真核细胞十篇
时间：2023-03-22 06:57:00
真核细胞篇1
1.细胞壁上的差异
原核细胞细胞壁的成分主要是肽聚糖和胞壁酸，还有脂多糖、脂蛋白等成分。细胞壁除对细胞有保护作用外，还对物质交换起部分调节作用，其成分还与抗原性、致病性等方面有关。真核细胞中动物细胞没有细胞壁，植物细胞的细胞壁成分主要是纤维素和果胶，起支持和保护作用。
2.细胞核与染色体水平
原核生物的特征是体积较小，直径由0.2～10μm，进化地位较原始，现存资料可以证明真核细胞是由原核细胞进化而来。代表性的原核生物有：细菌、蓝藻、支原体、衣原体、立克次氏体等。原核细胞与真核细胞最本质的区别就是看有没有成型的细胞核，原核细胞没有核膜将它的遗传物质与细胞质分隔开，没有核膜、没有核仁、没有固定形态、结构也较简单，其遗传信息量小，遗传信息的载体是的双链环状DNA分子，没有与组蛋白结合，不构成染色体（有的原核生物在其主基因组外还有更小的能进出细胞的质粒DNA）。真核细胞具有双层膜结构的核膜将细胞内部分成细胞核与细胞质两部分，核膜上有核孔，核内有核仁，其绝大多数遗传物质就分布在细胞核内，双层核膜的出现为遗传物质结构的演化提供了良好的微环境，使高度复杂的遗传装置相对独立起来，也使基因的表达具有严格的区域性。真核细胞遗传信息的载体DNA与原核细胞的DNA相比，其结构与数量都有变化。数量由几千发展到几万甚至十万以上；结构为线状，线状的DNA分子能与多种组蛋白结合，形成直径10nm的核小体结构，然后再以核小体为结构单位高度螺旋盘绕形成复杂的染色体或染色质。
3.细胞器水平
细胞器存在于细胞膜以内核膜以外具有一定形态结构功能。原核细胞只具有一种细胞器—核糖体。真核细胞除核糖体外，还有具有双层膜结构的细胞器：线粒体、叶绿体（植物细胞）；单层膜结构的细胞器：高尔集体、内质网、溶酶体、液泡（植物细胞）和没有膜结构的细胞器—中心体，它们分散在细胞质中，每种细胞器都有各自的结构和功能，他们之间协调配合来完成物质的代谢。如分泌蛋白的合成，首先要在核糖体上合成肽链，然后运到内质网中进行加工，再运到高尔基体上进行再加工，最后释放到细胞外，在整个过程中涉及到核糖体、内质网、高尔基体和提供能量的线粒体四种细胞器。二者虽然都有核糖体，但核糖体的化学组成和形态结构上有明显的区别。真核细胞核糖体的沉降系数为80S型，由60S和40S大小两个亚基组成；原核细胞核糖体的沉降系数为70S型，由50S和30S大小两个亚基组成。
真核细胞中的线粒体，有自己特有的基因组，能完成自己DNA的复制及部分蛋白质的合成，其内膜上有与氧化磷酸化相关的电子传递链，为细胞的代谢活动提供能量。原核细胞功能上与线粒体相当的结构是质膜和由质膜内折形成的结构，但后者没有自己特有的基因组。真核细胞的叶绿体，也有自己特有的基因组和合成系统。有些原核生物虽然也具有能进行光合作用的膜结构称之为类囊体，但未被双层膜包裹，不形成叶绿体。
4.基因结构及其表达上的差异
基因结构及其表达在原核细胞与真核细胞之间存在明显的差异。
原核细胞DNA含量有限又要保证生命活动必要数量的基因，就必须充分利用仅有的DNA来存储遗传信息，所以其基因简洁而有效，无多余序列。当基因表达时，转录形成的mRNA直接与核糖体结合开始翻译蛋白质，即原核细胞是转录与翻译同时进行的。
真核细胞DNA含量远远大于原核细胞，充分的遗传物质使它形成一些特殊的基因结构，如重复序列、内含子、假基因等。其中内含子是基因中不编码蛋白质的序列与外显子相间形成结构基因，正是因为它的存在，真核细胞的基因在表达过程中，出现转录后对mRNA进行加工的过程，即将基因中内含子所转录的RN段剪切掉形成mRNA。真核细胞的DNA存在于细胞核中，而翻译所需的核糖体在细胞质中，所以细胞核中的基因在细胞核中转录后，形成mRNA从细胞核中出来进入到细胞质中与核糖体结合翻译出相应的蛋白质，即真核细胞基因的转录和翻译不像原核细胞那样同时进行而是分开进行的，转录在细胞核中，翻译在细胞质中。这些结构上的特点，促成真核细胞能在转录前水平、转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平对基因的表达进行多种层次上的调控。原核细胞的调控方式比较简单使其能适应多种不利环境，进行快速调节。而真核细胞基因表达的复杂性及多层次性能够保证遗传信息传递的准确性和稳定性。
原核细胞与真核细胞除上述差异外，还有以下差异：真核细胞有内膜系统，原核细胞无；真核细胞有细胞骨架，原核细胞无；真核细胞的分裂有细胞周期，原核细胞无；真核细胞主要进行有丝分裂和减数分裂，原核细胞无等。
原核细胞与真核细胞除有差异外，也有相同的地方，如都有细胞膜结构，细胞质结构，翻译共用一套密码子等。
在学习过程中易出现的错误：
（1）把病毒当成原核生物。因为它们没有细胞结构，所以既不是原核细胞也不是真核细胞。
真核细胞篇2
【关键词】 真核表达载体
Blocking effect of vectorbased siRNA on stathmin gene expression in human HeLa cells
【Abstract】 AIM: To explore the blocking effect of siRNA on the expression of stathmin gene in HeLa cell line using siRNA eukaryotic expression vector. METHODS: Two stathmin siRNA cDNAs were synthesized according to the stathmin gene sequence and cloned into the vector pSilencer4.1CMVneo and named pSilencerS1 and pSilencerS2 respectively， which were further identified by restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing. HeLa cells were then transfected with pSilencerS1 and pSilencerS2. After G418 selection， the cells were selected and the interfering effect was detected by RTPCR. RESULTS: Restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing results showed that the 2 target segments were cloned into pSilencer4.1CMV neo vector respectively. The results of RTPCR indicated that both siRNA vectors could successfully knock down stathmin gene expression. CONCLUSION: The vectorbased siRNA on stathmin gene can effectively knock down stathmin gene expression， which has the potential of being applied in gene therapy against malignant tumors.
【Keywords】 stathmin; RNA， small interfering; eukaryotic expression vector; HeLa cells
【摘要】 目的： 构建人stathmin基因的siRNA真核表达载体，探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用. 方法： 将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1CMV neo真核表达载体，酶切及测序鉴定. 脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞，G418筛选后RTPCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果. 结果： 经酶切及测序鉴定，成功构建siRNA真核表达载体. 经脂质体转染HeLa细胞后，RTPCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达，HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低. 结论： 成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencerS1和pSilencerS2，并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用.
【关键词】 stathmin； RNA，小分子干扰；真核表达载体；HeLa细胞
0引言
Stathmin为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明［1，2］通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达均证实，抑制其表达可使细胞受阻于G2/M期，同时还可以使恶性肿瘤表型发生逆转. 因此，stathmin是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶点. RNA干涉是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解与之序列相对应的细胞内mRNA， 使基因转录后沉默. 许多学者［3-5］认为该技术的出现是基因功能研究及基因治疗研究手段的又一次革命性突破. 本试验通过构建针对stathmin基因的siRNA真核表达载体，以阻断肿瘤细胞内stathmin基因的表达，探讨肿瘤基因治疗新的模式.
1材料和方法
1.1材料
质粒提取试剂盒（Wizard plus Minipreps DNA Purification System）， pGEMTeasy 载体连接试剂盒，逆转录试剂盒Reverse Transcription System购自Promega公司. pSilencer4.1CMV neo载体及阴性对照pSilencer4.1CMV neo negtive control为 Ambion公司产品. 限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ为Takara公司产品，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司. TaqDNA聚合酶，DGL2000DNA Marker及琼脂糖凝胶购自鼎国生物技术有限公司. HeLa细胞及宿主菌株大肠杆菌JM109为本实验室保存.
1.2方法
1.2.1针对stathmin基因的siRNA cDNA设计和制备根据GenBank中stathmin基因的序列及siRNA设计原则，在编码区内选择两段19nt(分别位于基因序列中：398417;540559)作为不同的干涉区域，分别进行BLAST分析. 根据RNA干涉载体pSilencer4.1CMV neo的要求分别于上、下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点. 每段各设计一对55个碱基的序列，由博亚生物技术有限公司合成. 两对stathmin基因的siRNA cDNA序列如下： 5′GGATCCGAAACGAGAGCACGAGAAA TTCAAGAGA TTTCTCGT
GCTCTCGTTTCAGAAGCTT3′，互补链为： 5′AAGCTTCTGAAACGAGAGCACGAGAAA TCTCTTGAATTTCTCGT
GCTCTCGTTTCGGATCC3′；另一对为：5′GGATCCCGTTTGCGAGAGAAGGATA TTCAAGAGATATCCTTCTCT
CGCAAACGAGAAGCTT3′，互补链： 5′AAGCTTCTCGTTTGCGAGAGAAGGATATCTCTTGAATATCCTTCT
CTCGCAAACGGGATCC3′. 斜体部分为siRNA cDNA序列，中间为Loop.
1.2.2构建siRNA的pSilencer4.1CMV neo真核表达载体将合成的互补链分别退火，形成带有粘端的双链，用T4连接酶分别连接入线性化的pSilencer4.1CMV neo载体中BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间. 转化Jm109大肠杆菌，挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定. 酶切鉴定正确的克隆送上海基康公司测序，分别命名为pSilencerS1和pSilencerS2.
1.2.3脂质体介导的HeLa细胞的转染在6孔板内按照2.0×105细胞/孔接种细胞，第2日转染重组质粒及阴性对照质粒pSilencer4.1CMV neo negtive control（空载体），操作步骤按Lipofectamine2000说明书进行. 转染后48h换为含G418的选择培养基培养，10~12 d后获得3种质粒转染后的HeLa细胞稳定克隆.
1.2.4RTPCR法检测转染重组质粒HeLa细胞中stathmin基因表达分别收集3种转染后的HeLa细胞和未转染的HeLa细胞各1.0×106， Trizol RNA 分离试剂提取细胞总RNA. 取5 μg总RNA，加入1 μL oligo(dT)， 按照逆转录试剂盒说明书操作，合成cDNA第1链. PCR引物自行设计(基因序列中177626，扩增产物为449 bp). 上游引物为： 5′TACCGAAGAAGACTATAGGT3′；下游引物为5′ATCAGTCGAAGTCAGAGCA3′. 取2 μL逆转录产物为模板，PCR反应参数为：94℃预变性3 min； 94℃变性30 s， 58℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 30个循环；72℃延伸10 min. 并以βactin引物为内参照，上游引物为： 5′TCTGACACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG3′，下游引物为： 5′ CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG 3′，RTPCR扩增出一条838 bp的βactin cDNA片段. 各取10 μL PCR扩增产物，1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳0.5 h，凝胶图像分析仪分析结果.
2结果
2.1针对stathmin基因siRNA真核表达载体的构建将构建好的pSilencer4.1CMV neoS1和pSilencer4.1CMV neoS2质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，切出700 bp大小的片段（CMV启动子+siRNA），其结果符合所构建质粒的特征（Fig 1）. 将菌种送上海基康生物有限公司测序，结果完全正确. 证实干涉载体构建成功.
2.2RTPCR法检测转染重组质粒HeLa细胞中stathmin基因表达 RTPCR产物电泳显示，转染pSilencerS1和pSilencerS2后，HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低（Fig 2）.
3讨论
RNA干涉技术是指生物体内导入短的（21nt23nt）双链RNA(dsRNA)后使体内同源基因特异性的沉默. 这一现象首先在植物体及果蝇中发现，2001年以来发现在哺乳动物细胞中也普遍存在该作用，至今已有较多用于封闭病毒基因、癌基因及细胞因子等基因表达的报道. 虽然对其参与的酶及分子作用机制仍在探讨之中，但目前可以肯定，siRNA可以通过相关酶的作用（如： 螺旋helicase， 核酸酶nuclease）特异地与靶RNA结合，其后在RNA酶的作用下直接导致靶RNA的降解，从而达到封闭或改变靶基因表达的作用.
近年来stathmin吸引了更多的关注，因其在多种恶性肿瘤中高表达，目前已经证实的有： 白血病、淋巴瘤、神经系统胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌及消化系统恶性肿瘤等. 体外实验证明： 抑制stathmin基因表达能消除白血病细胞表型的改变. 体内实验也发现： 抑制stathmin能防止白血病的发生［6］. Stathmin蛋白表达对于维持和转变白血病细胞表达至关重要. 但没有证据表明其与恶性转变过程直接相关，但有实验证明高表达的stathmin对于肿瘤高增值率至关重要［7］. 因此，阻断stathmin基因的表达对于抑制肿瘤生长可能有重要的作用.本试验所构建的针对stathmin基因的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin mRNA的表达有明显的抑制，表明我们所构建的siRNA成功地发挥了干涉效应. 从而为进一步探讨stathmin基因表达与恶性肿瘤发生、发展关系奠定了基础，同时为开发以stathmin基因为靶点的肿瘤基因治疗方法奠定了实验基础.
参考文献
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真核细胞篇3
【关键词】 epor；gp130；嵌合抗体；克隆
单克隆抗体技术自1975年问世以来，在生命科学研究及临床疾病检验、治疗等方面的应用日益广泛，然而单克隆抗体多来源于小鼠，使其在体内的应用受到一定限制，因此需对单克隆抗体进行人源化改造。欧美正式批准上市，以及正在临床试用的治疗性单抗中以人源化鼠单抗数量为多。在抗体的制备过程中，抗体的表达载体系统多采用二氢叶酸还原酶（dhfr）基因作为可扩增选择标志基因，同时在培养基中加入甲氨蝶呤（mtx）来得到高拷贝量的抗体表达[1]。但是，mtx具有细胞毒性，会抑制细胞生长、引起细胞形态改变[2]。为了避免抗生素筛选药物对细胞的影响，各国学者做了大量研究。日本学者m.kawahara等人在2003年成功构建了抗原介导的遗传修饰细胞扩增体系（antigen?mediated genetically modified cell amplification,amega），将抗体的vl、vh与epor d2功能区和gp130跨膜功能区嵌合表达于细胞膜上，在细胞培养基中加入抗原，通过抗原与抗体的结合，有效地激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而大量扩增细胞[3]。本研究借鉴这一细胞扩增体系构建细胞因子受体?抗人afp人鼠嵌合抗体基因，探索获得高表达全抗体的新方法。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒大肠杆菌菌株e. coli dh5α由本室保存。pgem?teasy载体购自美国promega公司。载体pag4622、pah4604均由海军总医院王琰教授惠赠。质粒pvitro2购自美国invivogen公司。抗人afp单链抗体表达载体pet32/scfv由本室构建。
1.1.2实验标本标本来源于人胚胎肝脏组织，均取自非疾病死亡的引产胎儿，胎龄28周，胚胎的使用已得到医院和产妇的同意。
1.1.3主要试剂trizol reagent购自美国gibco brl公司。one step rna pcr kit（amv）、ex taq、t4 dna ligase及各种限制酶均购自大连takara公司。胶回收纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自美国omega公司。寡核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成（表1）。表1 pcr引物的名称和序列
1. 2方法
1. 2. 1 epor胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆和拼接trizol法提取4月孕流产胎儿肝脏总rna，用epf1/epr1引物对扩增epor胞外区基因，用gpf/gpr引物对扩增gp130跨膜区基因，rt?pcr反应条件为50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。胶回收纯化rt?pcr反应产物epor1和gp130，并分别克隆到pgem?t easy载体上，测序鉴定。用epf2/epr2引物对从epor1?t载体上扩增epor胞外区基因，在其5′加入肠激酶（enterokinase）的碱基序列：gacgacgacgacaag，胶回收纯化pcr反应产物epor2，并克隆到pgem?t easy载体上，测序鉴定。用hindⅲ和claⅰ双酶切gp130?t载体中的gp130跨膜区基因，和相应酶切的epor2?t载体连接，获得e?epor?gp130?t载体。
1. 2. 2人鼠嵌合抗体轻链载体的构建用vlf/vlr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vl基因，用clf/clr引物对从含有人kappa轻链恒定区序列的载体pag4622中扩增cl基因[4]，分别克隆到pgem?t easy载体上，测序鉴定。用bglⅱ和ecorⅰ双酶切vl?t载体中的vl基因，和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitro?vl载体。用ecorⅰ和xhoⅰ双酶切cl?t载体中的cl基因和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitro?l载体。
1. 2. 3人鼠嵌合抗体重链载体的构建用vhf1/vhr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vh1基因，克隆到pgem?t easy载体上，测序鉴定。用ecor v和nheⅰ双酶切vh1?t载体中的vh基因，和相应酶切的含有人gamma1重链恒定区序列的载体pah4604连接[4]，获得vh?pah4604载体。用vhf2/chr引物对从vh?pah4604载体中扩增人鼠嵌合重链基因vh?ch，克隆到pgem?teasy载体上，测序鉴定。
1. 2. 4细胞因子受体?抗人afp嵌合抗体表达载体的构建用bamhⅰ和kpnⅰ双酶切vh?ch?t载体中的vh?ch基因，和相应酶切的e?epor?gp130?t载体连接，获得h?epor?gp130?t载体。用bamhⅰ和claⅰ双酶切h?epor?gp130?t载体中的h?epor?gp130基因，和相应酶切的pvitro?l载体连接，获得pvitro?e?g?ig载体（见图1）。
2结果
2. 1epor胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆
trizol法从4月孕胎肝组织中提取总rna，琼脂糖凝胶电泳示：28s和18s条带清晰，且28s:18 s＞1。rt?pcr扩增epor和gp130，epor胞外区基因750bp，gp130跨膜区基因900bp，与预计大小一致（见图2）。epor和gp130分别克隆到pgem?t easy载体，测序结果经blast比对，与genebank中报导一致。
2. 2细胞因子受体?抗人afp嵌合抗体表达载体的构建
重组载体pvitro?e?g?ig经相应酶切后，分别获得epor胞外区，gp130跨膜区，及嵌合轻链和重链，人鼠嵌合轻链基因630bp，嵌合重链基因1929bp，与预计大小一致（见图3）。结果表明，细胞因子受体?抗人afp人鼠嵌合抗体真核表达载体构建成功。
3讨论
甲胎蛋白（alpha?fetoprotein，afp）是原发性肝癌诊断和生物治疗的一种重要肿瘤相关靶抗原，抗afp单抗多用于肝癌的放射免疫显像和导向治疗。但是单抗为鼠源性，应用于人体时可在体内产生人抗小鼠抗体（hama），既影响单抗的治疗效果，又有可能诱发过敏反应；此外，鼠单抗在人体内的半寿期较短，不能有效激活人体的补体依赖的细胞毒（cdc）作用及抗体依赖的细胞毒（adcc）作用。因此，通过用人igg抗体恒定区取代鼠单抗恒定区进行人源化，可消除其大部分异源性，并能保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力。迄今已构建了很多人?鼠嵌合抗体，通过大量的实验和应用证明嵌合抗体确实保留了亲本鼠单抗的抗原结合能力并能降低免疫原性[1]。由本室制备的抗人afp单链抗体具有较高的生物活性，竞争elisa实验显示：以单克隆抗体为阳性对照，抗afp单链抗体可抑制53%的单克隆抗体与抗原afp结合[5]。因此可以将其vl/vh链作为新的嵌合受体的识别单位，通过抗原afp与抗体vl/vh特异性结合，诱发epor?gp130融合蛋白的聚合,从而激发细胞生长信号传导，筛选出能与抗原高亲和性结合的抗体表达细胞[3]。
促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，epor）是ⅰ型细胞因子受体超家族成员。 gp130是白细胞介素?6（il?6）、白血病抑制因子（lif）、抑瘤素m（osm）、睫状神经营养因子（cntf）、白细胞介素?11（il?11）和心肌营养素?1（ct?1）所共用的受体和信号传导子[6]。虽然epor与gp130在结构和功能上不尽相同，但是二者之间有很多相似之处。epor与gp130均可结合并激活酪氨酸激酶（janus kinases，jaks），激活的jaks可活化信号转导与转录活化子（signal transducer and activators of transcriptions，stats），使其酪氨酸残基磷酸化，并结合成二聚体转位到胞核内，与特异的靶序列增强子结合调节基因转录[6,7]。也有文献报道gp130与epor分别可直接激活stat3和stat5[8,9]。另外，除了jaks?stats信号传导途径之外，gp130与epor还参与激活ras/map激酶途径传导信号[10,11]。m.kawahara等学者首次构建epor?gp130异源二聚体，并将其应用于amega体系中，结果发现，与单独转染epor ?vh/vl或gp130?vh/vl的细胞株相比，转染epor?gp130?vh/vl的细胞株表现出相同的，甚至更好的抗原剂量依赖性生长[12]。
本研究采用多基因共表达载体pvitro，由于其具有两个不同的转录单元，hferh启动子和hferl启动子可分别启动两个转录单元的表达，使l链和h?e?g链在细胞内可无干扰的高水平表达，它与两个单独的载体共转染一个细胞相比要更有效、更方便。我们应用此载体成功构建细胞因子受体?抗人afp嵌合抗体真核表达载体pvitro?e?g?ig，并将用此表达载体转染依赖il?3生长的小鼠前b细胞株（ba/f3细胞）以证实抗afp嵌合抗体能与抗原afp高亲和性结合，激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而实现抗原介导的细胞大量扩增。
【参考文献】
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真核细胞篇4
目的: 构建pcdna3.1()/xapc7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系smmc7721中的表达。方法: 采用pcr法从pet28b/xapc7重组质粒中克隆得到xapc7 cdna全长序列, 将之与pmd18t载体连接、 测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcdna3.1()中。构建好的pcdna3.1()/xapc7真核表达质粒经酶切鉴定后, 采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系smmc7721, 经g418筛选, 得到阳性克隆细胞株, 再应用半定量rtpcr技术检测转染前后该细胞株xapc7基因的mrna表达水平。结果: pcdna3.1()/xapc7经酶切鉴定及dna测序证实, 目的基因xapc7的序列完全正确, 真核表达载体构建成功; 经rtpcr检测, 重组质粒转染株的xapc7基因mrna表达水平高于对照组, 证实xapc7基因已经稳定转染到smmc7721细胞中并得到表达。结论: 成功地建立了人基因xapc7的稳定转染细胞株, 为进一步研究xapc7的功能奠定了实验基础。
【关键词】 真核表达质粒 smmc 7721 xapc7 构建 表达
xapc7基因编码人类蛋白酶体α7亚基（proteasome subunit, alpha type 7）, 该蛋白是20s蛋白酶体核心复合体的一个α亚基。作为蛋白酶体的一个亚基, xapc7编码产物参与了hbv、 hcv和hiv病毒的复制及多种蛋白质的降解, 并与hbx、 hif1、 cabl及arg等多种肿瘤相关的重要蛋白质相互作用; 同时该蛋白还参与膜蛋白的转运及对蛋白酶体活性的调节等; 此外本基因定位于20q13.33染色体, 既往研究提示人类肿瘤普遍伴随20 q的扩增[1, 2], 但xapc7在肿瘤方面的研究目前国内外鲜有报道。为了研究xapc7编码蛋白在肿瘤发生发展中的作用, 我们构建了重组人xapc7真核表达质粒, 并将其转染入人肝癌细胞系smmc7721中, 以便进一步探讨其对肝癌细胞生长、 死亡以及浸润、 转移的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌dh5α和人肝癌细胞系smmc7721均由本实验室保存。原核重组表达质粒pet28b/xapc7由上海复旦大学季朝能教授提供。质粒小量抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自优晶公司。限制性核酸内切酶bamh i、 xho i、 t4 dna连接酶、 dna mr标准(dl 2000)、 pmd18t载体均购自大连宝生物工程有限公司。阳离子脂质体lipofectamine2000、 trizol试剂、 g418和pcdna3.1()真核表达载体购自invitrogen公司。新生牛血清(fbs)购自gibcobrl公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 为人xapc7基因克隆及半定量鉴定之用, 根据genbank的基因序列(nm_002792), 应用软件primer designer 5.0各设计一对克隆引物及半定量引物。克隆引物: 上游: 5′ctcgagatgagctacgaccgc3′; 下游: 5′ggatcctgatgctttcttttgtttc3′, 在上、 下游引物中分别引入xho i、 bamh i酶切位点, 扩增大小为747 bp的人xapc7 cdna全长序列; 半定量引物: 上游: 5′gccatcaccgtcttctcg3′; 下游 5′gcccattgctctgcgtat3′, 扩增片段长度为355 bp。内参照βactin的引物序列为: 上游: 5′tgtgacgtggacatccgcaaag3′; 下游: 5′tggaaggtggacagcgaggc3′, 扩增片段为206 bp。所有引物均由invitrogen公司合成。
1.2.2 目的基因cdna的获取 以pet28b/xapc7原核重组表达质粒为模板进行pcr扩增, 反应体系, 质粒模板0.1 μl, 10×extaq pcr buffer 5 μl, dntp(2.5 mmol/l) 4 μl, 灭菌蒸馏水38.65 μl, takara extaq (5 u/μl) 0.25 μl, 上游引物(20 μmol/l) 1 μl, 下游引物(20 μmol/l) 1 μl; 反应条件: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 40 s扩增25个循环; 72℃延伸7 min。pcr产物电泳后, 切胶回收目的片段。
1.2.3 t载体克隆 用凝胶回收试剂盒回收纯化pcr产物, 并用pmd18t载体连接试剂盒将目的片段与pmd18t载体连接。连接反应体系为: solutioni 5 μl, pmd18t dna 1 μl(约50 ng), pcr产物 1 μl(约50 ng), dh2o 3 μl, 置于16℃连接2 h后, 用大肠杆菌dh5α感受态进行转化。随机挑取几个单菌落, 用xapc7克隆引物进行菌落pcr检测, 将阳性克隆菌落扩大培养, 送至invitrogen公司测序。测序正确的克隆命名为: pmd18t/xapc7。
1.2.4 真核表达载体pcdna3.1()/xapc7的构建 用bamh i、 xho i分别双酶切重组pmd18t/xapc7质粒及pcdna3.1()空载体, 凝胶电泳后回收目的基因片段, 连接、 转化并挑取单菌落, 用xapc7克隆引物进行菌落pcr检测, 将阳性克隆菌落扩大培养, 提取重组质粒pcdna3.1()/xapc7。
1.2.5 细胞培养 smmc7721细胞在含100 ml/l新生牛血清的rpmi1640培养液中, 于37℃ 50 ml/l co2饱和湿度的孵箱中培养。
1.2.6 smmc7721细胞的基因转染和筛选培养 将处于对数生长期的smmc7721细胞重悬于完全培养液中, 以3×105个细胞/孔接种于6孔板中, 培养24 h, 使细胞达到80%～90%融合。用脂质体lipofectamine2000分别介导空质粒及重组质粒转染细胞, 并设空白未转染组作对照（参照说明书）。转染24 h后采用不同浓度g418进行筛选, 以对照组细胞全部死亡时的g418浓度（800 mg/l）作为参照, 2周后g418改为400 mg/l维持筛选。用选择培养液（400 mg/l g418）培养4周后, 分离出存活的抗g418的阳性克隆, 最后用含100 ml/l新生牛血清的选择培养液扩大培养备用。
1.2.7 转染后真核表达的rtpcr鉴定 以βactin为内参照, 采用rtpcr法用半定量引物扩增xapc7基因, 对转染细胞内目的基因的mrna表达情况进行鉴定。扩增产物用25 g/l的琼脂糖凝胶电泳观察图像。转染细胞总rna的提取、 rtpcr的具体操作均按试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 xapc7目的基因的pcr产物鉴定 经20 g/l琼脂糖凝胶电泳, 在约750 bp处有明亮条带, 与预期目的片段大小一致（图1）。
图1 pcr产物20 g/l琼脂糖凝胶电泳（略）
m: dl 2000 dna marker; 1: xapc7.
2.2 t载体克隆的鉴定 目的基因与t载体连接后, 菌液pcr扩增产物经20 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定与目的基因大小相符, 表明所挑选的几个单菌落均为阳性克隆。菌液测序结果示: 装入t载体的序列与genbank上登录的人xapc7 cdna序列比较完全相符。
2.3 真核表达载体的构建与鉴定 将用bamh i、 xho i双酶切重组质粒pmd18t/xapc7得到的目的基因插入pcdna 3.1()空质粒, 获得pcdna3.1()/xapc7真核表达质粒, 该质粒再经bamh i、 xho i双酶切鉴定, 得到了747 bp的目的片段和约5400 bp的载体片段（图2）, 送测序证实该质粒含有完全正确的xapc7 cdna序列。
图2 重组质粒pcdna3.1()/xapc7双酶切鉴定（略）
m: dl 2000 dna marker; 1-3: pcdna3.1()/xapc7.
2.4 稳定表达株的筛选与鉴定 在6孔板中将pcdna3.1()/xapc7质粒转染入人肝癌细胞系smmc7721, 经4周选择性培养（400 mg/l g418）后, 得到了稳定表达目的基因mrna的阳性细胞株。筛选后的xapc7稳定表达细胞经半定量rtpcr方法分析, 结果显示, 转染了pcdna3.1()/xapc7的smmc7721细胞与对照转染空载体及未转染的smmc7721细胞相比, 三者的βactin表达水平差别不大, 说明rna总量基本一致。在25个循环内, 转染了pcdna3.1()/xapc7的smmc7721细胞扩增后得到一条大小为355 bp的清晰条带, 而对照转染空载体及未转染的smmc7721细胞则条带非常弱, 几乎看不到, 说明重组子已成功转入smmc7721细胞并得到表达(图3)。
图3 各转染组细胞xapc7基因的mrna水平变化（略）
m: dl 2000 dna marker; 1: 空白未转染smmc7721细胞组; 2: 转染pcdna3.1()空载体组; 3: 转染pcdna3.1()/xapc7组.
3 讨论
人类基因xapc7(又称c6、 hspc或rc61)编码人类蛋白酶体α7亚基psma7。其编码成员属于肽酶a t1a家族, 是蛋白酶体20s核心结构的α亚基。1996年huang等[3]以hbx为探针, 采用双酵母杂交法筛选hela细胞的cdna文库, 获得了xapc7的cdna, 并将其命名为xapc7。含248个氨基酸的xapc7与hc8(psma3)有33%的一致性, 并与果蝇的蛋白酶体亚基有高度的同源性。
研究表明xapc7可通过与hbx、 hif1、 cabl及arg等蛋白相互作用, 参与病毒复制、 蛋白酶体及转录因子的活性调控。有作者[4]研究证实, xapc7可与hbx相互作用。hbx与xapc7的相互作用是病毒复制的关键, hbx可能通过与xapc7相互作用干扰蛋白酶体复合物的活性, 从而导致hbv病毒的持续感染状态。另有研究报道xapc7与丙肝病毒内部核蛋白体进入位点的活化调节(ires)有关[5], 并在控制丙肝病毒翻译和下游的复制中发挥重要作用。同时有研究[6]提示hif1α是xapc7的细胞靶标。xapc7通过与hif1α的转录抑制区结合, 将底物hif1α募集至蛋白酶体复合物中, 促进其转录子的非氧依赖性蛋白酶体途径的降解, 从而抑制hif1α的转录。可见xapc7在hif1的活性调节中发挥重要作用。liu等[7]则发现cabl和arg的sh2区域可通过与xapc7结合而使其磷酸化,进而调节蛋白酶体介导的蛋白质的降解活性。表达磷酸化突变的xapc7细胞将出现g1/s过渡和s/g2进展受损, 氧化应激和电离照射可导致cablxapc7复合物和磷酸化xapc7的形成增加。可见, cabl和arg介导的xapc7的磷酸酪氨酸修饰调控着26s和20s蛋白酶体的活性。
尽管xapc7参与多种重要的肿瘤相关蛋白的表达及活性调节（如hbx、 hif1、 cabl及arg）, 但其本身在肿瘤的发生、 侵袭及迁移中究竟起怎样的作用？ 在肿瘤的发生中, xapc7是作为这些重要肿瘤相关蛋白的上游调控因子, 还是仅作为蛋白质降解的“垃圾处理站”而接受其他因子的调控？ shi等[8]采用serex技术在cdna表达文库中筛选到psma7阳性克隆, 进一步的表达谱芯片表明psma7在hcc样本中呈现表达上调, 实时定量rtpcr结果16个配对原发性肝细胞癌标本和癌旁非肿瘤组织标本中有7个在肿瘤组织中高表达（44%）, 初步提示psma7是一个原发性肝细胞癌的肿瘤相关抗原。但psma7在肝癌中究竟充当何种角色目前尚不清楚。为此, 本实验中成功构建了能在人肝癌细胞系smmc7721中表达的人xapc7基因真核表达载体, 为进一步研究xapc7基因对肿瘤细胞生物学功能的影响奠定了实验基础。同时本课题组正在制备抗xapc7 mab, 并构建rna干扰重组质粒, 从细胞增殖、 细胞周期、 细胞凋亡及对肿瘤细胞的侵袭迁移的影响等多方面考察本基因及其编码蛋白的功能。
致谢: 感谢上海复旦大学生命学院遗传所季朝能教授对本课题的协助和支持！
【参考文献】
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真核细胞篇5
【摘要】
目的: 构建含人野生型及致病突变A30P、 A53T SNCA基因的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA， 并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法: 通过RTPCR方法扩增SNCA基因， TA克隆后测序。在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR I、 BamH I两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C（Ala30 Pro）、 G209A（Ala53Thr）的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA， 并以PCR、 双酶切、 测序鉴定。以重组质粒pEGFPC3SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞; 以G418进行筛选; 以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein的单克隆PC12细胞株， 并以稳定转染pEGFPC3的PC12细胞作为对照组细胞， 通过RTPCR、 Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株。结果: PCR、 酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFPC3SNCA构建成功。RTPCR、 Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达。结论: 成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA; 成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein的单克隆PC12细胞株。
【关键词】 α synuclein（SNCA） 致病突变 真核表达载体pEGFP C3 稳定转染 PC12细胞
[Abstract] AIM: To construct recombinant eukaryotic expression vectors pEGFPC3SNCA containing human wildtype (WT) and pathogenic mutations A30P， A53T αsynuclein (SNCA)， and to obtain monoclonal PC12 cell lines overexpressing human wildtype and pathogenic mutations A30P， A53T αsynuclein by stable transfection. METHODS: Human wild type SNCA gene was cloned by using RTPCR. By TA extension cloning， the gene was ligated with Tvector and sequenced. Based on it， the recombinant eukaryotic expression vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its G88C (Ala30Pro) and G209A (Ala53Thr) pathogenic mutation were constructed by sitedirected mutagensis using primer variance in mononucleotide. And different recombinant plasmids pEGFPC3SNCA were identified with PCR， restriction enzyme digestion and DNA sequencing. PC12 cells were transfected with different recombinant plasmids pEGFPC3SNCA by liposome transfection method， screened with G418， and subcloned by limited dilution method to obtain different monoclonal PC12 cell lines stably overexpressing human wildtype， A30P or A53T αsynuclein， respectively， and PC12 cells stably transfected with pEGFPC3 were used as control group. These monoclonal PC12 cell lines were identified with RTPCR， Western blot and fluorescence microscopy. RESULTS: According to result of PCR， the double digestion and gene sequencing， it was comfirmed that recombinant eukaryotic expression vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its Ala30Pro and Ala53Thr pathogenic mutation had been constructed successfully. By means of RTPCR， Western blot and fluorescence microscope， it was comfirmed that objective gene sequences in PC12 cells were stably overexpressed. CONCLUSION: The recombinant pEGFPC3SNCA vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its Ala30Pro and Ala53Thr pathogenic mutations had been constructed successfully. The transfected monoclonal PC12 cells are obtained in which three SNCA gene isoforms had stable expression.
[Keywords]αsynuclein（SNCA）; pathogenic mutation; eukaryotic expression vector pEGFPC3; stable transfection; PC12 cell
多巴胺能神经元中出现路易小体（Lewy body， LB）是帕金森病（Pakinson’s disease， PD）的特征性病理改变， SNCA基因编码的αsynuclein在病理状态下聚集形成不溶性纤维， 构成了LB的主要成分， 而Ala30Pro、 Ala53Thr的致病突变与家族性PD相关[1， 2]。αsynuclein及其Ala30Pro、 Ala53Thr致病突变体在PD的病理机制中可能起着十分重要的作用， 我们通过构建含绿色荧光蛋白的SNCA同义突变基因及其Ala30Pro与Ala53Thr致病突变基因的真核表达载体pEGFPC3SNCA质粒， 并以此转染PC12细胞， 建立稳定表达该基因蛋白及变异蛋白的多巴胺能PC12细胞模型。
1 材料和方法
1.1 材料 克隆载体pTZ57R与真核表达载体pEGFPC3购自Promega公司; E.coli DH5α菌株、 培养基RPMI1640购自Invitrogen公司; PC12细胞株购自中国科学院上海细胞所; 小牛血清购自杭州四季青公司; Taq酶购自TaKaRa公司; 总RNA提取试剂为Gibco的TRIzol试剂; 反转录PCR试剂盒购自Fermanas公司; Lipofectamine2000转染试剂盒购自GbicoBRL公司; G418购自Mediatech公司; 胰蛋白酶、 兔抗人αsynuclein mAb购自Sigma公司; HRP标记的羊抗兔IgG的二抗购自DAKO公司; ECL显色剂购自Amersham公司。
1.2 方法
1.2.1 PCR引物的合成 根据GenBank中相应cDNA基因序列， 自行设计引物， 委托上海英骏生物有限公司合成， 引物序列: P1: 5′GTGTGGTGTAAAGGAATTCATT3′; P2: 5′CGCGGATCCAGAAACTGGGAGCAAAGATA3′。
1.2.2 总RNA的提取及RTPCR扩增 在50 μL反应体系中加入10 ×buffer 5μL， 10 mmol/L， dNTP 1 μL， 引物1、 2 各1 μL， 5 U/μL Taq酶0.5 μL， 模板cDNA 2 μL， ddH2O 40 μL， 计反应体系50 μL。PCR反应条件为94℃ 5 min， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 45 s， 后3步反复进行30个循环。扩增产物用Uuiq10柱式DNA胶回收试剂盒提纯。
1.2.3 野生型SNCA基因的TA克隆 取胶回收产物7.5 μL加入1 μL T vector、 1 μL 10×ligation buffer、 0.5 μL T4 DNAligase， 混合为10 μL连接反应体系于4℃过夜。将10 μL连接液与200 μL感受态细菌混匀， 冰浴30 min后于42℃水浴90 s， 置冰浴2 min。加入600 μL不含氨苄青霉素的LB培养液， 37℃、 225 r/min摇床45 min， 将细菌涂布于氨苄青霉素平板上， 37℃倒置过夜。取单克隆菌落加入含氨苄青霉素的LB(100mg/L) 37℃、 225r/min摇床8h， 用Uuiq10柱式质粒小抽提试剂盒抽取质粒， 作PCR及双酶切鉴定， 阳性者送检测序。
1.2.4 同义突变SNCA及Ala30Pro、 Ala53Thr致病突变SNCA的构建在野生型SNCA基因编码区内部存在EcoRI、 BamHI两酶切位点， 以野生型SNCA基因的TA克隆质粒为模板， 利用单核苷酸差异引物定点诱变法针对两酶切位点进行同义突变， 在此基础上同法构建G88C（Ala30Pro）、 G209A（Ala53Thr）已知致病突变体， 并对SNCA同义突变及Ala30Pro、 Ala53Thr致病突变基因进行TA克隆。
1.2.5 含同义突变及致病突变Ala30Pro、 Ala53Thr的SNCA基因重组真核表达载体pEGFPC3SNCA的构建 分别以SNCA同义突变及Ala30Pro、 Ala53Thr致病突变基因的TA克隆质粒为模板， 以P1、 P2引物， 以高保真Taq酶PCR扩增3种不同SNCA基因片段， 扩增条件同前。分别取相应提纯的PCR产物及pEGFPC3质粒5μL， 加入BamHI0.5μL、 EcoR I0.5 μL、 10×buffer2 μL、 ddH2O12 μL， 构成20 μL反应体系37℃ 酶切5 h。将3种不同SNCA的PCR双酶切产物电泳胶回收后分别与pEGFPC3空载体双酶切胶回收产物混合进行连接， 转化细菌后用Uuiq10柱式质粒小量抽提试剂盒抽取质粒， 作PCR扩增、 酶切及测序鉴定。
1.2.6 人同义突变（野生型）及致病突变Ala30Pro、 Ala53Thr SNCA基因在PC12细胞中的稳定过表达 PC12细胞长至80%融合后， 进行转染实验[3]。取2 μg质粒溶于100 μL无血清RPMI1640液， 再取3 μL脂质体溶于100 μL无血清RPMI1640， 静置5 min后将2液体混匀， 室温静置30 min; 培养细胞用无血清RPMI1640洗1次， 加800 μL无血清RPMI1640， 滴入转染混合液， 摇匀; 置37℃ 50 mL/L CO2的培养箱内培养5～24 h， 换液为RPMI1640(100 mL/L FCS)， 继续培养至总转染时间为48～72 h。pEGFPC3SNCA质粒转染PC12细胞48 h后， 加入含500 mg/L G418的选择性培养液， 2～3 d更换新的选择性培养液， 约5 d后见细胞死亡， 2周后见细胞克隆， 将具有G418抗性的细胞用200 mg/L G418维持培养基通过有限稀释法将细胞稀释至约1～30个/mL， 转移至96孔培养板中， 每孔加100 μL细胞悬液， 培养4～5 d后， 在显微镜下可见到小的细胞克隆， 期间更换选择性培养液， 第8～9天时， 肉眼可见细胞克隆。转移至24孔板继续用选择性培养液扩大培养。再用有限稀释法进行2次亚克隆。将单克隆细胞扩大培养备用， 并于荧光显微镜下观察摄片。
1.2.7 RTPCR检测转染PC12细胞中SNCA转录 收集筛选获得的阳性细胞， 用TRIzol抽提其总mRNA， 按TFermanas逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA， 取5 μL cDNA为模板， 用SNCA特异性引物扩增SNCA基因， 同时用转pEGFPC3的PC12细胞作阴性对照。
1.2.8 Western blot检测稳定转染的PC12pEGFPC3SNCA单克隆细胞αsynuclein的表达 将筛选获得的含同义突变及A30P、 A53T致病突变SNCA基因的PC12pEGFPC3SNCA细胞单克隆分别胰酶消化， 用含200 μg/L G418的培养基37℃ 50 mL/L CO2培养3 d后消化收集细胞， PBS洗涤后加入蛋白裂解液超声裂解， 4℃、 12000 r/min离心20 min， 取上清分装， 取适量稀释后进行蛋白定量， 部分存于-80℃待用。用上样缓冲液将各样品蛋白稀释至相同浓度， 100℃水浴5 min后进行SDSPAGE分离， 转NC膜， 脱脂奶粉4℃封闭1 h， 加入稀释的抗αsynuclein（1∶2500）抗体， 4℃过夜， 洗膜后加入HRP偶联的二抗作用1 h， ECL显色， X光片显影。BioRad Gel Doc XR凝胶成像仪读取， 并用Quantity One4.6软件处理。
2 结果
2.1 SNCA基因cDNA克隆及载体酶切鉴定结果 通过RTPCR方法成功克隆了SNCA基因的cDNA序列， 目的基因为481 bp（图1）， 所提质粒pTZ57R SNCA经EcoR I和BamH I双酶切鉴定正确（图2）， 含同义突变及致病突变Ala30Pro、 Ala53Thr的SNCA基因重组pEGFPC3SNCA载体的构建所提质粒经EcoR I和BamH I双酶切鉴定正确(图3)。
图1 RTPCR扩增SNCA基因（略）
Fig 1 SNCA gene by RTPCR
1: DNA marker(DL 2000); 2: Objective band was 481 bp.
图2 pTZ57RSNCA双酶切（略）
Fig 2 The double digestion of pTZ57RSNCA
1: DNA marker (DL 2000); 2: The digestive product by EcoR I and BamH I (objective band was 460 bp， vector was 2800 bp).
图3 pEGFPC3SNCA双酶切（略）
Fig 3 The double digestion of pEGFPC3SNCA
1: DNA marker (DL 15000); 2: The digestive product by EcoR I and BamH I (objective band was 460 bp， vector was 4700 bp); 3: pEGFPC3SNCA (5160 bp).
2.2 对TA克隆载体及pEGFPC3SNCA表达载体测序 M13+通用引物对TA克隆载体进行测序， 同时用目的基因两端序列设计引物对pEGFPC3SNCA表达载体测序， 结果与期望序列一致， 编码Ala30Pro的GCA突变为CCA， 编码Ala53Thr的GCA突变为ACA。
2.3 荧光显微镜观察SNCA基因在PC12细胞中的蛋白表达 稳定转染野生型、 A30P与A53T的重组质粒pEGFPC3SNCA的PC12细胞株， 在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光， 表明野生型、 A30P与A53T的αsynuclein在PC12/pEGFPC3SNCA细胞中得到了表达， 转染空载体的PC12细胞也见到高丰度的绿色荧光， 而未转染的PC12细胞则未见到绿色荧光（图4）。
2.4 RTPCR检测稳定转染PC12细胞中SNCA基因mRNA的转录 转染野生型SNCA、 A30P SNCA与转染A53T的SNCA的PC12细胞中， 能扩增出481 bp的特异性片段， 以重组质粒为模板作PCR作为阳性对照，
而转染空载体pEGFPC3的PC12细胞未扩增出SNCA的目的基因条带（图5）。
2.5 Western blot检测稳定转染PC12细胞中SNCA基因的蛋白表达 Western blot结果显示， 转染野生型、 A30P与A53T的重组质粒pEGFPC3SNCA的PC12细胞中分别检测到Mr为40000的蛋白条带， 转染空载体的PC12细胞中未见αsynucleinGFP融合蛋白的条带， 而4株PC12细胞均可见GAPDH蛋白的表达（图6）。
图4 SNCA在PC12细胞中表达的荧光检测（略）
Fig 4 Detection of expression of SNCA in the PC12 cells under fluorescentmicroscope
A: PC12 cells/pEGFPC3WTSNCA; B: PC12 cells/pEGFPC3A30PSNCA; C: PC12 cells/pEGFPC3A53TSNCA; D: PC12 cells/pEGFPC3.
图5 RTPCR检测转染PC12细胞中SNCA基因mRNA的转录
Fig 5 RTPCR analysis of hSNCA mRNA in transfected PC12 cells
M: DNA marker(DL 2000); 1: PC12 cells/pEGFPC3; 2: PC12 cells/pEGFPC3WTSNCA; 3: PC12 cells/pEGFPC3A30PSNCA; 4: PC12 cells/pEGFPC3A53TSNCA; 5: PCR product from plasmid of WTSNCApEGFPC3.
图6 转染的PC12细胞中αsynucleinGFP融合蛋白的表达
Fig 6 Detection of expression of αsynucleinGFP in PC12 cells by Western blot
1: PC12 cells/pEGFPC3; 2: PC12 cells/pEGFPC3WTSNCA; 3: PC12 cells/pEGFPC3A30PSNCA; 4: PC12 cells/pEGFPC3A53TSNCA.
3 讨论
SNCA基因编码人类αsynuclein蛋白， αsynuclein的过表达、 错误修饰与折叠、 原纤维及纤维形成参与了多巴胺能神经元的损伤过程[4]。当前对αsynuclein的生理功能以及病理过程中的作用仍缺乏足够的认识， 为进一步探索人类αsynuclein及其2种致病突变Ala30Pro、 Ala53Thr体在多巴胺能细胞中的致病机制， 构建一个合理高效的细胞模型显得极为重要。PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤[5]， 由于PC12细胞可合成多巴胺（DA）， 并有单胺氧化酶A， 在其细胞膜上有DA受体及多巴胺转运体（DAT）， 具备了与中枢多巴胺能神经原相似的多巴胺合成、 代谢和运输系统， 所以PC12细胞常用作研究中枢多巴胺能神经元的离体细胞模型。为了进一步研究该基因的作用机制， 我们用构建的野生型及致病突变A30P与A53T的SNCA基因的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA转染PC12细胞， 建立稳定表达该基因蛋白及变异蛋白的哺乳动物多巴胺能细胞模型。pEGFPC3是一真核表达载体， 在增强绿色荧光蛋白（EGFP）编码区的C端加多克隆位点， 使插入的基因所表达的蛋白与绿色荧光蛋白融合表达， 在荧光显微镜下可通过观察绿色荧光蛋白的表达而确定目的基因是否表达及蛋白定位等情况。本研究中选用阳离子脂质体介导[6]重组真核表达载体pEGFPC3SNCA转染PC12细胞， 此转染方法方便简单， 具有转染效率高、 无免疫原性、 整合和扩散性小、 容量大等优点， 可使目的基因在靶细胞中高效表达。通过此方法， 成功地将野生型及A30P与A53T致病突变SNCA基因导入了PC12细胞中， 并通过G418筛选， 获得了能稳定表达该野生型及A30P与A53T致病突变SNCA基因的转染克隆。RTPCR、 Western blot均鉴定有SNCA基因的mRNA表达与蛋白表达， 并以荧光显微镜观测到绿色荧光蛋白而看到αsynuclein在PC12细胞中的广泛分布与表达。从而为探讨该基因在多巴胺能细胞中的作用机制作了前期准备。
参考文献
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真核细胞篇6
［目的］ 构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。［方法］ 针对cyclin E基因，设计1对寡核苷酸，形成双链后将其将其插入Psilencer2.1-U6-neo质粒，构建cyclin E shRNA真核表达载体，酶切和测序鉴定。转染MCF-7细胞株，应用western blot检测cyclin E蛋白的表达。［结果］ 酶切和测序结果显示，成功构建特异性针对cyclin E的shRNA 表达质粒。转染MCF-7细胞后下调cyclin E的表达。［结论］ 成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体，为进一步应用RNAi技术进行肿瘤基因治疗的研究提供实验基础。
【关键词】 细胞周期蛋白E 短发卡结构状RNA RNA干扰
Construction and Identification of shRNA Expression Vector Specific for Cyclin E
Abstract: ［Purpose］ To construct the short hairpin RNA （shRNA） expression vector specific for cyclin E. ［Methods］ Oligonucleotides were designed specific for cyclin E gene， after annealing the formed double-stranded DNAs were ligated with Psilencer2.1-U6-neo. The expression vectors of Psilencer2.1-U6/shRNA were identified by enzyme digestion and sequence analysis and transfected into MCF-7 cells. The expression of cyclin E was analyzed by Western blot. ［Results］ The vector was identified by restriction enzyme digestion and sequence analysis， the expression vectors of Psilencer2.1-U6/shRNA was successfully constructed. The expression of MCF-7 cells cyclin E expression level was suppressed after transfection with cyclin E shRNA vector. ［Conclusion］ The Psilencer2.1-U6/shRNA specific for cyclin E is successfully constructed and it will provide experimental basis for cancer gene therapy by RNAi technique.
Key words: cyclin E; short hairpin RNA; RNA interference
肿瘤是一类细胞周期性疾病，细胞生长周期的失调在肿瘤的发生发展中起关键作用。Cyclin E高表达可以缩短G1期，引起中心体过增殖，扰乱有丝分裂，形成不稳定的染色体，从而诱发肿瘤[1]。已有研究提示，cyclin E在白血病、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤等多种肿瘤中过表达[2]，因此，cyclin E有望成为肿瘤基因治疗的新靶点。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是一种能阻断目的基因表达的有效方法[3]。本研究设计了靶向cyclin E的短发卡结构状RNA (short hairpin RNA，shRNA)，利用载体质粒Psilencer2.1-U6-neo构建产生shRNA，为今后将其进一步应用于cyclin E的靶向治疗研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
DMEM培养基、胰蛋白酶、E.coli DH5α、脂质体转染试剂LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT (Invitrogen)、胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，鼠抗人cyclin E多克隆抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG为Santa cruz公司产品、Supersignal West pico Trial Kit为PIERCE公司产品，小量质粒提取试剂盒（中鼎公司）、Psilencer2.1-U6-neo表达载体（Ambion公司），T4 DNA Ligase、BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ（NEB公司），MCF-7细胞株（浙江大学医学院病理教研室惠赠），半干转膜仪（BIO-RAD）。
1.2 实验方法
1.2.1 shRNA表达载体的构建
分别合成编码发夹结构shRNA的正义链和反义链，结构如下：BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalⅠ+HindⅢ，针对cyclin E基因的序列为：P1:5′-GATCCGATTTCTTTGACCGGTATATTCAAG-
ACGTATACCGGTCAAAGAAATCTTTTTTGTCGACA -3′，P2:3′-GCTAAAGAAACTGGCCATATAAGTTCTG-
CATATGGCCAGTTTCTTTAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，对照shRNA的序列为：P1:5′-GATCCGACTT-
CATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCT
TATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3′，P2 :3′GCTG-
AAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCCGTACG-CGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′。
分别取2ml 正反义寡核苷酸(终浓度均为25mmol/L)，16ml退火缓冲液(200mmol/L NaCl，20mmol/L Tris)，94℃水浴5min，然后自然冷却至室温。将退火后的双链siRNA模板与Psilencer2.1-U6-neo质粒表达载体于16℃连接过夜。以连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体。从每个培养皿上各挑取3个单菌落接种于3ml含Ampr抗性（终浓度为50mg/ml）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250r/min）培养过夜。用试剂盒小量提取质粒，并分别用SalⅠ做酶切鉴定。收集酶切鉴定正确的重组质粒，进行DNA测序。
1.2.2 细胞培养及siRNA转染
MCF-7细胞培养体系为含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养。转染24 h前，传代至6孔培养板，每孔2.5×105个细胞。实验分空白组、对照组和siRNA实验组。空白组不经任何处理，对照组转染阴性对照shRNA表达载体1μg，实验组转染shRNA-cyclin E表达载体1μg。用LIPOFECTAMINE 2000脂质体转染试剂进行转染，于37℃、5%CO2 转染48h后，收获细胞。
1.2.3 Western Blot检测cyclin E蛋白表达
收集转染的细胞，加细胞裂解液(1% NP40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，1mmol/L PMSF，100mmol/L Leupeptin，1mmol/L Na3VO4)裂解，10kg×10min离心收集上清液，Bradford法测蛋白含量。取25μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜（BIO-RAD半干转膜，24V、24 min），鼠抗人cyclin E(1∶1 000)，二抗(1∶7 000)，Supersignal West pico Trial Kit显色。同时检测Actin蛋白表达，作为内参照。
2 结 果
2.1 shRNA重组质粒的构建及鉴定
将提取的质粒用SalⅠ做酶切鉴定。经酶切鉴定：质粒Psilence2.1-U6-neo序列里面是没有SalⅠ的酶切位点的，而在我们的插入序列里面设计了SalⅠ的酶切位点，如果插入正确，就应该能够被SalⅠ所酶切；而重组质粒能被SalⅠ酶切，即为插入正确的质粒。测序结果显示，特异性针对cyclin E的 shRNA载体构建成功。见图1、2。
2.2 siRNA转染后cyclin E蛋白表达的变化
shRNA-cyclin E表达载体转染48h后，分别提取转染shRNA-cyclin E和对照shRNA表达载体的细胞总蛋白做western blot分析。与对照组相比，转染shRNA-cyclin E后，cyclin E蛋白表达明显降低。
3 讨 论
RNAi是最近发展起来的一种抑制特定基因表达的新方法，在基因组功能分析领域已经成为强有力的工具，并且随着在哺乳动物细胞内的进一步应用，人们已经开始关注RNAi作为一种基因治疗手段的潜力。多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ启动子下游。与直接导入化学合成的siRNA相比，这种技术由于涉及到克隆，这个过程需要较长时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的，但是操作简便，成本低，而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效率高[6]。另外我们选择的Psilencer2.1-U6-neo真核表达载体带有neo的选择标记，通过G418抗生素筛选，能筛选出表达shRNA的细胞，用于长期的基因功能研究。
Cyclin E是一种细胞周期蛋白，在G1/S期的过渡时期进行积累，调控细胞进入S期，之后被泛肽介导的蛋白酶解途径降解。如果cyclin E的降解途径发生缺陷的话，就会导致细胞进入S期加速，细胞的遗传就会不稳定，以致发生癌变。大量研究表明cyclin E在肿瘤的发生中起到重要作用，也能为大量常见的肿瘤提供预后信息[7，8]，同时cyclin E高表达也是肿瘤耐药的机制之一[9]。本实验以cyclin E为靶标，设计siRNA序列，并构建其表达质粒Psilence2.1-U6表达shRNA-cyclin E，酶切和测序结果显示，特异性针对cyclin E的 shRNA载体构建成功；转染乳腺癌MCF-7细胞后，使cyclin E表达明显下降，成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体，为RNAi在肿瘤cyclin E靶向基因治疗研究，提供了重要实验基础，我们也将进一步利用cyclin E的shRNA载体，进行肿瘤基因治疗的体内外实验。
【参考文献】
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真核细胞篇7
【关键词】 肺癌 基因治疗 单纯疱疹病毒胸苷激酶 (hsv²tk) il²2
0 引言
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，在我国城市人口中，它的病死率居各类恶性肿瘤之首。如何进一步提高治疗效果，降低死亡率一直是人们研究的重要课题。单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因系统(hsv²tk/gcv)以其具有的自杀效应在很多肿瘤的治疗研究中都显示了有效的作用，尤以其独特的“旁观者效应”受到广大研究者的青睐，在针对肺癌方面也有一定的治疗作用[1] 。但是肺癌的发生、发展是一个多步骤、多基因参与的过程，而且不同组织类型肺癌细胞其自身生物学特性也存在很大差异，因而国内外有学者提出单一的基因治疗对肺癌细胞的杀伤作用有限[2²3]，宜采用联合治疗来提高有效性。近些年肿瘤的th1/th2免疫反应状态也是国内外研究的热点之一，有文献报道在肺癌患者体内存在thl/th2细胞因子的平衡失调,发生了th1向th2的异常漂移, 存在il²2等th1细胞因子分泌的不足[4²6]。而且临床上单独应用il²2治疗肺癌及恶性胸水也显示了一定的治疗作用[7]。基于以上的理论和实验基础，联合hsv²tk和il²2的双基因治疗有可能提高单基因治疗的效果。在本实验中，我们构建了含有hsv²tk与il²2双治疗基因的真核表达载体，并初步观察了它在体外对非小细胞肺癌株a549的杀伤效应，为进一步基因治疗研究奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
腺相关病毒载体psnav购自北京本元正阳生物有限公司；psc11tk、pcdnail²2为美国梅尔医学院石长信博士惠赠；pires²eyfp为加拿大多伦多大学温晓燕博士惠赠；肺腺癌细胞系a549细胞，大肠杆菌dh5α为本室保存；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、dna连接酶试剂盒、去磷酸化酶试剂盒均为takara公司（日本）产品；trizol试剂、lipofectamine2000为invitrogen公司（美国）产品；各种限制性内切酶为fermentas公司（美国）产品、taqdna聚合购自赛百胜公司（上海）；逆转录酶、rna酶抑制剂为promega公司产品（美国）；gcv为湖南五洲通制药有限公司产品；elisa试剂盒购自上海西塘(进口分装)，胎牛血清为杭州四季青公司产品。mcs序列、引物序列以及基因测序由上海生工、上海博亚生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 psnav²tk²ires²il2载体的构建 psnav本身cmv启动子后的限制性内切酶位点较少，根据插入片段所需内切酶设计、合成mcs，插入载体中。从其他质粒中剪切需要的片段hsv²tk、ires（其前接有一段增强表达的ivs序列）、il²2并按不同的酶切位点依次插入mcs多克隆位点中，得到最终目的质粒psnav²tk²ires²il2(pmtⅱ)，酶切鉴定正确后送公司测序。在此构建过程中同时可获得只含有hsv²tk片段的对照质粒psnav²tk(pmt)。 目的质粒构建流程如图1所示：
图1 psnav²tk²ires²il2( pmtⅱ)的构建流程（略）
fig 1 construction of psnav²tk²ires²il2( pmtⅱ)
1.2.2 细胞培养及基因瞬时转染 细胞生长于含10％胎牛血清的dmem的培养基中，在37℃、5％co2饱和湿度的温箱中培养。细胞分为三组，每组三孔：（1）a549/pmtⅱ组，转染质粒pmtⅱ；（2）a549/pmt组，转染质粒pmt；（3）a549组,未转染质粒。每个实验重复三次。转染前一天以105细胞接种于24孔板。待细胞生长达到90%融合时，按脂质体lipofectamine2000操作说明书转染质粒。转染时细胞换无血清培养基，dna（μg）与脂质体（μl）按预实验所得最佳比例1∶1混合后转染。6h后，换完全培养基（含10%胎牛血清）继续培养，48h后，进行后续检测试验。
1.2.3 rt²pcr法检测hsv²tk基因与il²2基因mrna的转录 以trizol试剂提取细胞总rna、再逆转录得到cdna，再经过pcr扩增出目的片段。引物序列见表1。pcr反应条件：94℃预变性5min，94℃解链30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，循环30次，72℃总延伸10min，4℃终止反应。取5μl 的pcr产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。用柯达凝胶分析软件分析电泳条带的光密度。
表1 pcr引物序列及扩增片段大小（略）
tab 1 primer sequence of target genes
1.2.4 elisa法检测il²2的分泌 收集上述细胞的培养上清，每孔细胞上清设三个复孔，按照elisa试剂盒的说明书进行检测。
1.2.5 gcv作用后细胞生长状况的测定 将a549细胞按5×103/孔接种于96孔板,分组同上，次日将pmtⅱ和pmt分别转染细胞，转染步骤同上，转染36h后，gcv浓度按照0、1、10、50和100mg/l依次加入细胞中,每个浓度设3个复孔。每天更换加药培养基，并观察细胞的形态学变化。作用120h后，加入5g/l mtt 10μl，37℃作用4h，去上清，加入dmso 150μl，置摇箱中轻摇混匀后于490nm测吸光值。细胞存活率按下式计算：细胞存活率（％）=a实验组/a对照组×100%(以gcv浓度0mg/l为对照组)。
1.3 统计学方法
所有数据均以±s表示，用spss 13.0统计软件包处理，多组间均数比较采用单因素方差分析，均数间的两两比较采用q检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 pmtⅱ 的酶切、测序鉴定
重组质粒酶切片段大小与理论值相一致，测序结果提示与pubmed上所提供的基因序列相同。
2.2 rt²pcr检测hsv²tk基因与il²2基因mrna的转录
结果如图2所示，a549/pmtⅱ组、a549/pmt组, 均可检测到hsv²tk基因的 pcr产物，而a549组无此条带。三组均可检测到il²2的pcr产物。以gapdh为内参，采用半定量rt²pcr方法测定il²2的转录水平变化，结果显示a549/pmtⅱ组转染质粒pmtⅱ 48h后与其他两组相比il²2 mrna水平均升高（p<0.05），其他两组相比差异无统计学意义（p>0.05）。
1: 100bp dna marker; 2: a549组(198bpgapdh and 127bpil²2);3: a549/pmt组(302 bptk,198bpgapdh and 127bpil²2);4: a549/pmtⅱ组(302 bptk,198bpgapdh and 127bpil²2)
图2 hsv²tk与il²2 rt²pcr终产物电泳分析（略）
fig 2 electrophoretic analysis of the hsv²tk and il²2 rt²pcr final products
2.3 elisa法检测各组细胞上清中il²2的分泌
a549/pmtⅱ组il²2分泌量显著高于a549/pmt组和a549组(p<0.05)，后两组相比差异无统计学意义(p>0.05)，见图3。
图3 三组细胞培养上清中il²2水平 （略）
fig 3 the level of secreted il²2 among the three groups
2.4 倒置显微镜下观察自杀基因对细胞的杀伤的形态学变化
倒置显微镜下观察，a549/pmtⅱ组细胞密度随gcv浓度的增高和作用时间增长而逐步减小，gcv 10mg/l以上作用120h的各复孔均见细胞呈不规则形，多角形，甚至变圆，胞膜皱缩，部分细胞脱落悬浮，大量细胞碎片产生，部分细胞核染色质凝集，有调亡小体产生，gcv 100mg/l组作用120h镜下几乎不见梭形存活细胞。a549/pmt组经不同浓度gcv作用后也表现出相同的效应。而gcv作用于a549组则无此效应，见图4。
a：a549；b：a549/pmtⅱ gcv 0 mg/l；c：a549/pmtⅱ gcv 1mg/l；d：a549/pmtⅱ gcv 10mg/l；e：a549/pmtⅱ gcv 50mg/l；f：a549/pmtⅱ gcv 100mg/l
图4 gcv作用120h后对a549/pmtⅱ细胞的杀伤效应 (×100) （略）
fig 4 cytotoxicity of gcv on a549/pmtⅱ for 120h(×100)
2.5 mtt测定细胞的存活率
随着gcv剂量加大，a549/pmtⅱ、a549/pmt存活率呈逐渐下降趋势，具有一定的剂量依赖效应。作为对照的野生型a549剂量达到10mg/l仍然没有明显的影响，此剂量时hsv²tk阳性细胞的抑制率已经达到了66％(a549/pmt)、68％(a549/pmtⅱ)。在野生型a549细胞中，浓度为100mg/l时才表现出对细胞的抑制效应，见图5。
图5 gcv作用120h后三组细胞的存活率（略）
fig 5 the survival rate of cells treated by gcv for 120 h
3 讨论
hsv²tk/gcv自杀基因系统目前已经用于多种肿瘤的治疗研究。但单独应用hsv²tk/gcv系统尚存在不足，如仅针对分裂期细胞，杀伤效应有限，缺乏靶向性，肿瘤内部用药对远处转移肿瘤无效等。il²2通过激活机体的免疫系统不仅能杀伤肿瘤细胞提高治疗效果，而且还通过增强免疫细胞对肿瘤抗原的提呈能力对远处转移肿瘤细胞达到杀灭作用，同时可以以负反馈的方式杀灭携带有目的基因的肿瘤细胞而调节基因的表达水平，从而限制自杀基因对周围正常细胞的杀伤作用以及过度炎症反应的发生等。hsv²tk和il²2在杀瘤作用方面存在一定的互补性，因而成为基因联合治疗的新研究热点之一。国内外各学者已经对某些类型的肿瘤进行了其联合治疗的研究，如甲状腺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等[8²10]。barzon等 [8]构建含hsv²tk和il²2两种基因的重组逆转录病毒载体,用于甲状腺癌细胞株及裸鼠移植瘤模型。结果显示：对于分化甲癌联用双基因与单用il²2相比瘤体可减小80％，而对间变性甲状腺肿瘤，瘤体可达到完全消除；而且他们在此基础上对两例晚期甲癌患者进行了临床治疗研究[9]，在试验中可观察到患者外周血th1细胞因子表达的增加以及肿瘤实体中坏死灶的形成。但国内外尚未有两者联合共表达治疗肺癌的报道，因而本试验针对肺癌展开研究。
实验中，我们首先构建了pmtⅱ质粒。该真核表达质粒携带有hsv²tk基因和人il²2cdna，它们通过ires联接，因而可以在一个转录单位内共转录，从而实现双基因干预的目的。通过经酶切、dna测序鉴定证实pmtⅱ质粒序列正确。将质粒转染细胞，进一步通过rt²pcr对细胞内hsv²tk与il²2 的mrna进行检测，证实了pmtⅱ真核表达载体构建成功。
为了验证载体的功能，我们进行了进一步的实验。本研究中，目的质粒转染a549细胞后，可以看到在细胞的生长抑制试验中，gcv对转染有hsv²tk基因的两组a549细胞均有明显的生长抑制作用，而且呈一定的浓度依赖效应，而未转染基因的细胞，只有gcv浓度达到100mg/l时才表现出对细胞生长的抑制。hsv²tk/gcv自杀基因系统旁观者效应的发挥需要细胞间的连接。在光镜观察中可以看到gcv浓度在50mg/l、100mg/l作用120h时，细胞数大量减少，细胞间连接也随之大面积减少，与此相对应，我们在mtt试验中，观察到在gcv浓度大于10mg/l时，此系统对细胞的生长抑制趋势明显减缓，可见旁观者效应可能是hsv²tk/gcv系统发挥自杀作用的主要途径。在光镜观察过程中，不同浓度的gcv作用72h时，各组细胞间并没有出现肉眼可见的明显差异，这可能与hsv²tk/gcv系统对细胞的生长抑制作用需要较长的时间才能显现有关[10]。
本实验用elisa法对质粒转染后的细胞上清中il²2的水平进行了检测，结果发现3组细胞均能检测出有il²2的表达，但转染pmtⅱ质粒组显著高于另两组，提示pmtⅱ质粒能表达il²2，说明双表达载体构建是成功的。对il²2蛋白抗瘤效应的观察须在在体实验中进行，本实验尚未开展。
综上所述，本实验成功构建并验证了pmtⅱ双表达质粒，并初步观察了hsv²tk/gcv系统在体外对肺癌细胞株的杀伤作用，为进一步在动物机体内研究hsv²tk/gcv联合il²2基因治疗肺癌，以及应用腺相关病毒载体进行肺癌的基因治疗奠定了实验基础。
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真核细胞篇8
Construction of Eukaryotic Expression Vector Containing E.coli Purine Nucleoside Phosphorylase and Its Expression in MKN45 Cells
Abstract：Objective To clone E.coli PNP gene， construct its eukaryotic expression vector and obtain positive MKN45 cell clones expressing E.coli PNP gene stably. Methods PCR amplification was performed using primers based on E.coli PNP gene sequence from Genbank， E.coli genomic DNA as template .PCR product was inserted into pMD18T.After the sequencing was confirmed， the gene was subcloned to pcDNA3.1 to construct recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1EPNP.The recombinant plasmid was transfected into MKN45 cells by lipofectamin method. Results PCR yielded a fragment of 716bp and EPNP was verified by sequence analysis. Enzyme digestion analysis showed that the target gene was sub cloned into recombinant vector. Resistant clones MKN45 expressed high amounts of EPNP mRNA and showed a strong sensitivity to MePdR. Conclusion The eukaryotic expression plasmid containing E.coli PNP gene was successfully constructed. The positive MKN45 cell clones expressing E.coli PNP gene stably were obtained， which has laid a solid ground for further study of gastric cancer gene therapy with PNP/MepdR suicide gene system.
Key words：E.coli purine nucleoside phosphorylase; Suicide gene; Gene therapy
摘要：目的 克隆大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因并构建真核表达载体pcDNA3.1EPNP，将重组质粒转染MKN45细胞获得高表达大肠杆菌PNP基因的MKN45细胞克隆。方法 根据Genbank 中大肠杆菌PNP 基因的核苷酸序列，设计并合成了一对引物，以大肠杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并将扩增产物定向插入pMD18T克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pcDNA3.1，利用脂质体将重组质粒转染MKN45细胞。结果 PCR扩增出716bp 大小的片段，测序结果与已报道的EPNP基因序列一致；亚克隆经酶切鉴定正确； RTPCR证明经G418筛选得到的转基因MKN45细胞克隆中存在大量EPNP mRNA，前体药MePdR对转染EPNP的MKN45细胞有较强的细胞毒作用。结论 成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体， 获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN45细胞克隆，为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。
关键词：大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶;自杀基因；基因治疗
0 引言
随着现代生物技术的发展， 基因治疗已成为继肿瘤的手术治疗和放疗、化疗后的又一新途径。特别是自杀基因治疗为目前国内外研究的热点之一。大肠杆菌DeoD基因编码的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）能将无毒的前体药脱氧腺苷类似物分解产生剧毒的腺嘌呤类似物， 通过抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，而引起细胞死亡。同时它能够通过产生极强的旁观者效应，不仅使转基因细胞被杀死，而且大量未转基因的细胞亦被杀死[1，2]。本文对大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因进行分子克隆并构建到pcDNA3.1真核表达载体中， 并获得稳定表达EPNP基因的MKN45细胞克隆，为今后进一步研究自杀基因在胃癌基因治疗中的应用创造条件。
1 材料和方法
1.1 载体与菌株 大肠杆菌JM109和真核表达载体pcDNA3.1均购自Invitrogen公司。克隆载体pMD18T购自大连宝生物公司。
1.2 主要试剂 限制性内切酶Bam HI 和Hind III、T4DNA链接酶和TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker均购自大连宝生物公司；凝胶DNA提取Kit和PCR产物纯化Kit购自Promega公司；LipofectaminTM Reagent、Geneticin(G418 Sulfate) 及MePdR为Invitrogen公司产品；IPTG和Xgal购自上海生物工程公司。实验所用试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.3 目的基因的克隆 ①引物设计: 根据GenBank数据库提供的EPNP基因的核苷酸序列设计一对引物。为方便克隆，在上游引物和下游引物的5′端分别引入Hind III 和Bam HI 酶切位点。上游引物：5’ –ATCATAAGCTTATGGCTACCCCACACATTAATG3’下游引物：5ATATGGATCCTTACTCTTTATCGCCCAG3’②模板提取: 大肠杆菌JM109基因组DNA的提取，按文献[3]方法进行。③PCR: 94℃变性5min进入循环，94℃，60秒，56℃，60秒，72℃，120秒，经30个循环扩增后72℃延伸10min。取10μl PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。PCR产物的回收按PCR产物纯化Kit上的说明进行。回收产物保存于20℃备用。
1.4 PCR产物的克隆及测序 TA克隆载体pMD18T与胶回收纯化的PCR产物按1∶3(摩尔比)的比例在T4DNA连接酶作用下进行连接， 16℃反应16h。取10μl连接反应液转化JM109感受态细菌，将转化的菌液涂在Xgal 处理过的含有氨苄青霉素的LB平板上培养12h，在长出蓝、白克隆的LB平板上挑取白色克隆进行少量扩增、质粒小提， 用酶切初步鉴定阳性细菌克隆， 将酶切鉴定正确的细菌克隆送交大连宝生物公司测序。
1.5 真核表达载体pcDNA3.1EPNP的构建和鉴定 测序正确的质粒pMD18T用限制酶Hind III和Bam HI进行双酶切反应， 纯化回收约716bp大小的目的片段; 质粒pcDNA3.1也进行Hind III和Bam HI双酶切，纯化回收大片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和线性化的空质粒pcDNA3.1， 16℃反应16h。转化感受态细菌JM109，将转化的菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上培养12h，挑取6个阳性克隆进行少量扩增、质粒小抽，以Hind III和BamHI双酶切鉴定阳性细菌克隆。
1.6 真核表达载体pcDNA3.1EPNP的转染 将重组质粒pcDNA3.1EPNP转化的感受态细菌JM109及以空载体pcDNA3.1转化的菌株，在LB培养基中于37℃培养18h，按照质粒提取说明分别提取pcDNA3.1EPNP和pcDNA3.1，经紫外分光光度仪测定A260nm定量。按照LipofectaminTM Reagent脂质体转染说明转染胃癌细胞MKN45。
1.7 RTPCR 鉴定EPNP基因在MKN45细胞中的稳定表达 待具有G418抗性的MKN45细胞克隆长满6孔板时，抽提转染pcDNA3.1EPNP细胞(MKN45/pcDNA3.1EPNP)和转染空载体pcDNA3.1细胞(MKN45/pcDNA3.1)总RNA， 进行RTPCR反应， 鉴定EPNP和内参照GAPDH mRNA的表达。
1.8 MTT法检测MePdR对转染ECPNP细胞的细胞毒作用 转染pcDNA3.1EPNP细胞、转染空载体pcDNA3.1细胞和亲本细胞以1×104/孔接种于96孔板，24h后加入不同浓度的MePdR使终浓度分别为107、2.5×107、5×107、106、105mol/L，以不加药的未转染细胞作对照。每实验组设3个复孔，培养72h后加入MTT 20μl(5μg/ml)，4h后弃上清加入DMSO溶解，震荡10min后，酶标仪测490nm处吸光度（A）值，进而按下式计算各组细胞存活率：存活率=实验组A值/对照组A值×100%
2 结果
2.1 目的基因克隆及测序
以大肠杆菌基因组DNA为模板经PCR扩增出一条约716bp的特异条带，将纯化的PCR产物克隆于载体pMD18T中，转化JM109感受态细菌。蓝白筛选，随机挑取6个白色菌落提取质粒，用Hind III和BamHI双酶切后，释放出716bp左右的片段，见图1。测序结果经与Genbank中登录的序列相比较，序列完全正确 (本文资料未列出)，说明已成功扩增了大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的DNA序列。
图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
M：DNA Marker (DL2000); 1:pMD18T载体和EPNP基因; 2: PCR 产物
2.2 重组表达载体pcDNA3.1EPNP的构建和酶切鉴定
重组质粒用限制酶Hind III和BamHI双酶切，电泳结果显示约716bp处有一特异条带，证明目的基因已正确插入质粒pcDNA3.1，得到了真核表达载体pcDNA3.1ECPNP，见图2。
图2 重组质粒HindIII 和BamHI 双酶切鉴（略）
M：DNA Marker (DL2000); 1:pcDNA3.1; 2: EPNP基因; 3: 重组质粒pcDNA3.1EPNP双酶切
2.3 RTPCR鉴定EPNP基因在MKN45细胞中的稳定表达
重组质粒pcDNA3.1EPNP转染后经G418(500μg/ml)筛选得到G418抗性细胞克隆，抽提细胞总RNA行逆转录反应， 采用特异性扩增EPNP基因的上、下游引物进行PCR反应，得到了EPNP基因的目的条带(716bp)，提示G418抗性细胞克隆中存在ECPNP基因。空质粒pcDNA3.1转染后获得的G418抗性细胞克隆经RTPCR后无特异性条带生成，见图3。
图3 RTPCR 鉴定pcDNA3.1ECPNP转染细胞情况（略）
1: MKN45/pcDNA3.1; 2、3: MKN45/pcDNA3.1EPNP ; M: DNA Marker (DL2000)
2.4 MePdR对转染EPNP细胞的杀伤作用
用不同浓度的MePdR处理转染细胞和未转染细胞，MTT法检测细胞存活率。处理72h后，许多转染pcDNA3.1/EPNP细胞脱离了培养皿并且出现“收缩”现象，同时转染空载体pcDNA3.1细胞和未转染细胞仍然吸附在培养皿上未出现任何明显的细胞毒迹象，各种细胞存活率，见表4。很明显，MePdR并没有影响亲本细胞和转染空载体细胞的存活率，相反，MePdR对转染pcDNA3.1EPNP细胞有明显的细胞毒作用。
表4 不同终浓度的MePdR(0～105mol/L)（略）
3 结论
目前常用的自杀基因体系如:HSVTK体系和CD体系只能抑制DNA的复制，只能杀伤处于分裂期的肿瘤细胞，而在实体肿瘤中只有一部分肿瘤细胞处于分裂期，故对此类肿瘤，其杀伤力受到一定限制[4，5]。而经大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)催化分解药物前体6甲基嘌呤脱氧核糖核苷(MePdR)产生的MeP不但可以抑制DNA的合成，而且可以抑制RNA和蛋白质的合成，从多个环节杀伤肿瘤细胞，不但可以杀伤处于分裂期的瘤细胞，而且可以杀伤静止的瘤细胞，具有强大的杀伤力。另外，MeP可以穿过脂质膜， 不需依赖细胞连接即可到达邻近细胞，将其杀伤，旁观者效应明显[6，7]。一个自杀基因体系的旁观者效应越强，其疗效就越好。HSVTK体系的毒性产物为磷酸化物。不能透过脂质膜，只能通过细胞连接进入紧邻细胞，故其旁观者效应必须依赖细胞连接[8]。
本实验中构建的重组质粒限制性内切酶酶切图谱与预期结果相符，获得了约716bp大小的目的条带。目的基因测序结果与Genbank中登录的序列一致。因此，本实验中克隆的EPNP DNA序列是完全正确的。我们在实验中采用特异性扩增EPNP基因的上、下游引物，通过RTPCT反应鉴定EPNP基因在转基因MKN45细胞中的表达，证实了具有G418抗性的转染重组质粒pcDNA3.1EPNP的MKN45细胞克隆中有EPNP基因的mRNA水平的表达;同时， 用MTT法检测前体药MePdR对EPNP高表达细胞的杀伤作用，发现前体药MePdR对转染EPNP的MKN45细胞有较强的细胞毒作用。说明EPNP确实是药物敏感基因即自杀基因，也证明了这些细胞中有EPNP基因活性蛋白的表达。本实验中我们成功获得了稳定转染EPNP基因的MKN45细胞克隆， 为进一步研究PNP的生物学功能以及在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。
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真核细胞篇9
【关键词】 肺鳞癌;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白;真核细胞翻译启动因子4E;免疫组化
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是近年来发现的一种进化上高度保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是一种信号蛋白。最新研究指出信号通路处于生长调节的中心环节，参与多种病理和生理过程，在细胞的生长、分化、增殖、迁移和存活上扮演了重要角色。真核细胞翻译启动因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)是mTOR信号通路的下游位点，是真核细胞mRNA翻译的最有效的限速调节因子，在蛋白质合成的起始阶段起重要的调控作用〔1，2〕。本实验主要研究mTOR和eIF4E在肺鳞癌中的表达及二者与临床病理参数的关系，并研究二者之间的相关性，以探讨其在肺鳞癌发生发展中的作用，寻找可能的肺鳞癌治疗的有效新途径。
1 材料与方法
1.1 标本 选取郑州大学第一附属医院胸外科2008年2月至2009年2月经手术切除的有完整资料的肺鳞癌80例，每例均取癌灶、淋巴结，选取癌旁及正常肺组织各10例做为对照组。80例肺鳞癌中男性64例，女性16例，年龄36～74岁，平均年龄(61±4.5)岁。按2002版UICC pTNM分期〔3〕，Ⅰ期21例，Ⅱ期46例，Ⅲ期13例。有淋巴结转移65例，其中多于2个淋巴结转移的53例。肿块直径
1.2 实验试剂 兔抗人单克隆抗体mTOR和eIF4E均购自美国signalway antibodys公司，SP通用型免疫组化试剂盒购于北京博奥森生物技术公司。DAB显示增强剂购于北京中杉生物技术公司。
1.3 实验方法 采用免疫组化SP法，免疫组化染色按试剂盒操作说明进行，兔抗人单克隆抗体mTOR和eIF4E稀释浓度均为1∶100。以PBS液代替一抗做阴性对照，以已知肿瘤标志物做阳性对照，同时采用组内对照。
1.4 结果判定 mTOR和eIF4E定位于细胞质，部分位于细胞膜，阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色。采用二级积分法，阳性细胞计数：根据阳性细胞所占5个以上高倍显微镜视野比例计数，50%为3分。染色强度分类：淡黄色为1分，黄或深黄色为2分，棕色或棕褐色为3分。二者计分相乘大于1分为阳性。采用双盲法由两位病理科医师计分。
1.5 统计学分析 应用SPSS15.0版本统计学软件对结果进行χ2检验及Fisher精确检验和Spearman相关分析。
2 结 果
2.1 不同组织中mTOR和eIF4E的表达 肺鳞癌中mTOR和eIF4E呈弥漫性或散在分布的棕黄色颗粒表达于细胞质，mTOR和eIF4E的表达率分别是52.5%和75%，均明显高于对照组(P
2.2 mTOR和eIF4E在肺鳞癌中的表达与临床病理参数之间的关系 肺鳞癌组织中mTOR和eIF4E 的表达与肿瘤的病理分化程度、肿瘤大小、有无淋巴结转移明显相关(P
2.3 mTOR和eIF4E的相关性检验 Spearman相关性检验显示肺鳞癌中mTOR阳性42例，eIF4E阳性60例，二者双阳性表达38例，双阴性表达16例，二者表达呈显著正相关(r=0.376，P=0.001)。表2 mTOR和eIF4E 在肺鳞癌中的表达与临床病理参数之间的关系与Ⅰ期比较：1)P
3 讨 论
世界卫生组织报告肺癌和艾滋病将是21世纪危害人类健康最严重的两种疾病。肺鳞癌占肺癌发病率的50%～70%，在治疗上采用以手术为主综合治疗，但术后5年生存率20%～50%。随着对肿瘤发生分子生物学特性的深入了解，针对肿瘤发展特异性的生物环节的近分子靶向治疗逐渐被人们所重视。近年来的研究显示，mTOR/eIF4EBP1/elF4E信号通路处于生长调节的中心环节，参与多种病理和生理过程，在细胞的生长、分化、增殖、迁移和存活上扮演了重要角色，有可能成为新的靶向治疗位点〔3，4〕。
mTOR是一种进化上高度保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷酸肌醇激酶(phosphatidylinositol kinaserelated protein kinase，PIKK)家族，分子量289 kD，含2 549个氨基酸。受上游刺激因子如生长因子、胰岛素、营养因子、压力等激活后的mTOR引起其下游真核细胞启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)的磷酸化，导致4EBP1从mRNA的5′cap的eIF4E释放出来，此时eIF4E可与eIF4G，eIF4B，eIF4A结合为eIF4F。由于eIF4E的表达增高，可导致细胞周期蛋白D1、Rb蛋白、低氧诱导因子1(HIF1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、鸟氨酸脱羧酶等这一类mRNA 5′端非翻译区调控因子的活性升高，促使mRNA的翻译增强，使细胞由G1期向S期转换，调控细胞生长和代谢〔5～10〕。
本实验通过免疫组化检测mTOR及eIF4E在肺鳞癌、癌旁组织及正常肺组织的表达。结果显示mTOR及eIF4E在肺鳞癌组织中的表达明显高于癌旁及正常肺组织，说明肺鳞癌中存在异常活化的mTOR及eIF4E，间接说明了mTOR及eIF4E在肺鳞癌的发生、发展中起到一定作用。进一步研究显示mTOR及eIF4E的表达与肿瘤临床分期、分化及肿块大小相关。mTOR和eIF4E在肺鳞癌Ⅰ的表达明显高于Ⅲa期，且二者在直径≥5 cm肿块中的表达明显低于
进一步的研究也显示mTOR和eIF4E的表达呈高度正相关，正是mTOR的异常激活才导致其下游底物4EBP1磷酸化失活，从而释放其结合的eIF4E，促进帽结构依赖性翻译起始从而使细胞中蛋白合成加快，加速细胞生长和恶化;同时elF4E的表达明显高于mTOR，提示eIF4E有其他的激活途径〔14～16〕。
综上所述，mTOR和eIF4E在肺鳞癌的发生、发展中可能起到重要作用，这也为能够找到阻断此通路的特异性靶向治疗药物提供一定的理论依据。
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真核细胞篇10
一、细胞结构中有关的特例：
（一）线粒体：
1.线粒体与真核细胞
有线粒体的细胞是真核细胞，没有线粒体的细胞不一定都是原核细胞，如蛔虫是真核生物，由于长期适应无氧的环境而无线粒体，从而只能进行无氧呼吸。
2.线粒体与有氧呼吸
有线粒体的细胞可以进行有氧呼吸，进行有氧呼吸的细胞不一定有线粒体，例如硝化细菌、圆褐固氮菌等原核生物虽无线粒体，但其细胞膜上分布有与有氧呼吸有关的酶，能进行有氧呼吸。
(二) 叶绿体：
1.有叶绿体的细胞是植物细胞，没有叶绿体的细胞不一定是动物细胞，如植物的根细胞、杂草菟丝子的细胞等。
2.有叶绿体的细胞能进行光合作用，进行光合作用的细胞不一定有叶绿体，例如绿硫细菌、紫硫细菌、红螺菌、蓝藻等光合细菌。
(三)液泡：
1.有大液泡的细胞是植物细胞，没有大液泡的细胞不一定是动物细胞，未成熟的植物细胞也没有大液泡，如茎尖分生区细胞。
2.具有大液泡的植物细胞可以发生质壁分离，能发生质壁分离的细胞不一定是具有大液泡的植物细胞，只要是活的植物细胞都会发生质壁分离现象，其次某些微生物，如细菌、放线菌、真菌等其细胞结构也有细胞壁，甚至有液泡如酵母菌，因此这些微生物处于高渗溶液中也会发生质壁分离现象。
(四) 细胞壁：
植物细胞有细胞壁，有细胞壁的细胞还有原核生物，如蓝藻、细菌、放线菌等，同时有一些特殊的原核细胞没有细胞壁，例如支原体。
(五) 中心体：
动物细胞有中心体，有中心体的细胞不一定是动物细胞，也可能是低等植物细胞；但没有中心体的真核细胞是高等植物细胞。
(六) 细胞核：
原核细胞无成形的细胞核，真核细胞也不一定有核，如哺乳动物成熟的红细胞。
二、生态系统中有关的特例：
1.植物
一般而言植物是生产者但也有一些不是，如菟丝子是一种寄生性植物，不能进行光合作用，是消费者。还有少数植物是分解者，如水晶兰。
2.动物
大多数动物是消费者，但也有一些动物如秃鹫、蚯蚓、蜣螂等是分解者。
3.微生物
微生物大多数种类是分解者，如：圆褐固氮菌、反硝化细菌、酵母菌，霉菌等。而有一些微生物却是消费者，如根瘤菌；也有些微生物是生产者，如：硝化细菌、硫细菌、铁细菌等。
三、细胞生命中有关的特例：
1.在细胞质遗传中子代性状与母本相同，但与母本性状相同的遗传不一定是母系遗传，它可以是细胞核遗传中的子代表现出显性母本的性状。母系遗传后生性状分离，但没有一定的分离比，如花斑紫茉莉的母系遗传。
2.有丝分裂细胞中通常有同源染色体，但雄蜂是由卵细胞经有丝分裂形成，该细胞内就无同源染色体，凡二倍体生物的单倍体细胞进行有丝分裂时均无同源染色体。
3.真核生物进行有丝分裂可以形成纺锤体，但蛙的红细胞却进行无丝分裂，不形成纺锤体。
4.突变是不定向的，但生物工程可以对生物进行定向改造，如基因工程、细胞工程等。
5.先天性疾病不一定是遗传病，如先天性心脏病；遗传病不一定是先天性的，如青少年型糖尿病。
6.同源染色体是配对的两条染色体，形状和大小一般相同，一条来自父方，一条来自母方。但X、Y这一对特殊的同源染色体大小形态就不相同。
7.含一个染色体组的生物是单倍体，单倍体不一定只含一个染色体组，如棉花的单倍体体细胞含有两个染色体组，普通小麦的单倍体体细胞含三个染色体组。是不是单倍体不能只看含几个染色体组，关键看它是否由本物种的配子发育而来，凡有配子直接发育而来不管含几个染色体组，都是单倍体。
四、生物代谢中有关的特例：
1.神经递质传递的结果不一定都引起突触后神经元的兴奋，某些引起的是抑制。
2.自生与自养：自生的生物不一定自养，如圆褐固氮菌等自生但异养；自养的生物也不一定自生，如地衣中的藻类是与真菌共生。
五、生物生殖中有关的特例：
1.植物组织培养与无性生殖
植物组织培养一般是无性生殖，如根尖、茎尖等体细胞的培养，若培养的是花粉则是有性生殖，植物组织培养属于什么生殖方式应根据所培养的材料确定。
2.生殖细胞与性别的关系
生殖细胞不一定都与性别有关系，如真菌和一些植物产生的一些生殖细胞――孢子，就是无性的生殖细胞；不是所有的生殖细胞都经过减数分裂，例如真菌和一些植物，能够产生一些无性的生殖细胞――孢子。
六、名字干扰有关的特例：
