动物细胞培养技术十篇

动物细胞培养技术篇1

【关键词】病毒类疫苗 生物制品 细胞培养

疫苗是将病原微生物（如细菌、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。根据其所预防的传染病病原体种类不同大致可分为细菌类疫苗和病毒类疫苗两大类。现在在人群中使用的病毒类疫苗，除了乙肝疫苗是通过基因工程方法制得，其他病毒类疫苗生产都需要通过对病毒的培养，而后再经过纯化、浓缩、或灭活或裂解等过程制备。病毒体是一类专营宿主细胞内寄生型微生物，其繁殖需要在其特定的宿主细胞内进行。所以，病毒类疫苗生产过程中对病毒的培养就需要首先培养病毒体能够在其中繁殖的动物细胞。直接感染动物培养病毒存在着不同个体之间的差异，后继纯化程序太过繁琐等缺点，存在一定的安全隐患，所以此种病毒培养方法现在已经基本被淘汰。

在2010年版的《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）第三部生物制品类中预防类生物制品共包括48种疫苗，其中病毒类疫苗共有27种，分别针对乙型脑炎、森林脑炎、狂犬病、流感、乙型肝炎、甲型肝炎、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹和肾综合征出血热等11种病毒性传染病。在这27种病毒类疫苗的生产工艺过程中，有两种重组乙型肝炎疫苗是使用重组CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）和重组酵母菌生产乙型肝炎表面抗原蛋白质作为疫苗抗原，其他病毒类疫苗生产中病毒的培养方式全是在动物细胞中，包括，通过原代细胞培养方式、通过人二倍体细胞或Vero细胞培养方式、在鸡胚中培养方式。在相应的病毒接种之前，首先要做的工作就是培养这些动物细胞。

1 动物细胞培养一般过程

动物细胞培养是指在体外培养活的动物细胞群体，当前，许多生物技术领域都会使用到此项技术。特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如疫苗或基因工程药物在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。动物细胞培养常用的仪器设备包括，无菌室、超净工作台、低温冰箱、pH计、压力蒸气消毒器、电热恒温培养箱、培养器具、CO2培养箱、恒温水浴锅、倒置显微镜、离心机、无菌过滤器、洗刷装置、细胞计数板和电子细胞技术仪等等[1]。细胞培养又可分为原代细胞培养和传代细胞培养。

1.1原代细胞培养

原代细胞培养是将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。其基本步骤包括：取材、剪切、消化、分离、计数、培养，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及其生长环境的无菌[2]。由于原代培养的细胞转化极性较小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗。在《药典》第三部病毒类疫苗中，包括利用原代兔肾细胞培养风疹病毒，利用原代猴肾细胞培养脊髓灰质炎病毒，利用原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒、乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒、森林脑炎病毒，利用原代鸡胚细胞培养麻疹病毒、腮腺炎病毒，利用原代沙鼠肾细胞培养肾综合征出血热病毒。

但原代细胞培养也存在着有潜在外源因子、不能事先检查标化、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。因此，利用稳定的传代细胞来代替原代细胞培养这些病毒成为未来发展方向。《药典》第三部中，上述的各类病毒的不同毒株也有在人二倍体细胞中培养生产的疫苗，如：风疹病毒BRDⅡ减毒株、脊髓灰质炎病毒Sabin株，还有在Vero细胞中生产的冻干人用狂犬病疫苗、冻干乙型脑炎灭活疫苗等。

1.2传代细胞培养

传代细胞培养，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代或者再培养，对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。疫苗生产中的传代细胞培养是指对稳定细胞系的培养，取出生产指定用的冷冻保存细胞系，经过细胞复苏后进行培养过程。《药典》第三部中规定疫苗生产可利用的传代细胞是人二倍体细胞和Vero细胞。

人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗。用于疫苗生产的细胞株，必须符合相关规程要求。不能含有外源因子，核型正常，对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。第一株人二倍体细胞（HDC）WI-38建立于1961年，此后发现狂犬病毒PV株、PM株、HEP株、LEP株都可以在HDC中持续感染。法国于1974年12月批准了人二倍体细胞狂犬病疫苗（HDCV），因为它的高度安全性，HDCV也被WHO（世界卫生组织）推荐为金标准参考疫苗。但是，其生产成本很高，所以通常仅适应于发达国家[3]。

Vero细胞是由日本学者Yasumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴壁依赖性细胞系，它也是WHO和我国认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，Vero细胞具有以下特点：①来源方便，可连续传代，生长速度快；②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；⑧遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高；④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。因此Vero细胞也成为众多病毒类疫苗生产科研人员研究对象。有已经应用成功的狂犬病疫苗，处于临床试验期的流感疫苗，还有正处于研发过程中的脊髓灰质炎疫苗、乙型脑炎疫苗等[4、5]。

2 流感病毒的培养

流感疫苗生产过程中流感病毒的培养是在鸡胚尿囊腔中接种，病毒感染鸡胚尿囊腔上皮细胞培养方式。这种方式也是目前流感疫苗生产最常见的方式。但是，在实际应用中存在不同批次鸡胚供用之间有差异，在流感爆发季节鸡胚供用量无法满足，和生产过程人力劳动量大等不足之处。所以，使用动物细胞培养方式生产流感疫苗就进入了人们视野。WHO也建议使用已经建立的哺乳动物细胞系替代鸡胚进行流感疫苗生产[6]。目前实验使用的细胞有Vero细胞、Madin Darby狗肾细胞（MDCK）等。

3 病毒细胞培养的不足与其技术发展

由于疫苗使用对象是健康人群和婴幼儿，它的安全性始终是人们所关注的焦点。使用原代细胞培养和使用含有血清培养基培养细胞来生产病毒疫苗存在着不同批次原代细胞或血清之间有差异、易带入外源蛋白因子等一定的安全隐患。因此，现在科学研究一方面致力于寻找适用于细胞系培养的病毒株，另一方面在研究使用无血清培养基培养细胞技术。Vero细胞无血清培养技术已经在狂犬病疫苗生产中成功运用，在流感疫苗生产中运用目前已经处于临床试验期间[4]。另外在细胞大规模生产中使用的生物反应器技术的发展也是病毒类疫苗生产过程中的关键技术。国外推广较多的生物反应器有：美国NBS公司的填充床细胞培养反应器和Wave摇袋式一次性细胞培养反应器[7]。微载体悬浮培养技术已经成为动物细胞大规模生产中较常采用的技术。通过体外表达病毒结构蛋白，在特定状态下可自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒的病毒样颗粒（VLPs），利用此项技术生产疫苗也已经成为病毒类疫苗生产的一种新途径。

参考文献：

[1] Rajeev Nema， Sarita Khare. An animal cell culture： Advance technology for modern research [J].Advances in Bioscience and Biotechnology， 2012，3，219-226.

[2]周珍辉主编.动物细胞培养技术[M].中国环境出版社，2006（08）：01

[3]王月，黄思佳.现代狂犬病疫苗生产用细胞和毒种：现状与前景[J].国际生物制品学，2012.vol35.No.5.

[4]陈天，陈克平，陈昭烈.Vero细胞无血清培养技术的研究与应用[J].生物技术通讯，2009.vol20.No.3，417-425.

[5]王辉，过琴媛，张月兰等.Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗生产工艺参数的研究[J].生物学免疫学进展，2006年第34卷第3期.

[6]Perdue M L，Arnold F，Li S，et a1.The future of cell culture based influenza vaccine productions[J].EXPERT REV VACCINES.201l.10（8）：1183―1194.

动物细胞培养技术篇2

关键词 细胞工程 教学改革 生物技术

中图分类号：G642 文献标识码：A

细胞工程是理论与实践结合的综合性很高的一门学科，是应用细胞生物学和分子生物学的原理方法，在细胞水平上研究、改造生命遗传物质，以获得具有目的性状的细胞系或生物体的理论和技术的学科，它既是现代生物技术的重要组成部分，也是现代生物学研究的重要技术手段和工具，在高校生命科学及相关学科的课程设置中占有重要地位。①

在食品学科和食品生物技术专业上，细胞工程应具有有别于生物学科的教学内容和应用实例。结合食品生物技术专业的教学目的和现有教材，在课程内容上进行调整，注重其在食品生物技术上的特色和应用，并保持教学内容系统性与完整性，保证授课内容的全面、趣味、实用。站在现代科学发展的前沿，掌握生物工程领域科技发展的最新动态，及时把这些动态、研究成果以及有待攻关的技术和课题融入教学内容，激发学生学习探索新知识的兴趣，提高学生的综合能力。为此，本文对该课程的改革进行了如下的探讨。

1 对教学内容的改革

1.1 精选教学内容

教学内容是教学的核心，是教师给学生传授的知识和技能，灌输的思想和观点，培养的习惯和行为等的总和。随着对教学改革的开展，教学内容具体为教学过程中同师生发生交互作用、服务于教学目的达成的动态生成的素材及信息。

对于细胞工程来讲，涵盖了植物细胞工程和动物细胞工程两部分内容，在通常的专业设置上，各学校会根据自己的研究和应用领域，侧重于植物细胞工程或者动物细胞工程。在教学内容上，通常在植物细胞工程中会涉及植物组织和细胞培养、快速繁殖、原生质体培养、单倍体育种等内容；在动物细胞工程中会涉及动物的细胞培养、组织培养、单抗的生产、转基因动物的获得等内容。②

在食品学科和食品生物技术领域，植物细胞工程和动物细胞工程的知识都要涉及，简单来说植物细胞工程为食品来源提供基础研究手段，动物细胞工程可以为食品的功能性、安全性提供研究方法。植物细胞工程可以为学科建设和学生的知识体系提供包括组织培养、细胞培养、转基因技术等在内的知识，这些内容会应用在植物有用次生代谢物的生产方面，忽略传统生物学科中的人工种子、单倍体育种等偏重于生物学和农学的内容；动物细胞工程中的组织和细胞培养，不仅可以提供食品中功能成分研究的体系，还是一种重要的研究手段和生产方式。所以，本研究从植物细胞工程和动物细胞工程两方面选择在食品学科和食品生物技术中有理论和应用价值的内容，对细胞工程原理的教学内容进行更新。

结合以上所述食品学科特点和细胞工程学科特点，本课程主要围绕以下几个方面展开：一是细胞工程基础，包括基本概念，主要研究内容，细胞培养的基本设施、条件、方法和技术等；二是植物细胞工程， 包括植物组织培养、脱毒与快繁、原生质体融合、转基因技术等；三是动物细胞工程，包括动物细胞培养、细胞融合、细胞重组与克隆、转基因动物与生物反应器等；四是细胞工程的实践与应用，包括细胞工程及其相关技术的发展现状与应用进展，及其产业化发展前景等。把最新的科技发展成果融化到教学内容中，提高教学内容先进性、科学性；精选整合教学内容，注重理论并联系在食品生物技术中的研究和应用。

1.2 补充教学内容

在食品生物技术中，需要补充通常的生物技术中不会涉及的内容，如在植物组织和细胞培养生产有用的次生代谢物部分，通常来讲会涉及像黄酮类、萜类等有药用功效的次生代谢物，而对于食品生物技术专业来讲，选择一些色素类、香料类物质的次生代谢，可能应用在食品工业上的物质更符合专业特点。在动物细胞工程中，转基因动物内容的设置需要淡化，对于本专业来讲，动物细胞和组织培养在食品的安全性和功能性的检测上的作用和意义则显得更为重要。

1.3 开展细胞工程在食品生物技术中的应用讨论

面对近年来层出不穷的食品安全环节出现的问题，作为生物技术专业的重要课程之一，细胞工程应该提供学生发现、分析、解决该问题的思维方式，如对膨胀素在西瓜早熟过程中的作用、某些食品成分的安全性问题。在细胞工程课程中，学生能够了解细胞融合、杂交育种和转基因技术的差异，可以在他们的知识层面开展一些针对性的分析和讨论。提高社会民众的素质，应该至少从专业的学生做起，让他们具有分析问题、解决问题的能力。

2 对实验教学环节的改革

实验教学是对理论学习的有效验证和补充、延伸，在改革理论教学的同时，实验教学应当同步调整。细胞工程学是一门实验性很强的学科，某种意义上讲，细胞工程仍然是一种方法和技术，而且与其它生物技术课程交叉性很强。③在细胞工程的实验教学过程中，选取代表性的，能够体现细胞工程特点和技术的内容进行开展。④⑤如在植物细胞工程的组织培养环节，通常的生物技术课程会选择烟草等模式植物进行再生，虽然说烟草作为模式植物在通常的研究过程中具有普遍性，但是在食品生物技术专业，应该就具有食品特色材料进行展开，比如胡萝卜、番茄等的组织和细胞培养，在培养技术和过程上具有普遍性，从材料上和应用性上比较贴近食品。

改变通常的实验教学内容零散、断续和不相关的特点，在植物细胞工程部分，整个实验内容自成体系，每个实验环环相扣，而这一系列实验要求学生掌握基本的操作技能，对细胞工程的理论知识和实验技能有个系统的、完整的认识。例如，在植物细胞工程中的无菌苗繁育、快速繁殖、愈伤组织的诱导、细胞培养等，这一系列的实验，可以在老师指导下，由学生分组、选择自己的材料来完成，由此学生不仅可以掌握实验技能，还能更好地理解和应用所学知识，真正地将理论和实践联系起来。

3 改革教学方法

3.1 采用启发式、探究式教学方法

作为综合技术课程，细胞工程的各章节逻辑性不强，理论表述较少，应用技术细节较多，给欠缺基础知识的学生在理解、记忆课本内容时带来较大的难度。因此，在教学过程中，要大力提倡启发式、问题探究式、讨论式、训练与实践式教学方法，鼓励学生大胆质疑、自由探索，最大限度地发挥学生学习的主动性、积极性和创造性。⑥在讲授细胞重组与克隆过程中，只讲解细胞重组和克隆相关原理，而克隆的最新进展则由学生在查阅资料后，对其做讲解和归纳总结，由教师和其他学生给予评价和修正；并在介绍各种技术后，通过自主查阅文献，学生会发现更多自己更感兴趣的应用。

3.2 应用现代教学手段，提高教学质量

细胞工程是一个基础性和实践性很强的学科，课程的信息量大，内容基本是微观水平，传统的教学模式无法为学生呈现如此大量的课程内容，而且也很容易引起学生对课程的懈怠，降低学习兴趣，影响教学效果。为了提高教学效果，以计算机为工具，通过多媒体、教学录像、网络资源等现代化教学手段，不仅可以向学生提供丰富多彩的教学信息，还可以提供更加美观的人机交互界面，充分调动学生的情绪、情感、注意力和兴趣。使那些抽象的、在普通条件下难以观察到的、生长周期长的过程直观而形象地展示出来，有利于培养学生独立灵活地分析问题、解决问题的能力，提高教学质量，同时激发学生的学习兴趣。⑦

3.3 给予学生思考空间，提高学生提问能力

在我们的教学过程中，常常会发现学生在听讲，但是却没有深入思考，其中的一个表现就是没有提出问题。究其原因，在教师方面，没有留给学生思考的空间，没有诱导他们去思考；在学生方面，习惯于接受固定的、不需要质疑的知识，而在教学过程中的没有质疑、没有问题，某种程度上体现教学环节上的缺失，影响整体的教学效果。而提问、讨论的环节，无疑会帮助学生对知识理解得更加清晰，而且还可以提高学生的综合能力。对于食品生物技术专业来讲，知识跨越了食品和生物两个学科，简单的知识在日常生活中可见，复杂的生物学问题在科研中探讨，所以从这个角度来讲，在本专业中开展提问、讨论的教学方式是可行的，可以通过多重方式来诱导和实现。

4 结语

在细胞工程的课程改革中，我们的目标是调整为符合食品生物技术专业设置的教学目标的教学内容，采用能够现代化的教学手段，充分激发学生的学习热情，能够提升学生发现问题、思考问题、解决问题的能力，培养出掌握专业理论和专业技能、综合素质高、能力强的人才。本文对细胞工程教学的改革尝试，从教学内容、教学手段、实验教学等角度进行的思考和尝试，应用在教学过程中，并在此过程中进一步进行调整和补充，希望对食品生物技术专业的教学效果提升和知识体系建设有所启发和帮助。

课题项目：中国农业大学教学研究项目，项目编号201246

注释

① 王蒂.细胞工程学.中国农业出版社，2003.

② 赵会敏.生物技术专业动物细胞工程课程的改革与思考.广西大学学报（哲学社会科学版），2011.33（6）：172-173.

③ 刘清波，黄红梅，赵燕.农业院校细胞工程实验教学改革探析.现代农业科技，2010（15）：27-28.

④ 李艳红.细胞生物学和细胞工程实验教学的几点体会.实验室研究与探索，2004.23（7）：51-52，66.

动物细胞培养技术篇3

关键词：细胞室；管理；维护

中图分类号：R318

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）10023202

1 引言

细胞培养技术是指将活体的一小部分组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养、繁殖的技术[1]。现代生物技术的发展几乎都离不开细胞培养技术，尤其是在生物医学工程领域的发展，细胞培养技术更具有特殊的作用。许多重要的生物产品如疫苗、单克隆抗体、生长因子等都是通过细胞得来的，因此细胞培养技术的价值不言而喻。如今，细胞培养技术已然成为生命科学领域必备的基本实验技术之一[2，3]。

细胞室是进行细胞培养、细胞相关研究活动的重要场所，由于细胞培养要求无菌操作，因此细胞室的建设布局、维护管理也就有别于一般的实验室。笔者根据常州大学生物医学工程与健康科学研究院（医工院）中细胞室的建设经验，探讨细胞室的布局、管理与维护的方法。

2 细胞室的布局

细胞培养的区域划分一般涉及以下几方面：无菌操作，细胞培养用液配制，细胞孵育，储存，清洗、包装和灭菌。其中无菌操作，细胞培养用液配制、细胞孵育和储存区域对环境的要求严格，清洗、包装和灭菌区只需正常实验室环境即可。因此，细胞培养区域的布局可以按照操作类型和洁净要求进行划分。医工院实验室将细胞培养相关区域做如下规划：清洗、包装和灭菌工作在准备间中进行；细胞培养用液配制，储存，无菌操作及细胞孵育区在细胞室进行；准备间与细胞室相邻，以便进行物品传递。

准备间无特殊要求，划分清洗、包装和灭菌三个区域即可；细胞室要求较高，一般都装有高效空气过滤装置及专业恒温恒湿空调系统以保证室内环境清洁，细胞室顶部装有紫外灯以便进行日常无菌维护，墙面也多为易于消毒灭菌的彩钢板[4]。

医工院细胞室的区域布局如下：①日常服装存放区，用于存放外套、鞋、包等日常物品；②洁净室鞋服存放区，用于更换细胞室专用洁净服、洁净鞋及佩戴口罩等，该区域顶部装有紫外灯，以便对日常维护洁净物品；③风淋区，对洁净服外进行再次清洁，风淋区地面设有粘尘地垫，以保证除尘效果；④洁净走廊，洁净走廊内设有传递窗，以便递送灭菌物品等，另外洁净走廊可通向培养室；⑤培养室，细胞培养操作的区域，室内设有废液缸和消毒桶等。

3 细胞室的管理

细胞室建成以后，应从人才培养、制度建设、日常监管三方面加强细胞室的管理。

3.1 人才培养

细胞是一种特殊的生命，很多因素都能导致其发生微妙的变化，其中人员复杂同时缺乏系统技术培训是引起细胞室经常性污染的主要原因之一，一旦细胞室发生污染，那么就会造成科研工作的严重滞后，因此，要注重细胞室实验人员及学生的技能培训。

医工院通过引进、培训等手段建设一支具有专业素养的细胞室技术人员队伍，然后由细胞室技术人员对进入细胞室的人员进行统一培训和考核，考核合格后方能进入细胞室工作，尽可能的减少人为因素造成的细胞培养室污染，平时医工院内部细胞室技术人员举办讨论交流活动，也参加相关讲座、培训班及外出参观学习等活动，不断提高细胞室技术人员的技术水平。

3.2 制度建设

3.2.1 细胞室日常管理制度

医工院细胞室的日常管理制度涵盖了安全、卫生、公共事务等几方面内容。安全方面包括用电安全、用水安全、用火安全及用气安全；卫生方面包括个人卫生、实验室值日安排、消毒灭菌安排等内容；公共事务方面包括洗涤、包装、灭菌、配置消毒液、配置或分装细胞用液等内容。

3.2.2 细胞培养室人员准入制度

细胞培养室采取刷卡进入制度，非细胞培养室管理技术人员在进入细胞培养室前必须进行一段时间严格的安全与技术培训，经考核合格后方能开放临时卡进入细胞培养室开展工作，开展工作后有三个月实习期，实习期内无安全事故、无污染事故、认真履行职责、服从安排者可开卡长期出入细胞培养室，若实习期未达标则不允许进入细胞培养室或重新进行培训。

3.2.3 细胞培养室设备管理制度

细胞培养室内的设备一般包括超净台、细胞培养箱、离心机、液氮罐、倒置显微镜、冰箱、钢瓶等设备，这些设备应具备操作流程及注意事项，由专人维护，医工院细胞室设备采用预约制度保证日常工作有序开展。

3.2.4 细胞培养室意外事故应急预案

任何实验室都应该准备实验室意外事故应急预案，细胞室也不例外，但由于细胞室本身结构的特殊性导致其事故应急预案更具有针对性。

细胞培养室容易发生二氧化碳泄露，酒精灯起火或爆炸，培养箱长期不断电运转造成的起火等风险，因此，要建立专门的应急预案应对消防安全事故的发生。

对于细胞培养室来说，生物安全也是必须引起重视的。对于细胞的原代培养实验来说，经常接触到动物组织、尸体等生物废弃物，如操作处理不当，易引起生物安全事故。这不仅要求我们实验过程中严格遵守操作规程，做好实验防护工作，还要根据实际情况建立生物安全应急预案，以便应对突发生物安全事故。

另外，在细胞培养过程中容易出现细胞污染的情况，细胞污染大致可以分为细菌污染、真菌污染、根据细胞污染的类型建立细胞培养室污染应急预案有利于降低细胞培养室损失。

3.3 日常监管

细胞培养室的日常监管主要包括学生的操作技术，细胞培养试剂耗材，细胞培养室环境监控等内容。医工院检查学生的操作技术是通过随机抽查某个学生的细胞培养实验的方式来进行，以便及时纠正学生在细胞培养过程中不正确操作；细胞培养用的试剂耗材按价值分为不同的管理类型，由不同的人员负责，保证实验的顺利进行及避免浪费；细胞培养室内的环境监控主要是检查细胞培养室内空气的洁净程度及氧气浓度，因此细胞培养室内要定期采用沉降法测定菌落数量及配备氧浓度检测器。

4 细胞培养室的维护

细胞培养室的维护分为细胞培养室环境维护和细胞的维护。细胞培养室的环境维护分为“硬件”维护和“软件”维护两类，“硬件”维护主要是指定期检查、更换细胞培养室高效过滤系统、超净台过滤器、紫外灯管等设备配件；“软件”维护主要是指细胞培养室的值日安排、大扫除安排等。细胞的维护就是要规范细胞的储存，做好细胞的名称、数量、位置、储存日期、储存者等相关信息的记录存档工作，长期储存的细胞应取出复苏，以便检查细胞状态，定期检查液氮罐、超低温冰箱等细胞存储设备，确保设备能够正常运行。

5 结语

作为生物医学工程领域科研成果产出的重要场所，细胞培养室的重要性不言而喻，建立科学合理的实验室布局，提升细胞培养室管理、技术人员的技术水平，建立完善的细胞培养室管理制度，做好细胞室的日常维护，可以促进相关领域科研水平的提升及实现可持续发展。

参考文献：

[1]司徒镇强， 吴军正. 细胞培养 [M]. 2版. 西安：世界图书出版西安有限公司， 2007.

[2]孟祥玉， 谷铁军， 赵兴红， 等. 国家工程实验室中细胞培养室的建设与管理[J]. 中国现代教育装备， 2014， 17（4）： 29～31.

动物细胞培养技术篇4

1细胞共培养的方法

细胞共培养技术目前应用的方法可分为单层混合共培养技术、非接触式共培养技术和组织工程支架技术。单层共培养是将两种以上细胞放入同一器皿中共同培养的方法,非接触式共培养是通过Transwell小室来实现的。将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下室以聚碳酸酯膜相隔,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。组织工程支架技术是将在体外培养、扩增的正常组织细胞种植到具有良好生物相容性且在体内可逐步降解吸收的组织工程多孔支架上,使细胞在支架上增殖、分化[6]。现阶段美白药物筛选常用的是单层混合共培养技术,非接触式共培养还未见用于美白药物筛选,而组织工程支架技术中的皮肤类似物将可能成为发展方向。

2细胞共培养技术在美白药物筛选领域的应用及发展

黑素合成和转运的每一个过程都有着精细的调控机制,其中任何一个环节出现结构和功能的异常,都有可能引起皮肤色素异常性改变[7-9]。黑素生成是发生于黑素细胞的细胞器黑素小体,此过程包括黑素小体的形成和在L-酪氨酸酶作用下转化成为黑素的生化途径。酪氨酸酶是这一生物合成过程的关键酶,其活性与黑素合成量密切相关,控制其活力即可控制黑素生成量。因此,可通过抑制酪氨酸酶活性和黑素生成量来筛选美白药物,黑素细胞单独培养或黑素细胞与角质形成细胞共培养将是美白中药筛选的有效途径。

大量学者尝试通过黑素细胞单独培养来筛选能够使黑素合成、转运受阻的美白药物。杨壮群等[1,10-12]均通过单独培养黑素细胞筛选出有些中药提取物可以抑制酪氨酸酶活性、降低黑素含量,表明单独培养黑素细胞是一种筛选美白药物行之有效的方法。但随着对皮肤构造的深入了解,研究者意识到与黑素细胞相连的角质形成细胞对其发挥的作用不容忽视,罗增香等[13]通过中药单体蛇床子素、黄芩苷对黑素合成的研究发现,共培养体系中药物对黑素合成的抑制作用强于单独培养的黑素细胞,说明了两种培养方法确实存在差别。由于细胞共培养体系更接近正常人皮肤的真实构造,得出的数据更有说服力,所以研究者便把筛选药物的方法从黑素细胞单独培养向黑素细胞和角质形成细胞共培养过度,而更接近人体皮肤结构的皮肤类似物也有希望成为美白药物筛选的新方法。

2.1单层混合共培养的应用:单层混合共培养是将所研究的不同种类的细胞在同一培养器皿中混合培养。它提供了类似体内的复杂微环境,包括细胞与细胞间的接触反应和细胞因子的作用。由于其操作简便,目前广泛应用于模拟人表皮微环境的实验研究。1988年,Halaban[14]首次成功地将黑素细胞和角质形成细胞共培养,验证了该模型的可行性。马慧军等[15]也成功建立了人表皮原代黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型,为美白药物的筛选提供了可行的方法。仲少敏等[16]选取85种生药醇提物和水提物在 melan-a 与SP-1 共培养体系做实验研究,熊果苷作为阳性对照,结果川芎、威灵仙、桂枝、麦冬、白果、蒿本、红花、白苏叶的醇提物,五倍子的水提物在细胞培养水平对黑素生成有明显抑制作用,强于相同浓度熊果苷的作用,这一结果可为美白药物筛选提供依据。兰海龙等[17]以人包皮组织作为细胞来源,体外构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型,检测芦荟苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后对黑素细胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响,发现三种单体均对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成产生浓度依赖性抑制,初步阐明了美白药物的作用机理。解士海[4] 通过建立人表皮黑素细胞-角质形成细胞共培养的体外模型,研究了丹皮酚、苦参碱、氧化苦参碱、大黄素等中药单体对黑素合成过程的影响,结果表明通过观察黑素小体的转运证明了共培养模型的成功建立;熊果苷、丹皮酚、苦参碱剂量依赖性抑制共培养体系中黑素小体的转运;大黄素、氧化苦参碱对于黑素小体的转运无影响,表明丹皮酚具有很好的美白应用开发前景,大黄素及苦参碱有待进一步研究。左付国[9]建立了人的黑素细胞与角质形成细胞共培养模型,研究了熊果苷和淫羊藿苷两种中药单体对黑素小体转运的影响及其可能的作用机制,发现熊果苷可通过诱导黑素细胞树突退缩,抑制黑素小体的转运,这一研究结果为熊果苷作为美白药物提供了一项新的依据。

2.2皮肤类似物的应用前景:单层混合共培养模型可以对美白药物进行有效的筛选,但Tae-Jin Yoon 等[18]通过实验证明了黑素瘤细胞或黑素细胞单独培养或是与角质形成细胞共培养得到的数据与三维皮肤类似物的均有不同,而皮肤类似物更能准确地表现组织学构造,所以皮肤类似物模型,有望用于中药美白药物的大范围筛选,提高工作效率。人类正常皮肤主要以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主,其中Ⅰ型胶原含量最多,由于胶原分子结构中含有大量的双羧基及双氨基氨基酸和碳水化合物,适于细胞的粘附;胶原又是一种广泛存在于动物皮肤、肌腱和其他结缔组织中的天然蛋白质,来源广泛。因此,在胶原重组膜上接种人黑素细胞和角质形成细胞可以建立皮肤类似物模型。Lee等[19]利用含角质形成细胞和黑素细胞的皮肤类似物模型检测化合物光毒性,结果显示光生物学效应与天然皮肤很接近;Damour等[20]很早便指出组织工程皮肤将成为评估化妆品原料及产品皮肤刺激、光毒性、光保护等特征的有用工具,这都为皮肤类似物模型成为筛选美白中药的有效途径提供了依据。杨颖等[21-22]分别从胎牛皮和大鼠鼠尾腱中提取胶原纤维,再经处理制成生物相容性良好的胶原作为支架,在支架材料上种植成纤维细胞构建皮肤类似物模型。杨壮群等[23-24]通过人永生化表皮细胞(HaCaT)和黑素细胞共培养体系接种在鼠尾胶原凝胶支架上构建皮肤类似物模型。张铁良等[25]将鼠尾胶原溶液、浓缩培养基、NaOH溶液和以血清重悬的成纤维细胞溶液在适当的比例下混合后形成凝胶构建真皮类似物。刘源等[26]也运用组织工程方法以包皮组织作为细胞来源构建含有黑素细胞的皮肤类似物模型。虽然以上皮肤类似物模型的建立多是用于研究皮肤缺损的修复,美白中药筛选还未有人使用这种模型,但由于皮肤类似物模型有可能与人皮肤组织融合,将使得中药美白药物筛选的数据更加可靠,筛选方法更加有效,可以作为美白药物筛选的新尝试。

3小结

现今,通过细胞共培养技术筛选美白药物已成为研究的热点。细胞共培养技术经历了单层细胞的接触、非接触式共培养到三维皮肤类似物,共培养方法已日趋成熟。单层细胞共培养由于操作简单适合于实验室中药物筛选的研究,而且该模型接近真实的人体生理环境,使研究者能够更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点,填补了一种细胞单独培养和整体动物实验的空白[27],用此方法已筛选出了许多有效的中药提取物,有些已用于美白产品中。而三维皮肤类似物模型由于已验证了它与人类缺损皮肤的融合能力,证明了它与正常人皮肤具有良好的相似度,用该模型进行药物筛选得到的结果将更具有可信度。如果能够商品化皮肤类似物,将为中药美白药物的筛选提供一个更方便、快捷、有效的途径[28]。共培养技术的不断发展给研究者带来了新的机遇与挑战,在研究者的共同努力下将会得到更加方便、有效的药物筛选方法。

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动物细胞培养技术篇5

【关键词】　细胞生物学　实验教学　科研素质

细胞生物学是生命科学中重要的组成部分，它能够反映生命科学的形成进程，同时也体现生命科学的最新进展。该学科是由实验研究产生和发展起来的。因此，细胞生物学研究技术和方法的作用及地位显得尤为突出，细胞生物学实验课教学是培养本科生科研素养的重要环节。是研究性学习的重要内容，也是最必要的形式和过程。

1.开设实验课，是生命世纪所需。细胞生物学的发展经历了经典细胞学、实验细胞学及细胞生理学、现代细胞生物学等阶段，推动学科理论内容的产生、发展及丰富的动力是实验研究。例如：显微镜观察方法导致了细胞学的产生，而电子显微镜及其它更精细观察显像技术的应用，可以观察细胞内部的亚显微结构、甚至单一生物分子的位置，更加准确描述细胞的结构与功能。

在大三开设细胞生物学实验课是适时的。大三本科生经过动植物学的学习初步了解动植物细胞的一般特性：通过微生物学的学习，则了解微生物在细胞形态、结构及功能等方面的特殊性；生理学与生物化学的学习，掌握了细胞生命活动的动态性，并且有了相应的实验技能。在此基础上，本科生能够适应较为复杂的细胞生物学实验课的学习和操作。

细胞生物学实验技术直接与当今生命科学的前沿技术接轨，在高年级开设这样的课程，有助于本科生迅速进入毕业论文研究的状态，有助于考研进入更深层次的研究工作。

2.选择实验课内容，注重基本能力和创新能力的培养。参考国内主要细胞生物学实验教材，自编实验教材，编写过程中，注重介绍与某一个实验项目相关的背景知识和实验原理。例如：光学显微镜的使用是最基本的细胞生物学实验，是从事生物学教学和科研必备的基本技能，在实验教材中，作详细介绍，列出不同放大倍数物镜的镜口率、工作距离、景深和视野直径等参数，使学生明确“放大倍数小的物镜工作距离大，放大倍数大的物镜工作距离小，物镜是显微镜中关键部件”等基本规律，有助于使用和选择显微镜。

设计了染色体制备和分带的内容，可以允许每个人动手操作，完成整个实验程序，得到预处理、样品制备、离心、显微镜使用等综合技术的训练。事实反映出操作认真、严谨的同学能获得较理想的实验结果。

选编了细胞培养、荧光显微镜技术等较高要求的实验内容，并附编了相应的前沿技术，如激光共聚焦显微镜原理。这些都是从事细胞生物学科研工作所需的研究技术，该类实验内容的开设，使学生初步了解细胞生物学研究的基本技术路线和实验方法，使学生对实验课的认识从完成操作、获得学分过渡到科研综合性、探索性，乃至创新性的高度。

详尽描述实验操作步骤，特别是不可忽视的、影响实验成败的关键细节，以及实验试剂、药品的配制和仪器实验注意事项等内容。注意操作过程与实验原理的结合，增加图解。例如小鼠骨髓细胞染色体标本制备和C带分析实验，操作步骤多，影响因素多，相对成功率较低，学生兴趣浓。操作程序的清晰、严格要求是完成实验的重要保障。

设计具有启发性的创新性实验及实验后思考题，以激发学生利用所学理论知识和实际动手经验，熟悉怎样设计实验、组建哪些实验技术达到实验目的、哪些步骤是控制实验的关键及其影响因素，甚至可提出修改的方案。

3.注重课前准备，确保实验质量。教师持之以恒动手从事科研实验工作，掌握或了解本学科研究技术的过去、现在及将来。坚持与实验员设计、商讨、准备实验，要有预瞻性，掌握实验中可能出现的问题，以便在课堂及时准确回答学生问题。

作为实验教学的主体，学生的临阵状态也很重要。不少学生习惯于课前不预习，课堂上一边对照实验指导，一边操作，经常导致操作混乱、时间延长甚至实验失败。目前，此类现象仍然较普遍，教师需注意检查督促，进行关键性问题提问、请个别学生上台操作示范，教师再对其中的注意事项、操作错误重点强调。另外，可将预习作为实验成绩的一部分，学生有备而来，提高实验质量。

4.细致指导，重视基本技能训练。细胞生物学实验包括形态、结构观察性实验，也包括操作复杂、技术综合的实验，要求学生牢固地掌握基本实验技能，如显微镜及特殊显微镜的熟练操作，微观世界的确认，临时与永久玻片制作，实验动物解剖，生物绘图方法，离心机的使用，细胞生物学染色体方法，细胞培养过程的无菌要求，这些基本技能都是每个学生必需的。教师必修逐个指导、示范和纠正，培养学生正确的规范的操作习惯。严谨的科学态度、创新的精神和严格的实验习惯，是科研最基本的素养，而本科细胞生物学实验是训练的最好平台。

5.诱导启发，培养创造性思维。细胞生物学实验项目广泛，材料具有多样性和普遍性，教师给学生安排的实验是挑选了典型的材料和经典的实验方法。教师应鼓励学生在完成实验指导指定实验基础上，提出衍生性的实验题目，让学生书面自行设计实验(包括实验材料、方法、目的)，有条件情况下，少部分同学进行创新性实验。强调科研协作的重要性，鼓励同学之间互相学习，有利于同学们开阔视野、培养敏捷的思维，激发对科学的求知欲和对本课程的兴趣。

动物细胞培养技术篇6

关键词：  肺泡巨噬细胞;细胞培养;技术改良

肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)分布于呼吸道-肺泡表面，是肺部抗感染的第一道防线, 是肺部抵抗病原感染的重要组成部分。AM不仅具有吞噬和抗原递呈功能，而且还能分泌多种生物活性物质,对急性肺损伤的发生、发展及转归具有重要影响[1-3]，因此，AM一直是研究肺部抗感染模型的重要细胞类型。但由于在分离培养原代AM过程中存在获取率低、混杂红细胞、容易污染损伤、不易贴壁等技术难题[4]，目前国内外研究者只能使用小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S[5]、大鼠肺泡巨噬细胞株 NR8383[6]等细胞株替代原代AM，然而AM细胞株与原代培养的AM在细胞形态、细胞活力及细胞生理等方面存在明显差异。因此，优化原代AM培养技术从而得到理想的AM对研究肺部感染性疾病发生机制有很重要的作用。本研究探讨AM培养技术的改良措施及注意事项。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂和器材 DMEM(低糖)培养基( Gibco公司 )，胎牛血清(杭州四季青有限公司 )，青霉素、链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)，PBS(北京中杉金桥生物技术有限公司)，台盼蓝染液(Sigma公司)，瑞氏-姬姆萨染液(南京建成科技有限公司)，细胞培养箱(美国 Thermo Fisher Scientific )，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(日本Motic公司)，离心机(美国 Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 AM的分离培养 在参考郭晓芳等[7-8]分离AM技术的基础上，我们对分离AM的方法加以改良。SD大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，引颈处死;在75%乙醇中浸泡消毒1～2 min，移到超净工作台上，仰卧于小手术台上，固定头尾;打开胸腔，暴露肺;暴露颈部气管，用14号注射器针头从颈部正中线切口行气管插管，用4-0的手术缝合线结扎固定[8-9]。用冷PBS在体气管灌洗肺，同时按摩肺，每次5～10 ml，灌洗10次，灌洗液回收率为90%。灌洗液经200目细胞筛过滤，1 000 r/min低速离心10 min，弃上清，再用PBS洗涤2次，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬沉淀细胞制成单细胞悬液。在倒置显微镜下进行细胞计数和台盼蓝拒染试验检测细胞活力，调整细胞密度为1×109个/L ，将其接种于6孔培养板内。在37℃、5% CO2 浓度的培养箱中孵育1～2 h，弃上清，用PBS洗板2次去除非贴壁细胞，重新加入含10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基，继续放入培养箱内培养，2～3天更换培养液。

1.2.2 台盼蓝拒染实验 将0.4 %的台盼蓝染液[10]与等体积单细胞悬液混合，染色2～3 min ,取1 滴混合悬液于细胞计数器内。镜下观察可见，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，计数蓝染细胞和未蓝染细胞。细胞存活率按以下公式计算:

细胞存活率(%)=未染色细胞/(蓝染细胞+未染色细胞)×100%。

1.2.3 瑞氏-姬姆萨染色 取5 μl单细胞悬液于载玻片上，制成涂片。待涂片晾干后，按瑞氏-姬姆萨染液试剂盒说明书操作。染色完成后，在倒置显微镜下观察细胞染色情况，鉴定单细胞悬液中AM纯度。计算公式如下：

细胞纯度(%)=着色巨噬细胞数/细胞总数×100%

2 结 果

2.1 显微镜观察结果 单细胞悬液中AM呈圆形，透亮，培养40 min后可观察到呈椭圆形、三角形或不规则形的贴壁细胞，胞质丰富;2 h 后细胞贴满培养皿底部，细胞呈星形，有许多伪足和突起(图1A);培养2～3天后，细胞形态多样，呈圆形、不规则形、梭形等形态，胞体变大，胞质丰富(图1B)，此时细胞处于对数期，适合进行实验研究。图1 AM的形态学变化(×300)

A.肺泡巨噬细胞贴壁2 h;B. 肺泡巨噬细胞贴壁2天

2.2 台盼蓝拒染实验结果 大多数细胞呈圆形透亮存活状态;极个别细胞破坏死亡，台盼蓝进入细胞核内呈蓝染状(图2)。肺泡巨噬细胞的存活率≥95%。

2.3 瑞氏-姬姆萨染色结果 AM胞质呈灰色，胞质颗粒呈细小淡紫红色，核呈紫红色;同时可见核呈紫红色、胞质呈浅红色并有淡紫红色颗粒的中性粒细胞。AM细胞纯度≥95%(图3)。图2 肺泡巨噬细胞台盼蓝染色(×400) 图3 肺泡巨噬细胞瑞氏-姬姆萨染色(×600)

3 讨 论

目前原代AM培养在分离、培养过程中存在多种技术难题。在分离AM时，本实验运用了多种改良措施，获得了满意的效果：①灌洗前一定要把肺内血液驱除彻底，减少灌洗液中红细胞数量，减少杂质;②重悬细胞单细胞悬液时，要充分吹打细胞使之分散均匀，利于细胞贴壁;③PBS洗板及给细胞换液时，动作要缓慢，以免贴壁细胞脱壁，影响收集肺泡巨噬细胞的数量。

为了保持培养的原代AM的活力， 在分离和培养环节中，本研究采取了以下措施:①大鼠麻醉处死后到灌洗肺的时间应尽量缩短，以免时间过长影响细胞活力，整个过程要在冰浴上进行，放置时间过长、温度过高将导致细胞死亡;②大鼠浸泡乙醇消毒时，尽量在呼吸停止后浸泡，防止由于误吸乙醇破坏AM;③采用低速离心方法分离AM，避免破坏细胞结构，影响细胞活力;④AM种板时加入10%胎牛血清可以促进细胞贴壁，增加细胞活力，促使细胞恢复其原来生理状态;⑤在实验前去除血清，增加AM对药物的敏感性。

另外，在培养细胞过程中，菌室和超净台要常规消毒，整个过程要注意无菌操作，防止细胞污染。 综上所述，本实验采用以上改良措施后，经台盼蓝拒染试验及瑞氏-姬姆萨染色方法鉴定，可以得到大量纯度高、活性好的AM，为开展大鼠肺泡巨噬细胞的生物学功能及细胞生理、病理模型研究奠定了良好基础。

动物细胞培养技术篇7

活动简介

本次活动名称为“‘奇妙的克隆技术’实践体验”，实验内容为“猪卵母细胞体外成熟培养”。猪卵母细胞体外成熟培养是指将供体细胞核移入到去核卵母细胞内，在卵母细胞胞质的作用下，经过激活形成重构胚的一种技术。

奇妙的克隆技术实践体验专门邀请东北农业大学胚胎工程实验室主任、教育部“新世纪人才”支持计划入选者、“龙江学者”刘忠华教授为营员作了“克隆、干细胞、基因编辑和生物医学革命”的生命科学专题科普讲座，让营员们更好地了解生命科学及胚胎克隆技术领域的相关知识。

东北农业大学生命科学领域的专业优势为活动提供了坚实的实践保障。多年来，东北农业大学生命科学学院利用动物胚胎工程技术、植物生物技术和微生物工程技术为农业重大问题提供理论保障和技术支持，为国家培养和输送了大量生命科学领域高素质、高层次人才。学院拥有农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心、生命科学与生物技术研究中心、黑龙江省农业生物功能基因重点实验室、中加农业生物技术研究中心等。刘忠华教授等人获得了国内首例成体体细胞克隆猪和首例绿色荧光蛋白转基因猪等科研成果。在华人取得的世界首例克隆哺乳动物研究中，东农学子约占30%。生命科学学院堪称培养“国际胚胎工程精英的摇篮”。

活动实施方案

为了更直观、更具体地了解生命科学领域的前沿技术，学习克隆、干细胞、基因与生物医学基础知识，营员们在生命科学学院胚胎工程实验室利用体视显微镜观察猪卵母细胞，并用自己制作的“口吸管”进行提取。通过观察，显微镜下的卵母细胞结构清晰可见，且具有较强的观赏性。实践体验用营员们最大限度可以接受的教学方式，帮助他们走进生命科学，将严谨的理论与趣味的实验相结合，这也是学校针对营员设置科学体验活动的重点与特色。

实验名称

猪卵母细胞的提取、转移及体外培养。

实验目的

利用猪卯母细胞学习了解并掌握克隆技术中的细胞抽取及转移方法。

了解猪卯母细胞体外成熟技术并利用体视显微镜观察猪卯母细胞镜下形态。

实验仪器

体视显微镜、二氧化碳培养箱。

实验步骤

制作口吸管并练习使用。

用配有18号针头的lOmL注射器抽吸卵巢上3～6iilin的卯泡内的卵泡液，将抽取液放于15 mL离心管中，37℃水浴静置。

静置后弃去上清，加入HEPES重悬沉淀，再静置15min，重复3遍。

将重悬液放入直径90mm的塑料培养皿中，在体视显微镜下，用口吸管挑选卯丘细胞包裹3层以上、胞质致密且均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体COCs，用HEPES洗涤3遍。

转入培养箱中（饱和湿度、39℃、5%CO2）至少已经平衡2h的培养皿中的成熟培养液滴内，用胚胎级矿物油覆盖；然后转移到成熟培养液中继续培养。

活动效果

奇妙的克隆技术实践体验让营员们了解了生命科学的基础知识，向全体营员进行了生命科学展示。在活动过程中营员们结合自己掌握的生物学知识，根据教师的指导，透过体视显微镜真切地观察猪卵母细胞，并利用二氧化碳培养箱进行体外成熟培养，整个实践体验活动有序进行，营员们在实验过程中对奇妙的克隆技术产生了浓厚的兴趣。

此次奇妙的克隆技术实践体验活动寓教于乐，知行合一，在营员了解生命科学知识的同时使科学营活动充满乐趣，为科学营的开展塑造了良好的精神风貌。此项活动，成功为全体营员搭建了生命科学实验研究的平台，为广大青少年普及了科普知识，让营员们意识到原本看似遥远的科学研究、科研实验并不是遥不可及的。活动培养了营员们“学科学、用科学、爱科学”的意识，履行了高校服务社会的职能。实践体验活动引导营员们崇尚科学，激发了营员们对科学的兴趣，鼓励营员们立志从事科学研究事业，培养营员们的科学精神、创新意识和实践能力。

动物细胞培养技术篇8

1963年，美国化学家瓦尼和沃尔首次从一种生长在美国西部大森林中被称为太平洋杉树皮和木材中分离到了一种粗提物，并发现该粗提物对离体培养的小鼠肿瘤细胞有很高的抑制活性。1971年，他们同杜克大学的化学教授姆克法尔合作，通过X射线分析确定了该活性成分的化学结构――一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇。

细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累使细胞停留在G2期和M期直至死亡。由于紫杉醇能够抑制细胞分裂，阻止癌细胞的增殖，所以可以抗肿瘤。

1992年12月29日，美国FDA批准紫杉醇上市，商品名Taxol，用于治疗卵巢癌，后连续被批准用于治疗转移性乳腺癌、转移性肺癌、白血病等。在治疗类风湿性关节炎、早老性痴呆、先天性多囊肾病方面也存在潜力。

由于红豆杉分布地域较窄，而野生红豆杉的很多生物学特性，又限制了自然群落的发展，加之人为盗伐，如今全世界野生红豆杉已近濒危边缘。只有大力发展红豆杉产业，才能有效保护野生资源，解决紫杉醇原料短缺问题。

目前有关红豆杉的研究主要集中在红豆杉植物的人工种植、化学提取、组织和细胞培养、紫杉醇的合成和化学修饰、生物转化、微生物和基因工程等方面。其中，组织培养技术在红豆杉产业中应用最为广泛。红豆杉组织培养技术包括两个层面：一是利用微繁技术生产大量的组培苗以满足人工栽培需求；二是通过愈伤组织或细胞悬浮大量培养，直接提取紫杉醇成分并用于药物生产。

相对于种子繁殖、人工扦插两种常规繁殖技术，微繁技术具有繁殖速度快、可控性强、植物材料利用少等突出优点，还可用于脱毒苗及新品种选育。利用细胞悬浮培养方法提取紫杉醇是近年来红豆杉研究的一个重要课题。自1989年首次报道细胞培养法生产紫杉醇以来，各国学者开展了广泛研究，特别是在紫杉醇生物合成途径及代谢调控、细胞培养动力学、利用生物反应器扩大培养和紫杉醇类物质的分离纯化方面取得了较大进展。

虽然紫杉醇是毒性较小的药物，但使用后仍存在一些不良反应，例如：（1）中性粒细胞减少：紫杉醇的主要毒性包括骨髓抑制（以粒细胞减少症为主）、神经毒性和肌肉毒性。紫杉醇的毒性呈剂量依赖性，常见的是中性粒细胞减少或粒细胞减少。（2）心血管不良反应：在紫杉醇治疗的少量患者中出现明显的心血管不良反应，包括心肌梗死、房颤、轻度充血性心力衰竭、室性和室上性心动过速、室性心律不齐等，还有胃肠道反应（包括恶心、呕吐、腹泻及黏膜炎等）。（3）过敏反应：早期临床所报道的较严重的过敏反应在患者中的发生率高达18％。临床有不同程度的表现：潮红、呼吸困难、血压降低、血管水肿、另外还有荨麻疹、皮疹、瘙痒等。

典型例题

例1.红豆杉是我国珍贵濒危树种。南京中山植物园于20世纪50年代从江西引进一些幼苗种植于园内。经过几十年的生长繁殖，现在已形成了一个种群。请回答下列问题：

（1）在植物园引种栽培红豆杉的措施属于。

（2）如果对红豆杉种群密度进行调查，常用的方法是。将统计到的植株按高度（h）分为5级，每一级的植株数量见下表。

等级a级b级d级d级e级高度（cm）h≤1010＜h≤3030＜h≤l00100＜h≤300h＞300数量（株）1206232166根据表中数据，在坐标图中画出该种群各级别的植株数量柱状图。

（3）由表可以看出，此红豆杉种群的年龄结构属于。

（4）研究表明，红豆杉的种子成熟后被某种鸟类吞食，果肉状的假种皮被消化而种子随粪便散播到山坡上再萌发生长。从种间关系看，鸟类与红豆杉之间存在关系。

分析：本题考查种群密度调查方法、种群的年龄组成、种间关系、生物多样性的保护等知识，考查理解能力、信息获取能力和转化能力。

（1）由于从江西引进到中山植物园，远离原生长地进行的保护，所以称为迁地保护(易地保护)。

（2）对植物种群进行密度调查，常用样方法，活动范围比较大的动物用标志重捕法。

（3）植物高度越小，其年龄越小。从表中可以看出，幼株（a、b级）最多，成株（d、e级）较多、老龄植株（e级）少，故为增长型。

（4）鸟类吃红豆杉的种子，是捕食关系；鸟类为种子传播提供便利，是互利共生关系。

答案：（1）迁地保护（易地保护）（2）样方法柱状图如下

（3）增长型（4）捕食和互利共生（捕食和种间互助）

例2.获得紫杉醇的传统方法是从红豆杉属植物的树皮中提取，但产量有限，也不利于对濒危的红豆杉的保护。研究发现，红豆杉的其他组织细胞也能生产紫杉醇，有人尝试用植物细胞工程技术生产。下图为三种红豆杉细胞培养过程中细胞数量与紫杉醇产量的数据图，请回答：

（1）从红豆杉的树皮和树叶中分离纯化出的紫杉醇，是一种对乳腺癌、白血病等癌症有特殊疗效的抗癌药物，体现了生物多样性的价值。

（2）据图分析，获得高产紫杉醇应选红豆杉为原料，培养后期紫杉醇产量出现下降的原因包括等。

（3）将红豆杉细胞经组织培养形成方可接种到培养基中。在培养过程中，要不断通入无菌空气并进行搅拌的目的是和。

（4）利用组织培养技术生产与传统方法提取紫杉醇相比，前者具有（至少答出两点）等优点。

分析：考查植物组织培养过程、种群的增长和生物多样性的价值等知识，同时考查分析推理能力。

（1）生物多样性的价值包括直接价值、间接价值和潜在价值。药用价值属于直接价值。

（2）据图可以看出，同样的时间内云南红豆杉产生的紫杉醇最多。培养后期紫杉醇产量出现下降的原因一方面是活细胞数量减少（从左图可以看出），另一方面是某些有毒代谢产物的积累抑制细胞的活性等。

（3）外植体经过脱分化后形成愈伤组织，从愈伤组织中可以分离有用物质。在培养过程中，要不断通入无菌空气并进行搅拌的目的是保证氧气供应充足，同时使细胞与培养液充分接触。

（4）传统方法是从树皮中提取，产量低，还砍伐红豆杉，造成环境破坏。组织培养技术的优点是产量高、节约资源、保护环境等。

答案：（1）直接（2）云南活细胞数量减少，某些代谢产物的积累（3）愈伤组织保证氧气供应充足使细胞与培养液充分接触（4）产量高、节约资源、保护环境

习题链接

1.红豆杉中含有的紫杉醇主要存在于红豆杉细胞的（）

A.细胞膜B.细胞质基质

C.液泡D.细胞核

2.多囊肾病在我国是一种常见的单基因遗传病，该病严重危害人体多个系统，其主要特征为肾脏中出现多发性囊泡。下图所示为该遗传病的家族系谱图，有关说法错误的是（）

A.多囊肾病属于常染色体上显性遗传病

B.Ⅲ1与Ⅲ5基因型相同的概率是1/2

C.Ⅲ5与正常男性结婚，生下一个患病男孩的概率是1/4

D.从优生的角度出发，建议Ⅲ1在怀孕期间进行胎儿的基因诊断

3.人们利用植物的微型繁殖技术来进行工厂化育苗生产，这是利用了该项技术的（）

A.高效性和变异性

B.多样性和遗传性

C.高效性和遗传性

D.多样性和变异性

4.紫杉醇是从红豆杉属植物中提取的最有效的抗癌制剂之一。目前，生产紫杉醇的主要原料是天然生长的红豆杉树皮，而大量剥取树皮会造成树木的死亡和资源的破坏。请回答问题：

（1）为了合理开发和利用红豆杉，保护野生植物资源，科研人员取生长状况相似的野生南方红豆杉和人工栽培的南方红豆杉，分别测量其不同部位完全烘干的样品中紫杉醇的含量（占干重的百分比），测定结果见表1。

表1南方红豆杉树木各部位紫杉醇含量（%，w/w）

树皮树叶枝条种子野生植株0.017770.009460.012800.01406人工栽培植株0.014830.001020.001930.01256从实验结果看，红豆杉中紫杉醇含量最高的部位是，不同部位紫杉醇含量不同的根本原因是。为保护红豆杉资源，应以其为原料，提取、分离紫杉醇。

（2）科研人员为寻找更多紫杉醇来源，尝试利用植物组织培养技术，从红豆杉的愈伤组织中提取紫杉醇，实验结果如表2所示。

表2不同外植体形成的愈伤组织中的紫杉醇含量（%，w/w）

实验

组别培养基中植物生长调节剂的组合与水平外植体树皮树叶顶端分

生组织12mg/L2，4-D000.00122mg/L2，4-D+0.5mg/LNAA00.0020.00232mg/L2，4-D+0.5mg/LKT0.0040.0270.00441.5mg/L2，4-D+0.5mg/LKT00.0120.00950.5mg/L2，4-D+1mg/LNAA+0.5mg/LKT00.0270.004①该实验目的是研究。

②上述实验结果说明最适合做外植体，经过(过程)形成愈伤组织。

5.下表数据为实验测得体外培养的甲动物肠上皮细胞的细胞周期各阶段时间（单位：小时）。请回答：

细胞周期分裂间期分裂期G1（主要合成RNA和蛋白质）S（DNA合成期）G2（DNA合成终止、合成RNA和蛋白质）M合计时间（h）1073.51.522（1）在图中绘出该种细胞的细胞周期曲线图并注明各期名称（假设体细胞DNA相对含量为2C）。

（2）若在上述细胞的培养液中加入过量的DNA合成抑制剂，处于期的细胞立刻被抑制，再培养小时，则其余细胞都将被抑制在G1/S期交界处；去除抑制剂，更换新鲜培养液，细胞将继续沿细胞周期运行，在所有细胞达到期终点前，再加入DNA合成抑制剂，则全部细胞都被阻断在G1/S期交界处，实现细胞周期同步化。

（3）S期的启动需要一种蛋白质分子作为启动信号，这种蛋白质在S期之前合成并存在于S期全过程中。若将S期和G1期细胞融合，则G1期细胞核进入S期的时间将。

（4）在电镜下观察处于M期的细胞，可见纺锤体由细胞两极的发出。在M期中，染色单体的消失发生在（时期）。

（5）乙动物肠上皮细胞的细胞周期时间为24h，M期时间为1.6h。若要在光学显微镜下观察细胞有丝分裂过程中染色体形态的变化，选用（填“甲”或“乙”）动物肠上皮细胞更合适。

6.南方红豆杉为世界珍稀濒危物种，具有极其重要的药用和经济价值，虽可利用种子繁殖，但其种子的休眠期长，萌发率低。为挽救这一珍稀物种，某校研究性学习小组围绕“提前解除种子休眠提高发芽率”这一目标，做了如下实验探索。通过实验，得到了下表中的实验结果。请分析回答：

处理

方式机械破损后直接播种0.05％赤霉素溶液浸泡24h机械破损后，再用0.05％的赤霉素溶液浸种24h机械破损，再用40℃、0.05％的赤霉素溶液浸种24h发芽率28.2％23.8％80.4％96.6％（1）根据该小组的研究内容，请为他们拟订课题名称：。

（2）该小组做出的假设是：。

（3）概括该小组实验全过程的主要步骤：

a.将种子分为四组b.c.d.计算各组发芽率，表示实验结果

（4）该实验可得出的两条结论是：

a.；

b.。

（5）为了使该研究结果更加科学、更具说服力，应做哪方面的改进？。

7.部分患者注射紫杉醇后出现胸闷、气急和呼吸困难等过敏（超敏）反应症状，严重者发生休克。肾上腺素是临床上抢救过敏性休克的首选药物，研究其合适的使用方法一直是医学研究者的重要课题。下表所示为来自某医院的相关数据，请分析回答：

病例

（人）年龄范

围（岁）给药方法使用剂量给药次数不良反应

（如血压过高）死亡

（人）3115～68静脉注射常规剂量1次多53614～72静脉注射稀释剂量2～3次少0（1）过敏性休克是（非特异性/特异性）免疫失调引起的疾病。表中数据显示，肾上腺素的哪种具体使用方法对于抢救过敏性休克更为有效？。

（2）肾上腺分泌的肾上腺素进入中，与其他激素相互作用，共同动物的生命活动。

（3）某些神经元也能分泌肾上腺素。进入突触间隙的肾上腺素，可以与突触后膜上特异性受体结合，引发突触后膜变化；也可以与突触前膜受体结合，抑制肾上腺素继续分泌，实现调节；多数最终又被突触前膜摄取，并贮存在中，实现激素的重复利用。

8.血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。粒细胞属于白细胞的一类，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。下图简单表示造血干细胞形成各种血细胞的过程，回答问题：

（1）淋巴细胞中，能够产生抗体的细胞在中发育成熟。

（2）红细胞的直接生活环境是，成熟红细胞失去全能性的原因是。

（3）白血病是由于造血干细胞增殖分化异常而引起的，骨髓移植是目前常见的治疗手段，而脐带血移植将成为新的治疗途径。从免疫学角度分析，脐带血移植相对骨髓移植的优点是。

9.近年来，有关肿瘤细胞特定分子的靶向治疗研究进展迅速。研究发现，蛋白X是细胞膜上的一种受体，由原癌基因X编码。在一些肿瘤细胞中，原癌基因X过量表达会持续激活细胞内的信号传导，启动细胞DNA的复制，导致细胞异常增殖。利用动物细胞融合技术制备的单克隆抗体，可用于诊断和治疗原癌基因X过量表达的肿瘤。请回答下列问题：

（1）同一个体各种体细胞来源于受精卵的分裂与分化。正常情况下，体细胞核遗传信息相同的原因是。

（2）通过检测原癌基因X的和可判断其是否转录和翻译。检测成人多种正常组织后，发现原癌基因X只在乳腺、呼吸道等上皮细胞中有微弱表达，这说明。

（3）根据以上信息，可推测原癌基因的主要功能是。

（4）制备该单克隆抗体时，免疫动物的抗原可以是。B淋巴细胞识别抗原并与之结合，之后在适当的信号作用下增殖分化为和。

（5）用该单克隆抗体处理原癌基因X过量表达的某肿瘤细胞株，发现其增殖能力明显下降。这是因为。

参考答案

1.C

2.B提示：根据双亲患病产生正常女儿Ⅲ2可以判断是常染色体上显性遗传病。Ⅲ1的基因型是1/3AA或2/3Aa，Ⅲ5的基因型是Aa，故两者基因型相同的概率是2/3。

3.C

4.（1）树皮基因的选择性表达树叶(枝条、种子)

（2）①植物不同部位做外植体所形成的愈伤组织中紫杉醇的含量研究不同生长调节剂的组合与水平对愈伤组织中紫杉醇含量的影响②树叶脱分化

5.（1）

（2）S15G1

（3）提前

（4）中心体后期

（5）甲

6.（1）提前解除南方红豆杉种子休眠的技术（方法、措施）的研究或提高南方红豆杉种子发芽率的技术（方法、措施）的研究

（2）机械破损种皮、植物激素处理、适当提高温度等能解除种子的休眠，提高发芽率

（3）b．按上述要求对各组种子进行处理c．播种并分别记录各组发芽情况

（4）a.破损、赤霉素浸泡、适当提高温度对解除种子休眠有作用b.机械破损后，再用40℃的0.05%赤霉素浸泡，效果最好

（5）设置对照组，取等量未经处理的种子播种并计算其发芽率

7.（1）特异性使用稀释剂量，增加给药次数（多次给药）

（2）体液（血液、内环境）调节

（3）电位（负）反馈突触小泡

8.（1）骨髓

（2）血浆没有细胞核

（3）属于自体移植，排斥反应小

9.（1）亲代细胞通过有丝分裂将复制后的核DNA平均分配到两个子细胞中

（2）RNA蛋白质原癌基因X的表达具有（组织）特异性

（3）调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程

动物细胞培养技术篇9

1839年。德国植物学家施莱登和动物学家施旺共同创立了划时代的细胞学说，并被恩格斯誉为“19世纪自然科学的三大发现”之一。根据细胞学说的理论，当时有人提出，可以将不同植物或不同动物的细胞相互合并，创造出新的植物或新的动物。在当时的科学背景下，这只是科学幻想而已。随着细胞工程技术的崛起。它已成了现实。

细胞工程是细胞融合技术和组织培养等生物工程技术的统一。其中，细胞融合技术是细胞工程的主要支柱。细胞融合技术，就是利用一定条件使细胞质和细胞壁(或细胞膜)发生变化，使不同植物或不同动物的细胞相互合并的一项技术。细胞工程已创造了不少奇迹。如科学家成功地使山羊和绵羊的细胞互相融合，培养出一种头和尾象山羊、躯体像绵羊的“山绵羊”。再如，科学家已巧妙地使马铃薯和西红柿的细胞融合，培育出新的植物“土豆西红柿”。这种植物根部长出马铃薯，枝头结满西红柿，这种西红柿，还保留了两者都具有的抗病能力。

事实表明，细胞工程技术完全能培育出地球上从来没有过的动植物。科学家们宣称：人类已进入创造新的生命形态的时代。我们面前将会出现一个人工创造的新的生命世界，但这也可能带来一种可怕的事实一一出现人工制造的“新人种”!这并非故作惊人之语，美国社会学家史塔伯福特和物理学隶兰德指出：不久的将来，会有八类“新人种”出现!据预测，最早诞生的“新人种”有3种：一、“鱼人”――专为水底工作而设计，在水中或陆地上都能生存。有鳃和肺、蹼状的脚，类似海豚的声纳系统及橡皮鳍状皮。二、“ET人”――特为开发太空而创造的，他们有4只长手臂。由于在失重状态下无须靠脚支撑身体，故让另一双手取代双脚。据报道，澳大利亚试管婴儿研究组透露，他们准备将冷冻的人类细胞送到太空去与其它动物的细胞“杂交”，培育出一种货真价实的“太空人”。三、“ZT人”――这是未来的地球上的“超级寿星”。他们的外表基本上与令人无异，但可活到300岁。据悉，苏联科学家已在“炮制”这种“生命超人”。此外，科学家还提出一种设想――培养一种“半人半兽”的混种，即“”，用之给人类提供移植器官或充当“仆役性工人”。

有关“细胞拼接”的实验已开始，并有所进展。比如美国斯坦福大学的生物学家，就已成功地把人与鼠的细胞拼在一起。细胞工程的成就给人类和社会提出了一堆难题：人类是否应该“批量生产新人种”?是否应该让这些怪物混迹于人类之中?未来的人伦关系如何确定?

有人说，人类能够用科学手段创造新的生命形态，乃是人类的胜利，造物主的失败。有人却认为，假若由人类之手创造“新人种”，那恰恰是人类对对自己的亵渎，是人类自身的悲剧。

动物细胞培养技术篇10

[关键词] 肝动脉栓塞；T细胞克隆技术；结肠癌；肝转移

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）15-0009-03

[Abstract] Objective To discuss clinical efficacy of hepatic artery embolization combined with T cell cloning technology in the treatment of liver metastasis from colon cancer. Methods Clinical data of 64 cases with liver metastasis from colon cancer from Jan 2010 to Dec 2014 were respectively analyzed. 33 cases of control group were treated with hepatic arterial embolization， and 31 cases of study group were treated with hepatic artery embolization combined with T cell cloning technology. Clinical efficacy and peripheral blood T cell subsets after treatment of two groups were compared. Results Total effective rate of study group was higher than control group（P

[Key words] Hepatic artery embolization； T cell cloning technology； Colon cancer； Liver metastasis

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤，一旦发生肝转移，具有较高的死亡率，是导致治疗失败的主要原因。结肠癌无肝脏转移的患者5年的生存率较有肝脏转移的患者要高。提高发生肝脏转移结肠癌患者的生存率是治疗的关键。肝动脉介入治疗是治疗结肠癌肝脏转移的主要方法。T细胞克隆技术，能够促进增殖，提高杀瘤活性，并且杀瘤谱广[1，2]。自体细胞免疫治疗成为治疗晚期结肠癌的重要方法，并且具有毒性低的优点[3，4]。本文采用肝动脉栓塞联合T细胞克隆技术治疗结肠癌肝转移取得了较好的效果。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2010年1月～2014年12月在我院治疗的结肠癌肝转移患者64例的临床资料进行回顾性分析。纳入标准：所有患者均符合临床诊断标准，结肠癌腺癌，肝转移诊断明确，KPS评分70分及以上，临床资料完整。排除标准：合并其他系统内科疾病的患者，肾功能、心功能异常的患者。其中男38例，女26例，年龄41～77岁，平均（48.4±9.7）岁。根据患者的治疗方法分为对照组和研究组。对照组33例，其中男18例，女15例，平均年龄（47.8±8.9）岁；研究组31例，其中男20例，女11例，平均年龄（48.9±9.3）岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究通过医院医学伦理会同意。

1.2 治疗方法

1.2.1 肝动脉栓塞 所有患者均给予TACE治疗，应用Seldinger技术，局麻下行股动脉穿刺，插入导管，造影，观察肿瘤组织血供，明确主要供血动脉，插入导管至供血动脉内，栓塞肿瘤供血动脉注入化疗药物，常用药物奥沙利铂、亚叶酸钙、替加氟、丝裂霉素等。结束后拔出导管，局部加压包扎，制动24 h。常规心电监护，观察生命体征，观察是否有病情变化、保肝等治疗。

1.2.2 T细胞克隆技术 研究组在TACE术后大约1周行T细胞克隆生物治疗。患者在术前采集外周血进行T细胞培养。每次TACE+T细胞克隆序贯治疗间隔时间为4～6周，随访6个月～1年，每个治疗周期后评价病情。经病理、影像等相关检查证实的结肠癌肝转移患者，行规律肝动脉化疗栓塞治疗，并且控制稳定后，所有患者治疗前采静脉血进行免疫评估，并行免疫功能重建，再根据不同免疫情况对T细胞行培养增殖，回输入患者体内，连续3个疗程。具体过程如下：（1）外周血单个核细胞的分离：采集患者静脉血80 mL，用聚蔗糖400（Lympholyte-H，Cedarlane产品）分离单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells， PBMCs），经生理盐水洗涤细胞3次后备用。（2）DC细胞的分离及体外培养：PBMCs悬浮于DC培养基后，在培养皿内37℃ 贴壁培养3 h，悬浮细胞用于T细胞培养，贴壁细胞培养于DC培养基中并添加GM-CSF 1000 U/mL和IL-4 1000 U/mL，培养第4天添加相应肿瘤抗原提取物，培养第5天添加TNF-α 1 ng/mL，培养第7天后对DC细胞表型（CD80/CD83/CD86/HLA-DR）进行检测分析，微生物及内毒素检验合格后收集DC，按方案回输至患者皮下。（3）T细胞的体外培养和扩增：将贴壁处理后的悬浮细胞用T细胞培养基悬浮并调细胞密度为2×106/mL，添加IL-2 1000 U/mL、CD3McAb 50 ng/mL。此后每2天计数细胞并适当补充新鲜培养基。分别在培养的第10天、第12天和第14天进行细胞表型、微生物及内毒素检测，各项指标符合要求后收集T细胞、洗涤，按方案回输至患者静脉内。主要材料及仪器：日本泰尔茂公司提供的RH导管及1.5 m超滑导丝，北京医疗设备厂提供的电热恒温水浴锅，日本奥林巴斯（Olympus）公司提供的BX41显微镜，上海安亭科学仪器厂提供的LXJ-B离心机，上海安亭科学仪器厂提供的TGL-16B高速离心机，日本三洋电器集团提供的MC0-15AC 二氧化碳培养箱，美国Thermo公司提供的1300 series B2 100%外排生物安全柜，成都金凤液氮罐厂提供的YDS-35-80液氮罐，上海之信仪器有限公司提供的LX200手掌型离心机，美国奥林巴斯Olympus公司提供的CKX31显微镜，丹麦NUNC公司提供的96孔细胞培养板，美国Axygen公司提供的微量加样枪头，美国Eppendorf公司提供的离心管，美国ABI公司提供的ABI3730 DNA分析仪及GeneMapper软件。

1.3 评价方法

临床疗效判断[5]：包括完全缓解（CR）：所有目标病灶消失；部分缓解（PR）：基线病灶长径总和缩小超过 30%；无变化（SD）：基线病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达PD；进展（PD）：基线病灶长径总和增加超过20%或出现新病灶。完全缓解+部分缓解=总有效。采用流式细胞术分析T细胞亚群评估患者免疫功能情况，所有荧光标记的流式细胞抗体均购自美国BD公司，细胞表面标记分析和细胞内标记分析按说明书操作。

1.4 统计学处理

采用SPSS15.0统计学软件对数据进行分析，计数资料采用[n（%）]表示，采用χ2检验，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。P

2 结果

2.1 两组临床疗效比较

见表1。与对照组比较，研究组总有效率更高，差异有统计学意义（P

2.2 两组患者治疗后外周血T细胞亚群变化

见表2。与对照组比较，研究组治疗后总T细胞亚群、CD4+T细胞亚群、CD8+T细胞亚群高于对照组，差异有高度统计学意义（P

3讨论

结肠癌容易发生肝脏转移，部分患者在确诊时已经发生肝转移。发生肝转移后虽然部分患者可通过肝切除术获得一定的5年生存率，但是手术适应证要求较严格，并且术后容易发生复发。手术并不能根本上解决结肠癌。保守治疗包括全身化疗以及其他的姑息性治疗，但毒副作用较大，并且效果较差，影响患者的生存质量。经肝动脉介入化疗能够直接将化疗药物送至病变处，具有更高的针对性，效果优于全身化疗，并且全身毒副作用较小，两者联合，效果优于单纯使用全身化疗。生物治疗已经成为恶性肿瘤治疗的第四种模式。自体T细胞过继免疫治疗作为生物治疗中最主要的方法之一已经广泛应用于临床的治疗，该治疗符合生理低毒高效的特点，有着巨大的治疗潜力和生命力，是未来肿瘤治疗的发展方向。虽然近年自体T细胞过继免疫治疗技术取得了长足的发展，但由于缺乏客观评价方法，导致体外培养的细胞不能被有效地质控监测，回输至患者体内后其疗效又不能被准确和及时地评价，而阻碍了这项新技术规范化与标准化的实施。过继性免疫治疗是肿瘤生物治疗的方法之一。

研究证实，肿瘤的发生与发展与机体的免疫功能状态密切相关，肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群的比例常发生变化[6-8]。而且在结肠癌肝转移中也不例外。本研究中经自体T细胞过继治疗后，24例总T淋巴细胞比例升高，CD4+T淋巴细胞比例获显著改善者22例，CD8+T淋巴细胞亚群比例升高者21例。这些结果说明自体T细胞过继治疗确实能改善患者体内淋巴细胞比例，也提示该疗法可以不同程度地提高患者抗肿瘤免疫应答能力。因为CD8+T细胞是杀伤肿瘤细胞的主力，CD4+T细胞对于维持长期免疫记忆十分重要[9，10]。还有其他一些淋巴细胞亚群的变化也可能作为评价免疫功能指导临床工作的指标，如检测辅纯真、记忆T细胞亚群，杀伤性纯真、记忆T细胞亚群可以了解机体内免疫应答基础及活跃程度[11-13]。检测免疫效应T细胞亚群，如CD4+/CD8+/CD45RA+/CD45RO+/CD62L+，可以了解肿瘤的负荷情况和抗肿瘤细胞免疫应答的活跃程度[14，15]。另外，检测调节性T细胞亚群（CD4+/CD25+/Foxp3+及CD8+/CD28+），可以了解体内抗肿瘤细胞免疫应答受到抑制的情况，这些T淋巴细胞亚群有待于今后临床应用的实践。

综上所述，肝动脉栓塞联合T细胞克隆治疗结肠癌肝转移能够改善患者的预后，改善患者的免疫状态，有利于肿瘤细胞的清除。

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