水稻根际固氮菌促生特点评论

植物根际促生细菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria，简称PGPR)指存在于植物根际的能促进植物生长的细菌，具有固氮、解磷、产铁载体及分泌植物激素等生理活性，不仅能够促进植物生长，增加作物产量，还具有生物防治作用[1]，因而成为许多学者研究微生物肥料的热点对象。目前，RanjanPatra等研究鹰嘴豆根际促生菌的分类和促生特性，发现45%的根际促生菌属于固氮菌属，而且有些菌株同时具有2种或3种PGP（plantgrowth-promoting）特性[2]。Akhtar等研究PGPR菌株对扁豆的促生作用，发现PGPR菌株能够抑制致病菌的生长而有效的促进扁豆生长[3]。康贻军等阐述了PGPR菌株诱导体系抗性和诱导体系产生忍耐力两大促生机制[4]。部分PGPR可分泌有机酸溶解难溶磷酸盐，或分泌胞外磷酸酶降解有机磷，提高土壤中水溶性磷的浓度，有效地促进植物的生长[5]。铁是生物的必需元素，某些PGPR能合成各种对铁具有高亲和力的铁载体来螯合环境中的铁，供给植物细胞利用，改善植物的铁营养，防治碱性缺铁土壤植物缺铁失绿症的发生[6-7]。PGPR产生的铁载体可与植物根际病原微生物争夺有限的铁营养，抑制病原微生物的生长，起到生物防治作用。许多PGPR可合成生理活性化合物，促进植物生长发育，或调控植物其他生命活动。植物生长激素（IAA）是由植物根际细菌产生的、研究最广泛的植物激素，可增加根的长度，刺激根毛的增生和延伸，促进植物的生长和发育。对分泌IAA的细菌进行研究，有利于将植物促生菌应用于农业生产[8-9]。本试验对分离自水稻根际的具有高效固氮、解磷、产铁载体等功能的固氮菌[10]进行分类和培养，接种菌株到水稻幼苗根部，研究它们的促生特性，以期为特异性微生物肥料的开发利用提供试验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌株固氮菌（Azotobacterspp.）16株菌株可与水稻凝集素反应，对水稻根系具有一定亲和性，由安徽农业大学微生物实验室分离保藏[10]。

1.1.2水稻种子徐旱一号由安徽农业大学农学院提供。

1.1.3试验培养基Hoagland半固体培养基、Ashby培养基、解磷培养基[10]、MKB液体培养基[11]、产生长激素IAA培养基[12]。

1.1.4实验设备FOSSKjeltec8400全自动凯氏定氮仪；JA1103电子天平；LG10-2.4A高速离心机；VIS-7220型可见分光光度计。

1.2方法

1.2.1菌落形态特征观察菌株菌液在Ashby固体培养基上稀释涂平板、斜面上划线培养3d，观察各菌落形态特征。

1.2.2菌株生理生化特征研究[13]挑取各菌株单菌落，进行以下生理生化试验：革兰氏染色试验、芽孢染色试验、葡萄糖发酵试验、需氧试验、乙醇氧化试验、固氮试验、接触酶试验和类脂粒试验。

1.2.3土壤栽培水稻幼苗在100mL小烧杯中加进100g土壤并灭菌，将水稻种子催芽后移栽至烧杯中，室外自然条件下积水培养3d得到成活的健康幼苗，将各菌株菌液按1%的接种量接种到水稻幼苗根部；在室外自然条件下培养30d；测定各类生长数据。

1.2.4半固体培养基培养水稻幼苗取Hoagland半固体培养基60mL于30mm×180mm试管中，无菌操作将催芽3d的水稻幼苗移栽试管中，3000lx光照培养箱中28℃培养15d，测定各类生长数据。

1.2.5菌株固氮能力测定Ashby培养基培养菌体，采用FOSS全自动凯氏定氮仪测定培养物中的全氮含量（参照FOSS程序）。

1.2.6菌株溶磷能力测定[14]取4mL解磷培养基分装至试管中，接种固氮菌株，28℃160r•min-1摇床培养7d；取菌悬液至10mL离心管中，5000r•min-1离心15min；取1mL上清液到另10mL离心管中，加2mL水，加入1mL1mol•L-1H2SO4，再加1mL铁-钼酸试剂；混匀后反应15min，测定OD660。

1.2.7菌体产铁载体能力测定采用MKB液体培养基培养各菌株，用CAS法[11]检测菌株合成铁载体能力，测定680nm波长[15]处的吸光值(A)；另取2mLCAS检测液与2mL未接种的MKB液体培养基上清液充分混匀，同法测定的吸光值即为参比值(Ar)；数据处理，计算A/Ar值，参照标准得到结果。

1.2.8菌株分泌生长激素IAA能力测定参考文献[12]测定菌株分泌生长激素IAA能力。

2结果与分析

2.1菌株菌落形态特征

菌株在选择性平板上培养的菌落基本形态特征：形状均为圆形，菌落表面光滑，颜色有透明状、半透明状、白色、乳黄色和黄色。

2.2菌株生理生化特征

菌株的各生理生化特征如下：均为革兰氏阴性菌，均无芽孢和类脂粒，葡萄糖发酵、乙醇氧化结果均为阴性，生长均需氧，均有固氮能力，接触酶试验结果为阳性。根据菌株的形态特征和生理生化特性，参照文献[16-18]等对细菌进行分类，可以把菌株简单的分类鉴定到属（genus）的水平。本试验对分离自水稻根际土壤中的16株菌株进行分类，初步鉴定这16株菌株菌属于固氮菌属（Azotobacter）。

2.3固氮菌株对水稻幼苗生长的促进作用

经过半固体培养基培养试验，测定16株固氮菌对水稻幼苗生长的影响，发现固氮菌株R-N00、R-N1110和R-N1112对水稻的促生长作用较明显。与对照相比，接种菌株的水稻幼苗株高比对照分别增加23.48%、7.10%和17.97%，苗干重分别提高16.60%、9.23%和9.37%，根干重分别提高38.00%、30.00%和55.00%（表1）；其他菌株作用效果与对照相比差异不显著（略）。这些结果初步说明这3株菌对水稻的生长具有明显的促进作用。土壤栽培试验也获得类似的结果，菌株R-N00、R-N1110和R-N1112对水稻的促生长作用很明显。与对照相比，接种菌株的幼苗株高分别增加11.30%、8.79%和12.69%，苗干重分别提高93.25%、90.18%和97.21%，根干重分别提高71.25%、72.21%和74.92%。这些结果说明在近似自然条件下这3株菌对土壤中的水稻幼苗生长具有非常显著的促进作用。本试验采用半固体培养基和土壤培养水稻幼苗均是在实验室小规模条件下进行，与田间试验相比，有数据采集方便、影响因素少等优点，但也存在差异，需要进一步进行田间试验以验证所选菌株在田间的促生生理活性。

2.4固氮菌株的促生生理活性

本试验采用单位mg•L-1来表示3株菌的全氮含量，凯氏定氮法测得3株菌的全氮含量分别为13.37、11.93和13.57mg•L-1（表2）。3株菌的溶磷能力分别为41.63、37.76和39.78mg•L-1。按照文献方法测定这3株菌产铁载体能力均达到5+，但此结果不能比较这3株菌的产铁载体能力，因此本试验将3株菌上清液稀释后再测定，得到3株菌产铁载体能力分别为16+、24+和64+，说明这3株菌产铁载体能力均很强，菌株R-N1112产铁载体能力最强，而R-N1112的促生效果较好。供试3株菌分泌IAA的能力分别为6.79、8.60和3.39mg•L-1，菌株R-N1110分泌IAA的能力较强，但其促生效果却较低。

3讨论

目前，国内外很多研究植物根际促生菌（PGPR）的报道[19-21]，从各个方面研究PGPR及其作用机理。本试验从半固体培养基栽培和土壤栽培两方面说明，接种水稻根际促生菌后水稻幼苗的生长情况得到了不同程度的提高。并从固氮能力、溶磷能力、产铁载体能力和分泌生长激素IAA能力这4个特性初步说明其促生机理。试验测定3株固氮菌的固氮能力均在10mg•L-1以上，比同类报道的固氮菌的固氮能力[22]高很多；3株菌的溶磷能力均在35mg•L-1以上，比已报道的固氮菌株的溶磷能力[23]也强，但比溶磷PGPR菌株的溶磷能力弱[24]。已有文献报道固氮菌也具有一定的溶磷能力[25]，PGPR菌株同时具备固氮和溶磷能力，可改善水稻幼苗生长期的氮素和磷素营养[26]，达到促进水稻幼苗生长的效果。CAS检测法作为微生物铁载体室内检测的常规技术，但按照原程序，评价标准只有5级，比较粗糙；本试验对该方法加以改进，稀释菌液检测3株菌的产铁载体能力，最高能达到64+，结果相对客观准确。这一结果说明产铁载体能力强弱可以作为评价PGPR株菌促生效果的重要指标。菌株分泌的适量IAA可以有效地促进植物根系新陈代谢，有助于植物吸收土壤中的营养。本试验测得的3株菌分泌IAA的能力不超过10mg•L-1，同时也发现产生较高浓度IAA的菌株反而抑制水稻幼苗生长（数据略），与文献报道结果一致[27-28]。

试验结果显示，水稻PGPR菌株只具有某一种生理活性时，对水稻幼苗生长的促进效果较差或者极不显著，但是，当水稻PGPR菌株同时具有三方面或者更多促生活性，促生效果将很明显。本试验采用对水稻具有亲和性的特异性PGPR菌株，评价其中固氮菌R-N00、R-N1110和R-N1112各种促生生理活性，初步揭示这些菌株的促生机理，为研制水稻特异性生物肥料提供参考。