关节软骨的生物力学特性十篇

关节软骨的生物力学特性篇1

关节软骨细胞的力学特性是影响关节健康和功能的重要因素。对软骨细胞力学特性的深入研究将有助于了解软骨细胞在正常和病理条件下的调节情况，进一步为软骨损伤的修复提供新的方向。

1 简介

关节软骨细胞通过生物学、力学及理化相互作用于软骨细胞外基质从而感知其力学环境。细胞外基质的成分包括胶原（主要是Ⅱ型胶原）和蛋白多糖。胶原纤维形成一个密集的交联网，提供主要的张力及剪切力。蛋白多糖含有硫酸角质素和硫酸软骨素糖胺多糖链，其富含带负电荷的羧基及硫酸基团。这些负电荷产生的互斥作用及渗透梯度导致组织内膨胀压的出现。这种膨胀压影响组织的水合及软骨细胞的局部物理环境以适应应力加载或变形。

关节软骨细胞周基质富含Ⅵ型胶原及高浓度的蛋白多糖。细胞周基质通过结合于基质蛋白的细胞表面受体与软骨细胞相互作用。软骨细胞与这层基质被多数学者命名为Chondron。关于这个独特结构单元的功能目前仍不太清楚，有学者认为Chondron可作为力学的转导器，其通过细胞周基质中Ⅵ型胶原与细胞膜表面的一些成分的相互作用将力学信号转导入细胞内从而调节软骨细胞的代谢〔1〕。

软骨细胞通过对力学信号的反应协同环境因子和遗传因素共同调控细胞的新陈代谢。生理条件下，软骨具有一定的机械反馈调节机理，可阻止因软骨内液体过度溢出而发生的变形从而保护软骨。然而，在病理条件下力学因素可以导致关节退行性变的发生和进展。为了阐明力学刺激对关节软骨及软骨细胞的作用，国内外学者尝试了从动物体内模型到组织、细胞、分子水平等的体外实验等不同的研究方法。他们认为力学环境对软骨细胞生长、分化、表型的表达、对移植物软骨的生成过程及修复组织的生物学特性有非常重要的作用〔2〕。但是，调控软骨细胞力学信号转导的力学及生化过程仍未能彻底阐明。这种调控途径的完全认识将是理解维持软骨细胞外基质的正常生理过程和导致关节疾病（如骨性关节炎）的病理过程的基础。

2 关节软骨细胞的局部变形行为

软骨细胞局部的变形行为是理解其力学特性的基础。有学者用一种特殊设计的力学加载设备对软骨的切面施加30％的压力，通过显像系统观察软骨细胞的局部变形行为。结果发现随着细胞外基质的变形软骨细胞的形状和细胞内空间发生了很大的变化。随着压力的去除，软骨细胞恢复原形。细胞外基质的胶原的排列随着压力的去除也恢复原样〔3〕。

近年来，许多学者运用共聚焦激光扫描显微镜来观察软骨细胞形态。共聚焦显微镜可以对荧光染色的细胞膜和细胞器进行三维成像。通过几何模型程序确定软骨细胞的半径、体积、表面积和形状等的变化。结果表明，关节软骨细胞的形状和体积的变化与细胞外基质的变形紧密相关〔4〕。Wong等〔5〕对软骨进行应力加载和组织学固定再进行几何检测，结果发现软骨细胞及细胞核的体积和半径在压力方向上的减少程度与关节软骨厚度的下降程度相一致，垂直于压力方向上的软骨细胞及细胞核的大小没有发生显著性的变化。

3 软骨细胞变形与软骨代谢调控

除了可观察到的软骨细胞在应力作用下发生的形状和体积的显著变化外，也有证据表明软骨细胞的变形作为一种力学信号将调控新陈代谢和基因表达。有学者发现在单层培养的软骨细胞较三维培养的软骨细胞有较强的成纤维细胞表达及三维立体培养有助于软骨细胞表型的维持〔6〕。基于这些现象，有种假设认为细胞形状的改变（如变形）是影响软骨细胞代谢的调控因素之一。

在某些局部应力加载模型中，细胞变形引起的效应可以从其他物理因素的影响中分离出来单独考虑。例如，在微小的剪切应力条件下（如圆柱体的扭转）可以将细胞外基质的非流动依赖性效应从流动依赖性效应如流体静压、渗透压、液流和电场效应中分离出来〔7〕。使用这种模型，在频率为1 Hz 15％的正弦剪切应变条件下作用48 h，软骨细胞可以提高蛋白多糖的合成率并且可以改变蛋白多糖的合成类型。

为了将细胞变形的效应从与基质变形的相关因素中区别出来，DAndrea等〔8〕通过对单个细胞进行显微操作来检测细胞内离子的变化。通过微管直接干扰细胞膜致使胞浆内Ca2+浓度快速上升，据此推测Ca2+流动是受软骨细胞膜的力学拉伸而调控的。

Buschmann等〔9〕将受压的、经放射性标记的软骨板用戊二醛固定，通过放射自显影技术显示软骨细胞及细胞核的形态变化与新合成的蛋白多糖的空间分布的关系。软骨受压导致细胞及细胞核的半径和体积的下降，同时伴有蛋白多糖的合成减少。这些研究更进一步证实关节软骨细胞形状和体积的变化在软骨细胞信号转导和细胞代谢过程中的影响。

4 软骨细胞的力学特性

近年来，大多数学者运用微管吸吮技术对正常及病态软骨细胞进行直接的力学特性的检测。这种技术是用较小的吸吮压作用于单个细胞，应用视频技术确保细胞吸入微管有一个暂时的变形。使用1根内径约3 μm的玻璃微管对单个软骨细胞施加阶段性升高的负压，细胞达到平衡时的变形行为可以得到测量。对软骨细胞利用微管吸吮技术进行黏弹性特性的检测，结果显示在一阶跃式负压的作用下软骨细胞表现出典型的黏弹性固态蠕变特性。Trickey等〔10〕利用微管吸吮技术测得正常软骨细胞的平衡杨氏模量为（0.24±0.11）kPa，瞬时杨氏模量为（0.41±0.17）kPa，表面黏性为（3.0±1.8）kPas而骨性关节炎的软骨细胞的平衡杨氏模量为（0.33±0.23）kPa，瞬时杨氏模量为（0.63±0.51）kPa，表面黏性为（5.8±6.5）kPas.显然，正常软骨细胞和骨性关节炎的软骨细胞的力学特性存在显著的差异。这些差异反映出病态软骨细胞骨架结构和组成发生的改变。

5 软骨细胞骨架对软骨细胞力学特性的影响

软骨细胞骨架（cytoskeleton CSK）的研究是当前细胞生物力学中最为活跃的领域之一。CSK不仅在维持软骨细胞黏弹性固态特性及保持细胞内部结构的有序性中起重要作用，而且与细胞运动、能量转换、信息传递、基因表达、细胞分化等重大生命活动密切相关。软骨细胞骨架主要由微丝、微管、中间纤维所组成。最近的研究表明，不论是用细胞松弛素D破坏微丝还是用丙烯酰胺破坏中间纤维都可使弹性模量和表面黏性发生显著下降，而用秋水仙碱破坏微管则细胞的力学特性没有发生明显变化〔11〕。这些结果表明，微丝和中间纤维提供了软骨细胞的主要黏弹性固态特性而微管的作用并不十分明显。Ko等〔12〕证实细胞骨架在应力传导中扮演非常重要的角色，能将应力由细胞骨架迅速传导至细胞内的各个部位。由于细胞骨架亦有进入细胞核，近年来有学者针对细胞骨架在受力后对于基因调控的影响进行研究〔13〕。

6 软骨细胞核的力学特性

伴随着细胞外基质的受压，软骨细胞核也发生显著的变形。相关研究结果表明力学刺激可以从细胞外基质通过细胞膜到达细胞核进而影响基因表达。Buschmann等〔9〕的研究发现细胞核形状的改变与基质的组分如蛋白多糖的生物合成相协调。因此，有学者认为细胞外基质的变形可以通过与细胞核的连接调控细胞的活性〔14〕。

Guilak等〔15〕利用微管吸吮技术证实软骨细胞核表现为黏弹性固态特性样的蠕变行为。软骨细胞核的瞬时及平衡弹性模量比软骨细胞高2～3倍，表面黏性接近完整软骨细胞的2倍。软骨细胞核可以通过机械或化学的方法得以分离。机械分离的软骨细胞核的瞬时模量明显较化学分离的高，据此认为化学分离法改变了软骨细胞核的力学特性。

7 软骨细胞的渗透性膨胀行为

关节软骨受压力时组织间液渗出，细胞外及细胞周的电荷密度增加，软骨细胞的渗透性环境发生了变化。共聚焦显微镜的研究显示软骨细胞体积的变化是组织受压或渗透性改变的一种反应〔16〕。已有许多研究证实渗透性应力对软骨细胞新陈代谢和离子转运方面的影响。因此，渗透性应力及其相关的细胞体积的变化对软骨细胞的生理及力学特性有显著的影响。

当软骨细胞被从细胞外基质分离后由于细胞渗透环境的改变细胞体积会明显增加约30％～40％。在去离子水中（0m0sm），软骨细胞发生膨胀直到细胞膜皱褶消失发生溶解。细胞裂解后，细胞膜的面积约是原来等渗环境下面积的2倍多。由此推测软骨细胞膜除非在细胞或细胞外基质发生较大变形情况下不能承受显著的力学应变。

渗透压对软骨细胞的黏弹性有显著的影响。在低渗环境下，软骨细胞的瞬时及平衡模量和表面黏性明显下降了约25％～50%，而在高渗环境下，软骨细胞的黏弹性没有明显的改变。低渗环境下软骨细胞黏弹性改变的原因或许是因为细胞骨架成分或细胞间蛋白的含量及结构发生了变化。例如，Pedersen等〔17〕研究显示在低渗环境下细胞骨架中的微丝会迅速发生裂解。总之，软骨细胞生存的渗透环境的变化是影响软骨细胞力学特性的因素之一。

8 细胞周基质（pericellular matrix PCM）的力学特性

软骨细胞被一层较薄的细胞周基质所包绕，目前通常将软骨细胞及这层组织统称为Chondron。以前采用多步骤机械匀化分离，所获得Chondron量较少（约1%～2％）。最近，Lee等〔18〕应用酶解法可以得到约80％的Chondron。研究发现，Chondron富含蛋白多糖，Ⅱ型、Ⅵ型、Ⅸ型胶原，其中Ⅵ型胶原为特异性胶原。

Alexopoulos等〔19〕利用微管吸吮技术结合线性双向有限元模型对正常及骨性关节炎的PCM进行研究。结果发现，正常PCM的杨氏模量〔（38.7±16.2）kPa〕较骨性关节炎的PCM〔（23.5±12.9）kPa〕高约40％，而两者的泊松比接近并没有统计学差异，据此认为在骨性关节炎时PCM发生了明显的退变。同时发现酶解分离得到的PCM的杨氏模量较完整的软骨细胞的高，但较软骨细胞外基质低约2～3个数量级，因此认为细胞周基质的特性对软骨细胞的力学特性有显著的影响。

9 软骨细胞-基质相互作用的理论模型

细胞和组织的理论模型对软骨细胞的局部应力及变形的正确认识是非常有意义的，因为他们可以提供原位不能被实验测量的生物参数信息如：应力-应变参数、理化参数、细胞附近的瞬时电位等。各种理论模型的发展都认为软骨细胞及其细胞周基质的作用决定软骨细胞的应力-应变和液流特性。目前，有许多方法包括有限元分析用来解决细胞与基质间的相互作用问题。

利用线性双向理论模型可以量化软骨细胞在压应力条件下一过性的应力-应变、液流特性。这种模型可以将软骨的各种组分作为二相性介质通过固液相之间的相互作用调控黏弹性行为。这种模型可用以预测软骨细胞和细胞基质的力学特性及其软骨细胞的形态、内在空间、细胞周围的力学环境等。研究的结果表明关节软骨细胞的力学特性存在着时间变化性和空间不一致性。研究软骨细胞变形的的理论模型与显微实验检测表现出很好的一致性，理论分析与实验研究的有机结合将为软骨细胞力学特性的研究提供新的前景。

10 总结

大量研究表明，软骨细胞的力学特性在研究细胞与基质的相互作用中以及在软骨细胞的代谢调控中起着很重要的作用。软骨细胞在正常的生理应力条件下形状和体积发生明显的变化。有种假设认为细胞变形是软骨细胞在感知应力时进行代谢调控的生理因素之一。虽然在细胞变形时细胞内的信号转导机理还不是十分清楚，但是与诸如Ca2+、IP3和cAMP等信使分子及细胞骨架、细胞核等信号途径密切相关。

软骨细胞的力学特性受到细胞、胞周基质、胞外基质的结构和特性的影响。同时受到局部渗透环境的影响。通过理论分析与实验研究的有机结合进一步发现细胞周基质在关节软骨中起着举足轻重的生物力学作用。这将为研究软骨细胞力学信号的转导及软骨各组分力学特性奠定坚实基础，也为阐明力学因素在健康和病变软骨中的作用从而指导临床进行治疗提供理论依据。可以预见，对软骨细胞力学特性的逐步阐明将进入软骨损伤治疗的新纪元。

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关节软骨的生物力学特性篇2

骨关节炎(Osteoarthritis)是一组有不同病因但有相似的生物学、形态学和临床表现的疾病。该病不仅发生关节软骨损伤，还累及整个关节，包括软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉，最终发生关节软骨退变，纤维化，断裂，溃疡及整个关节面的损害。

本病的病理过程是以应力较高部位的关节软骨接触面广泛纤维化为特点，并伴有软骨下骨的骨质象牙化和硬化，关节边缘常常出现骨赘形成和骨的改建活动，关节滑膜囊的纤维化，与常见的滑膜非特异性炎症[1]。但是骨关节炎的致病机理仍然是一个充满争议和需要继续探索的课题，为了澄清骨关节炎发病和病程进展过程中，在关节组织中细胞分子水平的变化，这就需要使用实验动物模型观察。通过动物实验可以确定软骨基质的降解方式以及滑膜、软骨中的生物合成作用是如何被抑制的，同时还可以用来评价潜在的拮抗药物，为发现新的抗骨关节炎药物奠定基础。现就常用的骨关节炎实验动物模型的制备方法，应用优缺点和意义讨论如下。

1 关节腔内注射化合物诱导骨关节炎

多种化合物以关节内注射方式注入动物关节以后，可以出现许多类似于骨关节炎的病理改变。木瓜蛋白酶引起实验动物骨关节炎的机制可能在于其对软骨基质中蛋白多糖的分解作用，并能除去软骨细胞膜上有丝分裂抑制因子[2]。向C57Bl10小鼠关节内注射细菌源性胶原酶诱导骨关节炎的实验研究证实，在关节不稳定的程度与软骨损伤的严重程度（数量）和形成骨赘的大小之间，存在着显著的相关性[3]。关节内注射IL-1模型已经成功的用于确定某些蛋白酶抑制剂，但是否有抗骨关节炎药物的潜力有待研究。

2 骨关节炎制动造模方法

保证关节的正常活动和负重才能维持关节软骨的构成成分、结构和功能。固定肢体使关节制动可以诱发关节软骨萎缩，致使软骨变薄、水肿，蛋白聚糖含量下降，结构改变以及合成数量的下降，同时还有胶原合成及含量的增加。因为这些软骨改变与我们所见的人类骨关节炎病理改变相似，所以这种模型特别用于软骨退变过程的研究。但在着重软骨基本形态学的研究差别上，这一模型的使用逐渐减少。骨关节炎的软骨中，软骨细胞灶性增殖呈细胞团或细胞巢，通常活跃至骨关节炎的后期，而与此对比的固定关节的观察发现，软骨细胞没有这种变化，不形成灶性细胞团却常出现坏死，特别是在夹板固定牢靠无任何活动的时候。软骨的这种改变可能是软骨细胞缺乏营养造成的，因为制动肢体缺乏运动和负重。而且，如果允许制动的肢体小范围活动，那么软骨退变的范围将明显减少。

3 自发性骨关节炎模型

许多种类的动物可以自发形成骨关节炎，如拉布拉多犬，德国牧羊犬和比格犬，可随年龄增加发生骨关节炎，但在此模型中，早期的病理形态变化特征和人的骨关节炎相比，出现了更为严重的滑膜炎和关节囊的纤维化。许多品系的小鼠都可以出现自发性骨关节炎，较常用的有：斑点杂交鼠，STR/ORT，C57Bl品系小鼠。该模型骨关节炎病程的典型特征包括：关节间隙变窄，骨赘形成，局部软骨损伤，染色显示的蛋白聚糖减少。恒河猴和食蟹猴都有较高的自发性骨关节炎的发病率，其流行病学和病理学改变与人相似，其关节的大小可以满足放射学、组织学和生物化学的研究，另外对实验研究广泛使用的平行对照而言，这种动物也容易找到与实验组年龄相匹配非骨关节炎的对照。但缺点是此动物活动范围大又有较长的生命跨度，研究可能要持续许多年，还可能受到无法控制的环境因素以及伦理和资金条件的限制。

4 前交叉韧带横断模型（ALCT模型）

Stoop等[4]切断Wistar大鼠的膝关节前交叉韧带，于第2、3、14、28、70天处死动物，取膝关节软骨常规组织学及免疫组化检测变性的Ⅱ型胶原，在前交叉韧带切断后软骨损害最早改变发生于表层带的软骨细胞和软骨基质。术后14天出现表层带软骨细胞数量减少，剩余的软骨细胞肿胀，表层带纤维化。术后4周、10周，上述改变更明显。在纤维化的区域，变性的Ⅱ型胶原降解产物染色明显增加，胶原酶分裂位点染色与变性胶原分布相同，但染色明显较淡；在胶原发生纤维化前及没有出现纤维化的部位不能检测到胶原的损害。Myers证实在开放手术中使用电烧止血和关节内冲洗与不使用止血方式的手术相比，滑膜炎的发生率由原来的69％下降到24％。但开放性横断前交叉韧带后会造成早期软骨增生，并在4~5年后形成骨关节炎，以及包括软骨全层侵蚀及关节内的多种改变[8]。

近年采用较多的建立OA模型的方法是ACLT手术法，ACLT模型手术简单创伤小，稳定性好，对动物生理结构改变较少，能全面反映OA软骨退行性变化的病理过程，但该法造模时间长，一般需6周以上才能造模成功[5]。

常用的Hulth造模法，切除兔膝关节前后交叉韧带及内侧副韧带，切除内侧半月板，破坏家兔膝关节正常的力学轴线，由正常的外翻10度变为内翻，关节最大压力由正常的外侧胫骨平台转移到内侧胫骨平台与股骨内髁关节承担，关节的负重面减少，局部关节软骨所承受的压应力相对增加，韧带的破坏加重关节的不稳定，从而形成了关节软骨变形的起始环节。

5 骨关节炎负重模型

家兔全身麻醉后，在右后腿膝关节内侧作切口至关节腔，推开髌骨、髌韧带，屈曲膝关节，暴露前交叉韧带并切断，以前抽屉实验确认断裂后，逐层缝合，3天后以石膏将左腿固定于腹部，右腿负重，每日跑步训练2小时，术后1周伤口络合碘护理，分笼饲养，每兔一笼。

负重模型能明显缩短OA发生发展的时间。提示负重增加OA关节液中细胞因子的产生，在同样造模时间内，较ACLT模型组造成OA病变更为严重[6]。

6 动物半月板切除骨关节炎模型

半月板是膝关节的缓冲装置，是位于股骨和胫骨的髁部之间的半月形纤维软骨盘。半月板的作用在于承重，并使压力分布均匀；增加关节稳定性；作用并且通过滑液的表面扩散，有助于关节软骨的营养；并且具有保护关节软骨的作用。Lozoya等[7]切除Wistar大鼠膝半月板的30％~50％，致膝关节不稳，关节载荷传导紊乱，所有大鼠均出现关节软骨退行性变，软骨表面粗糙、侵蚀、纤维化，甚至完全缺失。Colombo及同事切除兔外侧半月板的同时还切除外侧副韧带及籽骨，此方法造成的家兔骨关节炎的病变一致性好，并在后来的研究中被广泛用来评估众多抗骨关节炎药物在软骨病变进程中的药效作用。

7 其他的动物骨关节炎模型

因为人的骨关节炎的发病率与职业相关（如一些要求重复机械性活动的工作），可以对动物关节再现与应力相关的病理变化实验，强制家兔跑踏轮锻炼5天结果显示，软骨中蛋白聚糖的合成和含量均发生了改变；支撑重力的变化也能诱导关节软骨的病变，反复纵向冲击家兔关节炎[8]和横向施加应力的犬关节炎均得到证实。一些手术方法使关节不再负重，如狗的胫骨截骨术，前爪切除术等，这些模型证实了负重对软骨完整的重要性。

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关节软骨的生物力学特性篇3

【摘要】 ［目的］探讨骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)生物材料在关节软骨缺损修复过程中的作用，为内源性修复关节软骨缺损提供实验基础。［方法］取24只14龄成年大白兔随机分成4组，每只动物于双侧膝关节股骨膑股关节面制备直径5mm全层关节软骨缺损模型。钻通骨髓腔。A组应用BMP/ bFGF生物活性材料，B组应用BMP生物活性材料，C组应用bFGF生物活性材料，D组单纯应用生物蛋白胶材料。于8、12、24周在大体，光镜及电镜下观察损伤修复效果，组织学评分。 ［结果］A组于8、12周时，软骨缺损被白色半透明坚硬组织平滑修复，富有光泽，24周时修复组织正常软骨边界模糊，连接紧密，质地坚硬，表面平滑光润。B、C组于8、12、24周时候均未见软骨缺损完全修复，边界清楚，中央凹陷明显残留。D组全程均未见软骨修复。组织学平分A组明显优于B、C、D组，而B、C组之间无差别。［结论］BMP/bFGF生物活性材料可以有效修复兔大面积关节软骨损伤，疗效明显优于单独应用骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子，为关节软骨损伤治疗提供新的治疗方法。

【关键词】 骨形态发生蛋白； 碱性成纤维细胞生长因子； 软骨缺损； 生物蛋白

Abstract：［Objective］To study the repair of articular cartilage defects with combined bone morphogenetic protein(BMP)/basic fibroblast growth factor (bFGF) biomaterial in order to supply experimental basis for repairing cartilage defects biologically.［Method］Twentyfour 14weekold rabbits were randomly pided into four groups，BMP/bFGF biomaterial gel(group A)， BMP biomaterial gel (group B)， bFGF biomaterial gel(group C) and simple fibrin glue treated group (group D).A couple of knees of each rabbit experienced 5 mmdiameterfull cartilage resection and drilling throuth of bone marrow.Gross appearance，histologicol section and electron microscope were axamined at 8，12，24 weeks after operation.［Result］In group A the cartilage defects were smoothly repaired by white translucent hard tissue at 8 and 12 weeks，and defect boundary was hard to be indentified with normal cartilage at 24 weks. No smooth repairing was observered in B，C and D groups. Group A got a better histological score than B，C and group D(P0.05).［Conclusion］Combined BMP/bFGF biomaterial is good for repair of articular cartilage defects and has better result than using BMP or bFGF alone.These results may provide a therapy for articular cartilage defects.

Key words：bone morphogenetic protein; fibroblast growth factor; basic defects of cartilage; fibrin glue

关节软骨缺损是临床常见疾病，病人会出现关节疼痛及运动障碍，最终引起骨性关节炎。 关节软骨缺损的修复是骨科研究的热点。目前常用的是外源性修复方法，如钻孔术、骨膜和软骨膜移植、细胞移植、骨软骨移植等，尽管软骨细胞移植在理论上更为有利，但依照国内外实际情况，自体软骨细胞回植的治疗方法在取材，培养，防止污染和经费方面都有困难，而且疗效也并不完美［1］。随着分子生物学研究的进展，发现软骨缺损的修复过程是一个多种因子参与的复杂过程。所以本研究基于临床实际情况，利用有效生物活性材料，为内源性软骨修复提供实验参考。

1 实验方法

1.1 实验材料

14周龄哈尔滨大白兔24只，哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供；医用生物蛋白胶， 广州倍绣生物技术有限公司；重组人碱性成纤维细胞生长因子，美国invitrogen生物有限公司； 牛天然骨形态发生蛋白，天津中津生物发展有限公司；戊巴比妥钠， 上海化学试剂厂。

1.2 BMP和bFGF生物蛋白胶复合材料的制备［2］

溶解60 mg/ml纤维蛋白原(50 000 u/ml和500 mg/ml)1 ml，准备凝血酶原溶液(500 u/ml)1 ml。改进共推注射器，控制其微量出液。纤维蛋白原和凝血酶原组通过“Y”形针头混合后立即成为固体状态。

30 mg骨形态发生蛋白溶于2 mL 4 mol/L盐酸胍、10.05 mol/L氯化钙溶液中，兑水透析24 h，备用。如果需要保存，将稀释液在-20°C条件下贮存。

先用0.1%胎牛血清蛋白1 ml溶解0.1 mg碱性成纤维细胞生长因子（防止碱性成纤维细胞生长因子粘附于安瓶内），将稀释液溶解于1 ml Tris液备用。如果需要保存，将稀释液在-20°C条件下贮存。

1.3 模型制备

1.3.1 动物分组

A组6只，利用BMP/bFGF生物活性材料治疗（n=12）；B组6只，BMP生物活性材料治疗；C组6只，bFGF生物活性材料治疗（n=12）；D组6只，生物活性材料治疗（n=12）。

1.3.2 动物建摸

全麻（2%戊巴比妥钠1.2 mL/kg耳缘静脉麻醉），双膝关节常规备皮、消毒，铺巾。取膝关节内侧小切口，向上向下少许锐性分离，屈曲膝关节将髌骨脱位于外侧，暴露股骨滑车关节面，制造直径5 mm、深3 mm的圆形全层软骨缺损。同时钻通骨髓腔。充分止血，利用共推针头注入各组活性材料，填满缺损。细致休整表面。冲洗，逐层缝合。对侧操作同上。术后置于标准动物实验笼中，每日活动，加强锻炼。术后8 、12 、24周每组空气处死2只动物，观察大体、光镜、电镜指标。

1.4 观察指标

1.4.1 一般观察

术后步态，膝关节活动范围，切口情况，动物大体状态和进食情况。

1.4.2 关节修复的大体观察

表面平整与否，色泽，质地，与临近软骨结合情况。

1.4.3 光镜观察 　 10℅甲醛固定，0.1 mol/L EDTA脱钙，梯度逐级脱水，缺损区纵形剖开石蜡包埋，4 μm超薄切片。HE、PAS染色，观察组织形态和蛋白多糖沉积情况。

1.4.4 扫描电镜观察

标本取材后纵行剖开，磷酸盐缓冲液漂洗，戊二醛溶液固定，置入锇酸2 h，洗净，逐级脱水，临界点干燥，喷金后电镜观察。

1.4.5 组织学评分 　 根据Wakitani等制定的评分标准，采用双盲法对各标本进行组织学评价。

2 结 果

2.1 BMP/bFGF生物蛋白胶的制备

在20℃左右的室温条件下，bFGF及 BMP溶液可以很好的溶解于纤维蛋白原中成为透明液体，与凝血酶混合后，于5 s内迅速凝结，成为固态胶体。材料白色半透明，富于光泽，质地松软而脆弱，充填于软骨缺损部可以很好的适应软骨的曲线，并可将修饰得非常平滑。注射过程应该均匀而快速，注于缺损部后待凝胶成型后，注意休整表面与正常关节面一致。

2.2 大体形态和一般状况

所有动物均无膝关节感染和积液发生。A组1只，B组2只，C组2只动物跛行（4周左右），关节活动受限。余所有动物均未见跛行，其膝关节活动范围较术前无明显改变，表现活跃，食欲佳。大体观察，A组：软骨缺损区均为修复组织所充填，表面光滑，半透明状而有光泽。术后8周修复组织成白色，质地坚韧，与周围组织结合紧密，但可清楚的显示界限，表面平滑与关节面曲线配合完善；术后12周修复组织仍成白色坚韧组织，与周围组织融为一体，边界趋与模糊，表面更趋平整；术后24周修复组织成为白色半透明软骨样组织，与周围软骨结合为一体，表面稍微凹陷，关节表面平滑，坚硬。B组，C组：术后8、12、24周均未出现完整平滑关节面修复现象，表面凹凸不平，只是在缺损边缘有部分修复组织出现，中央缺损长期存在，被暗红色疏松结缔组织充填，修复组织与正常软骨界限清楚。D组也完全没有出现修复现象出现 。

2.3 组织学观察

A组：术后8周，HE染色见缺损已经被明显修复，大量软骨细胞出现，圆形和椭形胞核清晰，有软骨陷凹出现，修复组织与关节缺损边缘软骨结合紧密，PAS染色见基质出现蓝染，糖胺多糖类物质开始大量沉积；术后12周，修复组织厚于正常软骨，修复组织与其结合紧密，以类透明软骨细胞为主，大量增殖，软骨陷窝大量出现，表层软骨细胞稀疏体积小，而底层细胞量多且较为巨大，呈现分层分布的特点，基质PAS染色见明显蓝染，糖胺多糖类物质沉积更为明显；术后24周，软骨厚度稍变薄，软骨陷窝明显，修复组织与正常软骨界限模糊，结合紧密，蛋白多糖类物质明显沉积，部分区域出现纤维软骨特点。B组、C组：术后缺损未被有效修复，中央凹陷表面长期残留，缺损内部被大量肉芽组织填充，边壁出现骨板，基质染色见少数靠近骨板的局部出现软骨基质沉积。D组：8、12、24周术后软骨缺损长期存在，缺损处被大量肉芽组织所填充。质地松软，与周围无明显连接，HE染色未见软骨细胞出现，PAS染色未见糖胺多糖类物质沉积。

2.4 电镜下观察

A组术后8、12周电镜下表层可见纵行排列的软骨细胞、软骨囊，软骨细胞之间可见间隙及成熟的软骨基质，部分软骨钙化；术后24周组:电镜下软骨基质胶原排列规则，软骨厚度均匀，软骨下方为排列规则的骨髓腔（图1～11）。

2.5 组织学评分

双盲法测定，结果显示，A组（1.92±0.69）明显优于B组（3.58±0.67），C组(3.33±0.89)及D组(12.45±1.05)。SPSS13.0软件进行方差分析，A组和B 、C 、D 3组均存在显著性差异(P

图1 BMP/bFGF生物活性材料组术后8周大体观察 图2 BMP/bFGF生物活性材料组术后12周大体观察 图3 BMP/bFGF生物活性材料组术后24周大体观察 图4 BMP/bFGF生活活性材料组术后8周（HE染色×40） 图5 BMP/bFGF生活活性材料组术后12周（HE染色×40） 图6 BMP/bFGF生活活性材料组术后24周（HE染色×40） 图7 BMP/bFGF生活活性材料组术后8周（PAS×40） 图8 BMP/bFGF生活活性材料组术后12周（PAS×40） 图9 BMP/bFGF生活活性材料组术后24周（PAS×40） 图10 BMP/bFGF生活活性材料组术后24周电镜水平扫描×1000 图11 BMP/bFGF生活活性材料组术后24周电镜纵向扫描×1000

3 讨 论

创伤、骨关节病等多种疾病均可造成关节软骨缺损。由于关节软骨不能自身修复，如何修复关节软骨缺损是骨科的研究热点之一。许多学者应用软骨生长板移植、软骨膜移植、骨膜移植及软骨细胞移植等多种外源性修复方法进行实验及临床研究。肌腱和筋膜瓣插入关节成形术主要应用于上肢关节，特别对于改善拇指功能有较好效果。1992年赵距才等报道动物实验术后3个月，移植的筋膜退变，成形的关节严重退变。Knight认为成形术只能提供一个无痛或微痛的有一定活动度的关节，不适于需要一个稳定、牢固、灵活关节的病人。自体骨软骨移植治疗关节软骨缺损的远、近期效果较好，但自体移植取材有限；同种异体移植远期有退变、易感染、易被吸收等问题。骨膜和软骨膜移植也是一种较好的修复关节软骨缺损的方法。骨膜生发层中的未分化间充质细胞可分化为骨细胞或软骨细胞，在关节腔内无血液供应低氧环境中分化为软骨细胞。但再生软骨有退变可能，持续被动运动(CPM)有利于骨膜再生软骨，并降低退变率。软骨膜再生软骨能力强，但来源少，再生软骨较正常软骨耐压能力差，并随时间延长逐退变。组织工程方法培养软骨细胞移植适合修复各种形状的软骨缺损，具有一定优势，但其缺点是自体有活性的软骨收集困难，同种异体细胞又有传播病毒的危险。

随着细胞因子研究的深入，发现多种细胞因子通过自分泌和旁分泌2种方式调节骨和软骨的生成， 其中主要有骨形态发生蛋白(BMP)、bFGF、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素生长因子(IGF)、血小板衍生因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)等。这些因子的发现使内源性修复关节软骨缺损成为可能。

BMP具有诱导未分化间充质细胞分化形成软骨和新生骨的生物学作用，在体外能诱导骨髓腔内骨髓源性干细胞，关节腔内的脂肪组织、髌韧带组织和滑膜组织的细胞分化为软骨细胞［3］。BMP能诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化形成软骨和骨，但BMP仅是骨生成的启动因子，对已分化的成骨细胞、骨细胞及软骨细胞无进一步促进其增殖作用。而软骨细胞形成后的进一步生长、增殖、分化是由其它骨生长因子调节的。bFGF广泛存在于人体组织中，对骨和软骨的修复起重要的作用，特别它是一种毛细血管增殖刺激剂，促进毛细血管向骨移植物中长入，使软骨生成早期的组织中软骨岛数量增多。所以它增加BMP成骨量的原理可能促进了需要血供的软骨内化骨，加速了软骨的成熟和骨化。因而BMP启动骨形成过程后，为bFGF提供了大量靶细胞。另一方面，bFGF无异位诱导成骨活性，BMP的异位骨诱导作用又可弥补bFGF的不足，从而使BMP和bFGF在生物学功能上形成互补，进而加速骨诱导、软骨形成过程。尽管BMP和bFGF的作用有着显著的差别，但它们在骨诱导、软骨形成中的调节是必不可少的。二者在不同水平和不同环节上参与对骨诱导、软骨形成过程的调节。在适宜的剂量下，二者存在着明显的协同作用［4］。医用生物蛋白胶具有良好生物相容性，可以完全被降解。由于其特有的三维网架结构营养物质的扩散，所以是关节内软骨修复的良好载体。有人用生物蛋白胶作为IGF-1的控制载体，用于治疗马的关节软骨损伤，取得良好的效果［5］。

本实验发展了这种天然材料，采用BMP/bFGF生物蛋白胶联合应用修复关节软骨缺损。结果表明，其关节软骨缺损修复效果明显优于单独应用其中一种因子，可见12例膝关节软骨缺损均愈合良好，关节面光滑、完整、无裂隙、富有弹性，与周围软骨界限不清，缺损区内软骨细胞丰富，排列趋于正常，软骨下骨进一步改建，软骨厚度基本达到正常。基质PAS染色见明显蓝染，糖胺多糖类物质沉积更为明显。而单独采用BMP/生物蛋白胶或bFGF/生物蛋白胶修复关节软骨缺损，由于功能较单一，可能在体内被降解后才可以被利用，较低的生物利用度限制了BMP及bFGF应用疗效的发挥。所以，软骨缺损均未愈合良好，关节面凹凸不平、表面不完整、裂隙清楚、基质PAS染色蓝染较淡，糖胺多糖类物质沉积不明显［6］。

综上所述，认为:（1)BMP及bFGF具有诱导形成软骨的活性，能促进关节内透明软骨再生，但能力较弱，无诱导关节软骨形成作用；（2)BMP/bFGF生物复合物能促进关节软骨形成，较单独应用BMP、bFGF效果好，是生物学修复关节软骨缺损的良好方法。

参考文献

［1］ 何 川，杨庆铭.骨髓源性间充质干细胞的基本概念和在骨科的相关应用研究［J］.中国矫形外科杂志，2005，5：389-392．

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［3］ 胡益华，林月秋 ，阮 默. rhBMP-2临床应用研究新进展［J］.西南国防医药，2007，5: 663-665.

［4］ 李 毅，陈槐卿 ，成 敏，等. 骨髓基质干细胞BMP-2和bFGF基因的联合修饰［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006，2:133-136.

关节软骨的生物力学特性篇4

1HA在骨关节炎(osteoarthritis，OA)治疗中的应用

OA是一种由于关节软骨退行性病变引起的中老年常见疾病，症状包括关节疼痛、功能障碍、关节畸形等。OA的关节宏观改变包括关节软骨的破坏、骨赘形成和骨-软骨接头的损伤。采用黏度补充疗法，即关节腔内注射HA能够提高关节滑液的黏弹性，部分恢复其性和减震性质，还能显著降低关节结构的恶化速度［1］。在OA的退化进程中，HA可通过抑制软骨基质蛋白聚糖聚集物的降解与增强蛋白聚糖及软骨细胞胞外基质的合成，发挥关节保护和抗炎效果［2-3］。HA能够降低炎症关节的伤害感知活性［4］，减轻关节疼痛［5］，并通过减少活性氧自由基、炎症介质和基质降解酶来保护软骨［2］。

关节腔内注射HA已广泛用于膝OA的治疗。凌沛学等［6］报道了国内近60家医疗单位对HA疗效的临床评价，肯定了HA在膝OA治疗中的有效性。临床多为每周给药1次，3～7周为1疗程。评价指标为严重度指数、关节疼痛、关节伸展度、晨僵、关节积液以及止痛药的摄入量等。患者注射2～3次后，症状获得明显改善。对关节疼痛的缓解最为明显和迅速，其次是关节活动度的改善。疗效与患者的严重度和病程具有相关性，对严重度较高的患者疗效较差。多数临床结果表明，HA具有较好的耐受性，未见明显的不良反应。少数资料报道的不良反应多局限于注射部位，如疼痛或肿胀，极个别的患者出现头痛和发烧等症状。不良反应常发生于注射后1～3d内，患者一般能够耐受，不需处理，2～3d内可自行消失［3］。

HA在髋、肩、踝和手OA中的应用也呈上升趋势。重度髋OA患者1周1次，连续3周接受HA治疗后，其疼痛和残疾评分显著降低，效果可维持至治疗后6个月［7］。HA在踝OA中的应用相对较少。Migliore等［8］对多种HA产品在踝OA中的应用进行了总结。临床试验结果显示，HA应用于踝OA的治疗是安全、有效的。肩、手部位的OA应用黏度补充疗法也能有效地缓解疼痛、改善关节功能［9-10］。

非交联HA在关节中消除较快，半衰期为20h左右［11］，因此临床使用1疗程需要持续3～5周，1周注射1次。交联HA关节腔注射剂在保留了HA良好的生物相容性的同时，延长了外源性HA在关节内的留滞时间，减少了1个疗程所需要的注射次数，为治疗OA的长效制剂［12］。已有多种交联HA产品用于OA治疗。对瑞典Q-Med生产的交联HA水凝胶Durolane的研究发现，大鼠膝关节单次关节内注射Duro-lane56d后仍具有镇痛作用［13］。Durolane在关节腔的半衰期可长达4周，单次注射即可达到HA注射液3～5次注射的疗效［14］。Krocker等［15］对50名OA患者单次注射Durolane，以视觉模拟法(VAS)和欧洲生活质量评分(EQ-5D)等指标对患病膝关节功能、疼痛度、生活质量几个方面进行评测。结果表明:注射2周后，关节功能及生活质量明显好转，在随后的22周内，所有受试者各项参数，包括生活质量、膝关节活动度、疼痛评分等明显改善。HylanG-F20是一种已在多个国家上市的交联HA产品。Chevalier等［16］报道一项安慰剂对照临床试验中，253例初期膝OA患者单次关节腔内注射HylanG-F206mL后，患者疼痛得到有效缓解，效果维持至给药后26周，且安全性与安慰剂相近。多项临床研究结果表明，HylanG-F20对疼痛的缓解作用与皮质激素类相近，虽起效较慢但作用时间大大延长，且其不良反应发生率显著低于皮质激素类。长期服用非甾体抗炎药(NSAID)的膝和髋OA患者经HylanG-F20治疗后，NSAID的服用量大幅降低［17］。

但目前各种评价关节内注射HA(包括交联HA)治疗OA的有效性的临床研究结果仍存在着矛盾性［18-20］。这种差异可能与研究方案的设计、临床终点的设置、评价方法、意向-治疗分析的缺失、患者人群和所使用的药物有关。需采用患者数量更多、随访时间更长的随机对照试验来进一步客观、全面地评价黏度补充疗法对OA的作用，确定最能够从该疗法中获益的患者人群［21］。

2HA在软骨和骨组织工程中的应用

2.1在软骨组织工程中的应用组织工程是一种治疗关节软骨损伤的新兴技术，该项技术在软骨组织的修复中已取得了良好的早期结果。种植特定细胞源和生物活性分子的支架是该技术的关键［22］。HA作为一种生物材料，具有生物相容性、无毒性、非免疫原性和非致炎性，这些性质使其适合用作软骨组织工程的细胞载体［23-24］。天然HA水溶性极强，且缺乏支架所必需的力学性能，现有的研究多采用HA(及其衍生物)与其他材料制备复合组织工程支架。近年来，以HA为基础的软骨组织工程支架的研究取得了长足进展。

目前软骨组织工程支架的种子细胞多采用软骨细胞。软骨细胞在单层培养系统中容易失去其表型特征，而在三维构造中会维持其原始特征［25］。将HA加入接种了关节软骨细胞的胶原支架中，能够改善三维环境，改善软骨细胞的生长、功能和基质的沉积［26］。将人关节软骨细胞在HA的苄基衍生物HYAFF-11上培养3周，与培养在塑料上的软骨细胞相比，Ⅱ型胶原、转录因子Sox9和聚蛋白多糖显著增多，Ⅰ型胶原和基质金属蛋白酶(MMP)的表达下降［27］。来源于牛［28］、兔［29］、大鼠［30］和猪［31］软骨的软骨细胞包封在以HA为基础制备的支架后，发生软骨细胞再分化，蛋白聚糖合成增强，Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白的表达提高。以上研究表明了HA在促进软骨基质合成、维持软骨细胞表型方面的有效性。

水凝胶能够更好地模拟细胞外基质的水合环境，因而成为软骨组织工程支架的一种重要形式，近年来发展的基于HA的支架大多采用这种形式。Pereira等［32］开发了一种新型可注射角叉菜胶/纤维蛋白/HA复合水凝胶。体外细胞培养研究显示，种植的人关节软骨细胞能够增殖并形成软骨特定细胞外基质。将种植了人软骨细胞的可注射水凝胶填充于实验形成的牛软骨块缺损，形成器官复合体。裸鼠皮下植入该器官复合体6周后，观察到牛关节软骨的再生。Tan等［33］通过琥珀酰-壳聚糖和醛化HA的原位交联获得了一种注射型复合水凝胶。包封于其中的牛软骨细胞24h后仍保持高活力和正常形态。Jin等［34］模拟软骨细胞胞外基质中蛋白聚糖的结构，合成了一种酪胺偶合葡聚糖-HA多糖杂化物，经酶催化交联后形成一种仿生水凝胶。研究显示，这种仿生水凝胶具有良好的生物相容性，并可为软骨细胞的增殖、分化及基质沉积提供支持性的微环境，适合用作注射型软骨组织工程支架。总之，以上研究显示基于HA的支架适合用作软骨再生中软骨细胞的传递工具。

骨髓多能间充质干细胞(bone marrow multipotentme senchymalstem cell，BMMSC)是软骨组织工程的另一种常用的种子细胞。与软骨细胞相比，MSC体外易扩增，并且不会丢失分化能力。近年来，已采用多种生物材料来构建三维支架，形成适宜的微环境，控制干细胞的行为和分化，促进和诱导软骨组织形成。这其中包括相当数量的以HA及其衍生物为基础的支架。MSC的增生和分化中表达HA受体CD44［35］，以HA为基础的支架可能通过与CD44的相互作用影响干细胞的分化。Chung等［36］采用甲基丙烯酸酯化HA水凝胶对MSC在HA微环境中的软骨形成情况进行了研究，并与相对惰性的聚乙二醇水凝胶进行了对比。结果显示，HA水凝胶中Ⅱ型胶原的表达为聚乙二醇水凝胶中的43倍，提示HA对MSC的软骨定向分化有显著促进作用。

Pasquinelli等［37］检查了HA苄基衍生物(HYAFF-11)对种植的大鼠MSC的活力及增生的影响，实验中未进行化学诱导。种植24h后，约96%的细胞黏附于HYAFF-11表面，覆盖了整个支架表面的约12%。其后，细胞对支架的黏附稳步提高，21d后覆盖了支架表面的约40%。培养3d后即观察到MSC迁移至支架内部，7d后MSC即均匀地分布于支架内。培养21d后，发现细胞外周出现少量胶原纤维和粒丝状蛋白聚糖及丝状基质结构。种植于HYAFF-11的MSC的高活力、高黏附率及两者之间的良性相互作用说明该支架具有应用于软骨修复的潜能。一种将HA的生物学特征和丝素蛋白的优良机械性质相结合的HA-丝素蛋白复合支架与简单的丝素蛋白支架相比，能够使得BMMSC进行更有效的分化和组织形成［38］。将BMMSC种植于HA/明胶复合支架，然后植入家兔模型的内侧半月板缺损，12周后经检查发现BMMSC发生软骨分化，且植入的支架与宿主组织相结合［39］。

2.2在骨组织工程中的应用

近年来的研究表明，以HA为基础的支架(多采用水凝胶形式)适合用作种子细胞和诱导骨形成的活性分子的载体，应用于骨组织工程。Kim等［40］制备了一系列以HA丙烯酸酯为基础的水凝胶。将以硫代聚乙二醇为交联剂制备的水凝胶与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-2和MSC共同孵育，得到复合支架。该支架植入颅骨损伤部位后，能够促进骨钙素表达和成熟骨及血管的形成，提示这种水凝胶适合用作组织工程中的细胞和生长因子的载体。又将HA丙烯酸酯与对MMP敏感的肽(GCRDGPQGI-WGQDRCG)相连接，制得对MMP敏感的水凝胶。这种水凝胶与BMP-2形成的复合支架能够促进颅盖骨缺损的重建和再生［41］。Antunes等［42］在聚乳酸三维多孔支架表面覆盖戊二醛交联的HA来增加支架表面的粗糙程度，交联HA的引入未增加支架的细胞毒性，两者形成的复合支架更有利于骨组织工程应用。Chen等［43］对一种热可逆性可注射聚合物水凝胶(HA-CPN)在骨组织工程中的应用进行了研究。这种水凝胶是通过将HA和末端为羧基的聚异丙基丙烯酰胺接枝于壳聚糖骨架获得。将犬MSC种植于该凝胶，形成细胞-支架复合物(MSC/HA-CPN)。体外对MSC/HA-CPN进行7d的成骨诱导，其碱性磷酸酶活性和钙含量明显提高，提示该支架适用于骨形成和骨组织再生，是一种理想的三维细胞载体。

3以HA为基础的凝胶用在BMP的载体中的应用

BMP具有诱导成骨的作用，可以用来促进骨折愈合、修复骨缺损等，其中以重组人BMP-2在骨科应用最为广泛。BMP植入体内后，很快被扩散稀释或酶解吸收，难以在新骨形成的全过程中充分发挥其诱导成骨作用，因此需要有合适的载体，在成骨过程中发挥支架作用的同时使BMP得到缓慢释放［44］。研究表明，以HA为基础的凝胶适合用作BMP-2的载体，实现BMP-2的控制释放，在体内获得持续的诱导骨形成作用。

Bergman等［45］采用双筒注射器将HA醛衍生物及聚乙烯醇酰肼衍生物与BMP-2的混合液注射入大鼠股四头肌，通过原位交联形成水凝胶。4周后观察到凝胶植入部位有异位骨形成，其体积与植入的凝胶体积相当，骨矿物质密度接近于股骨。研究结果表明，这种可注射水凝胶可采取最小侵袭性方法，作为运送BMP-2的无细胞支架，应用于骨组织形成。Martínez-Sanz等［46］制备了HA的醛衍生物和酰肼衍生物，交联后获得无细胞毒性的凝胶。体外试验显示，这种水凝胶能实现活性BMP-2的控制释放。将携带BMP-2的水凝胶注射入大鼠颅盖，8周后观察到骨组织形成。组织学检查显示，新形成的骨高表达骨钙素和骨桥蛋白，提示该凝胶可作为BMP-2的载体，促进骨量扩增。

4HA在制备骨组织替代物中的应用

由于机械强度较弱，HA单一成分不适合作为骨组织的替代物，往往需要与其他成分混合制备骨替代物。Pek等［47］采用纳米晶体羟基磷灰石和交联的HA-酪胺轭合物制备了一种骨水泥，与传统骨水泥相比具有极低的热释放量，能够避免对周围组织的损伤，并成功修复了小鼠小型骨及关节缺损。

5HA在椎间盘再生(intervertebral disc，IVD)中的应用

潜能IVD是一种无血管、无神经结构，由外部纤维环、内部胶状髓核和邻近的软骨终板构成。与软骨组织类似，IVD损伤的自愈能力较弱。IVD的退行性改变能够进一步影响其他脊柱结构，并最终导致大范围的结构异常和正常运动节段功能的损失［48］。

近年来组织工程技术在IVD受损组织再生中的应用得到迅速发展，HA是构建组织工程支架的常用天然生物材料之一。Halloran等［49］制备了非交联和酶交联胶原-HA复合支架。将牛髓核细胞种植于支架中，并培养7d，观察到交联复合支架未对细胞活力和增生产生任何负面影响。与非交联支架相比，种植于交联支架中的细胞其蛋白聚糖合成率较高，硫酸化糖胺聚糖的流失较少。Nesti等［50］将人BMMSC种植于包封HA水凝胶的生物可降解纳米纤维复合支架中。这种复合支架的外层为聚乳酸纳米纤维，内层注入HA水凝胶以提供支撑结构，并提高复合支架在细胞增生、分化中的生物相容性。体外培养28d，加入转化生长因子β诱导软骨形成。在体外培养中，种植细胞逐渐发育为软骨细胞表型，这些细胞保持了天然IVD的微结构。形成的软骨样HA纳米纤维支架复合体的结构与天然的IVD相似，都具有外部纤维环样结构和内部髓核样结构。总之，这种MSC/HA的IVD复合体具有应用于退化IVD的组织工程修复的潜能。Revell等［51］检查了2种HA衍生的生物可降解聚合物，HYAFF-120和HYADD-3在猪髓核切除术模型中对受损IVD的修复作用。研究中将自体BMMSC种植于HA凝胶中，然后注入切除髓核后的IVD中。与仅实施髓核切除术的对照组相比，种植或不种植MSC的植入HA凝胶都维持了髓核的正常两面凸起结构，6周后都含有形成基质的活软骨细胞。Cal-deron等［52］研制了一种交联Ⅱ型胶原-HA复合水凝胶，作为MSC的载体，应用于髓核的再生。这种水凝胶具有良好的稳定性和机械强度，种植的MSC细胞活力高，生长情况良好，并分化为软骨细胞。近年来的研究成果表明，HA可构建工程化IVD，用于IVD的修复和再生。

6HA寡糖对骨肉瘤的抑制作用

骨肉瘤是一种较常见的恶性骨肿瘤，易发于青少年，死亡率高。Hosono等［53］研究发现，外源性HA寡糖对LM-8和MG-63骨肉瘤细胞有显著的抑制作用。细胞活力分析和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP原位切口末端标记的分析结果分别表明，HA八糖可以显著抑制肿瘤细胞活力，并可诱导其凋亡。八糖还可以削弱细胞基质的功能，并显著降低内源性HA的存留量。另外，八糖能够抑制肿瘤细胞的迁移和入侵。肺是骨肉瘤转移的主要靶器官，应用化疗前，80%～90%的患者死于肺转移［54］。在体肿瘤内注射HA八糖可降低内源性HA在肿瘤部位的聚集，从而显著抑制了肺癌远端转移灶的形成。Nishida等［55］在2010年第8届Hyaluronan国际大会上再次公开了以上研究结果。以上研究表明，HA寡糖具有开发为抗恶性骨肿瘤药物的潜能。

关节软骨的生物力学特性篇5

1细胞因子与关节软骨代谢

关节软骨的各种传导信号之间的平衡有利于保持软骨的稳定性，一旦平衡被打破，关节软骨中的某些细胞如滑，造成软骨基质成分改变及合成受限，使基质过度分解最终导致基质降解。

2细胞通路调控关节软骨代谢

当促炎细胞因子活性增加，协调其他促炎介质共同参与，释放过量的MMPs，同时上调NF-κB配体（RANKL）表达。

3氧自由基与软骨退变

氧自由基由线粒体、内质网等亚细胞器生成的氧代谢副产物，过量的氧自由基能引起线粒体、内质网核酸损坏，细胞骨架破坏，抗氧化应激反应降低、蛋白质及脂类氧化改变。关节软骨受到过度持久的机械创伤应力不仅使关节软骨组织结构力学改变、抑制软骨细胞的正常生理功能细胞间滑液互流，尚且诱导氧自由基生产，Brouillette MJ质干细胞，采用IL-1β及TNF-alpha对其相互反应，观察细胞内氧自由基，过氧化氢，抗氧化酶表达情况以及细胞活性状态，研究结果提示通过降低氧自由基，下调基质金属蛋白酶的表达，保护抗氧化剂超氧化物歧化酶，最终有助于软骨保护作用。

4结束语

颞下颌关节软骨的年龄性退化是不能改变和否认的，其与细胞因子及其它相关介质之间存在紧密的相关性，但是它们的作用并非是线性的，而是多元化的。本文综述了细胞因子和氧自由基对颞下颌关节软骨组织的影响，但其如何影响颞下颌软骨代谢的详细作用途径和机制仍需进一步深入研究。

参考文献

[1]Fernandes JC， Martel-Pelletier J， Pelletier JP et al The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology[J] Biorheology，2002，39（1-2）：237-246

关节软骨的生物力学特性篇6

【关键词】 脂肪源干细胞 海藻酸钙 软骨

Abstract: ［Objective］To evaluate the effect of not induced adipose derived stem cells(ADSCs)with calcium alginate healing full-thickness cartilage defects of rabbit knee after the model was made in center of femoral facies patellaris artificially， in order to find a simple and working way of articular cartilage defect restoration. ［Method］Twenty-seven New Zealand white rabbits were pided in to A， B， C groups randomly. Calcium alginate was transplanted to cartilage defect position of rabbits of group A， nothing for group B and calcium alginate with not induced ADSCs for group C. The animals were killed in 4th， 8th and 12th week later.Restored tissue was evaluated using naked eyes， histological section and transmission electron microscopy， score was given according to modified Wakitani grade standard. The total score was analyzed with statistic software SPSS 11.5. ［Result］Articular cartilage defects of the animal of groups A and B were filled with fibrous tissue which contains protofiber when it was checked using histological section and microscopy.The defect was filed with chondrocyte-like tissue .Chondrocyte-like cells surrounded with lacunes were observed in histological section. Plenty of collagen fibers around cells could be seen under transmission electron microscopy. Group C had a significant statistical difference compared with groups A and B (P

Key words：ADSCs; calcium alginate; cartilage

关节软骨的自身修复能力有限，其损伤后的修复一直是骨科界的难题之一。随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用来探索软骨缺损治疗的可行性。2001年Zuk PA和Zhu Min［1］等从人脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞。目前已证实脂肪组织来源干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化［2］。本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进行观察分析，以探讨单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关节软骨缺损修复探索简单有效的途径。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

(1)超净工作台(JHT-DDC型，济南康宝净化设备有限公司)；(2)恒温孵育箱(Heraeus公司，德国)；(3)倒置相差显微镜(Nikon TE2000，日本)；(4)50 ml培养瓶(Corning公司，美国)；（5）低温高速离心机（Heraeus公司，德国）。

1.1.2 主要试剂

(1)DMEM培养基(Gibco公司，美国)；(2) Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)；(3)胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D-Hank’s平衡盐（Sigma公司，美国）；（6）海藻酸钠（上海化学试剂站分装厂）；（7）氯化钙（上海生工生物工程有限公司）。

2 实验方法

2.1 脂肪源干细胞的获取、培养和鉴定

将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪组织约10 ml，用2倍体积D-Hank’s平衡盐液漂洗3遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2%Ⅰ型胶原酶5 ml置于37℃温箱内消化0.5 h，低温高速离心机内1 000 r/min离心10 min弃上清，加入160 mmol/L NH4Cl约5 ml裂解红细胞10 min，筛网过滤，按8 000个/cm2种植于50 ml培养瓶中。培养瓶置于37℃体积分数为5%的CO2恒温孵育箱内。24 h后首次换液，去除残余红细胞及未贴壁细胞，后每隔2～3 d换液一次，融合达80%以上时传代，动物实验用细胞传至第4代。取部分2代细胞采用含10%FBS，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM诱导培养基向成骨细胞方向诱导。

2.2 动物实验

选择健康成年新西兰大白兔27只（购自山东鲁抗实验动物中心），体重2.5～3.5 kg，雌雄不限。编号后随机分成A、B、C 3组，每组9只，双膝均用于实验。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔。分别于左右两侧用直径3.5 mm的钻头在髌股关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约2.5 mm。A组：（18膝）缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶。B组：（18膝），空白对照，缺损处不作任何处理。C组：（18膝），置入培养的脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于2.0×106 ／ml。术毕兔清醒后，放置笼内自由活动，青霉素肌注连续5 d。

2.3 检测方法

2.3.1 细胞学检测

生物学特性观察：观察细胞生长情况；取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色；另取部分向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性。

2.3.2 修复组织检测

分别于术后4、8、12周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观察。(1)大体观察：膝关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无粘连及修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺兰染色，进行光镜下组织学观察；（3）透射电镜观察：取12周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。

2.4 统计学分析

根据改良的Wakitani评分标准(见表1)采用盲法对各标本进行组织学评分。每一标本均有3人进行评分，取均数，所得评分结果应用SPSS 11.5统计软件进行多因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett检验。表1 软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分

3 结果

3.1 脂肪源干细胞培养及诱导

细胞于接种后24 h左右开始贴壁，细胞形态呈长梭形、三角形或多角形（图1）。细胞生长旺盛，3～4 d即可传代。取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红O着色（图2），可见胞质中不含脂质，与脂肪谱系细胞无相关性。细胞培养7代后仍然增殖旺盛。向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色，可观察到形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色（见图3），说明所培养的脂肪源干细胞有向成骨细胞分化的能力，有潜在的分化特性，具有干细胞特征。

3.2 大体观察

术后3～4 d动物轻度跛行，1周左右恢复正常。膝关节无红、肿、热等炎症现象。处死动物后见关节液清亮，关节囊无挛缩、粘连和新生物形成，滑膜无充血水肿，软骨无侵蚀，关节边缘无骨赘形成。

术后4周，A、B组缺损处修复组织基本相同，缺损处未完全填充，修复组织为灰白色，基底部呈深红色，未见明显的炎性肉芽组织；C组缺损处亦未完全填充，但修复组织呈黄白色外观，表面粗糙；呈连绵的小丘状，与周围关节软骨分界清楚。

术后8周，A、B组缺损处修复组织仍基本相同，缺损处未完全填充，但较前为多，修复组织仍为灰白色，表面粗糙，C组缺损处未完全填充，修复组织亦较以前为多，淡黄白色，表面变的光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界仍能辨认。

术后第12周，A、B组缺损多完全填充，基本为纤维组织状物覆盖，表面与正常软骨齐平，深灰白色，质软，与周围正常软骨组织分界清楚，易剥离；C组缺损区修复组织色泽、质地同正常关节软骨，表面光滑，与周围软骨组织界面平齐并完全整合，结合紧密，不易剥离，与周围正常软骨组织界限模糊（图4）。

3.3 组织学观察

术后4周，A、B组见缺损区凹陷，有血凝块，被覆纤维组织，甲苯胺兰染色呈无异染性着色的纤维组织；C组见少量增殖的类似幼稚软骨细胞的细胞和较少的基质，细胞排列稍紊乱、不规则，细胞形态较小，周围无典型的陷窝样结构，甲苯胺兰染色异染性不明显，未见明显的多核炎性细胞。

术后第8周，组织学与第4周相似，A、B组缺损区有纤维组织覆盖，有原纤维形成，呈波纹状走行，修复组织异染，少而不均匀；C组修复组织中可见到较多的类幼稚软骨细胞和基质，类软骨陷窝多见，细胞分布不均，呈明显的甲苯胺兰异染性着色。

术后12周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，原纤维呈波纹状排列，未见软骨陷窝形成，甲苯胺兰染色少而不均匀；C组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞，但排列非柱状，较正常软骨细胞不规则，类软骨细胞周围可见类软骨陷窝（见图5），未见炎性细胞浸润，甲苯胺兰着色较前均匀。

3.4 透射电镜观察

透射电镜下可见藻酸钙凝胶孔径大，交联较紧密、壁厚。A、B组4周可见到缺损处有较多的红细胞，8、12周缺损由纤维组织充填，多为层状排列的纤维组织，4周海藻酸钙部分降解，8周大部分降解；C组8、12周，修复组织中可见类幼稚软骨细胞，细胞呈圆或椭圆形，表面有不规则的突起，胞质中可见丰富扩张的粗面内质网和小而圆的线粒体，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维(图6)。4周海藻酸钙部分降解，8周大部分降解。

3.5 统计软件分析结果

脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物移植组得分与其他两组相比各时期有显著性差异(P0.01)。（见表2） 表2 组织学评分时间

4讨论

关节软骨是一种高分化的组织，其自行修复后一般为纤维组织或纤维软骨组织，形成透明软骨组织的能力有限。软骨细胞移植可形成透明软骨修复［3］，但缺点是软骨细胞本身是高分化细胞，体外培养增殖能力有限，自体移植其取材过程也会对受损的关节产生额外的损伤并需要二次手术，过程繁琐且费用昂贵［4］。

组织工程技术为软骨缺损的修复带来了希望。骨髓基质干细胞的发现及其相关软骨组织工程应用研究较早，但骨髓基质干细胞取材、培养、诱导及移植相对较为麻烦，经济效果和临床效果也不理想。在体外培养条件下，脂肪源干细胞表现出与骨髓基质干细胞相类似的分化能力，而且具有易获得性、可迅速扩增及多向分化潜能等特点。本实验中，所培养的脂肪源干细胞，取材容易，培养、扩增效率较高，具有分化潜能，是优势较大的种子细胞。

当脂肪源干细胞在体外用软骨培养基培养时，能够被诱导成软骨系，组织学和组织化学明显显示软骨细胞的表型。在软骨源分化过程中有特征性分子如II型胶原、软骨寡聚蛋白和软骨蛋白聚糖表达，体外诱导和体内形成的软骨低水平表达X型胶原和I型胶原［5］。12周左右，C组修复组织为类软骨组织，透射电镜照片可见大量基质，也观察到了类似组织学结果。

Dragoo JL等［6］将脂肪源干细胞向软骨方向诱导后复合纤维凝胶移植到兔股骨髁全层软骨缺损处，结果显示修复效果较为满意。本实验的主旨是，由于不能判定诱导后植入，体内的真实生理环境是否会再次对经过诱导的细胞发生作用，与其通过人工的方法诱导后移植，增加了支出和过程的繁琐，不如省却人工模拟诱导的过程，将单纯细胞直接植入关节软骨缺损处，在转归过程利用真正的生理环境诱导分化，或许更能接近真实的修复。如果修复效果满意，将为软骨组织工程修复软骨缺损提供较为简单的方法。本实验中，脂肪源干细胞在植入前特意未进行软骨方向分化的诱导，而仅在证明其具有干细胞特性后，与藻酸钙凝胶混合后直接植入缺损处，最终所得的结果与Dragoo JL等的大体一致，这就提示，真实的生理环境诱导同人工诱导后植入差别不大。但因两种实验方法如造模及评价方法有些差别，是否的确如此，有待后继大规模动物对照实验进一步验证。 图1培养的脂肪源干细胞24 h后贴壁，态呈长梭形、三角形或多角形。倒置相差显微镜×200 图2培养的脂肪源干细胞爬片做油红0染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红0着色。右上角为阳性对照。苏木素油红0染色×200 图3成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色，形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色。Von Kossa染色×100 图4术后12周大体观察，A、B组缺损多完全填充，为纤维组织状物基本覆盖，C组修复组织类正常关节软骨，与周围正常软骨组织界限模糊 图5术后12周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，C组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞。图中箭头示为原缺损处。 HE染色×200 图6术后12周，C组修复组织中可见类幼稚软骨细胞，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维。透射电镜×4 200

藻酸钠是从海藻中提取的线状多糖成分，与软骨基质中的蛋白多糖结构相似［7］ 。藻酸盐与钙离子等二价阳离子交联后可形成网格状结构的多孔材料，常呈胶冻样凝胶，作为可注射性支架材料常用于填补组织缺损，并作为细胞载体运用于组织工程。藻酸钙凝胶在生物体内通过酶解生成葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸单体，对机体无毒性，无免疫源性，具有良好的生物相容性。有实验结果表明，脂肪源干细胞在藻酸盐支架中向软骨方向诱导后，其与脂肪源干细胞表现出良好的兼容性［8］。在本实验中，6周左右，藻酸钙凝胶即完全降解，组织切片未见明显炎性细胞浸润，藻酸钙植入后，4～6周左右时已大部分分解，提示其作为组织工程载体具有良好的应用前景。同时实验中也观察到，并非所有C组的动物软骨缺损处都达到完全修复，原因有待进一步探究。

总之，脂肪组织在体内含量大，取材简单，利于脂肪源干细胞收集，又兼该细胞易于扩增，故脂肪源干细胞对于软骨缺损修复相关的软骨组织工程来说，是一种非常有希望的种子细胞。从脂肪源干细胞被发现并证明其具有多向分化潜能以来，随着时间的发展和相关研究的不断深入，脂肪源干细胞向软骨方向诱导技术已经成熟，其相关软骨组织工程研究的体内、体外实验效果都较为理想［6、8］，为软骨缺损的治疗提供了新的途径。但现有文献记载的相关动物实验中，其体内观察时间较短，远期修复效果有待进一步研究。本实验结果最终提示，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植修复关节全层软骨缺损近期效果也较为理想，对于关节软骨缺损修复是一种很有希望的简单有效的组织工程方法。

参考文献

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［6］ Dragoo JL ， Carlson G ， McCornick F ， et al. Healing full-thickness cartilage defects using adipose-derived stem cells［J］ . Tissue Eng ，2007，13:1615-1621.

关节软骨的生物力学特性篇7

[关键词] 人膝骨关节炎；中医；西医；治疗现状；创新治疗

[中图分类号] R274.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）15-0147-05

[Abstract] Knee osteoarthritis frequently-occurring disease and the elderly group， and reduces the quality of life for the elderly， affects the elderly people in later life. Based on the connotation of knee osteoarthritis， by Chinese and western understanding of knee osteoarthritis research present situation and the analysis， elaborated the common acupuncture， traditional Chinese medicine external treatment， drug therapy， surgical therapy， and put forward innovative treatments. By the study of knee osteoarthritis treatment method， makes the far the most effective treatment knee osteoarthritis， contribute to improve knee osteoarthritis to cure.

[Key words] Knee osteoarthritis；Traditional Chinese medicine；Western medicine；Treatment situations；Innovative treatment

人膝骨关节炎是膝关节面软骨发生结构絮乱或退变，并伴随着软骨剥脱、下骨质增生，造成膝骨关节畸形。在临床上，人膝骨关节炎表现为关节疼痛、压痛、肿胀、僵硬、畸形、不稳以及有摩擦感和活动受限。人膝骨关节炎多发生于中老年群体，降低了中老年人的生活质量，为中老年人带来严重的经济负担。

1 人膝骨关节炎概述

研究人膝骨关节首先要了解什么是骨关节炎。骨关节炎又叫退行性关节病，其临床表现形式主要为僵硬、慢性疼痛、伴有关节功能障碍和肿大，其发病机制复杂。人膝骨关节炎又称增生性关节炎，是骨关节炎中最为常见的临床表现形式。主要病理表现为关节软骨面反应性增生、膝部关节软骨变性和骨刺形成。该病主要发生于中老年人群。难忍的疼痛、行动的不便严重影响中老年人的精神面貌和生活质量。膝骨关节炎是西医通过生物解剖学原理命名而成，而在中医学范畴内并没有明确的膝骨关节炎的名称。中医学多以主要症状或主要病机等命名。古代文献指出中医将膝骨关节炎称为“膝痹”。骨关节炎多发病于中老年人群，据国内外调查显示，骨关节炎的总患病率约为15%，其中以75岁以上老年人群体发病率最高，约80%。40岁人群约10%，60岁以上则达50%。而骨关节炎最终致残率为53%。疾病除了带来痛苦，还带来巨大的费用支出，不但给家庭还给社会带来巨大的负担。以我国为例，中国人口老龄化问题严重，60岁以上人口己超过1亿，据统计表明其中患骨关节炎人数约占5000万。显然，骨关节炎疾病已经成为威胁人们生活质量甚至生命的几项重要疾病之一，其预防保健己成为重大的公共卫生学问题。

2中西医对人膝骨关节炎治疗认识

2.1中医对人膝骨关节炎治疗现状

中医理论认为，膝骨关节炎多因为肝肾不足、机体衰老、腠理不密、筋骨失荣、骨髓不充、卫外不固等原因以致风寒湿邪乘虚而袭，导致经络阻滞、血脉不通闭阻关节，使膝骨关节僵硬、活动疼痛、屈伸不利最终导致膝骨关节炎的病发。中医理论中没有明确的膝骨关节名称，主要以痹证范围研究。近年来中医学对骨性关节炎治疗取得了很多进展，主要表现在对病因病机的研究和中医内治方向上的研究。骨性关节炎在中医理论研究中最早出现在《内经》中，《内经》指出：“痹，闭也。风寒湿三气杂至，合而为痹也。”这句话充分体现了膝骨关节炎发病时行动受到限制，并行动伴随着疼痛等症状。莫少庸在其《内外合治结合辨证用药治疗膝关节骨性关节炎89例》中对膝骨关节炎进行研究，将其分为四种类型，即气阴两虚型、肝肾亏损型、寒凝瘀阻型和痰湿型等。针对膝骨关节炎施以柔阴通痹汤、加味二仙汤、加味补阳还五汤治疗和痰通痹汤等，总有效率为97.75%。宏树臣在《中医指针综合治疗膝关节骨性关节炎》中从膝骨关节炎疾病病变的特点入手，将该病分三期进行治疗，即初期、中期和晚期。在初期以通经活络、活血化瘀、祛风除湿为主，配合化瘀定痛汤的使用，化解病情。中期和晚期力求补益肝肾、养血荣筋为主，佐以温经通络，理气散结。曹向阳等在《壮筋活血汤治疗膝骨性关节炎152例》中从整体上对膝骨关节炎做了研究。以壮筋活血汤治疗为主时，滋补肝阴、柔筋利节为辅进行治疗；以壮骨蠲痹汤治疗膝骨关节炎时，多用甘润之品调补肝肾，标本兼治，缓解症状，效果明显。另外，由吕建国和郑清莲共同撰写的论文《补肾活血方剂治疗膝关节退行性骨关节炎165例》中，发现补肾活血法能够延缓软骨组织的退变，消除骨关节炎的胶原老化现象。因此，以补肾活血的方法治疗膝骨关节炎可以改善机体微循环，促进软骨细胞的基质合成，改善膝骨关节炎带来的病变。

2.2西医对人膝骨关节炎治疗的认识

西医对人膝骨关节炎治疗的认识可以通过对膝骨关节炎的病因病机入手进行研究。西医认为膝骨关节炎是在生物学因素和力学因素的共同作用下，软骨下骨和软骨基质之间合成和分解代谢失衡的结果。膝骨关节炎病理改变主要表现为七个方面，即软骨下骨质硬化、关节软骨退变、骨囊肿形成、关节囊纤维化、滑膜绒毛肥大、挛缩、关节内渗液、游离体的形成以及BouChard与Heberden结节形成等。西医主要从生物学和力学两个方面因素对病理改变的机制进行论述。

2.2.1力学因素 关节面有效负重面积减少或负重增加，关节软骨面上的应力增加，高应力使胶原纤维网架的物理和化学连接发生松弛，超微结构遭到破坏造成了胶原纤维疲劳性断裂。同时，关节单位面积内的骨小梁压力增高，软骨下骨小梁发生微细骨折而塌陷，软骨下骨质硬化，软骨的营养作用受到影响，导致软骨缺少滑液的与营养而发生退变导致膝骨关节炎的发生。

力学环境异常分析膝骨关节炎可分为两类：即关节过度使用和关节面吻合不良。①关节过度使用包含关节软骨负荷过大和关节软骨长期磨损。前者主要由于膝关节长期屈曲负重和过度肥胖等因素，导致关节软骨压力增大，导致关节使用过度。后者主要出现在大运动量造成关节长期严重磨损的运动员中。②关节面吻合不良。关节面吻合不良分为两种，即关节力线或关节面形状改变导致的关节面吻合不良，比如骨折畸形愈合、先天畸形等；由于关节周围稳定装置紧张或松弛造成的关节吻合不良，如老年人由于肌肉松弛造成关节面不稳等。

2.2.2 生物学因素 生物学因素分析膝骨关节炎首先要了解正常关节的情况。正常关节软骨呈半透明状、浅蓝白色、光滑而有光泽，传导关节负荷并耐磨损以及关节和吸收震荡等功能。主要组成成分有软骨基质和软骨细胞两种，其中软骨基质是由蛋白多糖和胶原组成，软骨细胞位于其间顺胶原纤维方向排列。

3运用多种方案治疗人膝骨关节炎

3.1中医治疗人膝骨关节炎的方案

3.1.1 针灸治疗 （1）针灸治疗膝骨关节炎的有效性：针灸的形成和发展是我国中医在经历了几千年的传承所保留下来的重要宝藏。在治疗人膝骨关节炎的问题上，已经取得很好的疗效。杨志琴等[1]在《足三里灸配合电针治疗膝骨关节炎34例》中，用两组针灸方法以对比的形势进行研究。第一组是用电针和足三里穴隔姜灸相互配合对人膝骨关节炎治疗。第二组是直接运用电针对人膝骨关节炎进行治疗。经过两组对昆仑、阴陵泉、主穴太溪通过实际情况增加或是减少穴位的方法施针。结果表现为第一组治疗方案有效率达94.12%，第二组为79.42%。由此可见，无论是单一使用电针针灸还是配合使用都可以达到治疗人膝骨关节炎的目的。针灸治疗膝骨关节炎不但在国内应用广泛，近年来在西方的一些国家，针灸疗法也得到广泛的推广和应用，有三万多名医生在德国应用针灸治疗骨关节炎和一些慢性疼痛。在西班牙某疼痛俱乐部、美国马里兰大学医学院、德国海德堡大学、柏林慈善大学医学中心等机构通过对针灸疗法的对比研究证明针灸疗法的显著疗效[2]。（2）针灸的特点：针灸治疗膝骨关节炎的特点主要表现在配穴的多样性和实施方法多样性等。①配穴的多样性。配穴的多样性主要是指人体穴位众多，中医根据不同患者的不同情况，配以实施不同的穴位进行施针治疗。王应军[3]在通过针灸治疗与西药治疗对比得出，针灸治疗人膝骨关节炎无论在治疗效果还是在治疗安全方面都要比西医药物效果更佳、治疗也更加安全、价格也更加便宜、无副作用，更适用于人膝骨关节炎的临床治疗。在王应军[3]的研究中所采用的针灸疗法是取膝阳关、鹤顶、双侧的血海、内膝眼、阳陵泉、膝关、外膝眼等穴位，并针对具有感到寒冷的患者采取使用艾灸的方法驱寒散痛，目的在于通过对膝关节局部的穴位施针，达到补益气血、疏通经络的效果。卢得健等是以两组分别施针互为参照进行针灸治疗的研究。分别以温针和火针对人膝骨关节炎患者进行对比治疗。经过治疗发现无论是温针治疗还是火针治疗都可以减轻人膝骨关节炎患者的病症，但火针治疗的效果要优于温针治疗的效果。医者根据患者的实际情况将患者分为肾虚髓亏型、阳虚寒凝型和瘀血阻滞型，施针的主穴选取的是阴陵泉、阳陵泉、血海、梁丘、阿是穴[4]。②实施方法呈多样性。这里是指针灸治疗方式多种多样，除了传统的针灸方式外，还有许多独特的施治方式。如李瑛等在《“冬病夏治”治未病对老年膝骨关节炎的临床运用》一文中指出在每年的三伏天对78例膝骨关节炎患者进行温针灸治疗，具体治疗方法是以每个伏的第一天为起始日期进行治疗，以每天一次的频率实施1周的时间，并在休息3d后开始下一伏的治疗。每年伏天治疗三个7d，以3年为一个疗程。研究表明，这种治疗方法对人膝骨关节炎的有效率达到88.46%[5]。由此可见， “冬病夏治”这种治疗方法在防治老年膝骨关节炎的治疗中效果尤为显著，且该方法疗效可靠、简单易行、费用低廉，是老年人首选的治疗方法，同时也为解决我国人民群众普遍反映的看病贵提出了解决措施，这已经不单是治疗膝骨关节炎方面的进步，同时也是我国医疗领域的进步。除以上的两个特点外，针灸治疗膝骨关节炎的特点还有针灸治疗配以其他治疗方法共同治疗膝骨关节炎。吸收其他方法的优越性的同时，两者互相作用，取长补短，共同为解决膝骨关节炎患者减轻病痛、根除疾病这一相同的目标做出努力。桑秀丽等以针灸配合微波治疗膝骨关节炎，根据临床症状每次选用主穴4～6个，并配合TDP照射。同时配合以微波理疗仪连续治疗两个疗程。另外，以口服西药为另一组进行两种方式对比研究。结果表明，前一种方法较后一种方法对改善人膝骨关节炎患者的病症，尤其是疼痛、肿胀等症状有显著效果，是保守治疗人膝骨关节炎的有效方法[6]。

3.1.2 中药外敷 当今对膝骨关节炎治疗的观念中普遍认为只要买副膏药贴于患处就可以解决问题，市面上的膏药品种也非常的多。普通市面上的中药贴只能起到普通的缓解疼痛的作用，无法真正做到根除病症。在中医临床治疗中运用敷贴法、熏洗法和热熨法等治疗方式，临床实验表明运用这几种方法治疗膝骨关节炎效果明显[7]。首先，敷贴法。敷贴法主要指将膏剂或者散剂直接敷贴在患处，通过直接渗透法将药物直接作用到患处，起到治疗作用。比如，李文庆在《骨伤风湿膏治疗膝骨关节病的临床观察》中运用骨伤风湿膏进行膝骨关节炎的治疗，有效率高达94.5%。敷贴法方便易行，患者自身就可进行治疗，减少了去医院治疗的麻烦，避免了患者因为治疗影响工作和生活[8]。其次，熏洗法。熏洗法顾名思义就是用药物熬汤熏洗患处及周边部位，同时为了加强疗效，还可以加以白酒和米醋配合使用。熏洗法具有疏通筋脉、消除肿痛、活血通利等效果，但皮肤敏感的患者则需要谨慎使用该方法。最后，热熨法。热熨法与熏洗法都是热疗的方法，熏洗法是运用药汤蒸汽作用患处，而热熨法是运用药物加热后产生的热能结合药物自身的作用对膝骨关节炎进行治疗。孔熙春曾指出“以《刘寿山正骨经验》经验方加减，用白酒拌匀，装入布袋热熨，另配合梅花针治疗膝骨关节炎，结果总有效率88%[9]。”热熨法同熏洗法一样，对皮肤敏感的患者需要谨慎使用。

3.2西医治疗人膝骨关节炎的方法

3.2.1 药物治疗 除以上中医对人膝骨关节炎的治疗方法外，现代西医对人膝骨关节炎也有其自身独特治疗方法。目前，最为常见的治疗方法主要是以药物为主的治疗方法。药物治疗因其使用方式简单，在最近几年对药物治疗研究进展快速、效果显著[10]。目前常用的治疗人膝骨关节炎的药物主要有以下几种：

第一，对已酰氨基酚。对已酰氨基酚对人膝骨关节炎的治疗机制目前还不是十分清楚。但是它对老年人膝骨关节炎的病症有缓解疼痛的作用，而且服用对已酰氨基酚所产生的不良反应与布洛芬相比较为轻微。因此，虽然没有明显的消除炎症的作用，却仍是治疗人膝骨关节炎的主要药物之一。

第二，非甾体类消炎药。非甾体类消炎药具有防止软骨被破坏的疗效，这主要是通过抑制前列腺素的合成而形成的治疗人膝骨关节炎的方法。但是，不是所有的非甾体类消炎药都可以进行人膝骨关节炎的治疗。许多老年人服用非甾体类消炎药会产生诸如溃疡、胃肠道不适和肾毒性等不良反应[11-14]。如阿司匹林等抑制软骨基质蛋白聚糖合成的药物不利于人膝骨关节炎的治疗被排除在外。而美洛西康、舒林酸等可以促进软骨基质蛋白聚糖合成的药物，是目前临床上较为常用的非甾体类消炎药[15-17]。非甾体类消炎药抑制软骨基质蛋白聚糖合成是通过抑制环氧化酶实现的。而环氧化酶选择性地抑制药物虽然在临床上显示可以降低不良反应的发生，但是目前有报道称此类药物对心血管系统和肾脏有不良影响。这点需要临床实验进一步的验证。就其价格来说，这类药物的使用费用高于对已酰氨基酚。因此，在目前的临床治疗中，对已酰氨基酚仍然是人膝骨关节炎的主要治疗药物。

第三，双瑞醋因。双瑞醋因作为治疗人膝骨关节炎的慢性药物，主要产生于大黄提取物，通过抑制氧自由基的产生和释放来稳定溶酶体膜的同时导致金属蛋白酶的活性被抑制[18，19]。这些机制共同运作导致关节软骨的抗炎性增强，使得关节软骨得到保护。虽然双瑞醋因是治疗膝骨关节炎的慢性药物，但是不可否认其对膝骨关节炎的治疗效果在临床上得到认可，也是临床治疗膝骨关节炎的常用药物之一。

第四，透明质酸。透明质酸首次运用到治疗膝骨关节炎是在1974年，其治疗效果显著且治疗过程和效果安全系数高。透明质酸治疗主要是通过将透明质酸注入到关节腔内，起到关节的作用。这种关节最终导致关节活动性增强，减轻关节在活动时产生的压力的同时在一定程度上缓解因为关节炎症造成的疼痛症状。与此同时，因为透明质酸的使用安全性高、副作用小，所以透明质酸在临床上的应用减少了其他药物使用产生的对心血管、肾脏等的损害，也降低了膝骨关节炎的治疗成本。

除上述几种药物外，治疗膝骨关节炎的药物还有很多。病患在选择使用这些药物时应该按照自身的具体情况选择适合的药物。

3.2.2 外科治疗 提到外科治疗多想到手术治疗。当前，治疗人膝骨关节炎的外科治疗是由早期针对人膝骨关节炎的病因进行预防人膝骨关节炎而产生的[20-22]。早期外科治疗人膝骨关节炎手段还不是很成熟，技术也有些落后，针对人膝骨关节炎的治疗多集中在人膝骨关节炎的晚期。发展到当今，通过众多人膝骨关节炎专家的研究，再将人膝骨关节炎通过人体力学和生物学的领域进行分析，提出了治疗人膝骨关节炎的新方法。主要表现在：第一，关节清理术。通过临床实验可以发现患有人膝骨关节炎患者的关节腔内有许多软骨碎片、炎症介质、增生的滑膜组织和钙盐结晶等。这些物质在人膝骨关节腔内势必会导致关节内部炎症的产生，造成人膝骨关节炎的产生。为了减轻患者的痛苦就要清除关节腔内多余的物质，这就需要进行关节清理术。在关节镜的作用下，将关节腔内关节软骨的碎片和其他物质清除并反复清洁关节腔内部。这种方法可以降低人膝骨关节炎带来的炎症，减轻患者的痛苦。目前手术进行关节清理术仍然存在众多的争议，临床对比实验表明，关节清理术只适用于人膝骨关节炎早期[23-25]。第二，软骨下骨钻孔。软骨下骨钻孔手术可以伴随着关节清洁术同时进行。软骨下骨钻孔手术的机制是由于机械的原因使得关节软骨破裂，造成关节内部出现出血现象和纤维蛋白导致凝块。与此同时，关节腔内滞留的未分化的细胞经过分化形成了软骨细胞，形成一种与周围软骨组织不同的软骨组织。这种软骨组织无法起正常的软骨组织修复关节表面的作用。虽然如此，但临床上一些病例表明该软骨组织经过修复可在很长时间内与正常关节面具有相同的功能，在一定程度上缓解了患者的痛苦。第三，自体软骨细胞移植。自体软骨细胞移植是通过选取自身的软骨标本进行体外培养的方式培育软骨细胞。在进行手术的时候，通过手术清洁关节腔中病变，并依据关节腔内关节软骨的破损情况选择合适的骨膜并将其缝合在缺损软骨的周围。最后，利用将所培育的软骨细胞植入到骨膜下的方式完成整个手术。第四，自体骨软骨移植。自体骨软骨移植手术是在关节镜的协助下，从自身体内移植软骨到小于2 cm的软骨破痕中。因为移植的是自身的软骨，因此很容易保留透明软骨的特征。经过临床验证，自体骨软骨移植手术成功有效率达九成以上。

3.3创新疗法

除了传统治疗方法，现代医学结合基因技术和生物科技提出了长期服用硫酸氨基葡萄糖、基质金属蛋白酶抑制剂、抑制炎性细胞因子和基因治疗等创新疗法。长期服用硫酸氨基葡萄糖可以补充软骨滑液的不足，预防膝骨关节的结构改变，能快速地缓解症状，促进软骨代谢。使用基质金属蛋白酶抑制剂是近年来针对MMPs和TIMP研究力图关节软骨受到降解酶的作用而破坏的情况。临床和动物实验表明，基质金属蛋白酶抑制剂可有效降低关节软骨受到降解酶破坏情况，缓解病症，减轻患者疼痛。抑制炎性细胞因子是指抑制膝骨关节炎病理的主要因子，主要指控制细胞因子，调控细胞的活性，以达到预防和治疗膝骨关节炎的目的。最后是运用基因治疗膝骨关节炎。目前基因治疗方法还处于动物实验阶段，以求通过转基因的方法提高患者自身的抵抗力。通过基因片段加在膝骨关节上，以在根本上改变膝骨关节病变基因，达到根除膝骨关节炎病症的目的。虽然基因疗法还处在实验阶段，但动物实验表明该方法可行性高，治疗效果好，值得更多患者期待。

除上述的几种膝骨关节炎的治疗方法外，还有中西医结合法、手术治疗法等多种方法。由于目前膝骨关节炎发病的病因和病机仍然不是很明确，虽然有多种多样的治疗方法，但单一的方法还是不能完美根除膝骨关节炎病症。因此在临床治疗时，医生多采用综合性的治疗方法，集各家所长，以目前为止最为有效的方法治疗膝骨关节炎。膝骨关节炎降低了老年人的生活质量，研究膝骨关节炎的治疗方法已成为解决我国民生大计的重要内容之一。因此，研究人膝骨关节炎的治疗现状和方案具有重要的意义。

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关节软骨的生物力学特性篇8

【关键词】 气管软骨;应力松弛;粘弹性;力学特性

【摘要】 以应力松弛的试验方法研究气管软骨的应力松弛特性，为临床提供气管软骨的应力松弛特性参数。在日本岛津电子万能试验机上对10个软骨进行应力松弛实验，应力松弛实验应变增加速度为50%/min，实验温度为(36.5±0.65)℃，设定实验时间7 200 s，采集100个实验数据，以一元线性回归分析的方法处理实验数据。结果表明：气管软骨7 200 s应力松弛量为0.316 mpa，7 200 s时应力松弛曲线基本达到平衡。气管软骨应力松弛曲线是以对数关系变化的，气管软骨为非线性粘弹性材料。

【关键词】 气管软骨;应力松弛;粘弹性;力学特性

the experimental study of tracheal cartilage stress relaxationsun changjiang1，feng tiejian2，lu¨ yaping3，ma hongshun4

(1.china-japan friendship hospital, jilin university，changchun 130031，china;

2.nanling campus hospital of jilin university，changchun 130022;

3.daqing petroleum institute mechanical science and engineering college，province daqing 163308，china;

4.project strength departments of nanling school,jilin university changchun 130022)

abstract：to research the tracheal cartilage stress relaxation characteristic and provide the tracheal cartilage stress relaxation characteristic parameter for the clinical.10 cartilages were taken on the electronic universal testing machine to carry on the stress relaxation experiment.the increasing speed of the stress relaxation experiment strain was 50%/min.experimental temperature was (36.5±0.65)℃，the experimental time was set at 7 200 s.then 100 empirical data were gathered and processed by the method of unary linear regression analysis.the tracheal cartilage 7 200 s stress relaxation quantity was 0.316 mpa，the 7 200 s stress relaxation curve achieved the balance basically.the tracheal cartilage stress relaxation curve is changed by the logarithm relations，the tracheal cartilage is the non-linear viscoelastic material.

key words：tracheal cartilage;stress relaxation;viscoelastic;mechanics characteristic

1 引 言

国内外学者对气管损伤气道功能重建，对人工气管的基础研究和临床实践做了一定的研究，但对气管软骨的生物力学研究报道较少。WWW.lw881.com前田富兴等[1]对人工气管的抗变形能力进行了研究。toomesh等[2]以人工气管气道再建进行运动物实验研究。刘德若等[3]对人工气管进行了实验研究。徐艳等[4]研究了纺织结构复合材料人工气管。关于气管软骨的生物力学特性实验国内、外学者们也进行了一定的研究，邓卫军等[5]对成年离体猪气管进行了生物力学的特性实验。王忆勤[6]等对大鼠气管的零应力状态进行了研究。 杨林等[7]对旋转生物反应器用于提高组织工程气管软骨力学强度进行了研究。以往对气管软骨力学特性研究多以动物气管软骨和一维拉伸实验居多[5-7]，对人气管软骨应力松弛粘弹性力学特性研究较少。生物材料的粘弹性主要以应力松弛蠕变为表现形式，应力松弛是软组织在恒应变作用下，对载荷松弛适应性的反应，虽然机制尚不清楚，但气管软骨的应力松弛力学特性对于认识吻合口张力，确定气管损伤后的张力临界点具有重要意义。

气管由于炎症、肿瘤、损伤等疾患需要进行气道再建，现代呼吸道(气道)外科手术对气管病变不超过1/2程度，可切除病变部位气管后直接缝合吻接,修复和重建气管的功能。当气管切除超过其直接的吻合长度,则需要置换人工气管。鉴于临床实际需要，我们对正常国人尸体气管软骨进行了应力松弛实验，得出了气管软骨7 200 s应力松弛量，得出了应力松弛曲线和归一化应力松弛函数曲线。以一元线性回归分析的方法处理实验数据，得出了应力松弛函数方程。

2 材料与方法

2.1 材料

实验标本正常国人新鲜尸体气管标本2个，均为男性，25岁尸体1具，30岁尸体一具。由白求恩医科大学解剖教研室提供。将气管标本生理盐水浸泡的纱布包裹，装入塑料袋中密封后置于-20℃冰箱内保存。实验前取出标本在常温下解冻后，以手术刀切取软骨环试样10个。

2.2 试验装置

日本岛津ag-10ta自动控制电子万能试验机，该机具有自动控制应力、应变增加速度和使应力或应变保持恒定的功能。载荷通过载荷传感器传递，载荷传感器最大量程100 n，使用量程10 n。

2.3 应力松弛实验方法

首先测量式样的原始尺寸。在软组织测量实验中，测量试样的原始尺寸非常关键。作者采用国内外均认可的准长度理论，即在每一给定条件下式样的长度等尺寸。将试样装夹在软组织实验夹具上，给予满量程1%的初载做为准长度的基础。利用读数显微镜测量其长度、宽度和厚度，试样的长度为25 mm，宽度为5 mm，厚度为1.8～2.2 mm，韧带和其他软组织一样，其弹性主要来自熵的改变。因而不存在唯一的自然状态，所以首先对试样进行预调处理，即在同一应力水平下加载-卸载20次。对每个试样分别预调处理后进行实验。

将经过预调的10个试样分别装夹到软组织专用夹具上，夹具与有机玻璃缸连接，玻璃钢内装ph值为7.4的生理盐水，试样置于生理盐水中，装有试样的夹具与实验机上、下头连接。试验机带有-35℃～250℃环境温箱。可自动调节温度并保持恒温。本实验模拟正常人体温，在(36.5±5)℃的温度场下进行。预先设定好程序，记录方式为x-t，其中x轴为应力，t轴为时间。本实验以50%/min的速度对试样施加载拉应变，当应变达到9.28%，应力达到1.207 mpa时保持恒定，应力随时间的改变不断下降。

计算机程序设定从时间t0开始采集数据，每10 s采集一个数据40次，之后每136 s采集一个数据，采集50次，共采集90个数据，历时7 200 s达到设定时间后，计算机自动输出实验曲线和数据。

3 结果

3.1 应力松弛实验数据和归一化应力松弛函数数据

10个气管软骨试样应力松弛实验数据经统计分析后结果见表1。10个气管软骨试样归一化应力松弛函数数据见表2。表1 应力松弛实验数据(x±s)表2 归一化应力松弛函数数据

3.2 应力松弛曲线

对每组10个应力松弛试样的实验数据拟合应力松弛曲线见图1。对每组10个试样归一化应力松弛函数数据拟合曲线见图2。图1 应力松弛曲线

fig 1 the stress relaxation curve

图2 归一化应力松弛函数曲线

fig 2 normalized stress relaxation function curve

3.3 归一化应力松弛函数方程的计算归一化应力松弛函数方程的建立：以一元线性回归方法处理实验数据，松弛曲线是以对数关系变化的，因此设

g(t)=1

c lnt+d t=0

t>0(1)

令φ(a,d)=∑nt=1[g(t)-g(实)]2

则φc=0 φd=0

c∑11i=1ln2t+d∑11i=1lnt-∑11i=1g实=0

c∑11i=1lnt+d∑11i=1d-∑11i=1g实=0(2)

将实验数据带入(2)式，结出屈肌腱c=-0.0396,d=1.0306。将c、d代入(1)式得出气管软骨：

g(t)=1t=0

-0.0313lnt+1.0626t>0

4 讨论

试验结果表明，气管软骨7 200 s应力松弛量为0.316 mpa，应力松弛最初600 s变化较快，达总松弛量的30%，之后应力缓慢下降，达到7 200 s时曲线基本达到平衡，气管软骨的应力松弛曲线是以对数关系变化的。气管软骨在生理上主要是具有一定的舒张性，吸气时伸长而变粗，呼气时复原。气管具有一定的屈、伸性，屈、伸时气管和气管软骨都承受着一定的生理载荷。气管的力学性能的保持主要是胶原纤维的合理排列分布为弹性支架，通过蛋白多糖的亲水作用来形成局部的张力和渗透张力，当组织受载时，由于压力差大于局部张力使水缓慢流出，当去载时由于组织的膨胀压和渗透压使水流回组织内[8]。在正常的生理状态下，气管软骨能在生理载荷范围内适应外力的牵拉，表现出一定抗张性。

气管组织内含有胶原纤维，胶原纤维具有一定的韧性，胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，它是一种高级结构，可形成最佳的力学特性。胶原蛋白最最重要的力学性质是拉伸刚度和抗拉强度。

软骨是一种多孔的粘弹材料，组织间隙为液体所充满。在应力作用下，液体可在组织中流进或流出(当组织膨胀时流进，收缩时流出)，软骨力学性能随液体的含量而变化。事实上，液体在应力下的流动似乎是这种无血管组织取得营养的主要途径。因此，研究气管软骨应力-应变的关系不仅对于了解软骨传递载荷的特性有必要，而且对于了解组织的健康状况也是非常重要的[9]，软骨是由一种液相和固相组成，液相主要是水，固相主要是包括胶原纤维和弹性纤维，蛋白多糖和细胞成份。液相主要功能是通过自身的媒介作用把小的溶质传送或扩散于组织内外，固相胶原纤维的网状支架是张应变和张应力的表述[10-11]。蛋白多糖的亲水性很强，对维持软骨的粘弹性及对抗压力起着重要作用。

本实验初始应力与文献[12]相同，但本实验7 200 s应力松弛量低于文献[12]中髋关节软骨和膝关节软骨。承重部位软骨和非承重部位软骨具有不同的力学特性。本实验结果支持软骨的力学性质与软骨的胶原含量呈正相关的观点。软骨所处不同的生理解剖位置及不同的生理功能决定了其粘弹性的存在和其间的差异。

本实验以正常人青年新鲜尸体气管软骨为研究对象。更充分地揭示气管软骨作为生物粘弹性材料的力学特性，对临床更具有实际意义。

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关节软骨的生物力学特性篇9

【关键词】 中频药物导入；玻璃酸钠注射；膝骨性关节炎

膝关节骨性关节炎是一种常见的老年慢性疾病，是由多种因素引起的以关节软骨退变和骨赘形成为主要病理特征的关节疾患，是膝关节疼痛的常见原因。随着我国人口老龄化进程的加快，骨关节炎的发病率也在逐年增高，尽管人工关节置换术能为众多的患者解除痛苦，但由于人工关节费用高、创伤大、痛苦多等原因，目前尚不能普及。几年来，西华县人民医院疼痛科采用玻璃酸钠联合中频药物导入法治疗膝骨性关节炎，临床应用效果良好。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组患者167例，均符合1995年美国风湿病协会修订的诊断标准［1］。其中男74例，女93例。年龄44～76岁，平均(55.1±3.5)岁。病程3个月～15年。单膝发病121例，双膝发病46例。发病原因或诱发因素：膝关节畸形22例，扭伤13例，创伤及手术后8例，身体肥胖108例，无明显原因26例。全部病例均有膝关节疼痛，劳累后加重，休息后缓解之特点。合并有晨僵及跛行者45例，有起步疼痛及胶着现象者44例。临床检查压痛点多分布在膝关节两侧及髌骨周围。膝关节肿胀伴积液者23例，伸屈功能障碍者67例，活动有弹响及绞锁着32例，髌骨研磨试验阳性者78例。膝关节正侧位X-Ray片显示：膝关节间狭窄78例，胫骨踝间棘及关节边缘变锐65例，关节两侧骨赘形成45例，髌骨上下缘增生66例，关节内游离体2例。实验室检查：抗“O”及血沉均正常。

采用随机数字表法进行分组，玻璃酸钠注射＋中频药物导入组共有84例患者，中频药物导入组共有83例患者。两组患者在性别、年龄、病史等方面差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 治疗方法

1.2.1 中频药物导入治疗(电脑中频离子导入治疗仪由南京炮苑电子技术研究所生产，型号：NPD-4AS)，25 min/次，1次/d，连续治疗5周。中频药物导入液由当归、红花、伸筋草、透骨草、牛膝、羌活、防风、威灵仙、川芎、木瓜、生川乌、生草乌等中药煎制而成。

1.2.2 关节腔内药物注射 透明质酸采用山东正大福瑞达制药有限公司生产的透明质酸注射液(商品名施沛特)，为一次性注射包装，每支2 ml,含玻璃酸钠20 mg。注射部位常规消毒，在严格无菌操作下用1％利多卡因2 ml局部麻醉后，行关节穿刺，有落空感后回抽无血，推注无阻力，如有关节积液，应抽尽并保留针头位置，将玻璃酸钠注射液推入关节腔内，拔针后在穿刺部位无菌敷料覆盖保护针孔，然后缓慢被动活动膝关节数次，使玻璃酸钠均匀分布在关节软骨和滑膜表面，注射1次/周，连续5次为1个疗程。治疗后嘱患者尽量减少活动，充分休息，注射治疗当天停止中频药物导入治疗。

中频药物导入组：单纯采用中频药物导入治疗。玻璃酸钠＋中频药物导入组：除采用中频药物导入治疗外，每周行玻璃酸钠注射治疗1次。两组患者在治疗期间均不进行针对骨性关节炎的其他干预措施。

1.2.3 二组患者均在治疗期间限制致痛性活动，进行不负重膝关节屈伸活动及股四头肌等长收缩练习。

1.3 疗效评定标准 根据患者治疗前与治疗终点时症状及关节活动度总积分的降低百分率(改善率)来判断疗效，疗效分为临床控制(改善率≥95%)、显效(70%≤改善率＜95%)、有效(30%≤改善率＜70%)和无效(改善率＜30%)四级。

1.4 统计学处理 应用SPSS 12.0软件进行分析。数据均数±标准差(x±s)表示，两组计量资料的差值均服从正态分布，采用配对t检验进行统计学比较，P

2 结果

两组患者治疗前后症状、体征综合疗效、总有效率比较，均P

3 讨论

膝关节退行性关节病是一种常见的以关节软骨损害为特征的慢性关节疾病，其病变常累及软骨及软骨下骨、滑膜、关节周围组织。严重危害中老年人健康，临床常见、多发，严重影响患者的生活质量，临床上越来越受到重视。对该病病因，发病机制尚不十分明确，临床治疗方法虽多，但都不彻底。近年来，以高分子透明质酸制剂为代表的氨基糖类物质作为关节软骨保护剂，用以预防和治疗骨关节软骨病的研究，开拓了骨关节软骨病治疗的新领域。实验研究已证实应用玻璃酸钠凝胶液作关节内注射，能有效地预防兔关节软骨的退变，阻止了软骨基质降解酶对基质的损害［2］。由于该制剂之分子量与滑膜液中透明质酸分子量接近，且具有良好的生物相容性，能在体内完全代谢或吸收，因此高分子量、高浓度、高粘弹性的玻璃酸钠，能提高滑液中玻璃酸钠含量，增强关节液的粘稠性和功能，减少组织之间的摩擦，缓冲应力对关节软骨的作用，保护关节软骨，促进关节软骨的愈合和再生，同时透明质酸钠进入软骨基质，与某些疼痛介质结合，缓解疼痛，增加关节活动度。

中频电疗仪的中频药物导入作用是利用直流电的电场作用以及电学上“同性相斥”的原理来进行的，带负电荷的药物被直流电场的负极推动进入人体，带正电荷的药物则被正极推动进入人体。应用中频电疗仪有利于提高中药有效成分在膝关节内的渗透和吸收。中频电疗本身可有效改善膝关节局部血液循环，温通静脉瘀滞，降低骨内压力，加速新陈代谢，增加局部组织氧离子和营养成分的供给，具有消炎、镇痛的作用。

玻璃酸钠注射配合中频药物导入治疗膝关节骨性关节炎，内外结合，标本兼治，治疗效果远高于单一的治疗方法，值得临床推广应用。

功能锻炼对膝骨性关节炎的治疗及预防复发均有重要意义。尤其是病程较长的患者，股四头肌大多有不同程度的萎缩，关节稳定性较差，故要特别重视股四头肌的锻炼。长期坚持锻炼，对保持膝关节稳定，防止复发，控制病情发展十分有利。

参 考 文 献

关节软骨的生物力学特性篇10

【关键词】 骨关节炎； 强力霉素； 尿激酶型纤溶酶原激活剂； 基质金属蛋白酶

Abstract：［Objective］To investigate the effects of doxycycline on rabbit immobilized osteoarthritis and their mechanism.［Method］Twentyfour rabbits were randomly pided into normal，model，control and treatment groups，with 6 rabbits in each group.All of the animals were immobilized the lower left limbs with plaster bandage for 4 weeks except normal group.Doxycycline was orally given to treatment group.Cartilage degeneration of the medial condyle of femur was observed at 4 weeks and the levels of collagenⅡ，uPA and MMP13 were tested.［Result］Cartilage degeneration in treatment group was significantly slighter than those in model and control groups.Data of collagenⅡ，uPA and MMP13 between model and control groups had no significant difference，but a noticeable statistical difference among other groups.The uPA activity was positively correlated with MMP13.［Conclusion］Doxycycline inhibits the degeneration process of cartilage and improves the structure.The effects may be related to the inhibition of uPA and MMP13.

Key words：osteoarthritis;

doxycycline;

urokinasetype plasminogen activator;

matrix metalloproteinase

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种渐进性的退行性关节病，其发病与增龄、遗传、外伤等因素有关。关节生理环境失衡导致的炎症性级联反应在OA的发病中起着重要的作用［1］。而针对病理生理学改变的OA病情改善药物成为目前研究热点。本实验用强力霉素治疗兔制动OA模型来探索其治疗价值。

1

材料和方法

1. 1

动物及试剂

新西兰大白兔（新疆医科大学实验动物中心，医动字第16-003号）；强力霉素片（常州制药厂，批号：07121015）；Ⅱ型胶原单克隆抗体（Merck）；MMP-13单克隆抗体（CHEMICON）；uPA抗体（武汉博士德）。

1. 2

模型的建立与分组

健康成年新西兰大白兔24只，雌雄各半，平均体重约2. 5 kg，随机分为正常、模型、对照和治疗组，每组6只，正常组不予特殊处理，其他各组动物以石膏固定左下肢制作OA模型，固定范围自腹股沟下2. 0 cm 处至足趾，膝关节伸直位，踝关节背伸60°。4周后去除石膏，处死模型组动物，观察左膝关节退变情况，然后治疗组给予强力霉素25 mg/d，分2次灌胃治疗，对照组给予等量生理盐水。于用药4周后同时处死，观察比较。

1. 3

组织取材

先行左膝关节大体观察，然后以锐利刀片小心切取股骨内侧髁负重区同部位钙化层上软骨约3 mm×5 mm，10%中性甲醛溶液中固定后，做成石蜡切片，留做免疫组化染色，测定Ⅱ型胶原含量和uPA、MMP-13的表达情况；再将剩余全层软骨一并切除，进行HE染色和甲苯胺蓝染色。

1. 4

检测指标

关节软骨甲苯胺蓝染色，Mankin评分；免疫组化染色结果以Olympus dp70数码成像分析系统，在高倍镜下随机选取10个视野，分区测定Ⅱ型胶原IOD值与uPA和MMP-13阳性细胞占总细胞数的比率。

1. 5

数据处理

所得数据以±s表示，应用SPSS 13. 0软件处理，进行方差分析和t检验。

2

结

果

2. 1

大体与光镜观察

正常关节软骨面光滑，瓷白色，无溃疡及缺损。光镜下层次清晰，无裂隙，潮线完整，细胞排列有序。模型组关节内有黄褐色积液，关节囊增厚，滑膜增生，软骨面有糜烂溃疡，甚至缺损，周围软骨增厚变软，呈灰黄色，关节边缘可见骨赘形成。光镜下染色不均，部分区域全层软骨缺损，缺损区周围细胞和基质增生明显，细胞数增多，紊乱，甲苯胺蓝染色淡染。对照组增生反应仍较明显。细胞增生，簇集，结构紊乱，细胞簇集处甲苯胺蓝染色加深，远离部位染色仍较淡。治疗组退变较轻，缺损区周围软骨面较光滑，色泽稍暗，无明显骨赘。镜下软骨增生不明显，结构较规则，甲苯胺蓝染色轻度减退，细胞数基本正常（图1）。

2. 2

Ⅱ型胶原免疫组化测定

正常软骨Ⅱ型胶原染色均匀分布于钙化层以上的各层软骨，模型组和对照组主要集中在软骨深层，不均匀，呈斑片状深染区域，表中层表达明显减少，IOD值显著低于治疗组（P

2. 3

MMP-13和uPA免疫组化测定

正常软骨MMP-13和uPA仅有微弱表达，模型组和对照组表达明显增强，对照组MMP-13较模型组为弱（P0. 05），治疗组两者表达均明显减弱（P

各组指标Mankin评分，Ⅱ型胶原免疫组化、MMP-13免疫组化测定结果

3

讨

论

强力霉素是四环素类药物。除抗生素作用外，它还可通过多种途径对OA软骨起保护作用［2］。MMP是软骨降解的主要蛋白酶之一，能直接降解软骨的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，破坏软骨结构。MMP-13在关节软骨降解中起主要作用［3］。强力霉素则可以通过其螯合Zn2+和Ca2+的特性抑制MMP的活性，使病情得到改善。本实验正常组MMP-13仅有微弱表达，模型组和对照组呈高表达。强力霉素治疗后，退变软骨的损伤性反应明显减轻，MMP-13活性明显低于模型组和对照组（P＜0. 01）。

uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，主要通过与uPAR结合发挥作用，但uPA也可将纤溶酶原激活为纤溶酶，间接激活其他蛋白水解酶以及直接降解细胞外基质和基底膜等［4］。MMP的激活因子可由软骨细胞产生的uPA利用纤溶酶原生成的纤溶酶激活，从而使OA关节软骨中MMP的表达增高，Ⅱ型胶原被裂解而变性。研究表明，uPA介导的细胞外基质蛋白裂解作用与OA的关节软骨和骨的破坏密切相关［5］。本实验中，正常组uPA仅有微量表达，模型组和对照组的表达明显增高，治疗组表达明显减弱，与MMP-13表达呈正相关。表明强力霉素并不仅是MMP-13的抑制剂，同时对uPA的表达也有抑制作用，可能是一种潜在的uPA抑制剂。

关节软骨损害是OA的基本病理变化，而软骨细胞外基质的合成与降解失衡是造成软骨退变的重要原因之一。正常情况下，软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等细胞外基质，同时还合成少量的uPA、MMP以及它们的天然组织抑制剂，以维持软骨的正常新陈代谢。OA时，关节软骨细胞克隆，基质合成加速，但新合成的软骨细胞外基质最终不足以维持正常的软骨结构，从而发生了软骨的进行性破坏。本实验模型组关节软骨有明显的增生性反应，但是增生组织结构紊乱，已失去正常的关节软骨功能。治疗组关节软骨结构明显改善，Mankin评分和Ⅱ型胶原的含量明显增高（P＜0. 01），对照组则变化不明显。考虑为强力霉素抑制了uPA和MMP-13的表达，使软骨的结构和功能趋向正常化。但是对于已经造成的软骨损伤则无法恢复，只能由纤维软骨增生替代。

目前OA的治疗仍以缓解症状为主。而病情改善药物与症状改善药物的合理搭配，可能是一种更为合理的治疗方案［6］。本实验表明，强力霉素能有效抑制uPA和MMP-13的表达，改善软骨的结构和功能，可能是一种有效的病情改善药。本实验为进一步的临床研究提供了相关理论依据。

参考文献

［1］ Krasnokutsky S，Samuels J，Abramson SB.Osteoarthritis in 2007［J］.Bull NYU Hosp Jt Dis，2007，3:222-228.

［2］ 李 兵，吴志宏，邱贵兴.四环素类抗生素治疗骨关节炎的作用机制及应用前景［J］.中国矫形外科杂志，2007，3:197-199.

［3］ Mitchell PG，Magna HA，Reeves LM，et al.Cloning，expression，and typeⅠ collagenolytic activity of matrix metalloproteinase13 from human osteoarthritic cartilage［J］.J Clin Invest，1996，97:761-768.

［4］ Alfano D，Franco P，Vocca I，et al.The urokinase plasminogen activator and its receptor:role in cell growth and apoptosis［J］.Thromb Haemost， 2005，2:205-211.