细胞培养十篇
时间：2023-03-19 17:17:08
导语：如何才能写好一篇细胞培养，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
细胞培养篇1
关键词：心肌细胞；乳鼠；原代培养
中图分类号：R-332文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2007)04-0691-02
随着分子生物学和细胞生物学的发展，细胞水平的研究日益受到重视。体外培养的心肌细胞可保存其结构及功能上的某些特点，具有自发性搏动，可在不受神经、体液因素的影响下，直接进行心肌细胞的生理、病理、药理、毒理及能量代谢等方面的研究「1。以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子，心肌细胞培养有着广阔的应用前景。根据Simpon[2]的方法并稍加改进培养乳鼠心肌细胞叙述如下。
1 实验材料
1.1动物1～3天的Wistar乳鼠，由甘肃中医学院SPF级实验动物中心提供。
1.2实验试剂及设备DF培养液：将DMEM培养基与HamF12培养基按1∶1比例混合，5-溴脱氧尿嘧啶：均为美国Sigma公司产品；新生牛血清(NBCS)：杭州四季青生物材料工程研究所；胰蛋白酶和II型胶原酶(上海生物公程有限公司)；α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(α-sarcomericactin,α-SA)，链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（strept avidin biotin peroxydase complex, SABC）免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司)；超净工作台(苏净集团)；倒置相差光学显微镜(日本Olympus公司)。
2方法
2.1乳鼠心肌细胞的原代培养及纯化根据Simpon[2]的方法。取1~3天龄Wistar大鼠乙醚麻醉，75%酒精消毒。开胸取出心脏，取心尖部组织剪为1~3mm3碎块，加入0.08%胰蛋白酶溶液消化10min,待自然沉淀后弃上清。剩余组织块中加入混合消化酶（0.08 %胰蛋白酶+0.04%胶原酶等量加入的混合液）置37℃水浴消化10min，静置后将上清液移入盛有15%新生牛血清的DF培养液的离心管中终止消化，并以1000r/min离心10min，弃上清液，用DF培养液充分吹打成单细胞悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化为止。收集各次消化所得细胞悬液接种于100mL培养瓶中。
采取差速贴法壁和化学方法分离纯化心肌细胞。37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5～2h，分离纯化心肌细胞。非心肌细胞贴壁速度较快，首先附在瓶底，心肌细胞仍处于悬浮状态。吸出细胞悬液离心，将沉淀混悬按0．8×10 个／m2 的密度接种于50 mL培养瓶，其中置一0．5 cm×1 cm的盖玻片(预先用鼠尾胶原处理)，以便作免疫组化进行纯度鉴定。用0.1mmol／L 5-Brdu的培养基培养3天，以抑制非心肌细胞增殖，然后换为常规培养基培养，每2～3天换液1次。
2.2心肌细胞的形态学观察及鉴定①光镜观察：用倒置相差显微镜观察细胞。并照像，见图1。②心肌细胞纯度的鉴定：肌细胞纯度的鉴定分别在培养的第1、2、4、8天取出盖玻片。PBS清洗2次，丙酮固定后，用a―SA作免疫组化进行纯度鉴定。
3结果
3.1倒置相差显微镜进行细胞形态学观察刚分离的心肌细胞呈球形，培养4h细胞开始贴壁生长，呈圆形，后变为梭形，细胞贴壁生长并伸出伪足，变为三角形、多边形等。12 h细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动。第48h细胞伸出伪足相互交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性。培养的心肌细胞在3～18天无论细胞形态还是细胞括力都良好，在此期间可加各种处理因素进行实验研究。第19天心肌胞活力开始下降，搏动次数减少。第21天时部分细胞停止搏动,细胞皱缩、脱落。
3.2细胞的纯度鉴定在培养的心肌细胞中α-SA抗原表达呈阳性，棕黄色位于胞浆，非心肌细胞中呈阴性。因此α-SA的阳性率可做为心肌细胞纯度鉴定的指标。镜下选10个视野，每个视野200个细胞。计算阳性细胞的比率见表1。
表1培养心肌细胞的纯度(α-SA阳性率)
培养天数(天)阳性细胞数(个)细胞总数(个)阳性率(％)
4讨论
过去在乳鼠心肌细胞原代培养时，曾采用不同浓度胰蛋白酶消化法，用单一酶消化心肌组织，对细胞膜、细胞内微丝及微管损伤较大，获得的心肌细胞数量少而且活力差。本文采用胰蛋白酶加Ⅱ胶原酶的方法可分离出数量多纯度较高的心肌细胞，提高心肌细胞的存活率，因此消化过程和浓度的把握是原代培养的重要环节。
心脏是由心肌细胞和非心肌细胞组成。其中心肌细胞约占心脏组织的25%，近75%的细胞是非心肌细胞(如成纤维细胞和血红细胞)，其较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，很容易生长成优势细胞。体外培养时非心肌细胞的快速生长与体内的情况完全不同，可能使心肌细胞生长会出现密度抑制的现象「3；所以获得纯度高的心肌细胞培养模型对研究方法的科学性及结果的可靠性具有重要意义。
Simpos法[2]是乳鼠心肌细胞培养的经典方法，但研究发现用此法培养时心肌细胞的收获率和搏动率均较低，故而对其进行了适当的改良。主要有以下几点：①胰酶和Ⅱ型胶原酶合用；②每次消化时间不应过长，多次重复及时终止消化；③消化期间缓慢恒温振荡；④延长差速贴壁时间1.5～2h；⑤延长5-溴脱氧尿苷作用的时间。
细胞培养篇2
自从1965年chestman和smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来 ［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。 实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽 然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所 表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持 表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其 细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其 生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分 裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分 泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌 或旁分泌信号的方式而存活。
1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响
软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外 大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益 深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培 养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化 等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细 胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基 质合成代谢的细胞因子有：igfs.tgf-βs.pdgf,fgf.egf，对软骨细胞有抑制作用的有il- 1、il-2、il-7、tnf-α、ifn-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下 ：
1.1转化生长因子beta(tgf-β)
tgf-β最初是由robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。t gf-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明tgf-βs具有促进软骨细胞增 殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。f.redni等实验证明培养兔关 节软骨细胞表达了不同的tgfβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在s期表现了 低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而go/g期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此 ， tgf-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明tgf-β更多的结合在go/g1 期比s期的同步化软骨细胞，从而说明tgf-βs对软骨细胞的作用是通过 不同的途径［ 4］。也有学者证明tgf-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重 作用，1-10ng/ml浓度的tgf-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的ⅱ型 胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/l浓度下，tgf-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶 活 性，减少软骨细胞ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明tgf-β可 抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。tgf-β可能与多种因素如胞外基质和其它分 化调控生长因子参与对细胞的调节作用［6］。tgf-β在细胞对其它各种分化信号 的应答过程中同样也有调节作用。wen-ning qi等实验证明ⅱ型胶原能特异的调节tgf- β刺激软骨细胞合成ⅱ型前胶原dna和蛋白多糖，同时说明ⅱ型胶原在tgf-β存在的条件下 调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此ⅱ型胶原基因表达的变化在 tgf存在条件下受ⅱ型胶原的调控［7，8］。
体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如tgf-βs、igfs、fgf、bmp、 il-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，tgf-β对igf的分泌作用有三种，(1)减少41kd的ig fbp；(2)增加igf受体的结合位点；(3)下调了诱导型igf-1受体的自身磷酸化［9］ ，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为tgf-β和igf可以使反分化 的软骨细胞再分化诱导和持久表达ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培 养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌il-1有关，而tgfβ可作为一种il-1的拮抗剂，减 少了il-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了il-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。tgfβ可能通过以下两种途径拮抗il-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制 剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的合成有促进作用［1 2］。
1.2骨形态发生蛋白(bmp)
bmp是tgfβ的超家族成员之一，bmp-7(op-1)是bmp家族中的一员，其对无血清培养的高密 度单层细胞和悬浮在琼脂糖中的细胞有促进生长和成熟作用，可增加其碱性磷酸酶活性和提 高mrna和ⅱ型胶原的合成能力。实验rhbmp(op-1)能有效促进胚胎和成人关节软骨细胞合成 蛋白多糖和ⅱ型胶原而ⅰ、ⅲ型胶原没有增加。也有实验证明op-1对人软骨细胞特异性胶 原、蛋白多糖的促合成作用比igf-ⅰ、tgf-β和激活素更显著［13］。在培养软 骨细胞生长周期的不同时期，bmp的作用也不同，rhbmp调节软骨细胞增殖、分化作用依赖于 细胞的成熟状态，且静止区软骨细胞更敏感，同时对软骨细胞的自分泌也有作用［14 ］。关节软骨细胞原代培养时表达了bmp-4功能性受体。1998年rach1,venena等实 验证明bmp2和维生素c共同作用下培养的软骨细胞没有诱导其肥大，同时bmp-2独自干预下 细胞凋亡明显少于维生素c的干预，从而说明软骨细胞向肥大软骨细胞的过度与细胞增殖数 量减少而相对高的凋亡水平有关。软骨细胞体外传代培养渐反分化为成纤维样细胞或过度为 肥大软骨细胞与细胞生存的微环境有关［15］。
1.3胰岛素样生长因子(igfs)
igf于1953年由salmon和danghaday研究表明，igfs家族由两种相关多肽组成即igf-ⅰ和igf -ⅱ。在软骨细胞表面有igf的受体且软骨细胞能合成和分泌这种多肽。igf-ⅰ能与软骨细 胞膜上的受体结合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。igf-ⅰ能强烈刺激软骨细胞合成ⅱ 型胶原和蛋白多糖，igf-ⅰ还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，体内igf-ⅰ能促进骨 骺软骨生长。而igf-ⅱ能刺激软骨细胞dna和rna的合成且比igf-ⅰ更有效的刺激胚胎细 胞的生长。但igf-ⅰ对成年软骨细胞的作用强于igf-ⅱ，也能促进蛋白多糖的合成。软骨 细胞表面的igf-ⅱ的受体与igf-ⅰ相比，两者的结构与体外活性相似，但体内生物效应不 同。而igf结合蛋白(igf1bps)它通过特异性结合igfs而起作用，尽管目前对igfbps的生理功 能还不十分清楚，但它们对igfs的调节作用是肯定的，它们通过结合igfs减少了igfs与其受 体的相互作用，从而降低了igfs的活性。onley等人实验表明细胞因子可以调节igfbps的产 生，igfbps反过来调节igf的作用，同时表明il-1α、tnf-α降低细胞对igf-ⅰ的反应 性可能是通过增加igfbps而起作用。
1.4成纤维细胞生长因子(fgfs)
fgfs最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质，后来发现它在人体组织包括骨、软骨基质中 广泛存在，且对胚胎发育及软骨修复起重要作用。体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、 成熟和胞外基质的合成，而bfgf是一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨 细胞蛋白多糖的合成。在成人关节软骨中它与igf有协同作用，两者协同刺激软骨细胞有丝 分裂和蛋白多糖的合成，抑制软骨细胞分化为肥大表型。
1.5白介素和肿瘤坏死因子(il、tnf)
近来报道il-1对关节软骨细胞代谢的干预作用主要表现为抑制透明软骨特征性ⅱ、ⅳ型胶 原的合成，而促进ⅰ、ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合 成同时il-1对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提 高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。tnf是通过il-1而抑制ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成 ，但其作用远弱于il-1。
2力学刺激对培养软骨细胞的影响
关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成，而胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖，其中ⅱ型 胶原占胶原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，关节运动时软骨经历循环应力载荷而发 生周期性变形和恢复，循环载荷是软骨细胞执行正常功能和维持胞外基质正常表型的基本因 素。而体外培养软骨细胞其随传代次数增加而发生代谢、表型的变化伴有ⅱ、ⅳ型胶原合成 减少，ⅰ、ⅲ型胶原合成增加和蛋白多糖分子量的改变，为维持体外培养软骨细胞的正常形 态和功能则许多学者进行了软骨细胞培养的力学刺激实验研究。这种压力可分为两种：一种 是持续静压力，一种是循环动压力，力学刺激对调控软骨代谢和维持其胞外基质正常表型起 重要作用，其中静压力刺激减少了ⅱ胶原和蛋白多糖的合成，而正常动压力刺激则促进ⅱ型 胶 原和蛋白多糖的合成［16，17］，k.koarninnta［18］实验表明持 续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了聚合素mrna的表达，改变了高尔基氏器 的形态和抑制微丝的组成。在循环压力作用下软骨组织内4种物理特性发生变化；①静水压 ；②毛细液流；③流能；④组织与细胞变形。低频循环压力促进基质降解而高频循环压力则 促进软骨细胞合成代谢。所以力学刺激是软骨细胞的一个重要调节者，但软骨细胞又如何接 受力学刺激信号呢自从认识软骨细胞可以分泌整合素以来，整合素就在软骨细胞与胞外基 质信号转导方面起着重要作用。整合素是一种异二聚体(α、β)转膜糖蛋白特异性受体，力 学刺激使胞外基质与整合素结合同时与细胞骨架相连，从而影响着基因表达和调控细胞生长 和分化［19，20］。力学刺激促进胶原合成增加同时整合素合成也上调，力学刺激 增加了α2整事素亚单位mrna表达。实验表明在软骨细胞培养一周后，给予循环压力刺激 15次/min，结果3h后，循环压力促进了ⅱ型胶原和聚合素mrna的表达，从而说明胞外基 质 调节整合素来应答力学刺激。α2 β1整合素是ⅱ型胶原受体。软骨基质受体作为一 种 应力感受器在软骨基质网络中通过力学刺激信号来调控软骨细胞。周期性力学刺激促进基质 合成，而静压力则促进基质合成减少［21，22］，所以力学刺激信号可能通过力学 刺激、细胞外基质、整合素、细胞骨架(肌动蛋白)而调控软骨细胞的增殖和分化功能。taka haki-k［23］等实验证鞒?咚?降木菜?褂盏?l－6和tnf-α mrna表达增加 而缩减了蛋白多糖核心蛋白的表达，生理水平的静水压则增加了蛋白多糖核心蛋白的表达， 组织与细胞变形可兴奋ecm受体［24］细胞膜张力受体、细胞网架结构［25 ］而促进合成功能，总之，机构压力对培养软骨细胞的作用在有效范围内与压力值无关， 而与压缩程度(静压力)和频率(循环压力)有关，持续的静压力抑制软骨细胞的合成代谢，一 定频率的循环压力则促进软骨细胞的合成功能［26］。
3其它因素对培养软骨细胞的影响
体外培养软骨细胞随其传代而表型整个发生改变，正常的ⅱ、ⅳ型胶原合成减少，ⅰ、ⅲ 型胶原合成增加，在不同的培养条件下(如培养基、ph细胞的接种密度、血清浓度、氧分压 及其培养基的离子浓度、培养方式)其表型不同，有时可以反分化或向肥大软骨细胞转化。 体外培养只有保持其正常形态才能保持其正常功能。freed［27］等将软骨细胞移 植于dga、pla进行三维体外培养，证明三维培养6周后其细胞数扩增了近8.3倍，且传代后细 胞产生蛋白多糖和ⅱ型胶原的能力较佳，所以软骨细胞三维培养有利于维持其形状，常利用 胶原纤维蛋白、琼脂、海澡酸盐、pga、pla等为附属物进行三维培养。也有学者认为无血清 培养可以阻止软骨细胞反分化。培养基ph值轻度偏碱不利于蛋白多糖的合成，偏酸则相反。 低钙环境有利于软骨细胞的稳定［28］。1995年baragi［29］等将il - rα和标记基因lacz分别构建在腺病毒上转染软骨细胞并将它们分别与骨关节炎软骨组织块 一起培养，结果表明与il-1rα转染软骨细胞培养的组织块能抵制il-1β的作用而与lacz 细胞培养的软骨细胞块抵制作用明显减弱，从而说明基因转染可以用来调控软骨细胞从而维 持其表型。
4结束语
体外培养软骨细胞的优点是可以大量扩增及研究其生命活动的状况，但要维持其正常表型则 受到众多复杂因素的调控。就其细胞因子而言，细胞因子对体外培养软骨细胞的作用非单一 的，而是一个复杂的网络调节作用，如生长因子的生物学活性是由受体介导的，生长因子在 软骨细胞合成分泌后，多为无活性的前体分子需要经过特异性的激活才能发挥作用。生长因 子之间存在基因表达及其活性的相互调控tgf-β能促进pdgf的a链和b链的mrna表达和分泌 ［30］。bfgf能促进tgf-β mrna的表达，诱导间充质细胞分化成软骨细胞，增强 tgf对软骨细胞的增殖及其基质合成作用。生长因子之间还存在受体水平的调控，胰岛素不 影响tgf-ⅱ型受体的亲和力但增加了ⅱ型受体的数目引起受体上调效应，从而ⅱ型受体与 ⅰ型受体竞争，使胰岛素与ⅰ型受体结合减少。il-1可使tnf受体下调，而ifn-γ却使tnf 受体上调等。但是网络生长因子如何调控体外培养软骨细胞的增殖、分化阻滞反分化或向肥 大型转化、维持其正常软骨细胞表型及合成特异性胞外基质还需进一步的研究。总之软骨细 胞体外培养维持其正常表型则受到众多因素的影响如培养条件及其方式，细胞的微环境，ph 值、细胞密度、力学变化、生长因子等等。随着细胞生物学和分子生物学的发展，软骨细胞 体外培养大量扩增、分化维持其正常的表型及代谢的调控因素会渐为人们所明晰，为组织工 程化软骨修复软骨缺损、体外培养软骨细胞建立软骨细胞库(永生化软骨细胞)及揭示退变性 骨关节病又开拓了一条新的途径。
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细胞培养篇3
[关键词] CIK细胞；细胞毒活性；增殖率；表型
[中图分类号] R-331 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）01（a）-0012-03
肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视[1]。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cell，CIK）是肿瘤生物免疫治疗的主力军[2]。其主要的效应细胞为CD3+、CD56+表型T淋巴细胞，因此，培养高纯度CD3+、CD56+细胞是提高CIK细胞毒活性，增强对肿瘤细胞杀伤的关键[3]。本研究通过体外的CIK细胞毒实验及流式细胞仪分析检测CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率，观察不同培养时间CIK细胞的增殖能力、杀伤活性，以探讨CIK细胞培养时间与细胞毒活性的关系。
1 资料与方法
1.1 主要试剂
人淋巴细胞分离液Ficoll Paque Plus，基因重组人IL-2、IL-1、IFN-γ和CD3单抗（Sigma公司），RPMI1640培养基（美国GIBCO），小牛血清（NCS）（美国GIBCO），四甲基偶氮唑盐MTT（华美公司），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国）。流式试剂CD3FITC/CD56PE（BD公司，美国），肺癌细胞株A549均为本实验室保存和传代培养。
1.2 实验方法
1.2.1 CIK细胞的培养 抽取恶性肿瘤患者的外周血，Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞（PBMC），用RPMI1640调整至2×106个/mL进行培养，培养基中含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素和50 μmol/L、巯基乙醇、IFN-γ 1 000 U/mL，于当日加入IFN-γ（1 000 μ/mL），置于37℃和体积分数为5%的CO2培养箱中培养24 h，第1天加入IL-2（1 000 U/mL）、IL-1α（100 μ/mL）、McAb（50 μg /mL），以后每3天换液1次，培养42 d，于培养第0、7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞。
1.2.2 CIK细胞扩增分析 在培养扩增后第7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞制成细胞悬液，用台盼蓝排除法计数活细胞，并除以初始细胞数，求出实际扩增倍数。
1.2.3 CIK细胞的表型分析 分别收取培养第0、7、14、21、28、35、42天CIK细胞，用PBS洗2遍，重悬后分别加入1.5 mL管中，每管106个细胞，离心后，加FITC标记的抗CD3mAb和PE标记的抗CD56mAb各50 μL，于4℃孵育30 min。PBS洗2遍，离心后，每管加1 mL FACS保存液。用流式细胞仪分析CIK细胞的表型。
1.2.4 CIK细胞体外细胞毒活性检测 采用96孔培养板用MTT法测定CIK细胞的杀伤活性，收取第0、7、14、21、28、35、42天培养的CIK作为效应细胞，肺癌细胞株A549细胞作为靶细胞，取对数生长期A549细胞调整浓度为1×105个/mL，CIK细胞浓度分别调整为1×106/mL、2×106/mL、4×106个/mL，效靶比依次为10∶1、20∶1、40∶1，分为实验组、效应细胞组、靶细胞组，每组3个复孔，实验组每孔加效应细胞、靶细胞各100 μL，靶细胞组每孔加入靶细胞、1640培养液各100 μL，效应细胞组每孔加入效应细胞、1640培养液各100 μL，置37℃，5%CO2培养箱中培养40 h，加入MTT试剂每孔100 μL，37℃孵育4 h，弃去上清，每孔加入DMSO溶液100 μL，震荡溶解沉淀后于全自动酶标检测仪（波长571 nm）检测吸光度值（A值）计算杀伤率，杀伤率=[1-（实验孔A值-效应孔A值/靶细胞孔A值] ×100%。
1.3 统计学方法
应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 采用直接计数活细胞
观察培养第7、14、21、28、35、42天的CIK细胞扩增倍数的变化，结果见表1，培养第21天细胞扩增倍数为（372±1.87），培养第28天细胞扩增倍数为（410.00±6.52）倍，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）；培养第35天CIK细胞扩增倍数为（414.00±5.16）倍，与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（P??0.05）。
2.2 用流式细胞仪分析不同培养时间CIK细胞的表型变化
结果培养第0天CD3+、CD56+双阳性细胞仅占（6.20±1.12）%，第14天达（18.60±4.50）%，第28天为（35.60±2.30）%，达最高峰，其后逐渐降低。见表1。
2.3 MTT法检验培养
第0、7、14、21、28、35、42天的CIK细胞对肺癌细胞系A549效靶比10∶1时杀瘤率分别是14%、51%、86%、95%、68%、50%、27%效靶比20∶1时杀瘤率为15%、88%、98%、100%、81%、67%、53%；效靶比40∶1时杀瘤率为17%、98%、100%、100%、95%、75%、70%。见图1。结果显示，当效靶比为10∶1时，培养21 d的CIK细胞杀瘤率是95%，达最高峰；当效靶比为20∶1时，培养21 d的CIK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比为40∶1时，培养14 d的CIK细胞杀瘤率即可达到100%。
3 讨论
CIK细胞是在体外条件下通过加入不同的细胞因子（IFN-γ、IL-1、IL-2、CD3McAb）刺激外周血单个核细胞培养诱导而成，同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子。与既往临床使用的过继免疫疗法相比，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点[4]，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞[5]，其主要效应细胞为CD3+、CD56+T淋巴细胞，且细胞毒作用几乎唯一存在于CD3+、CD56+表型中。CD3+、CD56+细胞可释放大量的具有细胞毒性的胞浆颗粒而对靶细胞发挥溶细胞作用[6]。这种效应细胞在正常外周血中极其少见，仅为1%～5%。已经证实培养过程中CIK细胞毒作用的增加源于单个细胞基础上的细胞毒作用的提高和非活性细胞被激活，成为有细胞毒作用的细胞，即共表达CD56+和CD3+的细胞数量的显著增加[7]。由此可见，就免疫治疗来说，足够数量的、高免疫毒性的免疫效应细胞是保证治疗效果的必备条件。李文等[8]报道，CIK细胞总数应>5×109才具有治疗作用。李香丹等[9-11]根据实验研究，认为每杀伤1个肿瘤细胞需要40个淋巴细胞，所以在肿瘤生物治疗中，输注细胞数量与疗效呈正相关，应重点研究如何培养出高数量、高杀瘤活性的CIK细胞。从实验结果可以看出，培养时间可能是影响CIK细胞总数、CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率和CIK细胞杀伤活性的重要因素。因此笔者对不同培养时间的CIK进行了分析，期望寻找CIK细胞最佳培养时间区间。结果显示：培养第21天细胞扩增倍数为（372.00±1.87）倍，培养第28天细胞扩增倍数为（410.00±6.52）倍，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）。培养第35天CIK细胞扩增倍数为（414.00±5.16）倍，与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（P??0.05）。通过流式细胞仪检测不同培养时间CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率，结果显示培养至第28天CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率为（35.60±2.30）%，达最高峰，其后逐渐降低。故此可以认为，培养时间的延长有利于增强CIK细胞的细胞毒活性，但不是培养时间越长细胞质量越好，综合上述实验结果，笔者认为CIK细胞的最佳培养时间应为28 d左右。笔者用MTT法测定CIK细胞对肺癌细胞株A549的杀伤活性，结果显示：效靶比为10∶1时，培养21 d的CIK细胞杀瘤率是95%，达最高峰；当效靶比为20∶1时，培养21 d的CIK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比为40∶1时，培养14 d的CIK细胞杀瘤率即可达到100%。由此可见增加效应细胞的数量，会大大提升对肿瘤细胞的杀伤力。至于在培养过程中什么因素导致CIK细胞数量上显著的增加，有人认为是抗CD3单抗对CD3+T细胞的刺激导致了CD56+细胞群通过细胞与细胞接触或分泌某种细胞因子而得以表达和扩增，但确切的机制尚待进一步研究。
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细胞培养篇4
关键词：豆腐柴（Premna microphylla Turcz）；愈伤组织；悬浮细胞
中图分类号：R282；Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）01-0171-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.01.043
Embryoid Induction and Cell Suspension Culture of Premna microphylla Turca
LI Zhi-chao1，LI Lin-ling1，2，CHENG Hua1，2，CHENG Shui-yuan1，2
（1. College of Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei，China；2.Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratory， Huanggang 438000， Hubei， China）
Abstract： In order to find the suspension culture conditions of Premna microphylla Turca，the leaf blades of the experimented Premna microphylla Turca，induced embryogenic callus and subculture，which established a good dispersion and a high dynamic suspension cell line. The results showed that the callus induction from leaves were different. Which induces the most suitable medium for suspension culture of loose embryogenic callus contained MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L NAA+3% sucrose+0.8% agar. Cell lines can be dispersed better by cellulase and pectinase dispersed callus block. The most suitable medium for suspension cell growth contains MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT+3% sucrose. And in this medium，the fresh weight of the suspension cultured cells could be increased by 6.46 times per 7 days. Dark culture was more suitable for cell proliferation. The average contents of pectin and protein were 6.57% and 0.12% in the suspended cells of Premna microphylla Turca，which had been cultured for 3 weeks under the optimum culture conditions.
Key words： Premna microphylla Turcz； callus； suspension culture
豆腐柴（Premna microphylla Turcz）又名臭S荆、豆腐木、腐婢等，为马鞭草科豆腐柴属落叶直立灌木[1]。其叶片具有丰富的果胶，含量可达39.5%，酯化度73%～78%，可以作为优良的果胶提取原料[2]。此外，豆腐柴叶片中粗蛋白含量高达29.0%～34.1%，在目前已知植物中名列前茅；其根茎部含有木栓酮、木栓醇、十八碳酸、甾醇、胡萝卜甙、柚皮素、香草酸等多种药用成分[3，4]，被用于中国传统中医治疗皮肤伤口、感染、疟疾、痢疾、头痛和毒蛇咬伤等[4]。
目前，豆腐柴主要通过野外采集获得，由于野生条件下豆腐柴零星散布在海拔500～1 500 m向阳山坡疏林下、林缘、沟谷边、荒山、丘陵、灌木层中[3，4]，难以满足生产需要。此外，其生长缓慢，种子自然态萌发率低。因此，豆腐柴的繁殖和人工栽培尤为重要。关于这类野生药食用植物的人工繁育研究进展缓慢。房江育等[5]、李琳玲等[6]、刘世彪等[7]分别对豆腐柴扦插和水培生根进行了相关试验。程华等[8]、程水源等[9]探讨了植物生长调节剂对豆腐柴愈伤组织诱导的影响。而关于豆腐柴细胞悬浮培养体系构建的研究鲜见报道。本研究通过对豆腐柴疏松愈伤组织诱导和细胞悬浮培养进行研究，分析诱导疏松的、适合进行悬浮培养的豆腐柴愈伤组织的最适培养基及豆腐柴细胞悬浮培养的适宜条件，以期为通过细胞大规模培养生产豆腐柴果胶或次级代谢产物的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
材料采自湖北省罗田县大别山区野生豆腐柴的新鲜植株。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导 从豆腐柴枝中上部剪取生长健壮、无病、虫害的嫩叶，用流水冲洗后再用去离子水浸泡冲洗干净，置于超净台上无菌风吹干，用70%乙醇消毒30 s，0.1%升汞消毒数分钟，无菌水冲洗5～6次，每次1 min，用无菌滤纸吸干材料表面水分。
将消毒处理好的叶片用解剖刀切成0.5～1.0 cm2的小叶盘，接种于MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂。（24±2） ℃下进行14 h 2 000 lx光照+10 h黑暗培养。
1.2.2 悬浮培养分散细胞制备 分别采取机械分散法和消化分离法分散愈伤组织细胞。
机械分散法：将继代3次的愈伤组织用解剖刀切碎，再用无菌玻璃棒搅拌使其分散，经无菌80目网筛过滤后即为分散培养细胞。
消化分离法：选取生长旺盛，继代3次的愈伤组织约2.0 g，接种于细胞分散培养基MS液体培养基+0.04 mg/mL纤维素酶+0.04 mg/mL果胶酶中，24 ℃，120 r/min悬浮振荡培养2 d后，无菌80目网筛过滤即得分散培养细胞。
1.2.3 细胞悬浮体系优化设计 细胞悬浮培养采取以MS+5%蔗糖+350 mg/L水解酪蛋白为基本培养基，加上不同浓度配比的植物生长调节剂（表1）。用150 mL三角瓶悬浮培养豆腐柴愈伤组织细胞，取每瓶50 mL液体培养基进行接种。
将接种液接种于含有不同激素的MS液体培养基中（表1），置于24 ℃、24 h 2 000 lx光照或24 h黑暗条件下，120 r/min悬浮振荡培养。7 d继代1次，连续继代2～3次，将细胞悬浮培养物用80目镍网过滤，滤液分装后继续培养，作为起始悬浮培养液。每隔3 d取3瓶细胞培养液进行离心（5 000 r/min，10 min）后，于60 ℃烘干，测定细胞干重。
1.2.4 细胞形态观察 用解剖针挑取少量愈伤组织细胞于载玻片上，加一滴醋酸洋红染色液（细胞核染色用I-KI溶液），用镊子将组织捣碎，盖上盖玻片，轻压盖玻片至愈伤组织均匀分散，然后在显微镜下观察并拍照。
1.2.5 悬浮细胞果胶提取及含量测定 用孔径为100目的钢丝筛去掉细胞培养液留下悬浮细胞培养物，冷冻干燥后，用研钵粉碎，倒进50 mL烧杯中，再加入0.1 mol/L HCL 20 mL。微热搅拌30 min后，减压抽滤。滤液用2倍体积的95%乙醇沉淀，所得沉淀物呈透明、泡沫、胶状；将滤液装入分液漏斗进行分离，得到果胶后，使乙醇在空气中自然挥发，至质量恒定后，称重。
1.2.6 悬浮细胞蛋白质提取及含量测定 用孔径为100目的钢丝筛去掉细胞培养液留下悬浮细胞培养物，利用紫外吸收法测定悬浮细胞蛋白质含量。具体方法：用5 mL去离子水研磨成匀浆后，3 000 r/min离心10 min，取上清液1.0 mL于试管中。根据蛋白质浓度，用0.1 mol/mL pH 7.0磷酸缓冲液适当稀释，分别稀释成10倍、20倍和100倍3种样品，用紫外分光光度计分别在280 nm和260 nm波长下测定吸光度，以pH7.0磷酸缓冲液为空白调零。
按照以下公式计算：蛋白质浓度=1.45A280 nm-0.74A260 nm（mg/mL）；蛋白|含量=（1.45A280 nm-0.74 A260 nm）n/样品重×100%，式中，A280 nm为溶液在280 nm处的吸光度；A260 nm为溶液在260 nm处的吸光度；n为稀释倍数。
2 结果与分析
2.1 植物生长调节剂对豆腐柴悬浮培养细胞生长的影响
外植体经过诱导培养14 d后，在切口处形成白色或浅绿色愈伤组织。经分散后进行细胞悬浮培养，细胞均能达到较好的增殖。但组织细胞颜色和形态各有差异，主要有4种类型（图1），也有一些过渡类型。
染色后显微镜放大观测，结果（图2）表明，A类细胞多为椭圆形或接近圆形，形状规则、体积较小、细胞核较大、内含物丰富（图2A）；B类细胞高度液泡化，有长条形、半月形、圆形等一些不太规则的形状。这类细胞体积大、内含物少，细胞核较小，细胞染色浅，多数不着色（图2B）；C类细胞形状规则、体积较小、细胞间联系紧密，压片时不易分散（图2C）；D类细胞基本为膨大变形呈长条形细胞或无细胞器的畸变细胞，形状规则的细胞几乎没有（图2D）。
以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、KT、2，4-D和NAA，培养基中植物生长调节剂配比组合、培养体系的颜色变化、镜检细胞形态变化见表2。经过比较可以看出，添加2，4-D的培养基悬浮培养得到的豆腐柴细胞内含物较多，加NAA的培养基悬浮培养得到得细胞多变形或死亡，分裂成碎片，另外，培养基中加6-BA的效果普遍要比KT好。
2.2 细胞分散程度对悬浮培养的影响
愈伤组织细胞分散方法对细胞悬浮培养体系有一定影响。图3是通过机械分散法处理愈伤组织后细胞培养产物状况，培养体系中较浑浊（图3A），细胞团大小不均一，镜检会看到溶液中有较多死细胞，但容易产生较大的细胞团，且细胞团中易分化出胚性体细胞（图3B）。利用纤维素果胶酶分散细胞后悬浮培养细胞体系，静置后培养液较清澈，细胞团大小较均一，培养后期亦会出现较大颗粒的胚性细胞。
2.3 光照条件对愈伤组织的诱导、继代培养和生长状况的影响
将豆腐柴的叶接种于相同的愈伤组织诱导培养基中，分别置于黑暗和12 h/d、2 000 lx光照条件下进行培养。结果发现，2种培养条件下的外植体产生愈伤组织的时间和诱导愈伤组织的出愈率基本相同，但愈伤组织的状态有较大差异。光培养的愈伤组织呈翠绿色、质地紧密，继代后愈伤组织生长缓慢；暗培养条件下愈伤组织呈白色，较易褐变，愈伤组织生长疏松，继代后生长较快。因此，豆腐柴愈伤组织的诱导和继代培养宜在暗培养下进行。
由于培养基中所加激素的不同，悬浮细胞培养液状态和细胞鲜重增加量也不相同（表3）。结果显示，愈伤组织分散程度越好，越有利于悬浮细胞系的建立，后期细胞增殖越明显；悬浮培养的最佳培养基是MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT，其悬浮培养细胞鲜重增加量平均每7 d可达6.46倍。
2.4 悬浮细胞果胶和蛋白质含量
将外植体诱导培养14 d后的豆腐柴愈伤组织细胞，经纤维素酶和果胶酶处理后，置于经上述最佳悬浮培养基MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT中，24 h黑暗条件，120 r/min悬浮振荡培养21 d后，测定细胞果胶和蛋白质含量。结果（表4）表明，培养细胞中果胶平均含量达6.57%，蛋白质达到0.12%，远比豆腐柴天然叶片中含量低。
3 小结
结果表明，豆腐柴叶片诱导的疏松型愈伤组织细胞，经过0.04 mg/mL纤维素酶+0.04 mg/mL果胶酶处理后可以得到较好的分散培养细胞，在最佳液体培养基MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT中， 24 h黑暗条件，120 r/min悬浮振荡培养，大约7 d后即可得到较好的悬浮细胞系。虽然致密型愈伤组织块，经酶处理后也可以得到分散细胞，但由于后期培养系中细胞碎片较多，不利于悬浮细胞的增殖。初步测定比较了在最佳悬浮培养条件下，豆腐柴愈伤组织细胞和叶片中果胶和蛋白质含量差异，结果显示，豆腐柴悬浮培养的细胞中，主要的营养成分果胶和蛋白质远远低于叶片组织。后期需要对基本培养基配方、蔗糖浓度、前体物添加等因素进一步优化。
应用细胞悬浮培养技术，促成细胞增殖和细胞内营养成分的合成，进行工厂化生产，可缓解当前豆腐柴资源匮乏的困境；而且大量的研究也表明，相对于组织诱导培养，细胞悬浮培养更容易产生胚性细胞，进而促成植株再生，这也为将来克服豆腐柴自然状态下胚发育不足，种子难以繁殖等问题奠定前期基础[10，11]。虽然本研究中细胞增长量及果胶等成分均较低，但后期通过对培养技术体系进行优化，可为豆腐柴细胞工厂化扩大培养及有效成分提取提供理论依据。
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细胞培养篇5
【关键词】 牙囊细胞; 细胞培养; 方法学
Abstract: 【Objective】 To explore the culture method of rat dental follicle cells in vitro. 【Methods】 The dental follicle (DF) tissues were dissected for primary generation and passage culture by methods of explant, dissociation cell and improved explant, respectively. Consequently, the morphology of the cultured first passage DF cells and their ultrastructure were discovered under inversion phase difference microscope and transmission electronic microscope, respectively. 【Results】 At the third day in vitro, only a few cells extended from the explant by way of explant, and many DF cells mixing with impure cells adhered wall by way of dissociation cell. However, a large quantity of relative pure DF cells was discovered by way of improved explant at the same time. Transmission electron microscopy showed that the cultured cells contained electron-dense granules, and abundant rough endoplasmic reticulum(RER) and no desmosmoes. At about 10th , 7th and 6th day in vitro, DF cells were passed first time with achievement ratio of eighty, sixty and one hundred percent by ways of explant, dissociation cell and improved explant culture respectively. 【Conclusion】 Improved explant culture was a good culturing method for rat DF cells.
Key words: dental follicle cells; cell culture; methodology
牙囊对牙齿萌出起重要作用。牙萌出必须是在牙槽骨的吸收、形成牙槽骨的通道后,才能够完成这一生理过程[1]。Cahill和Marks[2,3]研究表明,以手术方法去除小鼠牙囊,牙齿则不能萌出;而保留牙囊,用其它物质替代牙胚,结果替代物可以萌出。Larson[4]在狗前磨牙牙冠形成后萌出前四周去除牙囊,牙齿同样不能萌出,将剥离的牙囊立即放回成釉器表面,牙齿即能重新萌出。这些研究证明牙齿萌出依赖牙囊的存在。牙囊在牙齿萌出过程中,从组织、细胞和分子水平上对牙齿萌出起重要的调控作用[5,6]。目前关于牙囊细胞的体外培养,国内外报道尚不多[7]。本研究以SD大鼠为实验对象,采用组织块培养法、细胞消化分散法及改良组织块法培养大鼠牙囊细胞,比较不同方法的优缺点,以寻求培养牙囊细胞的最佳方法,为研究牙囊在牙齿萌出过程中的作用在细胞方面提供依据。
1 材料和方法
1.1 试剂、仪器及动物实验来源
MEM培养基(GIBCO公司,美国),胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司),HEPES(Sigma公司,美国),胰蛋白酶(Advanced Technology & Industrial Company),左旋谷氨酰胺(GIBCO公司,美国),青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司),丙酮酸钠(Sigma公司,美国),PBS(北京中山生物技术有限公司),细胞培养瓶(Corning, USA),超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),细胞培养箱(Sanyo, Japan),倒置相差显微镜(Leica, Germany),SD乳鼠(中山大学动物实验中心)。
1.2 牙囊组织的分离与获取
取5只新生6或7 d的SD乳鼠,引颈法处死后,用75%酒精浸泡2~3 s,外科法取出下颌骨,置入D-Hanks’平衡盐溶液(含300 U/mL青霉素,300 μg/mL链霉素),在解剖显微镜下分离出下颌第1、第2磨牙牙胚。进一步在解剖显微镜下分离牙囊与成釉器,将分离出的牙囊组织立即置入MEM培养基中(含300 U/mL青霉素,300 μg/mL链霉素,pH 7.2)。用眼科剪将组织块切成1~2 mm大小的块。
1.3 牙囊细胞原代培养
1.3.1 组织块培养法 将上述方法获得的组织块离心5 min,弃上清液,加入12%MEM培养基0.5 mL,转入25 cm2培养瓶中,用弯头吸管把组织小块摆布在培养瓶底上。小块相互距离0.5 cm,轻轻翻转培养瓶,使牙囊组织贴附在培养瓶底,置入细胞培养箱中,于体积分数5%CO2、37 ℃饱和湿度条件下培养。12 h补加1.5 mL培养液,2~3 d换液1次,细胞长满后传代,以1.25 g/L胰蛋白酶和0.025%的EDTA(1∶1)液消化。
1.3.2 细胞消化分散法 用眼科剪将组织块切成1~2 mm大小的块,离心5 min,弃上清液。1.25 g/L胰蛋白酶消化10 min,待组织块分散成细胞团或单个细胞,再次离心5 min,弃上清液,加入12%MEM培养基2 mL,置入25 cm2培养瓶中,体积分数5%CO2、37 ℃饱和湿度培养。2~3 d换液1次,细胞生长形成单层后常规消化传代。
1.3.3 改良组织块法 采用细胞消化分散法与组织块培养法相结合法,用眼科剪将组织块切成1~2 mm大小的块,离心5 min,弃上清液。1.25 g/L胰蛋白酶消化5 min,再次离心5 min,弃上清液,加入12% MEM培养基0.5 mL,转入培养瓶,体积分数5%CO2、37 ℃饱和湿度条件下培养,12 h后补加12% MEM培养基1.5 mL。2~3 d换液1次,细胞生长形成单层后常规消化传代。
1.4 牙囊细胞的传代培养
上述3种培养方法分别重复5次实验。将上述方法培养的原代细胞分别进行传代培养。弃去培养瓶内培养液,D-Hanks’平衡盐溶液洗涤细胞。加入1.25 g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA(1∶1)液2 mL。倒置显微镜下观察,梭形细胞在1~2 min内收缩变圆,细胞相互分离。此时立即吸出消化液,加入12%MEM培养液4 mL以终止消化。用弯头吸管吸取瓶内培养液,反复吹打10次左右,使细胞脱离瓶底形成细胞悬液。将细胞悬液按1∶2进行培养,培养条件与原代相同。
1.5 透射电镜观察牙囊细胞
收集第3代细胞,加入2.5%戊二醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液,pH 7.4,含有2.5 mmol/L的氯化钙)固定15 min。将全部细胞收集在锥形离心管内,经2 000 r/min离心15 min成团。将团块转移至1.5 mL EP管内,经3 000 r/min离心10 min使细胞沉淀结块。用冷蔗糖缓冲液洗团块1 h,4 ℃条件下1 %饿酸固定1~2 h;体积分数50%、70%和90%丙酮脱水各10~15 min,体积分数100%丙酮脱水30~45 min。浸入1∶1丙酮包埋剂混合液,室温下放置1 h。浸入环氧树脂37 ℃ 24 h,60 ℃固化48 h。AO切片机做超薄片切,制备电镜标本。标本用饱和醋酸铀水溶液染色10~15 min,柠檬酸盐染色5~10 min。透射电镜下观察、拍照。
2 结 果
2.1 不同方法培养的原代牙囊细胞
组织块法培养牙囊细胞,见组织块4 h贴壁,24 h见个别细胞从组织块中爬出,呈贴壁型生长,第3 天时从组织块中爬出的细胞数量逐渐增多(图1),呈两种细胞形态。一种细胞呈梭形,中央有卵圆形核;另一种为上皮型细胞,呈扁平不规则多角形,中央有圆形核,且核较大。
细胞消化分散法培养牙囊细胞,可见细胞6 h贴壁,24 h半数以上细胞恢复形态,呈梭形或扁平多角形,两种形态细胞混杂生长(图2)。
改良组织块法培养牙囊细胞,可见消化后的组织块呈絮状,组织块4 h贴壁,24 h可见细胞从组织块中爬出,培养至第3天时,组织块周围有大量梭形或不规则三角形细胞,呈放射状或旋涡状走形,为典型的成纤维细胞表现(图3)。梭形细胞周围有上皮型细胞,随着梭形细胞增多,上皮型细胞数量也增多,并逐渐融合成单层细胞(图4)。
2.2 细胞的传代和纯化
将3种方法获得的原代细胞,均采用胰蛋白酶和EDTA混合消化法传代,注入酶2~3 min,即可见成纤维细胞样细胞胞质回缩,胞体趋于变圆,细胞间隙变大、分离。上皮样细胞则无上述变化。此时及时中止消化,进行吹打。将吹打脱落的细胞置入新培养瓶6 h后,细胞恢复形态,呈梭形或不规则三角形,并且部分开始分裂增生。改良组织块法培养6 d左右第一次传代,传代培养至第6 天见生长活跃的第2代牙囊细胞(图5),传至第3代时,可得到纯化的牙囊细胞。
2.3 透射电镜下超微结构
细胞细长,两极明显。胞浆中含有丰富的粗面内质网(rough endoplasmic reticulum, RER),并在细胞两极处消失,有的RER囊状扩张,含有大量絮状物质,偶见高密度电子颗粒(图6)。
2.4 三种方法培养结果的比较
采用3种方法各作5次培养,培养过程中细胞消化法出现2次污染,7 d左右牙囊细胞增殖形成单层并进行第一次传代,成功率为60%;组织块培养法未出现污染,出现一次组织块未贴壁,10 d左右进行第一次传代,成功率为80%;改良法培养过程中未出现污染,6 d左右进行第一次传代,成功率为100%。
3 讨 论
牙囊起源于外胚间充质,是包绕在成釉器外围的一层致密的结缔组织,在牙齿发育后期形成牙骨质、牙周膜和固有牙槽骨。在牙齿发育及萌出过程中,牙囊细胞在上皮根鞘及牙乳头细胞的诱导下分化形成牙骨质细胞、成纤维细胞及成骨细胞,分泌牙骨质基质、胶原纤维、骨基质,最终形成牙周组织[8,9]。有文献报道,体外培养的牙囊细胞具有某些成牙骨质、成骨样细胞表型[10],最近有学者从永生化的牙囊细胞中分离出了成牙骨质的祖细胞成份[7],进一步说明牙囊在牙齿萌出过程中,从组织、细胞和分子水平上对牙齿萌出起到重要的调控作用。牙囊细胞的体外培养是研究牙齿萌出过程中分子调控作用的细胞学基础。
体外培养牙囊细胞采用的动物模型主要有狗、小鼠和大鼠。文献报道中仅见牙囊细胞的细胞消化培养法[4],细胞消化分散法是用胰蛋白酶分解牙囊组织,使之分散成牙囊细胞团或单个牙囊细胞,然后进行原代培养。由于该方法在消化分离过程中细胞损伤大,可影响细胞的贴壁和成活率,此外消化分散法获得的细胞中,往往由于消化得到单个细胞或者小的细胞团,因而容易混杂有杂质细胞,不利于牙囊细胞的纯化,在本实验中观察到混杂有较多的上皮细胞,获得的牙囊细胞纯度不高。本实验尝试采用组织块培养法培养大鼠牙囊细胞,并进一步摸索出改良组织块培养法,因而作者尝试采用组织块培养法是将牙囊组织剪切成1 mm大小的组织块,使之贴附于培养瓶底,待细胞从组织内爬出、生长以获得原代细胞,该方法获得的牙囊细胞纯度较高,但在实验过程中观察到:①组织块接种后难免翻动和振动,使组织块不易贴壁;②加入培养液后,受浸泡的组织块受液体轻微的波动及浮力作用易脱落下来,即使贴壁也难以生长;③处于组织团块中心的细胞因营养穿透有限而代谢不良、生长缓慢,因而获得的牙囊细胞数量较少。因而培养效率降低,成功率为80%。
改良法是结合消化分散法和组织块法来培养牙囊细胞,同组织块培养方法一样,获得1~2 mm的牙囊组织块,但是将细胞分散法中的胰蛋白酶消化组织块时间由10 min缩短至5 min,这样获得的组织块大多变得疏松,细胞间距增大,但细胞之间未解离成单个散在细胞,仍呈团块状;同时由于缩短消化时间减少了消化酶对细胞的损耗,处于该状态的牙囊组织块,营养穿透性增强、细胞生长速度快,传代周期缩短,并且所得的牙囊细胞纯度高。而在预实验中发现将消化时间缩短在5~9 min时,则相当一部分细胞脱离组织块,因而胰蛋白酶消化时间控制在5 min是比较好的消化时间。牙囊细胞与其他成纤维细胞具有许多共同的特征,本组通过电镜观察到培养的细胞浆中含有大量的高密度电子颗粒,这种高密度电子颗粒无膜包被,直径约6 μm,这是一个重要特征,除牙囊细胞外,还在牙齿萌出前期的星网状层出现,而在其他的成纤维细胞中不出现。改良法培养成功率达100%,高于组织块培养法(80%)和细胞消化分散法(60%),传代周期为6 d,也较另外两种方法缩短,因而改良法简便易行,成功率高,值得推荐。
【参考文献】
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细胞培养篇6
【关键词】 表皮干细胞; 细胞培养; 细胞传代
近年来，人类组织干细胞的研究已成为国内外学者关注的焦点，表皮干细胞即是其中之一。表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群，在正常状态下维持表皮的自我更新，当受到损伤刺激时，表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[1]。随着人口老龄化速度加快，慢性溃疡及皮肤病患者日益增多，加之烧伤及意外创伤造成的皮肤缺损，临床对皮肤移植的需求越来越大。由于表皮干细胞数量少，缺乏明确的特异性分子标志，体外培养很容易丢失其干细胞生物学特性，增加了分离培养的难度。获得大量高纯度的表皮干细胞成为该领域研究的关键技术。我们根据几年来在细胞培养方面的工作实践，将人表皮干细胞的培养技术总结如下。
1 人表皮干细胞的分离与培养
应用IV型胶原快速粘附法从手术切除的人包皮组织中分离表皮细胞中的快速粘附细胞，这一群细胞被认为是表皮干细胞，它具有快速粘附、缓慢生长的特点[2]。取年龄在5～25岁无泌尿系统感染患者的包皮皮片，无菌条件下去除皮下脂肪层，用含青霉素、链霉素的PBS反复冲洗皮片数次，修剪成大小约0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培养皿中，加入0.25%中性蛋白酶10 ml，4℃消化l4～16 h，吸弃上清，分离表皮和真皮层。剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网研磨过滤。滤液经1 000转/min离心10 min，弃上清，收集细胞。加入表皮干细胞培养基(每100 ml KSFM培养基加入0.05 mmol氯化钙100 μl、HKGS添加剂1 ml)并轻柔吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶中，37℃孵育15 min。倒置镜下观察，粘附在Ⅳ型胶原被膜上的细胞为表皮干细胞，吸出细胞悬液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干细胞培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。2 d换液1次，显微镜下观察细胞生长，2～3 d内细胞开始分裂，4～5 d后会出现许多细胞克隆或集落。培养基中钙离子的浓度是保持人表皮干细胞既增殖又不分化的关键。钙离子浓度过低，会导致所培养的人表皮干细胞生长缓慢或不生长;若钙离子浓度过高，则加速了细胞分化。我们在实验中筛选出适合的培养基中钙离子浓度，可以保证有效的培养维持。在培养过程中，还要经常检查培养箱温度和CO2的浓度，过低或过高的温度和CO2含量都影响人表皮干细胞的生长，容易出现细胞老化和衰退现象。为了避免各种细菌、真菌污染培养箱，每周用75%的酒精擦洗箱内的托盘、格架、箱壁。托盘始终装有一定量的饱和浓度磷酸氢二钠(Na2HPO4)液体，细菌既不能在其中生长，也能提供合适的湿度[3]。
2 人表皮干细胞的传代
当原代细胞达到70%～80%融合时，需进行传代，否则细胞会没有足够的生长空间，也会因为营养耗竭而影响生长[4]。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培养瓶内细胞，置37℃温育5 min，必须经常在显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞部分漂浮起来，即可终止消化。加入2 ml终止液，用吸管反复轻轻吹打贴壁细胞，使其形成细胞悬液，按1∶2传代。传代细胞接种于IV型胶原预铺的培养瓶中。
3 人表皮干细胞的冻存
细胞不用或保种时，可将细胞冷冻保存在液氮中。细胞在培养基中直接降温冷冻，可因细胞内、外环境中的水而形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、渗透压改变、蛋白变性等，从而引起细胞死亡。因此，细胞培养基中要加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油。为保持细胞最大存活率，冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。一般用第2代人表皮干细胞培养至对数生长期时，用含胎牛血清的DMEM培养液将细胞配成5×106 /ml 的细胞悬液，1 000转/min，离心10 min，弃去上清，加入1～2 ml 含有10%DMSO的冻存液，用吸管小心吹打，重新悬浮细胞，分装于2 ml冻存管中，将盖拧紧，用记号笔记好细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作人等。放入-70℃冰箱过夜后，再转入液氮罐中保存。注意：用于冻存的细胞应在光镜下观察生长状态良好，冻存细胞的体积不要超过冻存管体积的1/2。
4 人表皮干细胞的复苏
从液氮中取出冻存管后，迅速投入预先准备的40～42℃水中，并不时摇动，让细胞冻存液快速解冻1 min左右。取出冻存管，用75%酒精擦拭消毒外壁后，吸出细胞悬液，加至10 ml离心管中，补加含胎牛血清的DMEM培养液，小心吹打使细胞分散悬浮。1 000转/min，低速离心10 min，弃去上清，加入表皮干细胞用的条件培养基适当稀释后，转入IV型胶原预铺的培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和水蒸汽培养箱中培养。复苏后要每天观察细胞状态，待细胞生长至适当密度时，及时分瓶培养或实验待用。
人表皮干细胞培养技术发展迅速，但诸如细胞在体外培养容易变形，多次传代后细胞克隆形成率明显下降，细胞逐渐分化难以保持原代细胞特性等问题，还有待更好地解决。
参考文献
1 Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage.J Cell Sci，1996，109 (Pt 5): 10171028.
2 Kim DS，Cho HJ，Choi HR，et al.Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents.Cell Mol Life Sci，2004，61(21): 27742781.
细胞培养篇7
【关键词】 半月板 胫骨 胰岛素样生长因子 成纤维细胞生长因子2
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the morphology of cultured meniscal fibrochondrocytes in different areas and the influence of growth factor on the cells. MethodsThe menisci were taken from both hindlimbs of onemonthold male goat under sterile condition， cut into pieces， rinsed with DHanks， then digested with type Ⅱ collagenase. Fibrochondrocytes were collected and cultured at 37 ℃ with 5% CO2 under saturated humidity. Trypan blue stain and immunohistochemistry stain of type Ⅱ collagen were applied to determine the vitality of the cells. Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was used to study the expression of aggrecan and flow cytometry to analyze the distribution of the cell cycle. ResultsMeniscal fibrochondrocytes adhered to the disk 36 hours after inoculation. The peripheral cells were mostly fusiformed， the central cells polygonal and the cells in between mixed. Trypan blue failed to stain the cells. After adding hIGFⅠ and bFGF to the medium， more polygonal cells were found in the peripheral region. A flow cytometry study showed that the cell proliferation was accelerated: percentage of meniscal chondrocytes in the S stage increased， while in G1 stage decreased. Immunoreactive product of type Ⅱ collagen was detected in the cultured cells by immunohistochemistry and the existence of aggrecan band proved by RTPCR. ConclusionThe morphology of cultured meniscal fibrochondrocytes was different in different regions. The cell proliferation can be accelerated by hIGFⅠ and bFGF.
［KEY WORDS］meniscus， tibial; insulinlike growth factor Ⅰ; fibroblast growth factor 2
半月板在临床上根据血运供应、承受机械应力以及解剖部位不同分为红区、白区和红白区，虽然半月板以纤维软骨细胞为主，但考虑到其不同区域承受应力刺激以及血循环、营养来源不同，各区的细胞群体形态应该也有差异。因此，本实验对不同区域的细胞分别分离培养，观察不同区域细胞在体外单层培养条件下的形态差异，并同时观察人胰岛素样生长因子Ⅰ（hIGFⅠ）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对其生长特性的影响。
1 材料与方法
1.1 半月板不同区域细胞的体外单层培养
无菌条件下切取成年山羊半月板，无菌PBS液漂洗2次，将内1／3、中1／3、外1／3三个区域分别剪碎成1 mm3大小碎块，加入2.5 g/L胰蛋白酶和2 g/L的Ⅱ型胶原酶，37 ℃振荡消化，离心收集细胞，加入含体积分数0.10的FBS、105 U/L的青霉素钠、105 g/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞。血细胞计数板法行细胞计数后，按1×105个／孔接种于6孔板。37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度培养。隔日换液1次，用倒置相差显微镜观察细胞生长情况，当长至70％～80％融合时消化传代培养。在条件培养液中分别加入终浓度为60 μg/L的bFGF和终浓度为100 μg/L的hIGFⅠ。
1.2 细胞生长特性检测
1.2.1 台盼蓝拒染试验检测细胞活性 将细胞稀释至1×109/L，取9滴细胞悬液移入小试管中，加入1滴4 g/L台盼蓝溶液混匀。在3 min内计数活细胞和死细胞，死细胞被染成蓝色。计算活细胞率：活细胞率=（活细胞总数/计数细胞总数）×100%。
1.2.2 测定细胞群体倍增时间（PDT） 在接种时和接种后不同时间进行细胞计数，按下述公式计算PDT：PDT＝｛log 2/（log Ntlog N0）｝×t，其中N0、Nt分别代表接种时和培养t h后的细胞数。
1.2.3 生长曲线的描记 接种24孔培养板，分8组，每组3孔，每日计数1组，共8 d。以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴（对数），描绘在半对数坐标纸上，连成曲线。在曲线上细胞数量增加1倍的时间为细胞倍增时间。
1.3 细胞爬片苏木精伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色
半月板细胞传代时接种于预先放入无菌盖玻片的6孔板内，长至60％～70％融合后行苏木精伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。
1.4 RTPCR检测aggrecan的表达
TRIZOL法提取加入生长因子培养的半月板细胞的总RNA，行RNA电泳观察28S和18S rRNA的位置及形状，确定有无RNA的降解。根据GenBank公布的序列分析设计aggrecan的特异性引物。上游引物：5′CGAAACAGCCACCTCCCCAACAG3′；下游引物：5′CCCTCTGTAGCTGGGAAGGCATAAGCAT3′。RTPCR反应产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测有无目的条带出现。
1.5 流式细胞仪检测细胞周期分布
收集加入或不加入生长因子的细胞行流式细胞仪检测细胞周期的分布情况。
2 结
果
2.1 半月板不同区域细胞的分离及体外单层培养
半月板细胞在接种后约36 h开始贴壁，并逐渐伸展。培养至10 d左右可长至70％～80％融合，台盼蓝拒染试验测得细胞活力在92％以上。无血运区半月板细胞以多角形软骨细胞为主，有血运区则大部分为长梭形成纤维样细胞，混合培养则两种细胞形态混合存在。3组不同区域细胞的生长速度大致相似，外侧稍快于内侧。传代后细胞贴壁速度及生长速度均高于原代细胞，细胞表型无明显改变。计算半月板细胞的PDT约为47.4 h。生长曲线描记显示，半月板细胞在经过2 d的滞留期后，开始进入对数增长期，在76 d的对数增长期内持续分裂增殖，然后转为平台期，此时细胞生长分裂渐趋稳定。加入生长因子后，外侧区半月板细胞多角形细胞所占比例增多；内侧区则多表现为细胞增殖旺盛，分裂象增多，细胞表型的改变不明显。混合区细胞表现也多为细胞分裂增殖加快。
2.2 细胞爬片苏木精伊红染色结果
细胞爬片苏木精伊红染色见胞核深染，细胞轮廓清晰，胞浆内可见颗粒，部分细胞可见明显核分裂象。Ⅱ型胶原免疫组化染色表明，在细胞浆中有大量棕黄色深染的颗粒出现。
2.3 RTPCR检测aggrecan的表达
细胞加入生长因子培养后，提取其总RNA行RTPCR，结果有约200 bp条带出现，表明有软骨细胞特异表型标记蛋白aggrecan的表达。
2.4 流式细胞仪检测细胞周期分布
传代后的半月板细胞以G1期为主，在加入生长因子培养之后，S期细胞比例增加，表明细胞生长分裂增殖活力较旺盛。
3 讨
论
半月板的主要成分是纤维软骨细胞，其基质成分以Ⅰ型胶原为主。它在膝关节内的重要性已越来越明确并受到重视，它可以传导负荷，吸收震荡减少应力，提高关节稳定性，限制膝关节的过度伸屈，并可对关节的润滑与营养起促进作用。因此，近年来对半月板的治疗观念已经发生很大转变，修复，包括缝合、钉合和各种生物学修复成为主流方法，并显示了良好的初期疗效。
本实验观察到半月板不同区域培养细胞的形态、增殖特性以及对外源生长因子的反应各不相同。内侧区的半月板细胞以多角形为主，属纤维软骨细胞样表型，贴壁相对缓慢，细胞群体倍增时间也较长，分裂增殖较外侧为慢；而外侧区则以长梭形的成纤维细胞样细胞为主，贴壁迅速，细胞群体倍增时间短，分裂增殖相对旺盛。而红白交界区（中1／3段）则是两种细胞类型的混合群体，其生长特性也介于两者之间，两种细胞也遵循各自的生长特性。外侧半月板细胞对生长因子相对敏感，在增快分裂增殖的基础上，也伴有部分细胞的形态改变，如胞体增大、回缩，透亮度增加，向多角形、短梭形或椭圆形转变等。而内侧半月板细胞则仅以分裂增殖加速为主，其形态改变不明显，细胞表型基本得以保持。
不同区域半月板细胞的表型不同，可能与其不同部分的营养来源及承受应力差异有关。半月板内侧为无血运区，其产生能量的主要方式是无氧糖酵解，其营养主要来自滑液供应，承受的应力也是以压应力和剪切应力为主，这种环境类似于关节软骨，因此其细胞表型可能更大程度上类似于关节软骨。而外侧的营养供应除部分来自滑液外，大部分营养物质还取自血液供应，承受的应力也是以张应力为主，这种特征可能使其细胞表型更类似于与其毗邻的关节滑膜细胞或纤维组织细胞。
WEBBER等［2］在体外培养半月板细胞时发现其对培养液的种类较敏感，以DMEM培养时为多角形，以HAMs F12培养液培养则为线形。年龄与性别并不影响细胞单层培养的性质。本实验应用DMEM培养液培养仍观察到半月板外侧区细胞呈成纤维细胞样表型，并未检测到不同培养液对细胞表型有何影响。
hIGFⅠ是胰岛素样生长因子家族中的重要成员，也是其中生物学活性最强和研究最充分的成员。hIGFⅠ具有非常广泛的生物学活性，对于骨细胞和成骨细胞具有中等促进有丝分裂的作用，可以促进成骨细胞的分化、增殖与募集，促进成骨细胞的胶原、骨钙素的合成以及对磷的吸收和氨基酸的运输［3］。hIGFⅠ也可刺激DNA和蛋白聚糖的合成，加速细胞分化增殖，并可提高细胞成熟度，对软骨基质合成和稳定也起着关键作用［4］。bFGF是重要的有丝分裂促进分子，也是形态发生和分化的诱导因子，在正常生理及病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程。在研究的所有生长因子中，bFGF被认为是对软骨细胞作用最强的有丝分裂原，可刺激蛋白聚糖及胶原的合成［5］。BOLANDER等［6］发现，bFGF可直接刺激体外培养的成软骨细胞的增殖并分化为软骨细胞或者使其本身数量增加。同时，KATO等［7］也证实，bFGF可促使软骨细胞合成及释放硫酸软骨素糖蛋白和Ⅱ型胶原，使细胞外基质增多。软骨细胞本身可分泌bFGF，不仅具有促进细胞增殖的作用，同时还可以使增殖的细胞稳定地向成熟软骨细胞分化。
本实验结果显示，加入两种生长因子后，可对不同区域半月板细胞产生较明显的影响，细胞分裂增殖加快，表现为细胞群体倍增时间缩短，细胞分裂象比例增多，在高倍镜下可见许多细胞明显的有丝分裂象。转染后S期细胞比例也相应升高，表明细胞的DNA及蛋白质等的合成功能也较旺盛，外侧区半月板细胞生长加快，部分细胞形态发生变化，胞体增大，多角形细胞所占比例增多。内侧区则多表现为细胞增殖旺盛，分裂象增多，细胞表型的改变不甚明显。混合区细胞表现也多为细胞分裂增殖加快。
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细胞培养篇8
【关键词】 树突细胞
In vitro culture and characterization of mouse spleen dendritic cells
【Abstract】 AIM: To explore and optimize the methods for in vitro culture of mouse dendritic cells (DC) that were then observed morphologically and identified biologically. METHODS: Mice were injected with 200 mg/kg cyclophosphamide through the tail vein， and were sacrificed 8 d later. Spleen cells were cultured with ordinary methods firstly， and 3 d later conditional medium containing IL4， GMCSF was added， and TNFα was added at day 5. At day 8， cells were subjected to phasecontrast microscope， scanning electron microscope， and transmission electron microscope analysis. At day 3， 5， 7， cells were subjected to FACS for detection of cell surface markers. RESULTS: Cultured cells displayed a typical DC phenotype in morphological analysis， and FACS showed these cells expressing such DC markers as CD11c， CD86，ⅠAb， H2D6. CONCLUSION: Using of IL4， GMCSF， TNFα as stimulators in the mouse spleen cell culture can obtain DC with high quality and high purity， which makes a foundation for future research on the basic and clinical usage of DC.
【Keywords】 dendritic cells; cytokines; MHCⅡ molecule
【摘要】 目的： 探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞（DC）的方法，并进行形态学观察和生物学鉴定. 方法： 应用环磷酰胺200 mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠，8 d后处死小鼠，常规培养脾细胞，第3日加入含有IL4， GMCSF细胞因子的条件培养液，第5日补加TNFα，第8日制备标本进行相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，并分别在培养第3， 5， 7日经流式细胞仪检测成熟细胞表面标志. 结果： 刺激培养细胞经相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，具有典型的DC形态，流式细胞仪检测发现细胞表面表达CD11c， CD86， ⅠAb， H2D6标志物. 结论： 在小鼠脾脏细胞培养中加入IL4， GMCSF， TNFα等刺激，可获得足量、较高纯度的DC，为DC的基础研究与临床应用奠定了基础.
【关键词】 树突细胞；细胞因子；MHCⅡ类分子
0引言
自从Steinman等于1973年发现树突状细胞（dentritic cell， DC）以来［1］，DC作为体内最重要的抗原提呈细胞，其强大的提呈抗原作用和启动初始T细胞的能力，日益引起国内外学者的关注. 特别是DC与肿瘤免疫的密切关系以及在抗肿瘤方面的独特功能，使其成为肿瘤免疫研究的一个重要领域. DC来源于骨髓CD34+细胞［2］，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键，然而DC在体内分布散在，含量极低，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%. 目前体外培养DC的方法尚不尽人意，在很大程度上限制了对DC基础和临床工作的开展. 我们在体外培养扩增了Balb/c小鼠的DC细胞，在培养中添加IL4， GMCSF， TNF等刺激，并通过相差显微镜、电镜观察和流式细胞仪检测分析对所培养细胞进行鉴定，为优化DC的体外培养方法进行积极的探索.
1材料和方法
1.1材料环磷酰胺购自上海华联公司；荧光标记抗体： CD11cFITC， IAbFITC， H2DbFITC， CD86FITC购自Diaclone公司；rmGMCSF， rmIL4， TNFγ，胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶购自美国GIBCOL公司；Hepes，青霉素，链霉素购自美国Sigma公司；倒置相差显微镜为日本Olympus公司生产，低速离心机为北京医用离心机厂生产，微量台式高速离心机为德国Heraeus公司生产，流式细胞仪为Coulter公司生产，扫描电镜、透射电镜由美国BD公司生产；6~8 wk龄雄性Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心.
1.2方法
1.2.1DC细胞的分离与培养将环磷酰胺按200 mg/kg体质量由小鼠尾静脉注射，8 d后颈椎脱位处死小鼠，750 mL/L乙醇浸泡10 min，无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100钼钢网上，剔除脾周围的结缔组织，剪碎、研磨后收集滤过的细胞悬液，离心800 r/min， 7 min，加TrisNH4Cl 3 mL，溶除红细胞，获取细胞悬液，以完全培养基悬浮为1×109 /L细胞，37℃，50mL/L CO2孵箱培养. 3 d后，吸弃全部培养基及悬浮细胞，加rmGMCSF/rmIL4条件培养基隔日半量换液，第5 d补加细胞因子TNFγ 1 mg/L，第7 d吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，次日收集悬浮的细胞即为富集的DC. 相差显微镜下观察细胞形态特点.
1.2.2扫描电镜观察取如上培养7 d的细胞悬液，接种放置在培养皿中的盖玻片上，37℃， 50 mL/L CO2孵箱培养. 待细胞汇合，取出盖片，浸入PBS漂洗细胞表面；将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4℃预冷的40 mL/L戊二醛，在4℃固定2 h，吸出固定剂，PBS浸洗2次，每次10 min，再用4℃预冷的10 g/L锇酸固定，在4℃固定1 h，然后用PBS浸洗2次，每次10 min；用系列梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，扫描电镜观察细胞表面结构.
1.2.3透射电镜观察取如上培养7 d的细胞悬液，PBS洗涤，细胞沉淀用40 mL/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，包埋，经超薄切片铅铀染色后透射电镜观察细胞超微结构.
1.2.4细胞表面标记FACS分析分别收集培养第3， 5， 7 d的细胞，离心800 r/min， 7 min，弃上清，用含20 mL/L牛血清的PBS洗液1 mL洗涤2次，分别加终浓度为5 mg/L的标记抗体1 μL（CD11cFITC， IAbFITC， H2DbFITC， CD86FITC）. 设阴性对照组. 4℃轻度震荡30 min；再用PBS 1 mL洗液洗涤2次；间标抗体再加入FITC标记羊抗鼠lgG， 100 μL/管，终浓度为5 mg/L，4℃避光轻度震荡30 min， PBS 1 mL洗液洗涤2次，加10 g/L多聚甲醛400 μL固定，上流式细胞仪检测.
2结果
2.1DC的分离与培养经尾静脉注射环磷酰胺的小鼠，饲养8 d后，脾脏明显增大，为正常小鼠脾脏体积的3倍左右，脾细胞数平均7.5×107/只. 镜下观察细胞体积较大、均匀、圆形，加入GMCSF 20 μg/L， IL4 1 μg/L体外培养3 d后，增殖出大量悬浮的粒细胞及疏松黏附于贴壁单核细胞上的增殖性细胞集落. 第8日收集已脱落的及疏松黏附的细胞集落，即为富集DC.
2.2相差显微镜观察培养7 d的DC，相差显微镜下可见较大体积的悬浮细胞，具多形性，贴壁时有细长突起，“呈树突状”，悬浮时向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，呈“刺猬状”，部分伸展为不规则状（图1）.
图1培养DC的相差显微镜观察×100（略）
2.3扫描电镜观察培养7 d的DC，扫描电镜下可见细胞伸展出大量大小不一、扁平的胞质突起，末端圆钝，细胞膜光滑无皱折（图2A）.
2.4透射电镜观察培养7 d的DC，透射电镜DC胞体周围可见不规则突起和褶皱；胞核染色深，偏向一侧，形状不规则，多为分叶状；胞质线粒体较为丰富，较多吞饮大泡及小泡，高尔基体、溶酶体少. 所培养细胞具有典型的DC形态特征（图2B）.
A： 扫描电镜；B： 透射电镜.
图2培养DC的电镜观察×1000（略）
2.5细胞表面标志FACS鉴定应用流式细胞仪分析体外培养第3， 5， 7日，及补加细胞因子TNFγ后第7 d的DC表面标志显示： N418（CD11c）细胞比例分别为16.22%， 13.54%， 34.37%， 78.16%; MHCII（Iab）细胞比例分别为28.80%， 21.88%， 25.85%， 58.45%; MHCI类（H2Db）细胞比例分别为4.82%， 2.46%， 11.94%， 24.635; B72（CD86）细胞比例分别为77.89%， 59%， 75.71%， 80.59%; 随着细胞成熟，MHCI类分子、MHCII类分子、共刺激分子的表达逐渐增高，加入TNFγ后，所测DC各表面标记均有较明显的增高，显示出TNFγ在DC的成熟分化中的突出作用. 流式细胞仪分析细胞表型结果证实所培养的细胞为淋巴系DC.
3讨论
DC在组织中分布广，但含量极少，因此建立成熟的DC体外培养技术获得足够数量的有功能的DC就显得非常重要［3］. 1992年，Steinman实验室首先建立了用GMCSF从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法，目前，小鼠DC的来源仍主要采用这种方法. 但新近研究表明［4］，如果应用亚致死量化疗或放疗药物处理小鼠，使DC前体细胞重新定位于脾脏，在特定的造血环境下扩增，再取出以GMCSF或GMCSF+IL4培养，就能扩增出大量DC，且具有产量大、纯度高、稳定性高、操作简便等特点. 在上述工作基础上，本实验予高剂量（200 mg/kg体质量）环磷酰胺经尾静脉注射小鼠，8 d后可见小鼠脾脏显著增大，此脾细胞经GMCSF （20 μg/L）+ IL4（μg/L）培养，第5日补加细胞因子TNFγ，第8日，获得了大量淋巴系DC，每只小鼠平均可得7.5×107细胞数，较文献报道细胞数高. 将培养细胞悬液在相差显微镜及电镜下观察，发现所培养细胞具有典型的DC形态特征，均明显有别于单核细胞和巨噬细胞［5］.
DC的发育、成熟与其在体内的迁徙过程和细胞表面标记的变化之间的复杂关系，是其重要的生物学特点［6］. DC并不是一个均一的群体，但所有的DC均来源于骨髓干细胞，不论是组织DC还是培养DC，不论是人DC还是小鼠DC，均可区分为非成熟和成熟两个阶段［7］. 非成熟DC主要位于易与外来抗原接触的外周器官，细胞表面较高表达与吸收和加工抗原有关的分子，如CD1A，CCR6；而当DC细胞完成抗原加工功能，向次级淋巴器官迁徙的过程中，那些影响DC细胞迁徙、提呈抗原、激活T细胞的趋化因子、黏附分子、MHCI类分子、MHCII类分子及共刺激分子，包括CD1， CD4， CD33， CD40， Iab， H2Db， CD80 （B71），CD86（B72）等的表达逐渐增加，最终，DC转变成为能够专职递呈抗原、发挥免疫功能的成熟DC［8-9］. 我们分别收集所培养第3， 5， 7日及补加细胞因子TNFγ后第7日的DC，应用流式细胞仪分析细胞的表型，结果显示所培养的DC已表达了主要表面标记，并随时间变化总体呈现上升趋势，在培养第5日有所降低，但到第7日时，均明显升高，由于所测表面分子均为成熟DC主要的标记，所以表型的变化规律基本符合DC的成熟过程. 培养DC表面这些分子的升高或较高比例的表达，表明其已成为有可能发挥功能的抗原递呈细胞.
另外，我们注意到，在培养第5日补加细胞因子TNFγ后，DC表面的标记分子明显上升，这进一步证实了TNFγ在DC发育、成熟中的作用. 可能的机制为：TNF作为第一信号，可上调并维持干细胞的GMCSFR，抑制干细胞朝粒系转化；上调的GMCSFR在接受GMCSF的刺激后，进一步朝DC方向发展. 实验结果中有些标记分子的表达比预期的以及理论上的表达量低，可能是由于体外培养DC的各种环境和条件与体内还存在着不同以及操作上的某些差异造成的，但结合细胞形态及表面标志物整体分析，本实验已培养出了具备典型成熟DC特征的细胞，为进一步探讨DC体外对T淋巴细胞的激活作用及抗瘤作用奠定了基础.
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细胞培养篇9
[关键词]毛囊干细胞；鉴定；分离培养
[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）19-0077-04
The cultivation and identification of hair follicle stem cells
XIAO Feng1，TAN Jun2
（Department of Plastic and Laser Aesthetic Surgery，People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410000，Hunan，China）
Abstract： Hair follicle stem cells are the ideal seed cells for skin tissue engineering，which has become a hot research topic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author will analyze and summarize several methods of isolation and culture of hair follicle stem cells in recent years.It will provide a solid foundation for the further study of hair follicle stem cells.
Key words：hair follicle stem cells；identification；cultivation
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，存在于胚胎及成体内。在一定条件下，干细胞可以无限增殖而保持未分化状态，也可以分化成多种功能细胞。20世纪，Cotsarelis、Taylor等[1]通过相关研究发现，在毛囊上部由外根鞘形成的明显突起，即隆突区域也有干细胞的存在，这些干细胞被定义为毛囊干细胞。毛囊干细胞与其他成体干细胞一样拥有强大的增殖能力及多向分化潜能[2]。毛囊干细胞能通过自身的分裂增殖产生各种机体所需的细胞，以补充脱落和缺失的细胞；毛囊干细胞不仅能够向下转移到毛囊根部生成毛囊，而且还能从毛囊外根鞘向上迁移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪[3-4]。近年来，毛囊干细胞的研究备受关注，已成为研究热点之一。目前，存在多种毛囊干细胞的分离培养及鉴定方法，为毛囊干细胞的深入研究提供了坚实的基础，作者就毛囊干细胞常用的分离培养及鉴定作一简要综述。
1 毛囊干细胞的分离纯化
此前，已有许多研究者采用不同的方法来分离毛囊干细胞，并成功地进行传代培养，进行后续更深入的研究。目前对毛囊干细胞分离纯化常用的有以下几种方法：
1.1 组织块培养法
取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用PBS液冲洗，将皮肤切成小块，表皮朝上贴于加入适量培养基的培养器皿中，置于5%CO2培养箱中，37℃，饱和湿度条件下培养。组织块培养法分离的干细胞能持续保持增殖趋势，没有明显的平台期，并且随着不断传代纯化，此方法获得的毛囊干细胞纯度明显增加。但是组织块培养法分离获取毛囊干细胞的效率较低。史明艳等[5]使用该方法成功获得毛囊干细胞，并分析指出该方法的优势在于组织块培养时从组织块中迁移出来其他细胞为毛囊干细胞创造了一个类似于体内的微环境，使毛囊干细胞能最大程度地保留增殖分化能力。
1.2 显微分离技术
取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高浓度青、链霉素的PBS液反复冲洗3次；在超净工作台内，显微镜下显微镊钝性分离单个毛囊组织，收集形态完好且处于生长期的毛囊。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入含培养基培养皿，于37℃、5%CO2孵箱中培养。显微分离技术能从样本直接选取毛囊干细胞相对富集区域，有利于后续进一步的纯化[6]。王祝迁等[7]使用此方法成功分离出大鼠毛囊干细胞，但单纯应用显微分离技术获取高纯度的毛囊干细胞需花费大量的时间和精力，效率偏低。
1.3 酶消化法
取含有待培养毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用含双抗PBS液冲洗，将皮肤样本剪成小块，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃摇床消化2h。取出组织用PBS冲洗3遍，置于胰蛋白酶（质量浓度为2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃摇床消化1h后，过200目钢网。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入细胞培养液培养。此方法获得的毛囊干细胞克隆形成能力强，获取效率高。郑宣等[8]用此法获得较纯的毛囊干细胞，但获得的毛囊干细胞经历增殖期后生长速度逐渐减慢，且细胞存活率下降，可能与酶消化法破坏了毛囊干细胞生长微环境有关。
1.4 差数贴壁法
将收集的细胞接种于Ⅳ型胶原包被的培养皿中，静置20min后，收集上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一培养皿中，贴附皿底的毛囊干细胞，置于体积分数为5%CO2、37℃孵箱中培养，每3d换液一次。与单纯使用某种毛囊干细胞分离方法相比较，联合差数贴壁法将更进一步纯化，获得纯度更高的毛囊干细胞。彭等[9]使用酶消化法联合差数贴壁法获得了形态典型且均匀一致的毛囊干细胞。目前此方法已被广泛使用。
1.5 免疫磁珠法
免疫磁珠法主要用来纯化分离培养获得的毛囊隆突区细胞中某种标记物阳性的细胞。首先制作细胞悬液，并加入FITC标记的某种标记物单抗，室温孵育30min，离心后弃上清中未结合的抗体，加入磁珠分选缓冲液重悬细胞，再次离心后弃上清，PBS缓冲液清洗2次，取重悬后细胞与免疫磁珠混合，室温反应30min。磁珠分离器分离8min，去除未与磁珠结合的细胞。将结合了靶细胞的免疫磁珠用磁珠分选缓冲液洗5次。体积分数为5%CO2、37℃孵箱培养48h，使细胞与磁珠分离，即可获得较纯的毛囊干细胞。谭挺等[10]用此法获得高纯度毛囊干细胞，他们指出此方法与显微分离技术连用有单次操作分离细胞数量大且纯度较高、能与细胞培养、流式细胞术、荧光显微镜等分子生物学技术兼容等特点。黄恩毅等[11]用此法有效分离并成功培养CD34+毛囊干细胞，发现分选后的细胞仍具有较好的活性，且增殖速度快，增殖期长。卢葳等[6]通过实验证实，免疫磁珠分选后毛囊干细胞活力较好，分离获得的毛囊干细胞适合用于细胞培养、诱导等后续试验。
1.6 流式细胞仪分选法
通过毛囊干细胞表达的某些特异性标记物，利用流式细胞仪可以将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来，获得较高纯度的特异性细胞。常用的是荧光激活细胞分选器。卢葳等[6]使用流式细胞仪分选CD34+毛囊干细胞，获得的毛囊干细胞纯度很高、污染机会小，但是分选过程费时，细胞分选后活力稍差。此方法适合于需要做免疫组化，蛋白质组织学等对细胞纯度要求高的实验。
2 毛囊干细胞的鉴定
干细胞的鉴定一直是干细胞研究的难点，常用干细胞的标记物辅助方法进行鉴定。毛囊干细胞有多种明确的分子标记物，如CD34、K15、K19 [12]。
2.1 角蛋白家族
角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。在表皮细胞中，它们以微丝的状态在细胞内形成广泛的网状结构。在上皮组织中有20多种不同种类的角蛋白表达。在表皮细胞中，随着分化程度的不同其所表达的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作为毛囊干细胞的鉴定手段。1998年，lyle等[13]通过表达克隆发现K15是毛囊干细胞表面标记之一，此后K15一直被当做较为公认的毛囊干细胞标记物。20世纪末，有研究者通过实验发现滞留细胞所在的毛囊隆突部细强表达K19[14]；同时有实验发现毛囊隆突部K19高表达细胞缺乏特异性分化标志，进一步证实 K19高表达细胞为毛囊干细胞，因此，认为K19也可作为毛囊干细胞表面标记物[15]。在毛囊干细胞分化过程中，K15表达减弱较K19早，K19表达阳性而K15阴性的细胞仍有可能为处于早期阶段的增殖细胞，因此推测，检测毛囊干细胞时K15更准确[13]。
2.2 钙黏蛋白家族
钙黏蛋白是一种同亲型结合、Ca2+依赖的细胞黏着糖蛋白，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有重要作用。不同细胞及发育不同阶段其细胞表面的钙黏蛋白的种类与数量均有所不同，目前已经发现几十种钙黏蛋白。CD34抗原是钙黏蛋白中的一种，是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，为阶段特异性白细胞分化抗原，CD34表达于人类造血干细胞，CD34是目前公认的造血干细胞标志物。Ohyama等[16]通过对鼠毛囊的研究，发现鼠毛囊中CD34阳性细胞与毛囊隆突部滞留细胞和K15阳性细胞在毛囊处位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干细胞标记物。Trempus等[17]通过动物实验首次证实了CD34表达于小鼠毛囊干细胞。但CD34在人毛囊干细胞不表达，Shu Jiang等[18] 通过对人头皮进行原位免疫组化和多色免疫荧光标记，发现CD34特异性表达于毛囊间表皮基底部。
2.3 整合素家族
整合素是机体重要的黏附分子，是广泛存在于动植物细胞表面的一类细胞跨膜蛋白，在细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间起黏附作用，整合素是由α和β两个亚单位组成的异源二聚体，它们按不同的组合构成20余种整合素。目前，整合素也被广泛用于毛囊干细胞的鉴定，常用的整合素为整合素β1。1995年，Jones等[19]根据表皮细胞表达整合素β1的水平将其进行分组培养，结果发现整合素β1高表达的表皮细胞比低表达者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Watt等[20]发现，富含整合素β1的皮肤基底细胞比整合素β1含量少的皮肤基底细胞能更快速的黏附细胞外基质蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述发现均为整合素β1作为毛囊干细胞特异性表面标记物提供有力支持。
3 结论
综上，目前常用的分离培养方法主要包括：组织块培养法、显微分离技术、酶消化法、差数贴壁法、免疫磁珠法、流式细胞仪分选法，每种方法均有各自的优势及缺陷；组织块培养法简单，但是分离纯度不高，分离效率低下；显微分离技术相对其他方法而言，分离纯度高，但是分离过程比较费时费力；酶消化法效率高，但是酶消化过程同时会破坏细胞微环境，影响细胞存活率；差数贴壁法一般联合其他分离纯化方法，能进一步纯化所获毛囊干细胞；免疫磁珠法获得的毛囊干细胞纯度高、活性强，但是分离方法较复杂；流式细胞仪分选法所获得毛囊干细胞纯度高，但细胞活性低。因此，在选择毛囊干细胞分离培养方法时一定要根据实验的特殊要求及实验条件选择合适的方法。毛囊干细胞的鉴定方法常用的包括：角蛋白家族、钙黏蛋白家族、整合素家族；实验条件允许的情况下，同时检测两种以上的标记物来鉴定毛囊干细胞是较为准确的一种方法。
毛囊干细胞具有其他干细胞的共同特征，具有多向分化潜能。目前，已有实验证实毛囊干细胞能用于尿道缺损、神经损伤的修复；能够分化成为脂肪细胞和成骨细胞[1，21-22]；能有效促进创面愈合，将其作为工程皮肤中的种子细胞，有利于表皮细胞及汗腺、毛囊等附属器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干细胞有利于瘢痕的修复，但该研究仍处于起步阶段，相信经过研究者们的不懈努力，其必将为瘢痕治疗这一世界性难题提供一种有效的新方法。
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细胞培养篇10
诱导多能干细胞只是干细胞的一种，但是，可以绕开使用胚胎干细胞的伦理限制，而且具有丰富的来源，因此被视为再生医学和器官移植的重要突破。此后，研究人员就希望能用诱导多能干细胞在实验室中培养和生成各种器官、组织和细胞，用以治疗更多疾病。现在，研究人员发现，诱导多能干细胞确实能培养并生成有生理功能的多种器官、组织和细胞。
诱导多能干细胞培育出肝脏
英国《自然》杂志2013年7月3日报道，日本横滨市立大学谷口英树研究小组与美国西奈山医学院研究人员合作，利用人类诱导多能干细胞培育出微小肝芽，然后移植到小鼠体内，结果这些肝芽成功生长成微型人类肝脏或称“迷你肝脏”，并像健康器官一样具有正常的肝功能。这是世界上首例用诱导多能干细胞培养的立体肝脏。在此之前，已经有研究小组能够用诱导多能干细胞培养出肝细胞，但是还不能培养出可以在人体内发挥功能的立体结构肝脏。
日本和美国研究人员利用人类诱导多能干细胞培养的肝脏从严格意义上来说还不是肝脏，但是可以看成是微小肝脏，它们的直径只有4毫米～5毫米，却表现出了肝脏的生物活性和生理功能。
研制的过程是，将人类皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞，并且让其分化成表达肝脏基因的早期肝细胞。然后在培养基中加入从脐带血中提取的内皮细胞和制造骨骼、软骨和脂肪的间充质干细胞，内皮细胞的作用是指挥血管排列和生成。此后，这些细胞在培养基中自行成长为球状的细胞团，如同人类胚胎中肝脏最初的发育一样。两个月后，这些细胞团快速生长成直径为4毫米～5毫米的微小肝脏，研究人员再把这种微小肝脏移植到小鼠的皮肤下。此后，微小肝脏与小鼠的血管慢慢连接起来，最终发育成类似成体肝脏的器官。这种微小肝脏还接管了小鼠肝脏的一些正常的工作。
为了验证这种微小肝脏是否有生理功能，研究人员对小鼠注射了两种药物，以检查肝脏是否有代谢药物的功能。这两种药物是抗炎药酮洛芬和治疗高血压的药物异哇胍。结果发现，小鼠的血液中产生了通常来自人类肝脏的代谢产物而非小鼠肝脏的代谢产物。这说明移植进小鼠体内的微小肝脏发挥了作用。
同时，研究人员还做了一个对照研究，以检测微小肝脏是否有解毒功能，以便帮助肝功能衰竭的小鼠存活。实验用了两组小鼠，一组小鼠的每一只体内都植入了12个诱导多能干细胞培养的微小肝脏，另一组小鼠作为对照组，未植入微小肝脏。研究人员对两组小鼠都注射白喉毒素。结果，移植了微小肝脏的一组小鼠有近1/3存活超过了40天，而对照组小鼠在10天内都死亡了。
此外，研究还发现，诱导多能干细胞生成的微小肝脏能够分泌肝脏的特异性蛋白，也能清除血液中的毒素，并且产生人类特异性代谢物。诱导多能干细胞生成的微小肝脏最为重要的特点是，它很快就能与附近的血管融合，从而获得受体血液系统的支持。这是器官移植最重要的一步，因为有了受体血液系统的支持，而且不受到受体免疫系统的排斥，移植的器官就会持续生长，成为受体体内的一员。因此，尽管这种能首次连接到受体血液系统的具有复杂生理功能的器官还比较微小，但已经是再生医学的一个重要里程碑。
当然，未来如果能进一步表明诱导多能干细胞培养的微小肝脏移植进人体后不受人的免疫系统排斥，那么微小肝脏就可以移植给人体，至少可以取代成人30%的正常肝脏功能。这对于挽救肝功能衰竭的患者具有重要的意义。当然，如果诱导多能干细胞培养肝脏的技术进一步成熟和有效，则有可能培养出像成人肝脏那么大的肝脏，器官移植将会获得突破性进展，因为病人再也不用长时间等待供体器官了。但是，要达到这一步可能还要等上较长时间。
培育简单器官和组织更容易
由于肝脏具有较为复杂的多种生理功能，如解毒功能、代谢功能、分泌胆汁、免疫防御功能等，这就意味着用干细胞培育肝脏更具挑战性和复杂性。因此，在用干细胞培育较为简单的器官方面，应当更有收获。事实也完全证明了这一点。
现在，多个国家的研究人员已经能用诱导多能干细胞培育多种简单的器官，如血管、肌肉、毛囊等。
美国麻省总医院史迪尔肿瘤生物学实验室主任雷克思·杰恩等人利用人类诱导多能干细胞衍生的血管前体细胞，在小鼠身上培育成了有生理功能的血管，而且这些血管维持活性长达280天。
用人类诱导多能干细胞培育的血管主要可以用于治疗心血管病和糖尿病导致的血管损害。比如，糖尿病晚期常导致病人的大血管并发症，如动脉粥样硬化、冠状动脉狭窄（可导致冠心病甚至心肌梗塞）、供应大脑的血管狭窄（可导致脑缺血甚至脑梗塞）、供应下肢的血管狭窄（可导致下肢的疼痛和坏疽），这时就可以用再造血管的方法来治疗晚期糖尿病人。同时，还可以用新血管为新生组织提供血液供应。
过去的一些研究显示，利用人类诱导多能干细胞能生成构建血管所需的内皮细胞，但是，将这些细胞导入到小鼠身上却无法形成持久的血管。于是，麻省总医院的研究人员利用来自健康成人以及1型糖尿病病人的人类诱导多能干细胞，在小鼠大脑外表面和皮肤下生成了血管。研究小组采用了一种最初用于人类胚胎干细胞衍生内皮细胞的方法，以此来扩大和培养人类诱导多能干细胞，然后让这些细胞群生成能够形成血管的内皮细胞。
随后，研究人员把这些内皮细胞与间充质前体细胞（可生成必要的结构细胞）一起移植到小鼠大脑的表面。在两周内，移植细胞形成了血液灌注的血管网络，它们与邻近的天然血管一样发挥了功能，并在小鼠体内持续发挥功能长达9个月。此外，研究人员也用同样的方法在小鼠皮肤下移植内皮细胞与间充质前体细胞，结果也生成了功能性的血管。但是，在皮肤下的移植需要移植更多的细胞，约为移植到大脑的5倍以上，并且生成的血管的寿命比在大脑生成的血管寿命短。
这项研究还表明，来自健康人的细胞和患1型糖尿病患者的人类诱导多能干细胞衍生的内皮细胞都可以生成能长期维持功能的血管。但是，不同的人类诱导多能干细胞和包括来自同一患者的不同细胞系在生成血管的潜力上有差异，因此，还需要更深入地了解干细胞生成血管的更多机理，而且需要找到更好的方法来操控生成特定器官所需的特异内皮细胞类型。
当然，由人类诱导多能干细胞生成的血管是否能应用于糖尿病病人，还需要在安全性和实用性方面进行更深入的研究，但毕竟这项研究已经让人们看到了一些希望。
另一方面，用干细胞培养成熟的心肌也有了新的突破。过去，在培养基中培养的心肌细胞并不像人体心肌细胞那样具有生理功能，例如传导生物电信号和收缩。为了解决这些问题，美国杜克大学生物医学工程系的尼纳德·伯萨克等人采取了一种新的方法来培育心肌，即用胚胎干细胞来培养心肌。胚胎干细胞不同于诱导多能干细胞，可能会受到伦理制约，而且所能获得的胚胎干细胞也有限，当然其全能分化和生长的效果优于诱导多能干细胞。
研究人员在实验室中把人胚胎干细胞分化得到的心肌细胞放入三维水凝胶中。此后，心肌细胞自行组装成心肌束，形成了纤维细胞在外、内皮细胞穿插其中的三维结构。而且，这种组织并非是心肌细胞的堆积，而是一块8毫米×8毫米的心肌组织，并且达到了与体内心肌细胞类似的功能指标。通过注入不同的药物可以检测心肌电传导性能的变化和检测药物对心肌收缩能力的影响。由此证明，这种由胚胎干细胞培养的心肌组织不仅可以传导生物电流，而且可以自主搏动。
研究人员认为，这种心肌组织的结构和功能都超过了以前的人工心肌，也是迄今为止和人体组织最接近的人造心肌薄片。虽然这是依靠胚胎干细胞培养的，但是，通过仔细总结培养的机理，未来可以通过提取心脏病人的皮肤细胞以获取诱导多能干细胞，再由后者来培养特异的心肌组织或心脏，如此，则可以修补病人的坏死心肌，或者直接为病人移植用其自身的皮肤细胞培养的心脏。
培育血细胞
诱导多能干细胞还能培育更多的血细胞，以用于输血、诊断和治疗疾病。
人的血液由血浆和血细胞组成。血浆相当于结缔组织的细胞间质，为浅黄色半透明液体，其中除含有大量水分以外，还有无机盐、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各种营养物质、代谢产物等。血细胞则分为红细胞、白细胞、血小板。人的血细胞总是在不断地新陈代谢。红细胞的平均寿命约120天，有粒白细胞和血小板的生存期限一般不超过10天。淋巴细胞的生存期长短不等，从几个小时到几年。一般而言，血细胞及血小板来自造血器官，红细胞、有粒白细胞及血小板由红骨髓产生，无粒白细胞则由淋巴结和脾脏产生。但是，由于疾病和造血功能异常会导致一些血液方面的疾病，如贫血。
贫血是指人体外周血液中红细胞容量减少并低于正常范围下限的一种疾病，但是由于红细胞容量测定较复杂，临床上常以血红蛋白（Hb）浓度来代替。在中国一般把成年男性Hb
因此，贫血的根本原因是红细胞减少，因而导致血红蛋白减少，血液携氧供氧能力下降，这就会对全身造成不同程度的影响。例如，造成神经系统的损害，表现为头昏、耳鸣、头痛、失眠、多梦、记忆力减退、注意力不集中等；贫血更影响呼吸循环系统，表现为气急或呼吸困难，并且有心悸、心律失常和心功能不全；贫血也影响消化系统，因为贫血时消化腺分泌减少甚至腺体萎缩，进而导致消化功能降低、消化不良，出现腹部胀满、食欲减低、大便规律和性状的改变等。
长期以来，治疗慢性贫血的效果并不如意。研究人员也在寻找新的方法，例如输血和单独输入红细胞。但是，输血和输入红细胞也可能发生排异反应和输血反应，甚至染上其他传染性疾病。如果能用病人的皮肤细胞产生诱导多能干细胞，再由后者生成红细胞，就可以把红细胞输入病人体内，治疗贫血。
现在，美国波士顿大学医学院的乔治·墨菲与波士顿大学公共健康学院的戴维·希尔领导的研究团队采用一种新的方法，对诱导多能干细胞进行分化，在试管内制造出了大量的人类红细胞和血小板。这些红细胞有望用于治疗贫血和诊断疟疾、镰状细胞贫血，而血小板则可用来检查心血管病和治疗凝血障碍。
