放射免疫显像研究管理论文

摘要目的：将抗人原发性肝癌(PLC)单抗TIGTC-Ⅲ，用胃蛋白酶法消化成F(ab′)2片段，标记131I后进行裸鼠人肝癌移植瘤的体内定位研究。方法：采用胃蛋白酶消化法，进行裸鼠体内核素显像。结果：消化产率为31.7%±2.4%，经细胞结合实验证明F(ab′)2具有良好的免疫活性，抗体片段进入裸鼠体内后，与完整抗体比，进入肿瘤的速度快，生物学分布特异性高，定位指数上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明显缩短。结论：F(ab′)2与全抗体比较可使成像时间提前，定位清晰。

关键词单克隆抗体F(ab′)2片段放射免疫显像

ThepreparationofF(ab′)2fragmentofmonoclonalantibodyTIGTC-Ⅲanditsapplicationintumorradioimmunoimagine

SHILe-Hua,YANGJia-He,CUIZhen-Fuetal.

EasternHepatobiarySurgeryHospital,TheSecondMilitaryMedicalCollege,Shanghai200433

AbstractObjective：InordertorealizetheimmunoimmagingwithF(ab′)2fragmentofmonoclonalantibody(TIGIC-Ⅲ)forPLC.Methods：Monoclonalantibody(TIGTC-Ⅲ)againsthumanprimarylivercancer(PLC)wasdigestedintoF(ab′)2fragmentbypepsindigestion.Afterlabelledwith131Iand125IradioiodinatedF(ab′)2wasinjectedintonudemicebearingtumorxenograftsofPLCviatailveinandradioimmunoimaginewasperformed.Results:TheexperimentresultsshowedthattheyieldofpureF(ab′)2was31.7%±2.4%,theimmunoreactivityofF(ab′)2basedonthecellbindingstudieswasretainedwell.Aftertheinjectionof131I-F(ab′)2intoPLCtumor-bearingnudemice,photoscintigraphywasperformedatintervalsof12h.Thexenograftswerevisualizeddistinctlyduring24～96h.Conclusion：Theratiooftumortonon-tumor(T/NT)washigherthanthoseoftheintactIgGinalltissues.XenograftsofPLCinnudemiceacumulatedTIGTC-Ⅲ.Theexcretionofradioactivitywasdecreasedrepidly.

KeywordsMonoclonalantibodyF(ab′)2Radioimmunoimagine

用胃蛋白酶法制成TIGTC-Ⅲ的活性片段F(ab′)2，标记上131I后进行了裸鼠人肝癌移植模型的放射免疫显像(RII)研究。

1材料与方法

1.1单抗TIGTC-Ⅲ的制备TIGTC-Ⅲ系将肝癌细胞株HEPG2免疫Balb/c小鼠后将其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合而成的杂交瘤分泌的一系列抗体之一，已经抗体的专一性分析［1］。

1.2抗体片段F(ab′)2的制备与纯化按Harlow方法进行［2］。

1.3TIGTC-Ⅲ和F(ab′)2的标记及其免疫活性测定用氯胺T法［3］。标记物用SephadexG-25柱分离，去除游离碘。0.22μm微孔滤膜除菌，用细胞结合分析法测定免疫活性。

1.4荷人肝癌裸鼠模型的建立［4］将PLC细胞接种在4周龄的Balb/c裸小鼠腋部皮下，待肿块长到0.8cm3左右时进行定位及治疗研究。

1.5放射免疫显像及抗体的生物学分布

1.5.1动物处理标记抗体注射前72h起，在饮用水中加1%碘化钾，以封闭裸鼠甲状腺对碘的摄取。

1.5.2TIGTC-Ⅲ及F(ab′)2在荷瘤裸鼠体内的分布［5］12只荷瘤裸鼠，每鼠注射7.4×106Bq的125I-F(ab′)2，给药后每24h处死3只，取肿瘤、血液及各脏器。分别称重并测其放射性算出T/NT。另取3只荷瘤鼠，从尾静脉注入125I-F(ab′)2及非特异性的131I-F(ab′)2，48h后处死，取器官组织称重后分别测放射性计数，计算定位指数。

1.5.3放射免疫显像每鼠注射200μCi/0.1mg的131I-F(ab′)2，对照组注射相同剂量的非特异131I-

F(ab′)2，每12h行γ照射。

1.5.4标记抗体的生物半衰期42只8周龄的Balb/c小鼠，分完整抗体组与F(ab′)2组。分别于给药后12、24、48、72、96、120h处死，分离血清并加200μl肝细胞(1×106)，测放射性计数后算出抗体的生物半衰期。

1.5.5TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的体内药代动力学取6只8周龄Balb/c小鼠分全抗体与F(ab′)2组，给药后分别于6、12、24、48、72、96、120h自尾静脉取血10μl，测放射性后绘制放射性-时间曲线。

2结果

2.1抗体片段的制备纯化TIGTC-Ⅲ，经电泳检测纯度大于95%。用胃蛋白酶消化，16h以上消化完全。消化液经层析后第1峰为F(ab′)2。其产率为31.7%±2.4%。

2.2标记抗体的质量控制TIGTC-Ⅲ的标记率为72%，比活度为7.54MBq/mg，放化纯度92.5%±1.7%。TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2标记上碘后，与PLC细胞的结合率分别为45%与28%，mIgG与其F(ab′)2的结合率均小于5%。

2.3不同时间每克肿瘤及其它组织对TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的摄取量见表1。

2.4不同时间的T/NT值见表2。

2.5定位指数静注碘标抗体后48h，测得定位指数TIGTC-Ⅲ为3.45，TIGTC-ⅢF(ab′)2为5.88。

2.6荷瘤鼠放射免疫显像注入抗体后24h瘤区有放射性浓聚，36h后肿瘤显像。显像最佳时间为全抗体96h左右(图1，B)，F(ab′)236～48h(图1，A)，mIgG整个显像过程无明显浓聚(图1，C)。

2.7抗体的清除速率及生物半衰期F(ab′)2在心血管的清除明显快于完整抗体，F(ab′)2的生物半衰期约20.0h，全抗体为52.6h左右，两者差异显著。

表1裸鼠组织对完整抗体及其片段的摄取率

Tab.1PercentageintakeofTIGTC-ⅢandF(ab′)2pergramoftissue

Tissue24h48h72h

TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2

Tumor0.311.412.210.793.110.68

Heart0.460.360.480.300.450.15

Blood2.511.451.870.621.620.41

Kidney0.911.750.926.870.760.59

Liver1.620.501.860.321.270.20

Lung0.860.940.670.580.630.22

Muscle0.360.250.310.240.420.15

Spleen1.390.811.520.401.230.19

Bone0.330.210.350.190.470.11

表2裸鼠注射完整抗体及其片段后的T/NT值

Tab.2T/NTvaluesofdifferenttissueinnudemiceafterinvivoinjectionofTIGTC-Ⅲ&F(ab′)2

Tissue24h48h72h

TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2

Cerebrum19.5018.3321.8020.2023.5022.80

Bone2.702.852.953.023.202.85

Blood0.690.890.711.180.781.22

Heart1.380.692.502.883.102.72

Intestine2.251.124.754.865.305.58

Kidney1.080.432.150.562.400.81

Liver2.072.552.603.843.024.24

Lung1.270.981.340.761.500.80

Muscle3.503.253.783.453.853.47

Skin0.430.660.981.721.421.56

Spleen1.671.902.253.442.483.89

Stomach1.410.722.853.983.704.65

图1F(ab′)2注入荷人肝癌裸鼠体内后72h的RII

Fig.1TheradioimmunoimageofPLC-bearingnudemice72hafterinjectionofF(ab′)2

3讨论

在以单抗为载体的放射免疫显像中，由于完整抗体的Fc段常与组织细胞的Fc受体结合而使本底清除减慢，从而影响成像，抗体片段优于完整抗体已被许多学者所证实［6］。我们实验结果亦表明F(ab′)2比完整抗体有如下优点：F(ab′)2进入肿瘤速度快，生物学分布特异性提高，定位指数上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明显缩短，从而使成像时间提前，成像清晰。

随着影像技术的发展，使原发性肝癌的诊断及定位变得较为容易，因此，单抗在肝癌的应用主要在于放射免疫治疗，由于F(ab′)2的以上特点，使抗体片段在肿瘤部位的摄取量低于完整抗体，且生物半衰期短，免疫活性低，从而用于肝癌导向治疗不如完整抗体。如何解决这一矛盾将是以后进一步研究的目标。

在抗体片段的制备中有两个基本要求，即尽可能高的消化产率及保留免疫活性。本实验采用胃蛋白酶消化法，此法虽然产率较低，但方法简便，免疫活性较高。F(ab′)2片段的免疫活性在标记的前后均低于全抗体，可能是消化过程中酶对其损伤所致，为保留抗体的免疫活性，应尽量缩短反应时间。

作者简介：施乐华，男，40岁，肝胆外科学博士；

指导教师，吴孟超，男，中科院院士，博士生导师，主要研究肝癌的基础研究与临床治疗

作者单位：施乐华杨家和崔贞福吴孟超(第二军医大学东方肝胆外科医院，上海200433)

潘文舟孔令山(第二军医大学长海医院，上海200433)

王明库(黑龙江红兴隆管局中心医院，黑龙江155811)

4参考文献

1施乐华，吴孟超，陈汉etal.分泌抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤TIGTC的制备及专一性分析.第二军医大学学报，1996；17(4)：313

2HarlowED.Antibodiesalaboratorymanual.NewYork:ColdSpringHarborLaboratory,1988:615

3肖祥熊.实用放射免疫分析及其临床意义.上海：上海同济大学出版社，1985：5

4刘康达，鱼达，包炎明etal.裸鼠人肝癌模型在肝癌导向研究中的应用.中华肿瘤杂志，1988；10(6)：414

5RiethmulleyG,Schneider-GadickeB,SchlimokGetal.RandomisedtrialofmonoclonalantibodyforadjuvanttherapyofresectedDukesCcolorectalcarcinoma.Lancet,1994;343:1177

6GoldenbergDM.Currentstatnsofcancerimagingwithradiolabeledantibodies.JCancerRes,1987;113:203