组织因子和血小板研究论文

【摘要】组织因子(tissuefactor,TF)在凝血和血管内血栓形成中起重要作用，它不仅存在于血管外组织细胞中，而且也存在于血循环细胞中。血中单核细胞可以被内毒素等诱导表达组织因子。近年来许多研究证明，血小板上的P-选择蛋白、CD40配体及GPⅡb/Ⅲa受体等也影响单核细胞表达组织因子。除此之外，有相当多的证据表明，在生理情况下，血循环中也存在组织因子，血小板内的组织因子是其中一部分，它在一定的条件下释放，启动凝血反应。本文就参与凝血的血小板和组织因子的关系作一综述性分析。

【关键词】血小板；组织因子；凝血；血栓形成

PlateletandtissueFactor——Review

AbstractItisgenerallyacceptedthattissuefactorplaysanimportantroleincoagulationandintravascularthrombusformation.Tissuefactorisnotonlyfoundprimarilyonthesurfaceofcertaincellsthatarelocatedoutsidethevasculature,butalsofoundincirculatingcells.Monocyteexpresstissuefactorinducedbyendotoxin.Recently,manyresearchesindicatethatP-selectin,CD40ligandandGPⅡb/Ⅲareceptorofplateletcanalsoaffectexpressionoftissuefactorbymonocyters.Inaddition,alotofstudiesshowedthattissuefactorexistinthecirculationincludingcontainedplatelet.Tissuefactorintheplateletreleasesundercertaincondition,andinitiatescoagulation.Inthisreviewtherelationbetweenplateletandtissuefactorwaselaborated.

Keywordsplatelet;tissuefactor;coagulation;thrombusformation

血小板的主要生理作用是参与正常的止血，防止损伤后血液丢失，血小板的黏附、聚集、释放反应以及凝血功能是完成正常止血功能的基本因素。组织因子（tissuefactor,TF）是凝血级联反应的启动子，它的相对分子量约为47kD，与血中Ⅶ/Ⅶa结合形成复合物，启动外源性凝血途径，生成凝血酶原酶复合物，并与血小板相互作用，形成纤维蛋白。两者共同都参与止凝血反应和血栓形成的过程，并起着不可或缺的作用。TF是一种细胞跨膜糖蛋白，广泛分布于各种组织中，很多非血管细胞都可以合成和表达TF。在组织损伤后，这些细胞和循环血接触，启动凝血反应。作为凝血反应的启动子，TF主要分布于血管壁外膜，对凝血和血栓形成的调节都是有必要的。在正常情况下，与血液直接接触的细胞不产生TF，但内皮细胞和单核细胞可以被诱导表达。某些细胞因子诱导内皮细胞表面表达TF，而血小板、内毒素等可以诱导单核细胞表达TF［1］。近年来，许多研究者对血小板诱导单核细胞表达TF的机制进行了深入的研究。

血小板对单核细胞表达TF的影响

P-选择蛋白诱导单核细胞表达TF

P-选择蛋白为黏附分子选择蛋白家族的成员，是一种完整的膜蛋白，贮藏在血小板α-颗粒膜内和内皮细胞的W-P体内；介导血小板和内皮细胞与中性粒细胞和单核细胞的相互作用。Celi等［1］用3种不同P-选择蛋白（活化血小板表达的P-选择蛋白、转染含P选择蛋白重组子的中华仓鼠卵母细胞(CHO)表达的P-选择蛋白、纯化的P-选择蛋白）进行实验，证实了P-选择蛋白能够诱导单核细胞表达TF；纯化的P-选择蛋白以剂量依赖的方式刺激单核细胞TF的表达。表达P-选择蛋白的中华仓鼠卵母细胞(CHO)也能刺激单核细胞表达TF，而表达E-选择蛋白和不表达P-选择蛋白的该种细胞却不能刺激TF表达；抗P-选择蛋白抗体能抑制纯化的P-选择蛋白和表达P-选择蛋白的CHO细胞诱导TF的作用；单核细胞和表达P-选择蛋白的CHO细胞共同培养，可以检测到单核细胞内TFmRNA增加和表面表达的增加。以上均说明P-选择蛋白在介导单核细胞和血小板结合的同时，上调了TF的表达。但是活化的血小板上调TF表达作用比单用P-选择蛋白或转染P选择蛋白的中华仓鼠卵母细胞(CHO)更大，可能血小板除P-选择蛋白还有其他的分子作用于单核细胞TF的表达［1］。

CD40L在诱导单核细胞表达TF方面的作用

CD40是一个50kD的膜结合糖蛋白，主要表达于B淋巴细胞，还有树突状细胞、单核细胞和内皮细胞等。它的配体（CD40L,CD154）是肿瘤坏死因子超家族的成员，主要表达于CD4T辅助细胞，还可表达于平滑肌细胞、巨噬细胞、激活的嗜碱性细胞。最近发现，其还表达于激活的血小板［2］，且在P-选择蛋白依赖的诱导单核细胞表达TF方面起一定的作用。Lindmark等［3］报道，在凝血酶受体激动剂活化的血中，77%单核细胞TF阳性，而加入抗CD40L的抗体的血中单核细胞TF的表达比前者减少17%；但是同时加入P-选择蛋白抗体和CD40L抗体，TF的表达并没有比单加P-选择蛋白抗体时显著减少。可能，CD40L辅助加强P-选择蛋白诱导单核细胞表达TF的作用。

GPⅡb/Ⅲa拮抗剂表非替得（eptifibatide）对单核细胞表达TF的作用

GPⅡb/Ⅲa是血小板表面纤维蛋白原的受体，它与纤维蛋白原结合后，纤维蛋白原起到“胶水”样作用，把血小板彼此聚集起来。GPⅡb/Ⅲa拮抗剂eptifibatide能抑制血小板的聚集，但是大量临床试验表明，它却不能减少冠心病急性事件的发生率。有资料表明，eptifibatide不能阻止血小板的激活，如释放反应和包括P-选择蛋白在内的黏附分子细胞表面的表达［4，5］。Scholz等［6］发现，eptifibatide在(0.0625-1.5mg/ml)范围内以剂量依赖的方式增加血小板和单核细胞的结合和单核细胞表面TF的表达；eptifibatide在0.5mg/ml时能使TF表达增加60%-120%。故在临床上应用时其抗血栓形成的能力减少。以上说明活化的血小板不是通过GPⅡb/Ⅲa受体上调单核细胞表达TF的。

循环血中存在TF

以往认为，在生理情况下直接与循环血液接触的血细胞和内皮细胞不表达TF。只有当血管损伤暴露组织细胞，或血管内皮细胞、单核细胞受到内毒素等刺激时，表达的TF才得以与血液接触。但近年来很多研究表明，血中也存在TF，称为血生的TF或血浆TF,也能止血和形成血栓。在健康人体中，血浆TF平均浓度为(187.3±108.7)pg/ml［7］。在正常情况下，由于其浓度较低，TF是加密而无活性的，它只结合FⅦa和TF抗体［8］，而且血浆中也含有组织因子途径抑制物（TFPI），故不能启动凝血反应。Giesen等［8］研究发现：①在体外用包被胶原的玻片与提取的外周血反应，可看到有血栓形成；该血栓用Ⅶa和TF抗体检测都可以发现大量的TF，而该胶原玻片上没有TF，提示血中存在TF；②当用抗TF抗体抑制循环中的TF活性时，上述实验中血栓的形成减少，而对照组仍有大量的纤维蛋白形成；③从新鲜的血中能分离到TF。而且循环中的TF抗原在心血管疾病［9］，败血症［10］及凝血紊乱如弥散性血管内凝血［11］等高凝性疾病中都有升高。由于TF是一种跨膜蛋白，故其在血中以微粒［12］或表达在细胞膜上的形式存在。微粒是活化的或凋亡的细胞脱落的膜部分，常与细胞激活和损伤有关，也可作为细胞间的效应分子［13］。在胶原活化的外周血中，TF可在直径约300-600nm的微粒表面检测到；选择性移除循环中微粒可减少血浆中2/3以上的TF活性［14］。随着对血生的TF研究深入，有人发现血小板中也有TF［14-16］,它可能是血生的TF来源之一。

血小板中存在TF

Zillmann等［17］在富血小板的血浆中，用前列腺素预防其聚集，多次用氯化钠缓冲液洗涤血小板，然后裂解血小板，可检测到大量的TF。有资料报道，用细胞分类法把血小板来源的微粒从血浆中分离出来，TF分子全长都能在微粒内检测到；在静止的血小板中，在免疫显微镜下可观察到TF贮藏在膜上和基质的α－颗粒内及开放管道系统；用胶原或凝血酶激活的血小板，在其胞膜上也可看到TF表达，即当血小板被强激动剂激活后，原先合成并贮藏在血小板中的TF暴露在细胞表面，或以颗粒的形式分泌出去［14］。另有报道，用流式细胞仪可在未活化的血小板及用凝血酶、胶原和ADP活化的血小板表面检测到TF的表达；同时在这些血小板离心后的上清液中，斑点杂交证实TF抗原的存在［16］。另外，最近发现在用于输注的浓缩血小板中用免疫细胞化学方法和功能试验都能检测到大量的TF［18］。

血小板中有TFmRNA

最近发现，血小板中有TFmRNA［15］，血小板尽管没有细胞核，但是能够保持有从巨核细胞来源的mRNA，这些mRNA在细胞的整个生命过程中都是完整的，体外实验中已经发现血小板可以合成蛋白质［19］。在排除白细胞的污染情况下，Camera等［15］采用RT-PCR发现，未活化的血小板中有TFmRNA；GPⅠbmRNA共扩增证实，TFmRNA来源于血小板；但是他们发现，嘌啉霉素不能抑制TF暴露在活化的血小板表面，由血小板合成的TF可能对早期膜上表达的TF影响不大，而且蛋白质可能在几小时后才合成。

其他细胞传递TF给血小板

血小板中的TF除自己合成外，也可能来源于其他细胞的传递。目前已知内皮细胞［20］、动脉血管的平滑肌细胞［21］和白细胞［8］都有合成TF的能力。CD15是一种白细胞膜糖蛋白，属细胞黏附分子成员，与P-选择蛋白相互作用，促使白细胞在血小板和内皮细胞上的黏附。如将静脉血与包被胶原的玻片接触产生的血栓，在免疫显微镜下可发现TF微粒伪足从白细胞伸向血小板。双免疫标记检测显示，白细胞参与这过程的黏附分子为CD15和TF抗原。从循环血中单采血小板，未检测到TF，但单核细胞经TNF的诱导后，再与单采的血小板混合，则共聚焦显微镜显示TF在血小板内；在血小板和单核细胞的黏附处可检测到大量的TF和CD15，用抗TF抗体或CD15抗体都能减少血小板TF的表达［22］。以上资料说明，白细胞传递TF给血小板，而传递的过程是依赖CD15和TF与血小板的相互作用，获得TF的活化血小板能够启动凝血和生成血栓。总之，血小板中存在TF已经明确，但是由血小板自己合成还是从其他细胞传递过来，或者两种情况都存在，目前尚无一致定论。

血小板释放TF的调节

一般认为，血小板在静息情况下，其内的TF以无活性的方式存在，只有在一定条件下才释放TF。

血小板激动剂作用后释放TF

用人TF的多克隆抗体检测非活化的和活化的血小板离心后悬浮液中的TF抗原发现，活化的血小板释放TF抗原量明显比非活化血小板多；用双相FXa试验法检测表明，凝血酶、胶原和ADP激活血小板后，活化的血小板的TF活性比比非活化血小板的TF活性高1倍以上；用ELISA法检测非活化和活化血小板离心后悬浮液中TF抗原的量，结果表明TF抗原量活化血小板比非活化的血小板平均多20%-30%［16］。以上实验结果均表明血小板活化后释放TF。

血小板释放TF的其他调节

提纯的血小板在受胶原刺激后可表达TF，而同样的刺激对白细胞却无明显的作用；但是血小板和白细胞的悬液受胶原刺激后，则白细胞TF活性比提纯的血小板明显增强［23］。研究发现，细胞和含TF的微粒或血小板之间的相互作用对TF活性的调节起关键的作用,而活性氧系统和血小板-白细胞黏附时分泌出来的细胞因子可以上调TF活性［23］。此外,活性氧可能还会通过中性粒细胞蛋白酶来灭活组织因子的抑制物［17］，并促进加密的TF的表达［24］。从过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的抑制TF活性效果中可看到，活性氧不仅可提高TF的活性，而且可增强TF诱导纤维蛋白形成和活化血小板的能力；嗜中性粒细胞和含TF的微粒及血小板牢固的结合，以及中性粒细胞释放的细胞因子都可以加强血液中TF的功能［14］。在血栓形成过程中，许多细胞因子都可调节血小板微粒的释放，如可溶的CD40配体，也可以促进血小板的释放［25］。

血小板TF在凝血过程中的作用

普遍认为，TF位于血管壁，与血浆中各种凝血因子分隔，从而防止血栓在完整的血管内生成。凝血和血栓生成是在血管损伤后形成的，因为血管损伤后血管壁上的TF暴露于血，与FⅦa结合形成复合物，从而启动凝血级联反应，形成血栓止血。同时，血栓的扩大还需要血小板的黏附，使其聚集于血管壁。血管壁上TF启动的活化凝血因子需要与血小板上的磷脂结合才能形成凝血酶原酶复合物。然而，黏附于血管壁的血小板白色血栓及早期生成的少量纤维蛋白是一道屏障，阻止活化的凝血因子与上层的血小板接触，使血栓不能扩大。即使凝血因子是通过理想的自由扩散运动也要数小时才能到达1mm血栓的顶端，而损伤血管壁形成的血栓一般有1-3mm大小。因此如果血细胞或微粒携带TF可以在逐渐形成的血栓表面激活凝血因子，而不需扩散［26］，即血小板表面本身能够形成一个纤维蛋白生成体系，使纤维蛋白不断生成,这样就可以稳定和巩固新形成的血栓［27］。问题和展望凝血是一系列凝血因子及其他成分参与相继酶解激活的过程，分子机制极其复杂，临床许多疾病如休克、血栓性疾病都存在凝血功能紊乱。随着研究的深入和现代科学技术的发展，很多作用机制都会得到阐明。在健康人中，TF不仅存在于血管外组织细胞，而且存在于血管壁及血循环中的一些细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、白细胞、血小板等。血小板与血液中TF表达的关系是十分密切的，因此对血小板在生理性止血、凝血及血栓性疾病的发病方面起着其他重要的作用，仍需进一步深入研究，只有这样才能了解疾病的发生、发展进程，以利于指导治疗。

【参考文献】

1CeliA,PellegriniG,LorenzetR,etal.P-selectininducestheexpressionoftissuefactoronmonocytes.ProcNatlAcadSciUSA,1994;91:8767-8771

2HennV,SlupskyJR,GrafeM,etal.CD40ligandonactivatedplateletstriggersaninflammatoryreactionofendothelialcells.Nature,1998;391(6667):591-594

3LindmarkE,TennoT,SiegbahnA.RoleofplateletP-selectinandCD40ligandintheinductionofmonocytictissuefactorexpression.ArteriosclerThrombVascBiol,2000;20:2322-2328

4SchneiderDJ,TaatjesDJ,SobelBE.Paradoxicalinhibitionoffibrinogenbindingandpotentiationofalpha-granulereleasebyspecifictypesofinhibitorsofglycoproteinⅡb-Ⅲa.CardiovascRes,2000;45:437-446

5KlinkhardtU,KirchmaierCM,WestrupD,etal.DifferentialinvitroeffectsoftheplateletglycoproteinⅡb/ⅢainhibitorsabixicimaborSR121566Aonplateletaggregation,fibrinogenbindingandplateletsecretoryparameters.ThrombRes,2000;97:201-207

6ScholzT,ZhaoL,TemmlerU,etal.TheGPⅡb/Ⅲaantagonisteptifibatidemarkedlypotentiatesplatelet-leukocyteinteractionandtissuefactorexpressionfollowingplateletactivationinwholebloodinvitro.Platelets,2002;13:401-406

7SongKS,KimHK.Plasmalevelsoftissuefactorantigeninpatientswithnon-insulin-dependentdiabetesmellitus.YonseiMedJ.2004;45:38-42

8GiesenPL,RauchU,BohrmannB,etal.Blood-bornetissuefactorviewofthrombosis.ProcNatlAcadSciUSA,1999;96:2311-2315

9SuefujiH,OgawaH,YasueH,etal.Increasedplasmatissuefactorlevelsinacutemyocardialinfarction.AmHeartJ,1997;134:253-259

10NieuwlandR,BerckmansRJ,McGregorS,etal.Cellularoriginandprocoagulantpropertiesofmicroparticlesinmeningococcalsepsis.Blood.,2000;95:930-935

11AsakuraH,KamikuboY,GotoA,etal.Roleoftissuefactorindisseminatedintravascularcoagulation.ThrombRes,1995;80:217-224

12BerckmansRJ,NeiuwlandR,BoingAN,etal.Cell-derivedmicroparticlescirculateinhealthyhumansandsupportlowgradethrombingeneration.ThrombHaemost,2001;85:639-646

13FreyssinetJM.Cellularmicroparticles:whataretheybadorgoodfor?JThrombHaemost,2003;1:1655-1662

14MullerI,KlockeA,AlexM,etal.Intravasculartissuefactorinitiatescoagulationviacirculatingmicrovesiclesandplatelets.FASEBJ,2003;17:476-478

15CameraM,FrigerioM,ToschiV,etal.Plateletactivationinducescell-surfaceimmunoreactivetissuefactorexpression,whichismodulateddifferentlybyantiplateletdrugs.ArteriosclerThrombVascBiol,2003;23:1690-1696

16SiddiquiFA,DesaiH,AmirkhosraviA,etal.Thepresenceandreleaseoftissuefactorfromhumanplatelets.Platelets,2002;13:247-253

17ZillmannA,LutherT,MullerI,etal.Platelet-associatedtissuefactorcontributestothecollagentriggeredactivationofbloodcoagulation.BiochemBiophysResCommun,2001;281:603-609

18Perez-PujolS,ArasO,LozanoM,etal.Storedplateletscontainresidualamountsoftissuefactor:evidencefromstudiesonplateletconcentratesstoredforprolongedperiods.Transfusion,2005;45:572-579

19LindemannS,TolleyND,DixonDA,etal.Activatedplateletsmediateinflammatorysignalingbyregulatedinterleukin1βsynthesis.JCellBiol,2001;154:485-490

20MallatZ,BenamerH,HugelB,etal.Elevatedlevelsofshedmembranemicroparticleswithprocoagulantpotentialintheperipheralcirculatingbloodofpatientswithacutecoronarysyndromes.Circulation,2000;101:841-843

21SchecterAD,GiesenPL,TabyO,etal.Tissuefactorexpressioninhumanarterialsmoothmusclecells:TFispresentinthreecellularpoolsaftergrowthfactorstimulation.JClinInvest,1997;100:2276-2285

22RauchU,BondermanD,BohrmannB,etal.TransferoftissuefactorfromleukocytestoplateletsismediatedbyCD15andtissuefactor.Blood,2000;96:170-175

23PennMS,PatelCV,CuiMZ,etal.LDLincreasesinactivetissuefactoronvascularsmoothmusclecellssurfaces:hydrogenperoxideactivateslatentcellsurfacetissuefactor.Circulation,1999;99:1753-1759

24Sturk-MaquelinKN,NieuwlandR,RomijnFP,etal.Pro-andnon-coagulantformsofnon-cell-boundtissuefactorinvivo.JThrombHaemost,2003;1:1920-1926

25PrasadKS,AndreP,HeM,etal.SolubleCD40ligandinducesbeta3integrintyrosinephosphorylationandtriggersplateletactivationbyoutside-insignaling.ProcNatlAcadSciUSA,2003;100:12367-12371

26BalasubramanianV,GrabowskiE,BiniA,etal.Platelets,circulatingtissuefactor,andfibrincolocalizeinexvivothrombi:real-timefluorescenceimagesofthrombusformationandpropagationunderdefinedflowconditions.Blood,2002;100:2787-2792

27EngelmannB,LutherT,MullerI.Intravasculartissuefactorpathway——amodelforrapidintiationofcoagulationwithinthebloodvessel.ThrombHaemost,2003;89:3-8.