/d，连续21 d)和68名病人组成的安慰剂组在加拿大神经病学量表评分(Canadian Neurological Scale，CNS)，日常生活活动量表(Barthel指数) 和临床总体印象量表(Clinical Global Impression，CGI)都没有显著差别，只是在认知功能上有显著差异〔6〕。而之后的Skvortsova一项多中心，前瞻性的研究是予138名发病12 h之内的患者10 ml/d ，连续10 d的施普善注射，与139名只给予基础治疗的患者作对照，在第10天和第28天美国国立卫生院神经功能缺损(The National Institutes of Health Stroke Scale ，NIHSS)评分、 改良Rankin 量表(Modified Rankin Scale)评分及 Barthel 指数都有显著进步〔7〕。Gusev还研究了对于缺血性梗死后期神经功能恢复与施普善剂量的关系，20 ml剂量组比10 ml剂量组在运动和语言功能的恢复上要快〔8〕。Vilenskir则研究了对于卒中12 h之内的病人髓腔内注射施普善5 ml比静脉点滴10 ml的疗效好〔9〕。施普善治疗缺血性脑梗死在不同的时间段，不同的给药方式均有一定疗效。
2 出血性脑梗死
动物实验已证明施普善对于出血性脑梗死的治疗作用，但应用于临床研究较少。Maximova 给予38例高血压所致的幕上脑出血患者予以施普善(30 ml，连续14 d)/安慰剂随机三盲对照临床试验显示施普善能明显改善NIHSS评分，Barthel指数和改良Rankin量表评分，并可观察到脑内血肿量减少〔10〕。
3 阿尔茨海默病(AD)
目前，AD尚缺乏特效药物进行治疗，一线的治疗药物仍然是胆碱酯酶抑制剂，但其副作用较多。神经营养因子近年来成为治疗AD的热门候选，因为越来越多的证据表明神经营养因子的缺乏在AD神经变性的发病机制上起重要作用。魏朝晖对轻中度AD的5项随机、双盲，施普善/安慰剂对照的临床试验进行Meta分析，施普善30 ml/d，每周5次，连续4 w能明显改善CGI及简易智力状态量表(MMSE)评分〔11〕。 Alvarez还研究了不同剂量的施普善对于轻至中度AD患者临床综合印象和认知功能的影响，279名患者参与，分为10 ml剂量组，30 ml剂量组和60 ml剂量组，每日一次，每w5次，连续4 w，发现随着剂量的增加，CGI相应改善，但认知能力的改善没有随着剂量的增加而明显改善〔12〕。
4 血管性痴呆(VD)
VD是在脑血管壁病变基础上，加上血液成分或血液动力学改变，造成脑出血或缺血，导致认知功能等方面出现障碍，患者的记忆、语言、注意、知觉、逻辑思维障碍和社交能力、生活自理能力下降，通常伴有人格和情感改变 。一般进展较缓慢，病程波动(呈阶梯式进展)，常因脑卒中引起病情急性加剧。Muresanu对41名轻至中度VD的患者给予10或30 ml/d的施普善每周5 d连续4 w后观察认知水平及定量脑电图的关系，发现给予施普善组的认知水平较安慰剂组明显提高，且定量脑电图显示慢波减少，α波增加，与认知水平的改变相符〔13〕。
5 颅脑外伤
颅脑损伤后，可因脑挫裂伤、颅内血肿导致颅内压升高，继发脑缺血、缺氧、水肿、酸中毒、微循环障碍等一系列病理变化，随着颅脑外伤的发病率逐年上升，促进脑损伤的恢复，减轻家庭、社会负担，成为亟待解决的问题。施普善用于颅脑外伤的研究虽多，但病例数均较少，Wong〔14〕对于外伤后48 h之内的21例患者给予50 ml施普善治疗20 d，与同所医院的脑外伤病人进行队列分析发现，3个月、6个月后格拉斯哥昏迷评分(GCS)均明显升高，且无严重不良反应。Alvarez给予20名脑外伤后的病人30 ml/d施普善注射，每周连续5 d，使用4 w以上用定量脑电图检查病人，可见病人的慢波活动减少，提示施普善有利于脑外伤病人的恢复〔15〕。
6 新生儿缺血缺氧性脑病，儿童精神发育迟滞
施普善是由自由氨基酸和低分子肽组成，副作用相对较小，较多的用于治疗新生儿或婴幼儿的神经细胞损害，新生儿缺氧缺血性脑病(HIE) 是新生儿最常见的中枢系统疾病，是新生儿窒息后产生的严重并发症，病死率高，幸存者常致脑瘫、智力低下、癫痫等慢性长期神经精神障碍，马香桃给予30名患新生儿缺氧缺血性脑病的患儿施普善5 ml/d，连续10 d，与未给予施普善组进行对照，发现患儿意识，原始反射均有明显好转〔16〕。Serkina对20名围产期缺血缺氧的患儿予以每日0.1 ml/kg的施普善治疗10 d，发现其疗效是通过免疫调节及抗氧化作用〔17〕来实现的。Govorin给予4～6岁精神发育迟滞的儿童0.1 mg/kg/d，连续42 d的施普善，安慰剂对照发现实验组的精神心理明显改善〔18〕。
7 小 结
施普善是不含蛋白质的标准化特异性氨基酸和低分子肽混合物的水溶液，其作用非常复杂。事实上，有些疾病如缺血性脑卒中的发病机制非常复杂，是多因素共同作用的结果。这也许是目前临床上治疗这些疾病尚难取得令人满意效果的主要原因，施普善参与了神经保护的多个环节，有多个特异性的结合位点，正因为如此，它具有更大的潜在实用价值。
参考文献
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水解蛋白篇5
【关键词】 颈性眩晕;手法调整;脑蛋白水解物
作者单位：537000 广西玉林市中医院颈性眩晕是由颈椎或颈部软组织病变引起的以眩晕为主要表现的临床综合征，是临床常见病、多发病。近年来该病的发病年龄明显提前，严重影响患者的日常生活和学习，引起国内外学者的极大关注。目前治疗颈源性眩晕的方法多样，但多数只针对部分病因治疗，疗效不一。笔者于2010年11月至2012年3月采用手法调整与脑蛋白水解物静脉滴注治疗该病患者80例，经临床观察效果满意，现报告如下。
1 临床资料
1.1 一般资料 本组80例，均为我院2010年11月至2012年3月门诊和住院患者，经颈椎DR检查显示颈椎生理曲度变直或反弓，有颈2棘突(或横突)偏歪和对侧颈5棘突(或横突)偏歪的病例，随机分为治疗组和对照组各40例。其中治疗组男14例，女26例。年龄19～75岁，平均49.5岁；病程1周～5年。对照组男17例，女23例；年龄20～73岁，平均50.2岁；病程3周～2年。两组患者一般资料比较无统计学意义(P＞0.05)。
1.2 诊断标准 参照《中医病症诊断疗效标准》［1］与第二届颈椎病专题座谈会纪要制定颈椎病的诊断标准［2］：①眩晕与颈部改变有关。②旋颈试验阳性。③颈部活动受限，患病椎体棘突偏歪，椎体旁压痛。④颈椎8线显示颈椎生理曲度变直或反弓，骨质增生，环齿间隙改变。⑤颈部血管超声检查显示椎动脉血流速减低。⑥CT及RI显示颈椎间盘突出，硬膜囊受压。
2 治疗方法
2.1 治疗组治疗方法 ①手法调整：第一步: 患者取坐位,术者站于患者后面，采用捏拿、揉滚、分筋理筋、点按等法充分放松四线两区九穴。即:颈后正中线、颈两侧旁线、枕下线、两肩胛区、 颈后区、 风府穴、双侧风池穴 、双侧完骨穴 、双侧肩中腧 、双侧肩舒外腧穴。放松的重点是寰枕筋膜、枕下三角、肩胛内缘部分，时间约8 min。第二步：患者取坐位，术者站于患者后面，采用八字触诊法找到偏歪的颈2棘突(或横突)和对侧偏歪的颈5棘突(或横突)，应用颈椎旋转复位法调正颈2棘突(或横突)，然后再用颈椎侧旋提推法调正对侧偏歪颈5棘突(或横突)。时间约2 min。第三步: 患者平卧位，颈下垫薄枕, 术者坐于患者头顶侧，采用醒神开窍法，行开天门，揉搓额部，下推太阳，指点睛明、攒竹、丝竹空、率谷、百会、四神聪等穴, 并开四关(双合谷, 太冲), 合并耳鸣的点耳门、听宫、听会等穴，时间约5 min。②注射用脑蛋白水解物(国药准字H20041580)静脉滴注：注射用脑蛋白水解物90 mg加入5％葡萄糖注射液250 ml(糖尿病患者改用0.9％氯化钠注射液250 ml)静脉点滴，1次／d，10 d为1疗程。
对照组治疗方法单用手法调整治疗。
2.2 疗效评定标准 根据国家中医药管理局《中医病症诊断疗效标准》［1］。治愈: 眩晕消失，伴随症状消失，正常参加工作和劳动。好转: 眩晕减轻，伴随症状减轻， 颈部功能改善。无效: 治疗后症状无改善。
3 结果
见表1。
表1 治疗组和对照组疗效比较(例，%)
组别例数 治愈（%） 好转（%） 无效（%） 总有效率（%）
治疗组 40 34（85.0） 5（12.5） 1（2.5） 97.8
对照组 40 20（50.0） 14（35.0） 6（15.0） 85.0
注：χ2=11.46，P
4 讨论
颈源性眩晕是一种临床常见的以眩晕和平衡失调为特征，多伴有颈部疼痛的疾病，是由颈部异常传入神经活动而发生的异常空间定位和共济失调的非特异性感觉障碍［3］。眩晕发病机理复杂多样，归纳各种原因最终结果导致椎动脉受刺激(或受压迫)而供血受阻，使椎基底动脉系统缺血，进一步引起脑内微循环障碍而致病。由于颈椎结构与椎动脉走行的特点，颈性眩晕好发部位是颈2与颈5椎，因为环枢椎区的椎动脉有4个弯曲，本来血流不畅，一旦局部有病变，则更影响血液的循环;第5颈椎的椎动脉孔距离椎体最近，一旦第5颈椎有病损亦易影响椎动脉的血流而引起眩晕［4］。笔者采用放松手法使径向部软组织松解彻底, 尤其是枕下三角, 环枕筋膜部, 起到缓解肌肉痉挛, 减轻对血管、神经的刺激, 改善微循环, 消除炎症刺激作用。采用颈椎旋转复位法和颈椎侧旋提推法调正偏歪的颈2颈5椎，恢复了颈椎正常的解剖位置，纠正椎体失稳、关节移位，扩大椎间隙，减轻对神经组织的压迫和刺激，使粘连得到松解，改善生理曲度，解除椎动脉的挤压，改善椎基底动脉供血，以减轻眩晕。采用卧位揉按点压头面部穴位以达到醒神开窍, 聪耳明目的功效。相关文献显示，45 %以上的颈性眩晕患者为脑血管病患者，而其中62 %的人有颈椎病，且有眩晕症状［5］。眩晕发生后，脑组织局部及机体发生一系列生理病理反应，这些改变是继发性脑损害的主要原因。脑蛋白水解物是一种大脑所特有的肽能神经营养药物，可通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢。本文资料显示，手法调整结合应用脑蛋白水解物对改善颈性眩晕，防止继发性脑损害具有较好的疗效，比单用手法调整治疗效果好，值得临床推广使用。
参 考 文 献
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水解蛋白篇6
目的: 从蛇毒中获得大量高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶。方法: 采用离子交换和亲和层析技术进行纯化。结果: 从江浙蝮蛇毒中提取出了一种高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶, 不需活化即可水解激肽原, 释放激肽, 并具有精氨酸酯酶活性。粗毒经提纯, 比活可达800 u/mg以上, 远远高于哺乳动物来源的激肽原酶, 纯度可达95%以上。对其性质考察, mr为38 000, n-末端的15个氨基酸序列分析表明, 该酶与蛇毒丝氨酸蛋白酶及胰蛋白酶——激肽释放酶同源。结论: 这种方法适合于工业化生产。 【关键词】 江浙蝮蛇 蛇毒 激肽原酶
自从有人在美洲矛头蝮蛇(bothrops jararaca)蛇毒中发现激肽原酶后, 蛇毒激肽原酶越来越受到广大学者的重视［1］。我国蛇类资源丰富, 但受提纯工艺的限制, 至今仍未开发出蛇毒激肽原酶的药物制剂。我们采用离子交换和亲和层析技术, 从江浙蝮蛇（agkistrodon halys pallas）蛇毒中提取了高纯度的激肽原酶, 并对其性质进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料 江浙蝮蛇蛇毒冻干粉（辽宁省清源县）, deae-sepharose , 琼脂糖凝胶（瑞典pharmacia公司）, 苯甲酰精氨酸乙酯（baee）, 对甲苯磺酰精氨酸甲酯（tame）, 标准蛋白, 激肽原, 激肽等底物（sigma公司）, 低压型高效液相色谱仪（日本岛津公司）, 8823b紫外检测仪（北京宾达英创科技有限公司）, balb/c小鼠（7周龄）由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 蛇毒激肽原酶的分离纯化 （1）deae-sepharose离子交换色谱: 称取江浙蝮蛇毒15 g, 用0.02 mol/l ph7.8的tris-hcl缓冲液溶解, 以4 000 r/min离心20 min, 取上清, 透析12 h后, 以6.0 ml/min的流速上阴离子交换柱（deae-sepharose）, 上样完毕后以0.02 mol/l ph7.8的tris-hcl缓冲液洗去未吸附的杂蛋白。（2）亲和色谱法: ①免疫抗体亲和层析柱的制备: 取少量离子交换色谱活性洗脱液, 用高效液相色谱法纯化并经定性得到蛇毒激肽原酶, 取该蛇毒激肽原酶50 μg与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物, 对7周龄的balb/c小鼠皮下注射免疫, 每次0.2 ml, 每周1次, 共免疫6次。在采集血清前3 d取0.2 ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。用溴化氰活化4b-sepharose琼脂糖凝胶, 把得到的蛇毒激肽原酶抗体偶联到多糖基质上, 从而制成免疫亲和层析柱。 ②亲和色谱法纯化蛇毒激肽原酶: 将经离子交换纯化的酶用平衡液透析, 上抗体亲和层析柱。用亲和层析洗脱液（0.02 mol/l tris-hcl缓冲液, ph7.2, 含0.5 mol/l nacl, 70 g/l arg）洗脱。收集洗脱峰, 冷冻干燥保存。（3）纯度检测: 取主峰组分适当稀释, 用高效液相色谱（hplc）法检测。色谱条件: tsk-2000sw凝胶柱, 280 nm检测, 流速1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相, 进样量20 μl。
1.2.2 比活性测定 ① 舒缓激肽原酶活力测定［2］: 取0.2 ml激肽原底物（20 g/l, 0.05 mol/l, ph7.8磷酸缓冲液配制）, 加0.1 ml酶液, 37℃水浴保温3 min, 立即取0.15 ml测离体豚鼠回肠平滑肌收缩幅度, 用0.1 μg激肽做对照, 以每毫升酶液3 min释放相当于1 μg激肽定为1活力单位（u）。②精氨酸酯酶活力的测定: 以baee及tame为底物测定［3］。③蛋白含量的测定: 采取凯氏定氮法测定蛋白质含量。
1.2.3 理化性质 ①电泳法相对分子质量（mr）测定: 以兔磷酸化酶b（mr 97 400）、 牛血清白蛋白（mr 66 200）、 兔肌动蛋白（mr 43 000）、 牛碳酸酐酶（mr 31 000）、 胰蛋白酶抑制剂（mr 20 100）、 鸡蛋清溶菌酶（mr 14 400）作标准蛋白, 用还原型sds聚丙烯酰胺电泳法测定。②高效液相色谱分析: 色谱条件（tsk-2000凝胶柱, 280 nm检测, 流速1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相）。以牛血清白蛋白第v组份（66 200）、 卵清蛋白（44 300）、 木瓜蛋白酶（mr 21 000）、 溶菌酶（mr 14 300）为标准蛋白, 测定纯度及mr。③n-末端氨基酸残基测定: pvdf膜上样, abi procise 491型测序仪测定。
1.2.4 酶学性质 ①最适ph: 将baee配于不同ph的0.05 mol/l tris缓冲液中, 测定激肽原酶水解baee的最适ph。②不同ph值下的稳定性: 将激肽原酶分别溶于不同ph值的0.1 mol/l tris缓冲液, 于室温静置24 h后, 取样测定水解baee底物的活性。③不同温度下的稳定性: 将激肽原酶分别于不同温度下保温3 h, 测定水解baee的活性。④edta对激肽原酶活性的影响: 将激肽原酶制成含0.1 mol/l edta的溶液, 测定水解baee活性。⑤不同二价金属离子对激肽原酶活性的影响: 将激肽原酶制成含ca2+、 zn2+ 、 co2+、 hg2+、 mg2+、 ba2+0.01~0.1 mol/l的溶液, 测定其水解baee的活性, 并用edta络合后再分别测定其水解baee活性。
2 结果
2.1 蛇毒激肽原酶的分离纯化 蝮蛇毒经deae-sepharose阴离子交换层析, 亲和层析, 可将杂质蛋白除去, 得到的样品经hplc检验, 纯度可达95%以上。
图1 deae-sepharose离子交换色谱图（略）
透过峰过后, 梯度洗脱得到5个峰, 经定性检测3, 4号峰为活性峰.
图2 蛇毒激肽原酶亲和色谱图（略）
1: 平衡液洗脱透过峰; 2: 为亲和洗脱液洗脱所得活性峰.
图3 激肽原酶纯度检验图谱（略）
色谱条件: tsk-2000凝胶柱, 280 nm检测, 流速 1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相, 对峰面积积分, 主峰面积达95%以上.
图4 激肽原酶sds聚丙烯酰胺电泳图谱（略）
m: 分子量标准品; s: 蛇毒激肽原酶样品.
2.2 活性测定 与粗毒相比, 提纯高的激肽原酶比活提高了约300倍, 活力回收率可达60%以上, 水解baee的比活可达到800 u/mg以上, 水解tame活性较低, 约是水解baee活性的5%。
2.3 理化性质 经sds聚丙烯酰胺电泳及hplc方法检测, 江浙蝮蛇毒激肽原酶的mr约为38 000, 与组织型激肽原酶相似。
2.4 江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶、 哺乳动物胰蛋白酶n末端氨基酸序列［4］比较 蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸蛋白酶具有同源性, 属丝氨酸蛋白酶的一种, 且与哺乳动物的胰蛋白酶——激肽释放酶具有同源性。
表1 江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶、 哺乳动物胰蛋白酶n末端氨基酸序列比较（略）
2.5 酶学性质 ①最适ph: 测定蛇毒激肽原酶水解baee底物活性的最适ph值为7.0~8.0, 这与哺乳动物的组织激肽原酶相同, ph10以上, 底物自发水解无法测定。②不同ph值下的稳定性: 蛇毒激肽原酶在ph4.0~9.0条件下, 活性基本不变, ph低于4.0或高于9.0时, 活性迅速下降, ph大于10.0时, 底物baee发生水解而无法测定。③不同温度下的稳定性: 在30℃以下时, 激肽原酶的活力基本不变, 超过40℃时, 活力迅速下降, 高于60℃时, 发生蛋白质变性而有沉淀析出。④edta对激肽原酶活性的影响: edta对激肽原酶的活力无影响, 证明蛇毒激肽原酶不是金属酶。⑤不同二价金属离子对激肽原酶活性的影响: ca2+、 mg2+、 ba2+对激肽原酶活力无影响, zn2+（0.1 mol/l）、 hg2+（0.01 mol/l）、 co2+（0.1 mol/l）可完全抑制激肽原酶活性, 且用edta络合不能使其活力恢复, 蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性质, 故hg2+可使其活性丧失, 但zn2+ 、 co2+对其活性影响的原因尚不明确, 可能是因为与蛇毒激肽原酶不可逆性结合, 从而改变其构象使其失活。
3 讨论
激肽原酶在体内有重要的生理功能［5］, 目前临床广泛用于原性高血压、 心绞痛、 动脉硬化、 视网膜血流障碍、 肢端知觉异常, 闭塞性血栓性血管炎等疾病的治疗。但因为以往从哺乳动物的胰腺提取的胰激肽原酶纯度不高, 具有一定的抗原性, 进入人体后, 可能诱发过敏抗原抗体反应, 已有报导注射胰激肽原酶导致固定性药疹［6］及重症多形红斑药疹［7］, 且不能实现静脉给药, 使药物不能最大限度发挥效用。近年的提取工艺虽可得到高纯度激肽原酶, 但在提取过程中, 酶活力损失较大, 回收率低, 难以实现工业化生产, 因此寻找高纯度且无抗原性的激肽原酶并建立一套适合工业规模化生产的工艺方法是目前面临的新课题。
我们在传统提取工艺的基础上, 用离子交换, 亲和层析两步即可制备高纯度的蛇毒激肽原酶, 该方法设备简单, 条件温和, 产品回收率高, 产量大, 完全符合工业化生产的要求, 填补了蛇毒激肽原酶生产工艺上的一项空白。与哺乳动物来源的激肽原酶相比, 从江浙蝮蛇毒中提取的激肽原酶有如下特点: ①比活高（≥800 u/mg）, mr小（约为38 000）, 等活力单位给药蛋白含量低, 不易引起过敏反应; ②纯度高, 提纯后纯度可达95%以上。如果用于药物, 大大提高了药物的安全性; ③无病毒隐患。不携带可能同人类共同感染的病毒。④无酶原形式, 不需活化即可释放激肽, 可直接发挥作用。该蛇毒激肽原酶最适ph值为7.0~8.0, 且在ph4.0~9.0范围内, 活力基本保持不变, 有利于在人血浆环境中保持其活性。该酶在30℃以下活力基本不变, 而在冻干状态下, 37℃放置90 d, 活力下降在5%以内, 经试验, 在整个冻干制剂生产过程中, 酶活力的损失率均在10%以内, 因此可以生产出相对稳定的制剂产品。n-末端的氨基酸测序结果表明, 蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸蛋白酶同源, 属丝氨酸蛋白酶的一种, 可能也具备大多数蛇毒丝氨酸蛋白酶的特性具有较长的生理半衰期, 可能成为临床用药; 同时, 它与哺乳动物的胰蛋白酶激肽释放酶具有同源性, 可以部分解释其与组织激肽原酶的相似性。蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性质, 不是金属酶, 而zn2+、 co2+对酶活性的影响的机制可能与改变其构象有关, 有待进一步证明。
总之, 我们从蛇毒提取的激肽原酶将为药学领域提供一条新的途径, 应用于药物必将带来临床新的治疗方法。
【参考文献】
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水解蛋白篇7
关键词：急性脑梗死;醒脑静注射液;脑蛋白水解物
中图分类号：R743.33R289.5文献标识码：B
doi：10.3969/j.issn.16721349.2015.01.016文章编号：16721349（2015）01004403
Clinical Observation on Xingnaojing Injection and Brain Protein Hydrolysate for Treatment of Acute Cerebral Infarction
Xie Qingyong，Wen Zhenmei
Meizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Meizhou 514031，Guangdong，China
Abstract：ObjectiveTo study the effect of Xingnaojing injection and brain protein hydrolysate for treatment of acute cerebral infarction. MethodsNinety cases with acute cerebral infarction were randomly divided into observation group and control group，45 cases in each group. control group pure to conventional treatment plus brain protein hydrolysate，based on observation group was treated in the control group，treatment with Xingnaojing injection 2 weeks，4 weeks to observe curative effect and adverse reactions. Results Basic recovery 25 cases in observation group 45 cases （55.56%），10 cases were markedly improved （22.22%），effective in 5 cases （11.11%），the total effective rate was 88.89%;Basic healing 16 cases in the control group 45 cases （35.56%），8 cases were markedly improved （17.78%），effective 4 cases （8.89%），total effective rate 62.22%，Observation group and control group in the treatment of ischemic cerebral apoplexy curative effect more significant differences （P
Key words：acute cerebral infarction;Xingnaojing injection;brain protein hydrolysate
脑梗死又称缺血性脑卒中，是指脑供应血管由于各种原因引起相应血管的闭塞，脑部供血中断，又无充分侧支循环代偿供血时，导致脑组织缺血、缺氧性坏死和脑软化，而产生血管供应区脑功能损害和神经症状的一群临床综合征。动脉硬化性脑血栓形成是缺血性脑卒中最常见的原因，约占急性缺血性脑卒中的60%～80%。急性脑梗死可分为三个阶段，即超早期（发病1 h～6 h内），急性期（1周～2周），恢复期（>2周至6个月）。急性脑梗死以其高发病率、高复发率、高致残率和高死亡率而引起国内外神经病学界的广泛关注。我院2011年1月―2013年7月，运用醒脑静注射液联合脑蛋白水解物治疗急性脑梗死获得满意疗效，现报道如下。
1资料与方法
1.1临床资料90例急性脑梗死患者来源于我院门诊及住院，采用随机双盲的原则分为观察组和对照组。
观察组45例，男性25例，女性20例;年龄39岁～86
岁（69.16岁±4.23岁）。对照组45例，男性24例，女性21例;年龄40岁～85岁（68.71岁±4.69岁）。其中合并有冠心病40例，2型糖尿病56例，高血压病82例。两组患者均无急性脑出血、急性心肌梗死、未控制的恶性肿瘤、肝肾功能不全以及其他系统严重疾病。两组患者在一般资料上经统计学处理，无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2诊断标准参照2005年国家中医药管理局《中药新药临床研究指导原则》、《中医病症诊断标准》、《中风病诊断与疗效评定标准》等相关部分拟定诊断标准。
1.2.1西医诊断标准参照1995年中华医学会第四次全国脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点》[1]。
1.3治疗方法
1.3.1对照组所选病例全部给予脑蛋白水解物注射液20 mL加生理盐水100 mL或5%葡萄糖注射液100 mL，静脉滴注，每天1次，共4周。合并冠心病、糖尿病、高血压病患者分别给予扩冠、稳定斑块、控制血糖、控制血压等常规治疗。
1.3.2观察组在对照组治疗基础上加用醒脑静注射液（由江西济民可信制药有限公司提供），每次20 mL加生理盐水100 mL或5%葡萄糖注射液100 mL，每天一次，共4周。
1.4疗效标准全部病例治疗2周、4周时，临床功能缺损评分增减评价疗效，参照1995年中华医学会第四次全国脑血管病学术会议制定的脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准[1]。
1.5统计学处理所有数据经SPSS11.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，各参数组间比较采用t检验。
2结果
2.1两组临床疗效观察组与对照组在治疗4周后临床疗效比较有统计学意义（P
2.2两组治疗前后神经功能评分观察组于治疗后2周、4周神经功能缺损评分与对照组比较有统计学意义（P
2.3两组治疗前后证候积分评分观察组治疗后证候积分评分与对照组比较有统计学意义（P
3讨论
急性脑梗死是急性脑血管病中最常见、发病率最高的一种临床类型，是指由于脑动脉病变，使血管腔狭窄或闭塞所引起的脑梗死。其中，大部分是由于动脉粥样硬化引起，侵犯大中动脉发生梗死，引起脑血栓形成。小部分是由于高血压动脉硬化累及微小动脉，引起脂肪透明变性或纤维样坏死，造成腔隙性脑梗死。高龄、高血压、高血脂、糖尿病和心脏疾病等都是急性脑梗死的危险因素。大量研究表明，炎症反应介导了脑缺血/再灌注损伤。伴随着细胞因子、黏附分子表达和促发炎症的级联反应，白细胞黏附、聚集和迁移并产生大量的蛋白水解酶、氧自由基及花生四烯酸代谢产物，破坏血脑屏障，导致血管源性水肿和出血，加重继发性脑损伤[2]。
脑蛋白水解物是从猪脑组织中提取的各种特异性氨基酸及小分子肽复合物，本品易通过血脑脊液屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗低氧能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其他激素系统，提供神经递质肽类激素及辅酶前体，具有促进神经纤维生长的类神经生长因子功能，改善病变区脑细胞功能，使其免受各种缺血、低氧和神经毒素的损害，是一种治疗脑神经功能障碍的药物[3]。钱文运[4]研究发现，脑蛋白水解注射液能有效改善血液流变学异常，降低血液黏滞度，改善红细胞变形能力，预防和治疗缺血性脑卒中。徐晶雪[5]研究发现，应用脑蛋白水解物佐治急性脑梗死的观察组疗效优于常规改善脑循环、脱水、对症处理的对照组，未见有过敏反应及其他不适;与对照组相比，脑蛋白水解物能促进意识、原始反射及肌张力的恢复，临床近期疗效肯定;在远期疗效观察组发现神经系统后遗症的发生率也明显低于对照组;同时，脑蛋白水解物对急性脑梗死患者的意识、语言障碍及瘫痪肢体等功能恢复有较好的效果。
醒脑静注射液为传统中医方药“安宫牛黄丸”之改制剂型，由天然麝香、冰片、栀子、郁金组成，其中麝香芳香开窍，善于走窜，系醒神回苏之要药;冰片辛香走窜，助麝香开窍醒脑;栀子、郁金清热凉血、泻火解毒。诸药合用，共奏开窍醒脑、凉血行气、活血化瘀、清热解毒之功。
麝香可减少局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积、改善脑缺血后神经行为症状，有效降低脑缺血再灌注后脑含水量及血脑屏障的通透性，对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠有一定的脑保护作用[6]。冰片可以明显降低麻醉犬的血液黏度，脑血流阻力，使脑血流量增加，对中枢神经系统兴奋性有双向调节作用，既可镇静安神，又可醒脑[7]。栀子的有效成分熊果酸具有中枢镇静作用，并能加强延脑交感中枢紧张度，有明显中枢降压效应;栀子还具有脱水作用，可以改善脑水肿[8]。郁金含挥发油、姜黄素等主要成分。近代研究证明，郁金具有调节免疫功能，抑制中枢神经，改善血液流变性，抗自由基损伤等作用。
醒脑静注射液的现代药理和临床研究证明，其对心血管、神经、呼吸等系统均具有广泛的临床应用价值，其主要作用机制有：对中枢神经系统的双向调节作用;清除氧自由基，抗氧化作用;兴奋呼吸中枢，降低动脉血二氧化碳分压，改善通气;抑制炎症因子释放，保护神经元;改善内皮功能障碍，防止血栓形成，改善冠脉循环[9]。醒脑静注射液联合脑蛋白水解物，可以改善脑循环，营养脑细胞，对急性脑梗死患者的意识、语言障碍及瘫痪肢体等功能恢复有较好的效果。
本研究表明，在急性脑梗死的治疗中，观察组与对照组在疗效方面比较有统计学意义（P
参考文献：
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水解蛋白篇8
【关键词】柱前衍生；老酸奶；L-羟脯氨酸；液相色谱
0.引言
最近一则关于“果冻，老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在网上流传，因破皮鞋可以提炼出明胶。明胶是一种极为常见的食品添加剂，是从牛、猪等动物骨和皮中的胶原通过变性而制得的变性蛋白质，其化学组成与胶原基本相同，主要成分是胶原蛋白。老酸奶等乳制品为了保持其口感和外观，会适当添加明胶等食品添加剂，这是国家允许使用的。而皮革制成的明胶透明，无味，消费者根本无法区分。本文通过检测皮革水解蛋白来区分食用明胶和皮革制成的明胶。皮革水解蛋白多用皮革厂制作服装、皮鞋后的下脚料来生产，自然这种蛋白中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进去的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，如果长期食用含有皮革水解蛋白的食物，金属铬离子便会被人体吸收、积累、中毒，使人体关节疏松肿大，严重的会患上癌症。对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L-羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酪蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为含有皮革水解蛋白，即可判断该乳制品中含有由废弃皮革而来的成分。
本文提供了乳制品中L-羟脯氨酸的检测方法，采用异硫氰酸苯酯PITC柱前衍生法，利用液相色谱和氨基酸分析柱，对L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法检测结果准确，方法稳定性好，可用于老酸奶等乳制品中是否含有皮革成分的鉴别。
1.材料与方法
1.1原理
样品经蛋白水解试剂水解，释放出L-羟脯氨酸，然后用异硫氰酸苯酯（PITC）衍生，采用液相色谱仪测定，外标法定量。
1.2仪器
液相色谱仪（附紫外检测器）；旋转蒸发仪；分析天平（感量0.1mg）；离心机；涡旋混合器；恒温水浴振荡器。
1.3试剂
1.3.1乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；正己烷（分析纯）；L-羟脯氨酸标准品≥90%
1.3.2蛋白水解试剂：称取0.1g苯酚置于100mL容量瓶，加入50mL浓盐酸，加水定容至100mL。
1.3.3 0.1mol/LHCl水溶液：量取8.3mL浓盐酸，用纯水定容至1000mL。
1.3.4衍生剂PITC溶液：将250μL异硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10mL。
1.3.5三乙胺溶液：将1.4mL三乙胺用乙腈定容至10mL。
1.3.6标准溶液储备液：称取一定量L-羟脯氨酸，用0.1mol/LHCl水溶液溶解，得到浓度为1mg/mL的储备溶液。
1.3.7标准溶液使用液：将储备液用0.1mol/L HCl水溶液稀释，得到浓度为10μg/mL的L-羟脯氨酸溶液。
1.4样品水解
称取奶粉0.1g或老酸奶0.5g（精确到0.1mg）,置于20mL蛋白水解瓶中（迪马公司生产），加入10mL蛋白水解试剂，旋紧盖子，振荡混匀，然后置110±1℃烘箱中水解24小时。水解完毕，用超纯水将水解液全部转移至蒸馏瓶中，75℃下减压蒸馏至近干。用0.1mol/L HCl水溶液分三次溶解残渣，定容至25mL容量瓶中，混匀,待衍生。
1.5样品衍生
准确量取200μL标准和样品水解溶液，分别置于2mL样品瓶中，各加入100μL三乙胺溶液和100μL衍生剂PITC溶液，混匀，室温放置1h，再分别加入400μL正己烷，旋紧盖子后剧烈振荡5～10s，静置分层，分别取下层溶液，经0.22μm针式过滤器过滤，待分析。
1.6测定
1.6.1分析条件
色谱柱：DiamonsilAAA250×4.6mm，5μm
流 速：1.0mL/min
检测器：UV254nm
柱 温：：45℃
进样量：10μL
流动相A：0.05mol/L乙酸钠水溶液（冰乙酸调节pH值为6.50±0.05）
流动相B：甲醇：乙腈:水=20:60：20
梯度程序
1.6.2测定
按仪器操作规程，依次注入标准工作溶液和样品处理液，将标准浓度，称样量和稀释体积输入计算机中，仪器测定结果后自动计算结果并打印。
2.结果与讨论
2.1添加回收结果及变异系数
表一 奶粉中添加回收结果及变异系数
表二 老酸奶中添加回收结果及变异系数
L-羟脯氨酸标准5μg/mL液相色谱图
奶粉中添加L-羟脯氨酸（添加水平5μg/mL）
的液相色谱图
老酸奶中添加L-羟脯氨酸
（添加水平5μg/mL）的液相色谱图
通过上述表格可以看出：奶粉和老酸奶通过加标测定，回收率均在89.95%-92.16%之间，回收效果很好，变异系数在4．33%-5．96%之间也在规定范围内。
2.2结论
根据上述实验可知：采用PITC柱前衍生法，利用液相色谱和氨基酸分析柱，对老酸奶及乳制品中L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法具有检测结果准确，方法稳定性好，回收率高等优点，可用于老酸奶及乳制品中是否含有皮革成分的鉴别。
【参考文献】
水解蛋白篇9
【关键词】
果糖二磷酸钠;脑蛋白水解物;新生儿;缺氧缺血性脑病
新生儿缺氧缺血性脑病是指各种围生期窒息引起部分或全部缺氧,脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤。是引起新生儿急性脑死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一。
我院应用FDE联合脑蛋白水解物对HIE患儿进行治疗,取得满意疗效,现报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料所选82例患者全部来自我院2008年8月至2009年8月住院治疗患儿,均符合中华医学会儿科学会新生儿组制定的足月儿HIE诊断治疗标准[1],均与生后72 h后行头颅CT检查进一步确诊。随机分为两组,治疗组42例,其中男24例,女18例;入院日龄48 h 2例;出生体重2500~4000 g 40例,>4000 g 2例;合并蛛网膜下腔出血13例。治疗组40例,其中男24例,女16例;入院日龄48 h 1例;出生体重2500~4000 g 39例,>4000 g 1例;合并蛛网膜下腔出血10例。两组患儿在性别、 日龄、 出生体重、入院时间、病情分度方面,经统计学处理,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2治疗方法两组患儿均在入院后给予3项支持治疗,即维持良好的通气、换气功能 ,使血液生化和pH值保持在正常范围;维持脑和全身良好的血液灌注;维持血糖在正常范围。同时给予对症处理,即控制惊厥、降低颅内压等。同时给予维生素K1常规止血治疗。治疗组加用果糖二磷酸钠200 mg/(kg・次),缓慢静注,1次/d,同时给注射用脑蛋白水解物,20 mmg+10%葡萄糖溶液30 ml,1次/d,静脉点滴,疗程7~14 d,伴有感染者加用抗生素。分别记录两组临床观察指标。
1.3疗效判定显效治疗7 d内患儿颜面红润,哭声有力,反应、吃奶好,呼吸平稳,心率>100次/mim,原始反射恢复,四肢肌张力恢复正常。有效治疗10 d以内症状体征完全恢复正常。无效治疗10 d以上临床症状及体征仍未完全恢复。
2结果
治疗组总有效率为95.2%,对照组总有效率为77.5%,经统计学处理,差意有统计学意义(P
表1
两组新生儿缺氧缺血性脑病患者临床疗效(率,%)
组别例数显效有效无效总有效率%
治疗组42例29例11例2例95.2
对照组40例9例22例9例77.5
注:两组对比Δ χ2=6.02,(P
3讨论
HIE是新生儿的常见病,可导致中枢神经细胞不可逆损伤,造成不同程度的后遗症。其发病机理目前认为是脑血流减少和脑组织代谢改变[2]。当缺氧缺血为部分或慢性时,体内血液出现代偿性重新分配,以保证心脑的血液供应。但随着缺氧时间的延长,代偿机制丧失,脑血流终因心功能受损,全身血压下降而锐减引起脑损伤。葡萄糖代谢是人脑的维一能量来源,缺氧缺血时,葡萄糖无氧酵解增加,细胞内乳酸堆积和ATP生成不足,导致细胞膜上钠-钾、钙泵功能不足,钠进入细胞导致脑水肿,钙进入细胞导致脑细胞不可逆的损害,并进一步破坏细胞膜的完整性及通透性。细胞内钙超载及能量持续衰竭,产生大量的兴奋性氨基酸及氧自由基,进一部加重了脑细胞的损害。
3.1FDP是存在与人体内的细胞代谢物,能调节葡萄糖代谢中的多种酶系的活性。外源性的FDP,能通过激活磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性,使细胞内三磷酸腺苷和磷酸肌酸的浓度增加,促进钾离子内流,有益于缺氧缺血状态细胞的能量代谢和葡萄糖的利用,从而可使缺氧缺血器官减轻损伤[3]。
3.1.1保证脑血流灌注、营养心肌。HIE患儿因合并缺氧缺血性心肌损伤,表现为心率减慢,血压下降及心输出量减少,而使脑血流减少,引起缺氧缺血性脑损伤。因此在HIE的治疗早期就应注意心功能保护。临床用FDP,能从细胞分子水平改善心肌细胞代谢,增加能量,提高细胞膜泵的功能,增加心肌收缩力,使心排血量增加,动脉血压上升,以保证脑血流灌注及营养心肌。
3.1.2促进脑细胞能量代谢,增加ATP生成量。新生儿脑细胞代谢最旺盛。HIE时能量产生障碍,导致细胞正常功能不能维持,最终导致神经细胞不可逆损伤。因此改善细胞能量代谢具有重要意义。FDP是糖代谢的中间产物,提供外源性FDP,能绕过糖酵解关键限速酶磷酸果糖激酶(PFK),而直接参于无氧酵解,产生ATP。另外,(FDP)可激活丙同酸激酶以及可反馈刺激细胞内酸中毒而失活的(PFK)活性,这两种酶活性增加,使的糖酵解过程加速,ATP生成增加,以维持神经细胞能量代谢的正常水平,减少细胞损伤。因此FDP在促进脑细胞能量代谢,保护脑细胞方面有肯定作用[3]。
3.1.3改善红细胞功能。能使红细胞内2、3-二磷酸甘油酸含量增高,延长红细胞生存寿命,稳定红细胞膜并增加其韧性,有助于血红蛋白与组织之间氧的交换,从而增加缺血组织对氧的利用,使缺血的周边组织含氧量增加[3]。
3.2脑蛋白水解物为一种大脑所特有的肽能神经营养物,能以多种方式作用于中枢神经,调节和改善神经元的代谢,促进突触的形成,诱导神经元分化,并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒性的损害。脑蛋白水解物含有神经组织特异性多肽和氨基酸[4],进入人体后可通过血脑屏障进入脑组织,促进脑内蛋白质合成,影响呼吸链,具有抗氧的保护功能,改善脑内能量代谢。激活腺苷酸环化酶和催化其他激素系统,提供神经递质、肽类激素及辅酶前体等,从而有利于脑组织的修复。
参考文献
[1]中华医学会儿科学会新生儿组.新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准.中华儿科杂志,2005,43(8):97-98.
[2]杨锡强,易著文.儿科学.人民卫生出版社:123-124.
水解蛋白篇10
关键词：超声波；蓝圆；中性蛋白酶；酶解；水解度
中图分类号：Q681 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.01.005
Abstract： The protein of decapterus maruadsi was hydrolysis with neutral protease， and the effect of ultrasonic wave on enzymatic hydrolysis process was studied with taking degree of hydrolysis as criterion. Through single factor test， the effects of ultrasonic treatment time， hydrolysis time， the amount of enzyme， the material/water ratio and the temperature on the hydrolysis process were studied， and the optimum conditions of the enzymatic hydrolysis were optimized by orthogonal test. The results showed that when the time of ultrasonic treatment with ultrasonic power 500 W was 25 min， neutral protease was 8 000 U・g-1， the material/water ratio was 1∶20 （g・mL-1）， the temperature was 50 ℃， the hydrolysis time was 4 h， the degree of hydrolysis could reach 52.08%， and the scavenging rate on hydroxyl radical of enzymatic hydrolysate was 46.42%
Key words： ultrasonic wave；decapterus maruadsi；neutral protease；enzymatic hydrolysis；degree of hydrolysis
蓝圆（Decapterus maruadsi）又名池鱼、巴浪鱼，为鲈形目科圆属的一种，富含蛋白质及不饱和脂肪酸EPA和DHA，营养丰富，肉味鲜美[1]，主要分布在印度洋和太平洋；其在我国产于南海、东海及黄海，以南海、东海产量较多，为我国重要的经济鱼类之一。蓝圆生产盛期正值南方高温季节，产量多又集中，加之消费者对其食用价值认知较低，因而鲜销较少，大部分被加工成咸干品，或用于制成动物饲料（甚至直接丢弃）。蓝圆由于加工利用水平较低，其丰富的蛋白资源没有得到充分的利用，造成很大的资源浪费[2-3]，其产品附加值很低。探讨蓝圆的深加工技术和应用，提高其附加值，对于充分利用水产蛋白资源具有重要的意义。近年来，国内外有不少研究对低值鱼类的综合利用进行了探讨和报道，主要是利用蛋白酶酶解低值鱼蛋白，实现海洋低值蛋白源高值化，积累了大量的技术经验（比如对鲢鱼[4]、草鱼[5]、 鳙鱼[6]、巴菲蛤[7]等低值鱼类酶解工艺的研究）。虽然目前国内对于蓝圆生产水解蛋白有了一定的研究[8-11]，但将超声波技术应用于蛋白质酶解的研究还处于起步阶段。
本研究以韩山师范学院化学教学实验示范中心自制脱脂蓝圆鱼粉为原料，采用中性蛋白酶水解蓝圆鱼蛋白，以水解度为指标，研究超声波处理应用于中性蛋白酶水解蓝圆鱼蛋白的酶解工艺，探讨不同酶解条件对蓝圆鱼蛋白酶解效果的影响，通过设计正交试验确定中性蛋白酶水解蓝圆鱼蛋白的最佳工艺条件，并研究最佳酶解工艺下酶解液对自由基的清除作用，旨在为低值鱼的开发利用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
脱脂蓝圆鱼粉由韩山师范学院化学教学实验示范中心自制；中性蛋白酶（BR，酶活力 5万U・g-1）购自江西锐阳生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器
JFSD-100-II粉碎机（上海嘉定粮油仪器有限公司）；FA2004N电子分析天平（上海精密科W仪器有限公司）；SHP-501超级恒温槽（上海恒平科学仪器有限公司）；ZK072型电热真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）；KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；752S紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；KDN系列凯氏定氮仪（上海灿孚机电有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 蓝圆鱼肉蛋白的酶解工艺流程 称取一定量鱼粉，置于250 mL锥形瓶按比例加入蒸馏水制成鱼肉蛋白悬浮液超声波500W功率处理一定时间自然pH值，加入一定量的中性蛋白酶，按设定条件（温度和时间）进行酶解酶解结束后，持续沸水浴2 min灭酶冷却将酶解液转移进容量瓶并用蒸馏水定容静置60 min，取上清液为水解液。测定水解液氨基氮含量，重复3次其结果取平均值，以此计算水解度并评价酶解效果。
1.3.2 酶解单因素试验 （1）超声波（功率为500W，下同）处理蓝圆鱼粉制备.自然pH值、室温26 ℃条件下，加入一定量（精确到0.001 g）蓝圆鱼粉，配成料液比1∶20（w/v）的蓝圆鱼蛋白溶液，超声波处理25 min待用。
（2）超声波处理时间对酶解效果的影响。取8个250 mL锥形瓶加入制备液，编号1～8，分别用超声波500W功率处理0，10，15，20，25，30， 35，40 min；然后各按10 000 U・g-1原料的量加入中性蛋白酶，水解2 h后沸水浴5 min灭酶；冷却，离心分离，取上清液（水解液）进行测定。
（3）水解时间对酶解效果的影响。取8个250 mL锥形瓶加入（1）制备液，编号1～8，按10 000 U・g-1原料的量加入中性蛋白酶，分别水解1.0，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0 h后沸水浴5 min灭酶；冷却，离心分离，取上清液（水解液）进行测定。
（4）加酶量对酶解效果的影响。取8个250 mL锥形瓶加入（1）制备液，编号1～8，再分别按4 000，6 000，8 000，10 000，12 000，14 000 U・g-1加入中性蛋白酶，水解3.5 h后沸水浴5 min灭酶；冷却，离心分离，取上清液（水解液）进行测定。
（5）料液比对酶解效果的影响。取8个250 mL锥形瓶，编号1～8，自然pH值、室温26 ℃条件下，各加入一定量（精确到0.001 g）蓝圆鱼粉，分别配成料液比1∶8，1∶12，1∶16，1∶20，1∶24， 1∶28，1∶32，1∶40（w/v）的蓝圆鱼蛋白溶液，超声波500 W功率处理25 min；按10 000 U・g-1原料的量加入中性蛋白酶，进行水解3.5 h后，沸水浴5 min灭酶；冷却，离心分离，取上清液（水解液）进行测定。
（6）酶解温度对酶解效果的影响。取6个250 mL锥形瓶加入（1）制备液，编号1～6，按10 000 U・g-1原料的量加入中性蛋白酶，分别在30，40，50，60，70，80 ℃恒温水浴3.5 h后，沸水浴2 min灭酶；冷却，离心分离，取上清液（水解液）进行测定。
1.3.3 正交试验确定最佳酶解条件 为综合考虑各因素之间的相互影响，在单因素试验的基础上，以超声波500 W功率处理时间、料液比、加酶量、酶解温度和酶解时间为试验因子，设计L16（45）正交试验，对蓝圆鱼蛋白酶解工艺条件进行优化，蓝圆鱼蛋白水解液pH值自然，不加以调节。试验水平如表1所示。
1.4 测定项目及方法
1.4.1 蛋白质含氮量的测定 采用凯氏定氮法[13]。蛋白质是含一定量氮的有机化合物，含氮有机物与浓硫酸、催化剂、加速剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中；然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来计算样品中的总含氮量。
式中，W表示蛋白质的质量分数（%）；c表示盐酸标准溶液的浓度（mol・L-1）；V1表示空白滴定消耗标准液量（mL）；V2表示试剂滴定消耗标准液量（mL）；m表示样品质量（g）；0.014表示氮的毫摩尔质量（g・mmol-1）；F表示蛋白质系数。
1.4.2 水解液氨基氮含量测定 采用双指示剂甲醛滴定法[14]。量取酶解解液2份，分别置于三角瓶中，其中一份加中性红指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定至琥珀色为终点；另一份加百里酚酞及中性甲醛，摇匀，静置，用氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。记录2次消耗的碱液毫升数。
氨基酸态氮=（（V1-V2）×N×0.014）/W×100% （2）
式中，N表示NaOH标准溶液当量浓度；V1表示测定样品消耗NaOH标准溶液的体积（mL）；V2表示测定空白消耗NaOH标准溶液的体积（mL）；W表示样品溶液相当样品的质量（g）；0.014表示氮的毫克当量。
1.4.3 水解度的计算
水解度=水解液氨基氮含量/总氮量×100%。
1.4.4 酶解液羟自由基（・OH）清除率的测定 采用Fenton反应系统[15-16]。在510 nm 处测量被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，便能测定出被测物对・OH 的清除率。
・OH清除率= （A0-（A1-A2））/A0×100%（3）
式中，A0为空白对照液吸光度值，只加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢，不加入鱼蛋白酶解液的吸光度值；A1为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢、鱼蛋白酶解液的吸光度值；A2为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、鱼蛋白酶解液，不加过氧化氢引发反应的吸光度值。
2 结果与分析
2.1 超声波处理时间对酶解效果的影响
由图1可知，蓝圆鱼蛋白的水解度在不同时长的超声波的作用下有所差异， 0～25 min时，随着超声波处理时间的延长，鱼蛋白的水解度逐渐升高，25 min时水解度达到最大；25 min后，水解度随超声时间的延长而趋于平缓。其原因可能是由于0～25 min时，随着超声时间的延长，蛋白质的空间构象发生变化，埋藏在蛋白质内部的活性部位暴露出恚扩大了与酶接触的机会，使鱼蛋白水解度逐渐提高；而当超声波处理25 min时，蛋白质的活性部位完全暴露出来，所以即使进一步延长超声处理的时间（比如30～40 min），水解度也基本不变。因此，室温26 ℃条件下，超声波500W功率处理蓝圆鱼蛋白的最佳时间为25 min。
2.2 酶解时间对酶解效果的影响
由图2可知，蓝圆鱼蛋白水解度随着酶解时间的延长而逐渐提高，可能是由于超声波预处理使蛋白质的空间构象发生变化，并使得埋藏在蛋白质内部的活性部位暴露出来，酶解时间越长，中性蛋白酶与蛋白质的活性部位接触越充分，酶解越彻底，因此，水解度逐渐提高。虽然6 h的水解度最高，但是时间越长，蒸发水分越多，水解液颜色变深、较混浊；而水解3.5 h时颜色居中，水解度可达到49.51%。所以，选择的最佳酶解时间为3.5 h左右。
2.3 加酶量对酶解效果的影响
由图3可知，蓝圆鱼蛋白水解度随着中性蛋白酶添加量的增多而提高，但当中性蛋白酶添加量大于10 000 U・g-1时，水解度的增加曲线趋于平缓。其原因可能是随着加酶量的增大，中性蛋白酶与蛋白质的活性部位接触面增大，酶解速度增加，水解进行得较彻底，水解度逐渐提高。 因此，加酶量选择10 000 U・g-1比较合适，水解效果较佳。
2.4 料液比对酶解效果的影响
由图4可知，蓝圆鱼蛋白溶液经超声波预处理25 min后再进行酶解，在料液比为（1∶8）～（1∶20）时，随着料液比（w/v）的减小（加水量增多），蓝圆鱼蛋白水解度逐渐提高，料液比为（1∶20）～（1∶28）时，蓝圆鱼蛋白水解度随着加水量的增多而有所下降。其原因可能是由于料液比为1∶8时，加水太少，鱼粉浓度过高，蛋白溶液黏度较大，使得流动性差，不利于鱼粉与酶的充分结合；逐渐增大加水量有利于鱼粉与酶的结合，在料液比为1∶20时，加水量比较合适，鱼粉可以与酶分子充分结合；当加水量过多（如料液比为1∶24时），底物浓度过低，底物与酶结合的机会减小，酶解产生的氨基氮含量减少，水解度有所下降。因此，选择料液比为1∶20较为适宜，此时蛋白液水解效果较佳。
2.5 温度对酶解效果的影响
从图5可以看出，当温度为30～50 ℃时，蓝圆鱼蛋白水解度随着温度的升高而增大；当温度达到50 ℃时，水解度达到最大值（54.446%）；当温度超过50 ℃（60～80 ℃）时，水解度有所下降。中性蛋白酶在不同温度酶活力不一样，温度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折叠结构的展开；但当温度继续升高，超过酶的最适宜温度时，酶会逐渐失活，导致蛋白质水解度下降。
2.6 正交试验结果
由表2可知，影响蓝圆鱼蛋白水解5个试验因素的主次顺序依次为E>B>A>D>C，即酶解温度>酶解时间>超声波500功率处理时间>料液比>加酶量；由各因素水平的均值K的大小关系可知，中性蛋白酶酶解蓝圆鱼蛋白最佳工艺条件为A2B4C1D3E3，即超声波500功率处理20 min、酶解4 h、加酶量8 000 U・g-1、料液比1∶20、温度50 ℃。在最佳工艺条件下，酶解蓝圆鱼蛋白水解度为58.02%，大于正交表2的最大值57.83%。
2.7 酶解液对羟基自由基（・OH）的清除率分析
对最佳条件下所得酶解液进行抗氧化实验，对羟基自由基（・OH）清除率进行测定，结果如表3所示。
由表3可知，各吸光度（A）均值分别为：A0=3.160，A1=2.217，A2=0.524。计算可得最佳酶解工艺条件下酶解液对羟基自由基（・OH）清除率为46.424%。
3 结 论
本试验证明对于采用中性蛋白酶对蓝圆鱼蛋白进行水解以获得具有活性的酶解液，超声波处理具有一定作用，能在一定程度上提高水解度。在单因素试验基础上，以料液比、超声波500 W功率处理时间、加酶量、温度、酶解时间为试验因子，通过设计正交试验优化中性蛋白酶水解蓝圆鱼蛋白，确定其最佳酶解工艺条件为：料液比为1∶20、超声波500 W功率处理20 min、加酶量8 000 U・g-1、水解温度50 ℃、酶解4 h。在此条件下，水解度为58.02%，所得酶解液对羟基自由基有良好的清除作用，其清除率达46.42%。
参考文献：
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