细胞免疫十篇
时间：2023-04-05 13:31:41
细胞免疫篇1
假如把岳武穆《满江红》词中的这一句用来写照今天的抗癌战场,那是再恰当不过!
千千万万的科学家和医生们,多么希望在传统的手术、放射、化疗三大治癌方法的基础上,找寻出新的有效方法,驾长车、破险关,直捣癌症的巢穴。
于是,有了今天的抗癌细胞免疫战!
神奇细胞
1985年,美国,国立癌症研究所的罗森伯格教授向世界宣布:采用转移性细胞免疫疗法,可治愈10%的晚期恶性黑素瘤和10%的晚期肾癌病人。
佛罗里达一名29岁的护士,患恶性黑素瘤已届晚期。可恶的瘤细胞在全身到处乱跑,手术刀切除了一部分,瘤细胞又在它处长出来。采用转移性细胞免疫疗法三个月,癌瘤全部消失。五年后的今天,这位护士仍健康如常人。
要弄清罗森伯格疗法的道理也并非难事。在我们身体的血液循环里,存在着一类肩负重任的细胞――淋巴细胞,它们是身体卫士,能抵御外来的细菌,破坏体内衰老的细胞,还能围攻癌细胞。可惜,在癌症病人,这类细胞变得懒洋洋、死气沉沉。罗森伯格疗法的关键之处,就是要重新“武装”这类细胞,并扩编队伍,使它们变得更富有战斗力。
要使这类细胞活跃起来,需借助另外一类淋巴细胞产生的一种物质――白细胞介素2。白细胞介素2原来的名字称为T细胞生长因子,顾名思义,它就是能使T淋巴细胞生长的物质。
罗森伯格教授的方法,就是抽取病人部分血液,经过仪器分离出淋巴细胞,再和白细胞介素2放在一起培养。经过一个多月后,淋巴细胞重新充满活力,同时又分裂出更多的淋巴细胞,形成一支抗癌军团。此时,把500亿个生力军重新输回到病人身上,它们便向体内的癌细胞发起攻击。
这些细胞,现在的名字就叫做LAK细胞,它的意思是:被淋巴激活素活化的杀伤细胞。
扶正祛邪
转移性细胞疗法,从细胞水平上体现了扶正祛邪的精髓。正者,机体内的卫士淋巴细胞;邪者,作恶多端的癌细胞。LAK细胞,只是取自血液循环中游弋的卫士,它们的战斗力,还不十分强大。那么,是否还有更具杀伤力的细胞呢?
很早就有人发现,假如癌组织中存在有较多的淋巴细胞,病人的预后会相对好一点。从这一意义上看,浸润在癌组织中的淋巴细胞,是否已经意识到大敌当前,正在奋起作战呢?让我们先看看这样的一个实验:
切下一块癌组织,再利用神通广大的酶把癌组织的细胞一一分开。当然,这里面既有癌细胞,也有正常的淋巴细胞。然后,再加上白细胞介素2。你猜猜,出现了什么结果?
30～45天后,培养物里所有的癌细胞均被杀死,只剩下大量繁殖的淋巴细胞。这些细胞,科学家命名为“肿瘤浸润性淋巴细胞”,简称TIL。
经过上述步骤之后,可把2000亿个TIL细胞和白细胞介素2一起注入患者体内。这样,便为身体增加了一支强大的抗癌生力军。罗森伯格教授用这种方法治疗20名晚期黑素瘤病人,有11位的肿瘤至少消退了50%。在生已无望的病人中取得这样可观的成就,这是多么令人振奋的消息。
难怪近数年,在世界范围内掀起一阵阵用LAK细胞或TIL细胞治癌的热潮。但我们也应看到,目前这些方法对黑素瘤、肾癌和恶性胸、腹水有较好的效果,对其他的实体肿瘤的疗效,则仍在摸索之中。
因子大战
细心的读者或许会注意到:转移性细胞免疫疗法中,有一个举足轻重的角色――白细胞介素2。这白细胞介素2是什么东西?既然有2,是否有1,有3呢?
有的。白细胞介素这一家族,现在发现的已有七种以上,它们的本质,就是由各种免疫细胞产生的一类糖蛋白。这一家族主要的七兄弟各有各的职责,它们分工明确而又互相配合,在我们自身的抗癌战场上,扮演着重要角色。
现在,这类物质有了一个更为科学的名称:细胞激活素。意思就是:这类物质能影响细胞的活性,或使细胞繁殖与分化。打个比方,一株植物,因缺水缺肥而渐枯萎,给它添肥加水,植物又生机勃勃,不断长出新芽,开花结果。这细胞激活素,就是这肥、这水。
细胞激活素中,还包括了我们熟悉的干扰素,干扰素能抗病毒,对血液淋巴系统方面的肿瘤也有一定效果。但对肺癌、乳腺癌等实体肿瘤,效果则欠佳。
近年来热门的还有所谓的肿瘤坏死因子,它能选择性地攻击癌细胞而不损伤正常细胞,因而受到重视。
凡此种种,我们不是可以看到抗癌战场正在出现一场因子大战吗?
基因疗法
既然细胞激活素具有抗癌作用,我们何不大量生产并加以使用呢?种种原因限制了这一良好的愿望。
原因之一,是这类因子具有很强的毒性,在人体上大剂量使用,会引起严重的副作用。譬如,细胞坏死因子,人体就无法耐受注射足够的有效剂量,故只能在体表的肿瘤上应用。
假如我们能在体内的癌灶上建立一座“工厂”,就地源源不断地生产这些重型武器,那么,岂不是既能抗癌又不致产生太严重的副作用吗?这并非天方夜谭式的美梦,而是在实验中已获成功的现实。
在人体内,要产生什么样的蛋白质,由细胞中的基因所决定。细胞激活素是糖蛋白,它们的产生,当然也由细胞中的基因决定。
把决定生产肿瘤坏死因子或白细胞介素2的基因,插入到上文中我们提到的“肿瘤浸润性淋巴细胞”即TIL中,这些细胞只是在体内的癌灶中聚集,之后便在那里生产肿瘤坏死因子或白细胞介素2了。这样,我们便实现了梦想,在癌灶中建立了一座生产重型武器的工厂。
细胞免疫篇2
英文名称：Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology
主管单位：中国免疫学会；第四军医大学
主办单位：中国免疫学会；第四军医大学
出版周期：月刊
出版地址：陕西省西安市
语
种：中文
开
本：大16开
国际刊号：1007-8738
国内刊号：61-1304/R
邮发代号：52-184
发行范围：国内外统一发行
创刊时间：1985
期刊收录：
CA 化学文摘(美)(2009)
CBST 科学技术文献速报(日)(2009)
中国科学引文数据库(CSCD―2008)
核心期刊：
中文核心期刊(2008)
中文核心期刊(2004)
中文核心期刊(2000)
中文核心期刊(1992)
期刊荣誉：
Caj-cd规范获奖期刊
联系方式
细胞免疫篇3
【关键词】 细胞块；免疫细胞化学；胸腹水；肿瘤细胞
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.19.009
Research and analysis of cell mass immunocytochemistry in 65 hydrothorax and ascite cases LIU De-mei. Department of Pathology， Shandong Weifang City People’s Hospital， Weifang 261041， China
【Abstract】 Objective To investigate clinical significance of cell mass immunocytochemistry in improving positive rate of tumor cell， identifying benign and malignant cells， determining tumor cell source in hydrothorax and ascite cytological diagnosis. Methods A retrospective analysis along with related clinical data was made on hydrothorax and ascite smear， cell mass， and immunocytochemical diagnosis in 65 cases. Results Among 65 hydrothorax and ascite cases， 3 cases of them had very few tumor cells with negative cell mass. The other 62 cases had totally corresponding smear and detection results. There were 13 cases without tumor cell or suspected cell in benign smear and cell mass， with negative report. There were 49 cases had accurate results for suspected positive smear and malignant cell source by immunocytochemistry. Conclusion Cell mass immunocytochemistry provides good application value for identification of benign and malignant cell and tissue source， and it is worthy of promotion. Its positive rate is lower than normal smear in improvement， and their combination can improve accuracy of diagnosis. Combined clinical data and cellular morphology are necessary for cell mass and immunocytochemistry. It is necessary for rational choice and application.
【Key words】 Cell mass； Immunocytochemistry； Hydrothorax and ascite； Tumor cell
近年来， 随着恶性肿瘤的发病率逐年升高并有年轻化的趋势， 肿瘤的早期发现、诊断和治疗已成为医疗界的重点和难点课题[1]。特别对于浆膜腔积液是唯一体征的就诊患者， 其细胞学检查则显得极为重要。因很多恶性肿瘤常仅表现为体腔积液而原发部位隐匿[2]， 而单靠细胞形态很难明确肿瘤细胞来源和肿瘤细胞类型， 因此免疫细胞化学的检测对鉴别诊断非常有价值[3， 4]。近年来， 随着细胞块及免疫学检测技术的发展和完善、抗原的纯化和抗体制备技术的提高， 免疫细胞化学技术已成为辅助细胞病理学诊断的重要方法[5]。本文收集了本院65例胸腹水标本， 进行普通涂片、细胞块及免疫细胞化学检测分析， 旨在探讨细胞块免疫细胞化学在胸腹水肿瘤细胞学诊断中对于提高肿瘤细胞阳性率、鉴别细胞良恶性、确定恶性细胞来源的临床意义， 现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 标本来源 65例送检标本包括胸水47例， 腹水18例， 所有标本均来自本院2014年1～7月住院及门诊患者， 其中男36例， 年龄32～80岁， 平均年龄61.6岁；女29例， 年龄29～81岁， 平均60.1岁。65例中37例具有恶性肿瘤病史， 28例以胸腹水为首发症状， 表现为胸闷、纳差、腹胀、肺不张、肺炎、胃溃疡、冠心病、电解质紊乱等， B超或CT检查显示胸腹腔积液。
1. 2 标本处理 将临床送检的胸腹水标本置于50 ml离心管内， 2000 r/min离心10 min， 弃取上清液， 取离心后沉淀物或中间层的白膜（有核细胞层）涂片2张， 95%酒精固定、HE染色；剩余标本（如果细胞量少则需多次离心）加入10%福尔马林固定液， 离心、用滤纸包裹细胞团、脱水、浸蜡、包埋， 制成石蜡细胞块， 切片1张， HE染色。
1. 3 免疫细胞化学染色 所用免疫化学试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司， 方法采用SP法， 所有操作均由经验丰富的专业技术人员按说明书及标准操作完成。本室胸腹水免疫细胞化学常用检测项目有26项。见表1。
表1 常用免疫细胞化学检测项目
免疫细胞化学项目
上皮源性标记 CK广、EMA
肺来源 TTF1、CK7、CK5/6、Syn、CgA、P63
卵巢来源 CK7、CA125、WT-1
乳腺来源 CA15-3、ER、PR、C-erbB-2、P53、CK7GCDFP-15
胃肠道来源 CEA、CA19-9、CDX-2、CK20
间皮细胞来源 Calretinin、WT-1
组织细胞来源 CD56
淋巴细胞来源 LCA、CD3、CD20
1. 4 细胞形态学观察 观察细胞涂片的一般情况、细胞大小、形态、排列及细胞核的大小、形态、核浆比、染色质、核仁 、核膜、胞浆等特点并结合临床资料， 判定细胞良恶性。细胞形态学观察及判定标准参照诊断细胞病理学及细胞病理学鉴别诊断彩色图谱[2， 6]， 如良性间皮细胞形态：细胞圆形、边界清晰或微绒毛、核中心或偏心位、圆形或肾形、核膜边界清晰、光滑、染色质细颗粒状、均匀分布、单个或多个微小核仁、浆丰富、淡或浓、外周渐淡。腺癌细胞学特点：胞体大、大小不一、核浆比高、核畸形、核偏位、染色质粗糙、深染、胞浆丰富、多有分泌现象、常成团或状排列等。普通涂片与细胞块切片对照观察， 对发现可疑细胞不能明确诊断者或有肿瘤细胞不能明确来源及肿瘤类型者， 选择相应的免疫细胞化学项目进一步检测；对于涂片中仅有几个肿瘤细胞， 而细胞块中未发现可疑细胞者， 不再进行免疫化学检测。
1. 5 免疫细胞化学结果判定 以原始涂片及细胞块中细胞学形态为基础， 充分观察免疫化学标记后的目的细胞形态， 结合不同抗体标记细胞不同的阳性部位及抗原在组织细胞分布的不规则性， 避免假阳性及假阴性， 严格按标准、准确判读免疫细胞化学标记结果。
2 结果
65例胸腹水中有3例涂片仅见几个肿瘤细胞， 而细胞块为阴性， 其余62例标本涂片与细胞块检查结果完全相符（占95.4%）；其中13例良性病变标本涂片及细胞块均未查到肿瘤细胞或可疑细胞， 报告阴性；5例可疑阳性及44例需鉴定肿瘤细胞来源的标本， 通过免疫细胞化学均明确诊断结果。
65例标本恶性肿瘤细胞阳性52例（占80.0%）， 其中3例因肿瘤细胞极少， 结合临床资料以细胞涂片结果报告；其余49例可疑阳性或阳性标本根据各例不同的细胞形态及鉴别诊断需要、参考临床资料， 选择不同的项目组合， 进行相应的免疫细胞化学检测证实或进一步确证为：肺癌27例， 卵巢癌14例， 胃肠道癌5例， 乳腺癌1例， 食管癌1例， 胰腺癌1例， 肾恶性肿瘤1例， 纵隔肿瘤1例， 恶性鞘膜瘤病1例。
52例恶性肿瘤胸腹水中腺癌38例， 占73.1 %；小细胞癌4例， 占7.7 %；鳞癌3例， 占5.8 %；其他恶性肿瘤5例， 占9.6 %；细胞学不能明确类型者2例， 占3.8%。
3 讨论
近年来， 随着细胞学特别是细胞块技术的发展， 免疫化学技术在胸腹水细胞学诊断中得到了进一步的应用。魏谨等[7]报道胸腔积液细胞块组阳性率为83.3%（25/30）， 高于常规涂片组46.7%（14/30）， 两者差异有统计学意义。而本文对65例胸腹水细胞块及免疫细胞化学研究显示， 常规涂片组（真阳性率80%）敏感度略高于细胞块组（真阳性率75%）， 提示在提高肿瘤细胞阳性率方面， 尤其当肿瘤细胞极少时， 细胞块并不具优势。对于细胞形态学观察， 常规涂片中细胞形态舒展， 可观察细胞量大， 易于辨认；而细胞块在制作过程中因脱水固定等程序， 使细胞体积相对变小， 形态略有变化， 故不及常规涂片中形态典型， 但肿瘤细胞的排列更接近组织学， 便于与组织学对照， 因此对于细胞块中细胞形态观察特别是异型性不明显的单个肿瘤细胞的观察， 应与常规涂片相对照， 二者相互结合对照观察可以弥补形态诊断上的不足。但细胞块具有可连续切片、可重复性、易于保存、做免疫组化染色定位准确、阳性率高、特异性强等优点[8-10]是普通涂片无法比拟的。
细胞块免疫细胞化学对于鉴别细胞良恶性直接体现于对细胞组织学来源的推断。通过免疫化学标记胸腹水中的可疑细胞为外来细胞特别是上皮源性的细胞等， 间接判定良恶性。本文有5例胸腹水发现可疑细胞， 通过免疫化学标记明确诊断为癌细胞， 49例标本通过细胞块免疫细胞化学检测， 明确诊断及组织类型45例（91.8%）， 结合临床资料符合诊断2例， 仅能鉴别良恶性细胞但不能明确组织类型者2例。这可能与抗体特异性及抗体组合的合理选用有关， 也与免疫细胞化学检测技术的局限性有关， 有待于进一步研究和探索。
关于抗体组合的合理选用， 一般应遵循两个原则， 一是确定性指标与排除性指标联合应用， 二是采用双标的方法。即选择一组至少两种互相支持的抗体， 同时再选用反向否定的抗体， 以同时获得双重互补， 正反两方面的证实。同时为避免假阳性和假阴性的发生， 选择正确的阳性和阴性对照。因为抗体的相对特异性和一种抗原在同一种肿瘤以及不同肿瘤间的异源性表达， 仅用一种抗体辅助诊断易产生误差， 故宜选用几种适当的抗体组合应用以提高诊断的敏感性和特异性[9， 11]。本文对65例胸腹水细胞学诊断研究显示， 细胞块免疫细胞化学在胸腹水肿瘤细胞学诊断中对于细胞良恶性的鉴别和鉴别组织来源具有良好的应用价值， 值得推广应用。但在应用过程中必须注意以细胞形态学为基础， 与临床资料相结合， 合理选择检测项目， 做到三者联合应用， 对于提高细胞学诊断水平至关重要。
参考文献
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细胞免疫篇4
【关键词】 结肠肿瘤;rko细胞系;p物质;受体,神经激肽;免疫细胞化学
【摘要】
目的 探讨p物质及其受体神经激肽1(nk1)在体外培养的结肠癌细胞系rko 中的表达及免疫细胞化学定位。方法 将rko细胞接种于提前放入盖玻片的6 孔板进行细胞培养,细胞融合30％时将盖玻片取出进行免疫细胞化学染色。结果 在rko 细胞系中p物质和nk1呈阳性表达，p物质阳性表达多数位于细胞浆；而nk1阳性表达多数位于细胞浆，少数位于细胞膜。结论 神经内分泌机制可能参与了结肠癌的发病过程。
【关键词】 结肠肿瘤;rko细胞系;p物质;受体,神经激肽;免疫细胞化学
immunocytochemical expressions of substance p and neurokinin1 in rko cells of colon cancer
］
zhao lingling, chen hua, wang jigang (qingdao university medical college, qingdao, 266003, china);
［abstract］ objective to investigate the immunoexpressions of substance p and nk1 in rko cell lines of colon cancer. methods rko cells were inoculated on the cover glass and cultured on 6well plate. the cover glass was removed from the plate upon 30% of cell fusion, and the expressions of sp and nk1 of the cultured cells were checked via immunocytochemical staining. results positive expressions of substance p and nk1 were mainly found within the cytoplasm of the rko cells, while a few of nk1 noted on the membrane. conclusion the neuroendocrine mechanism might involve in the process of morbidity of colon cancer.
［key words］ colonic neoplasms; rko cell line; substance p; receptors, neurokinin1; immunocytochemistry
p物质属于速激肽家族,由ppta基因编码, 11 个氨基酸组成[1]。它能够特异性结合并激活其受体神经激肽1 (nk1),后者属于7 次跨膜g蛋白耦联受体[2]。nk1 受体激活后,以g 蛋白作为第二信使活化pkc 和mapk/erk 通路[23]。近年来研究显示,g蛋白耦联受体介导的信号转导通路参与了某些恶性肿瘤的发病过程。赵双罗等[4]研究显示，从溃疡性结肠炎到癌前病变，再到结肠癌病人血浆中的p物质水平逐级增高。但目前还没有p物质在结肠组织及细胞中表达的报道。nk1在结肠癌组织及细胞可表达[5]。目前对p物质和nk1在结肠 rko 细胞系中表达情况及定位尚不清楚。本文采用免疫细胞化学染色技术，研究p物质和nk1 在体外培养的rko 细胞系中的表达情况及免疫细胞化学定位。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
兔抗人p物质多克隆抗体（1∶200，工作液），购自北京中杉金桥生物公司；兔抗人nk1多克隆抗体(1∶200)购自millipore公司；正常山羊封闭血清、elivisiontm试剂盒、dab显色剂等均购自福州迈新公司；dmem(低糖)、胰酶(含有0.5 g/l胰酶和0.53 mol/l edta)购自gibco公司；胎牛血清购自paa公司。人结肠癌rko细胞系由浙江大学来茂德教授馈赠。
1.2 细胞培养
rko 细胞培养于含有体积分数0.05 胎牛血清的培养液中,隔天换液。在细胞90%融合时将其接种于预先置入盖玻片的6 孔板中,每孔细胞数约5×105个,置于37 ℃含体积分数0.05的co2培养箱(美国shel lab公司)中继续培养。在种板第2天,贴壁细胞融合30％将盖玻片取出,置40 g/l甲醛中固定15 min。
1.3 免疫细胞化学染色
采用elivision 两步反应系统免疫细胞化学染色,所有染色过程在室温下进行。细胞固定标本经pbs 冲洗后先用体积分数0.30 h2o2 孵育15 min,然后滴加非免疫山羊血清30 min 封闭非特异性结合位点。一抗孵育1 h 后,pbs冲洗，后滴加试剂a (增强剂)作用30 min和试剂b (辣根过氧化物酶聚合物)作用20 min,用dab 显色3 min。最后，苏木精复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以正常山羊封闭血清代替一抗做阴性对照。采用乳癌冷冻组织切片作为阳性对照。1.4 结果判定
所有染色标本采用olympus bx51 显微镜观察,阳性判断标准参照文献[6]：以低倍镜下见到染色呈明显棕黄色的细胞为阳性。每个标本在高倍镜下(400倍) 随机选取10个视野计数阳性细胞数。
1.5 统计学分析
采用spss 16.0及ppms 1.5[7]软件进行数据处理，结果以±s表示,组间比较采用t检验。
2 结果
rko细胞贴壁良好,约30%融合,在盖玻片上呈树枝状,细胞呈多角形,界限清晰。经免疫细胞化学染色后,绝大多数细胞中p物质均呈阳性反应,棕黄色颗粒位于细胞浆。nk1在rko细胞系中定位于细胞浆,少数表达在细胞膜，绝大多数rko细胞呈强阳性表达。阴性对照未见阳性着色。每高倍视野rko细胞系中p物质和nk1阳性细胞数分别为(80.17±9.70)、(77.33±8.52)个，二者比较，差异无显著性(t=0.537,p>0.05)。
3 讨论
nk1广泛分布于神经组织和非神经组织[7],参与了包括肿瘤在内的许多疾病过程。各种肿瘤细胞表达的nk1能够高度依赖于p物质的刺激,从而使细胞持续增殖。nk1能引起ca2+动员,pkc以及mapk/erk的活化。nk1活化后以g蛋白为第二信使激活下游信号转导通路,其β和γ亚单位能够活化raf1和erk1/2而引起细胞的转化,不同条件下这条途径既可引起细胞增殖也可促进细胞的凋亡[78]。本研究显示,p物质和nk1在体外培养的结肠癌细胞系rko中均呈阳性表达，提示两者可能参与了结肠癌的发生。nk1受体在结肠癌细胞高表达与rosso等[5]的研究结果相一致。由于p物质及nk1与神经内分泌系统密切相关,提示神经内分泌机制可能参与了结肠癌的发病过程。p物质能够上调nk1的表达水平[10],rko细胞系中p物质阳性表达也提示nk1高水平表达。singh等[11]认为,p物质刺激部分癌细胞的生长作用可能是通过它和一些细胞因子(il21、il26和scf等)的共同作用而引起的。本文研究结果表明,rko结肠癌细胞本身存在p物质的高表达,这提示p物质以自分泌方式刺激肿瘤细胞的生长。另外,petel等[12]报道在细胞培养上清液中存在p物质,这表明p物质也可能通过旁分泌方式上调并激活细胞膜上nk1受体,从而激活下游信号转导通路引起肿瘤细胞的增殖。考虑到两种方式同时参与了p物质对结肠癌生长的影响过程,我们认为阻断其中任何一种方式都可能起到抑制肿瘤生长的作用。
免疫化学方法简单实用,用该法标记特定类型的肿瘤标志物一直是重要的辅助诊断手段[1314]。本研究免疫细胞化学染色结果证明p物质和nk1两种神经内分泌指标在rko细胞系高表达,这为临床上具有该细胞系特点的结肠癌提供了一种新的简单可靠的诊断指标。
综上所述,本研究结果不但提供了结肠癌rko细胞系的一种新特性,也为新的抗肿瘤药物研究提供了理论基础。进一步研究p物质及其受体nk1与rko细胞系的关系,以阐明二者在该类型结肠癌中的作用,对研究结肠癌的发生机制有着新的意义，并可能为结肠癌的临床诊断提供新的指标。
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细胞免疫篇5
【关键词】 细胞
【关键词】 脐血干细胞；移植；免疫治疗
脐血造血干细胞移植融化疗与免疫治疗于一体，作为血液恶性疾病的治疗手段已获公认，其重要原因就是脐血造血干细胞移植比其他造血干细胞移植具有诸多优点：来源丰富、取材简单；对供、受者HLA相符的要求相对较低；不易受病毒及残留肿瘤细胞的污染；CD3、CD4相对不成熟，GVHD发生率低；NK细胞、LAK细胞较多，GVL发生率低；增殖、自我增殖能力强；骨髓基质细胞多，给造血干细胞提供生长的微环境等。造血干细胞移植的临床快速发展丰富了移植免疫理论，移植免疫的进展亦促进了造血干细胞移植的临床实践。脐血造血干细胞移植亦存在诸多免疫方面的问题，如GVHD、GVL、免疫耐受等发生率虽较低但均有其免疫的机制。为更好地理解、认识及进一步解决这些问题，本文将从相关免疫学的角度对这些现象作一综述。
1 T细胞抗原识别和激活的分子基础
脐血造血干细胞移植时，由于受者在移植前接受了预处理的超大剂量放/化疗，受者免疫受到抑制，因此，更多的情况是发生供者对受者的免疫反应，供者的T细胞被激活。T细胞可通过特异性和非特异性抗原两条途径被激活。在移植免疫中起重要作用的是抗原特异性激活。抗原特异性激活需要T细胞与“专业化”的抗原递呈细胞（APC）反应。APC在不同条件下由不同细胞组成，主要包括树突状细胞、巨噬细胞、激活的B细胞、单核细胞等。T细胞的激活可人为地分为三个阶段：第一阶段为粘附：APC与T细胞通过细胞表面粘附分子及其配体在外周血与淋巴细胞随机接触发生反应。细胞表面粘附分子包括LFA3及其配体CD2、ICAM1、LFAⅠ等。第二阶段为识别：在粘附的基础上，若APC可呈递足够量的特异性抗原多肽给T细胞，则T细胞可通过T细胞受体对抗原进行识别。T细胞受体抗原的识别受MHC限制性，内源性抗原肽通过MHCⅠ类分子提呈给CD8+的TCR，外源性抗原肽通过MHCⅡ类分子提呈给CD4+的TCR。第三阶段为T细胞的激活：TCR与抗原肽的结合使T细胞具备被其它信号激活进而分化、增殖和分泌细胞因子的能力；但若缺乏其它信号的刺激，则不能被激活或发生增殖和分泌细胞因子。TCR与抗原的结合是T细胞激活的第一信号，第一信号具有抗原特异性和MHC限制性；第二信号则是非特异性的：CD28仅局限表达于T淋巴细胞和浆细胞，但直到80年代末期、90年代初期才确定了CD28在APC表面的配体B71（CD80）、B72（CD86）。越来越多的资料显示，B71和B72途径可能传递不同的共刺激信号。也有证据显示B7家族中可能尚有其它组成成份。这些分子的发现无疑会对B7/CD28共刺激信号乃至免疫激活的理论发生冲击。因此，T细胞通过粘附分子与APC接触，进而识别APC呈递的抗原多肽。通过B7/CD28等多个黏附分子对传递第二信号，进而T细胞被激活发生增殖、分泌不同的细胞因子。T细胞激活后表面表达另一分子――CTLA4，结构与CD28类似，但与B7分子结合后发挥的作用与其相反，在共刺激信号中发挥重要的负调节作用，抑制T细胞过度增殖。因而通过调控粘附分子、第二信号系统，可以改变免疫反应；若阻断粘附分子或TCR与抗原的接触，则T细胞发生抗原识别的最终结果是免疫抑制；这些细胞再次遇上特异性抗原，仍会发生免疫反应；但若调控发生在B7/CD28阶段，则结果完全不同，这些细胞由于已与特异性抗原肽发生接触，此时阻断第二信号B7/CD28，则细胞进入一长久的特异性免疫无反应状态，即使再次遇上此抗原，仍无法发生免疫应答反应［1～3］。
2 免疫耐受
宏观上讲，有三条途径可以达到免疫耐受。第一是克隆清除，第二是克隆失能，第三是免疫抑制。同其他大器官移植不同，异基因造血干细胞移植最终可不必使用免疫抑制剂而达到免疫耐受。虽然确切的免疫耐受机制尚未完全阐明，但临床和实验室资料支持上述三种机制并存。例如，慢性GVHD病人存在特异性对宿主起反应的供者淋巴细胞，而无慢性GVHD的病人则无此类细胞。换言之，在无慢性GVHD的受者，针对宿主的淋巴细胞被克隆清除或克隆失能。同样，在动物试验中，有急性GVHD表现的动物体内可发现特异性对宿主抗原反应的T细胞克隆。而在无急性GVHD的动物则极难分离出上述T细胞克隆。当然，也有第三种机制参与免疫耐受机制及免疫抑制的证据：临床及动物试验发现有抗原特异性和抗原非特异性免疫抑制细胞的存在，免疫抑制药物对造血干细胞移植免疫耐受形成的重要性等均支持免疫抑制机制的参与。由于免疫耐受对造血干细胞移植的重要性，近年全世界科技工作者花费大量的财力、物力和人力对免疫耐受进行了研究，试图在免疫耐受机制和诱导免疫的方式上取得进展。
2.1 免疫抑制剂的进展
用于造血干细胞移植的免疫抑制药物主要是环孢素A。环孢素A的应用使移植的免疫合并症明显减轻，使移植疗效大为改进。近年来，大环内酯类抗生素FK506、MMF等新型免疫抑制剂的应用，有望进一步提高移植的安全性。尤其是FK506能使HLA不合的造血干细胞移植形成免疫耐受。上述药物可分别通过抑制某些细胞因子（尤其是IL2）的产生，阻断细胞因子与受体的结合，干扰细胞因子受体的表达等机制而发挥免疫抑制作用［4，5］。
2.2 特异性免疫耐受的诱导
迄今为止，仅在动物模型上获得成功。脐血移植属异基因造血干细胞移植，以下两方面的进展值得一提：①通过阻断共刺激信号即第二信号，诱导免疫耐受。如前所述，T细胞的激活需第一、二信号；CD28/B7在第二信号中发挥重要作用。应用阻断CD28/B7的制剂，可干扰T细胞的特异性激活，细胞进入免疫无能状态；CTLA4Ig或B7抗体可用来达到此目的。动物实验表明，必须完全阻断B7家族的信号传导，方能诱导MHC不合的免疫耐受；体内应用CTLA4Ig虽能明显降低MHC不合移植致死性GVHD发生率，但并不能完全消除致死性GVHD。体内体外联合阻断B7/CD28信号传导可能会获得更好的结果。②基因工程。供者T淋巴细胞是GVHD的关键细胞，体外去掉之无疑会减轻GVHD，但同时会使异体植入发生困难，尤其是HLA不合的异基因造血干细胞移植。由于认识到植活主要是T细胞的早期功能事件，而GVHD往往是植活以后发生。因此近年有学者试图用基因工程的方法诱导免疫耐受；体外将标记基因重组到供者T淋巴细胞上，后者与DHPG接触后即出现凋亡。结果既能保证植活的需要，而且一旦发生GVHD则可应用DHPG输注诱导T细胞凋亡，阻止GVHD的发生。③嵌合体形成免疫耐受。动物实验证实，用CD4单抗对受者进行的非清除性造血干细胞移植可形成供受者嵌合，若供受者形成嵌合体状态，则不易发生GVHD，其机制虽未获阐明，很可能是T细胞克隆被清除或有veto细胞的存在。最大的问题是如何设计一有效的非清除性方案使之能形成嵌合状态。临床应用非清除性造血干细胞移植在HLA相合的异基因移植获一定成功，但未能完全避免GVHD，提示人与动物实验仍有一定差异。此一方法能否跨越HLA不合的免疫屏障，尚有待进一步临床证实［6～12］。
3 急性GVHD
急性GVHD是异基因造血干细胞移植的主要合并症，其发生的基础在于供受者MHC及次要组织相容性的差异。有关其发生的细胞和分子机制近年已越来越清楚。由于受者机体处于免疫抑制状态，供者T细胞（主要是成熟T细胞）被激活。激活的过程同上。由于预处理并不能安全清除受者APC，故受者APC直接将MHC或次要组织相容性抗原处理为多肽后呈递给供者T细胞。供者T细胞被激活分泌大量细胞因子，如IL2及其受体。这些因子一方面可刺激T细胞的增殖和细胞因子再分泌，另一方面尚可促进APC的活性及其他分子的分泌，如粘附分子、MHC的高表达等。
T细胞激活后如何导致组织的损害尚有诸多不甚清楚之处。早年认为细胞毒性T细胞直接导致组织损害和坏死。然而，此一假设近年渐被搁置。越来越多的试验证据表明，大颗粒细胞――NK细胞无疑对GVHD的组织损害发挥一定作用；细胞因子如TNF、IL1等对GVHD组织损害的作用也越来越获肯定［13，14］.
4 慢性GVHD
慢性GVHD由于有类似于胶原血管炎性疾病的临床表现，一般认为与急性GVHD不同，更可能是一种自身免疫性疾病。早期常以100 d作为鉴别急、慢性GVHD的标准。但近年的资料表明，慢性GVHD应更好地从临床、病理和发病机制方面加以认识。虽然从临床的角度非常难确定GVHD与自身免疫的关系，动物试验已证实慢性GVHD呈自身免疫性疾病的病理生理过程。在动物模型中，源于慢性GVHD的T细胞特异性对MHCⅡ类分子的公共抗原簇发生反应，既使在无IL2的条件下仍可分泌因子IL4和IFNγ，并且刺激纤维母细胞产生胶原蛋白。GVHD的发生可能与受体胸腺功能受到破坏，使之不能对针对自身抗原的T细胞实行克隆清除，后者由供者造血干细胞分化而成［15］。
5 同基因GVHD
病理改变类似慢性GVHD。动物模型研究表明，其发生机制是由于自身免疫性T细胞针对MHCⅡ类抗原分子。自身免疫性T细胞发生的机制是由于胸腺严重受损，髓质（Medulla）内缺乏表达MHCⅡ类抗原的细胞，因而在胸腺内发育成熟并移至外周血的T淋巴细胞可以导致组织损害，而其他可以灭活自身免疫的免疫监视细胞又由于预处理（如放射线）而遭灭活。将正常淋巴细胞回输给照射后的动物宿主，可以恢复宿主的调节功能，从而预防此免疫过程。环孢素A由于可以阻止此免疫监视机制的重建，因而在诱发同基因（或自体）GVHD中起重要作用［16］。
6 GVL效应
诸多事实证明移植物抗白血病效应（GVL）的存在：①免疫抑制剂的骤停可使复发（主要是分子生物学和细胞遗传学复发）病人再次进入缓解状态；②异基因造血干细胞移植复发率低于同基因造血干细胞移植；③发生急、慢性GVHD的病人复发率低于不发生GVHD的病人；④接受非去T细胞造血干细胞移植且无急、慢性GVHD发生的病人，移植后复发率仍低于同基因移植。这些资料不仅支持GVL效应，并且表明即使无GVHD发生，仍发生GVL效应。在不同疾病种类作用强度不同。如在AML和CML作用明显，但对ALL则作用较弱。而在多发性骨髓瘤中，GVL效应最弱［17］。
GVL的效应细胞和分子机制目前尚未清楚的阐明。不过，供者T细胞无疑发挥重要作用。因为去除供者T细胞后，GVL效应明显减弱。诱发GVL、GVHD的抗原是否为同一抗原，激活的是否为同一效应细胞等问题均尚待进一步明确。初步资料表明MHC、次要组织相容性抗原在GVHD、GVL反应中均发挥重要作用。其他抗原，如肿瘤特异性抗原PML/RARα、bcr/ab1等也参与了GVL反应，但这些抗原介入的反应对临床GVL效应有何影响尚难以评价。最近的一些临床和动物实验资料表明不同亚群T细胞在GVL与GVHD中起不同作用；CD4细胞对GVL效应尤为重要，因为选择性去除CD8亚群T细胞（保留CD4细胞亚群）的移植，能有效降低GVHD发生率且并不影响抗白血病效应。此外，自然杀伤细胞也参与GVL反应［18～20］。虽然GVL和GVHD之间的关系尚未阐明，临床资料提示二者并非完全一致。最近的小鼠动物试验中，发现GVL、GVHD二者在淋巴细胞分布动力学、细胞组成亚群及巨噬细胞表面抗原表达方面，均有明显差异。证明了二者在细胞乃至分子水平确是两种不同的过程。随着对两者免疫机制的进一步研究，必将给更好的应用GVL效应奠定理论基础［21］。
7 排斥
虽然对HLA相合的脐血干细胞移植而言排斥并不构成临床的主要问题，但对于HLA不合的脐血干细胞移植，由于跨越的免疫屏障较大，且常采用去除供者T细胞的方式进行移植，排斥就转化为主要矛盾。排斥的机制一般认为是由于残留的受者T细胞识别供者抗原并发生免疫反应所致。供者T细胞由于可以抑制受者残存的T细胞而有促进植活之功能。近年对供者移植物中促进植活的不同细胞成份研究取得一定进展。动物模型表明，表达TCRαβ受体的细胞是促进植活的主体细胞。而表达TCRγδ的细胞具有促进细胞植活却不引起GVHD的功能，可用于HLA不合的移植。CD8+T细胞同样对促进植活起重要作用。进一步研究显示，其亚群Tc2是促进植活的主体细胞，且不引起严重GVHD［22~24］。
总之，异基因脐血造血干细胞移植是当今免疫治疗的热点，免疫耐受和免疫反应是其核心。随着对移植免疫反应的细胞分子机制的进一步深入研究，我们完全有可能在不远的将来建立全新的免疫耐受模式，在受惠于脐血干细胞移植带来的免疫治疗的益处的同时免受其合并症之苦，并最终跨越HLA不合的免疫屏障，将血液恶性肿瘤的治疗推向一个新的时代。
参 考 文 献
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细胞免疫篇6
【关键词】肿瘤;细胞免疫疗法;分子生物学
机体免疫系统能够识别和清除肿瘤细胞已被许多实验明确证实。细胞免疫疗法通过提取人体最有力攻破癌细胞的免疫细胞，对其进行诱导、扩增、激活，使其具有识别和杀死肿瘤细胞的能力后再回输到病人体内，通过增强机体对肿瘤细胞的免疫应答能力的方式来抑制或消除肿瘤的生物细胞免疫疗法。近年来的研究显示，以免疫治疗为主体的肿瘤生物治疗已被公认为继手术、放疗和化疗后的肿瘤治疗的第四模式，其疗效已在多种肿瘤的治疗中得到验证。本文就细胞免疫疗法在临床多种癌症治疗中的应用进行综述。
1过继性细胞免疫治疗白血病
细胞免疫治疗成为白血病治疗中一个迅速发展的领域。Armstrong等曾将白血病的细胞免疫治疗大致分为两类：一是输注可在体内刺激抗白血病活性的细胞，即疫苗治疗；二是输注有内在抗白血病活性的免疫效应细胞，即过继性细胞免疫治疗。有学者用肿瘤特异抗原（TSA）/肿瘤相关抗原（TAA）的某些肽段致敏肿瘤患者缓解期自身T淋巴细胞，诱导产生特异性CTL，在体外可有效杀伤患者自身肿瘤细胞，而对正常造血细胞无毒作用。Sprent等报道了DC来源的exosomes能在体外直接诱导CD8+T细胞扩增，因此认为其在体外扩增抗原特异性CTL方面具有重要的理论和临床应用价值。乔建辉等在国内首次报道DSI能促进异基因造血干细胞移植后供者嵌合体的增加，有利于供者细胞植入，而且具有并发症少，较好的GVL效应等优势。最近一项针对半相合移植后复发患者的DSI临床报道显示，20例复发患者中有8例达到完全缓解，平均生存1118d，治疗效果比较满意。
2肺癌的细胞免疫疗法
免疫治疗是肺癌综合治疗的主要手段之一，细胞免疫治疗通过给机体输注抗肿瘤免疫效应细胞的方法来达到治疗肿瘤的目的。许多动物实验和临床资料表明，IL一2／LAK细胞疗法具有抑制瘤、杀伤瘤作用。近来，Ebina将BAK疗法应用于非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗。该研究提示具有免疫活性的NSCLC患者更适合BAK疗法。BAK细胞治疗可纠正免疫功能低下，有利于延长NSCLC患者的生存期，提高生存质量。TIL细胞治疗结肠直肠癌、恶性黑色素瘤与肾细胞癌已显示一定的临床疗效。近年来，CD3 AK细胞抗肿瘤作用的基础和临床应用研究取得了长足进展。杨新静等将CIK细胞用于肺癌的治疗研究，研究发现经过体外制备的CIK细胞不仅增殖速度快，而且对肺癌细胞体内外均具有高效的杀伤活性。
3卵巢癌的免疫治疗
卵巢癌是女性生殖器常见恶性肿瘤之一，近年来，有关卵巢癌免疫治疗方面的研究较多。Bjorge等指出，因为卵巢癌在远处转移前的相当长一段时间内都存在于腹膜腔内，并且卵巢癌术后遗留微小病变细胞处于休眠状态或至少处于低代谢率，所以卵巢癌非常适用于局部单克隆抗体的免疫治疗。过继细胞免疫治疗，其优点是绕过了机体免疫系统对肿瘤抗原的免疫耐受效应。Lambeck等研究了在卵巢癌患者体内的p53特异性T细胞反应，表明卵巢癌患者体内存在一种弱的混合型辅T细胞，即p53特异性T细胞可以诱导p53特异Thl／CTL免疫，其研究结果支持了使用p53长肽作为瘤苗免疫策略的理论。卵巢癌的免疫治疗仍处于实验室研究阶段和部分临床前期研究阶段，需对肿瘤特异抗原、机体抗肿瘤免疫、肿瘤化疗与免疫治疗的时序等基础和临床问题进行更深入的研究。
4EBV病毒特异性CTL治疗鼻咽癌
鼻咽癌细胞表达HLA I类分子，抗原递呈机制正常。鼻咽癌病人外周血中存在EBV特异性CTL，具备细胞免疫治疗的基础。Chua等报告EBV特异性多克隆CTL(5×107―3x108)治疗4例晚期鼻咽癌病人，除外周血EBV拷贝数降低外，没有观察到肿瘤缩小。Straathof等报告6例复发性／难治性鼻咽癌病人接受EBV特异性多克隆CTL(2×107／m2-2×10S／m2)后，CR 2例，PR 2例，SD l例，PD 1例。5例病人的外周血EBV拷贝数在6周内明显降低，另1例在治疗前没有检测到EBV。EBV特异性多克隆CTL输注没有明显毒副作用。生物治疗技术的进步使鼻咽癌患者获得更多治疗机会，但是，鼻咽癌是地区性疾病。受到国际社会的关注程度有限，需要更多的循证医学证据来证实生物治疗对鼻咽癌的有效性。
随着肿瘤分子生物学和肿瘤免疫学的发展，已能在体外培养出许多种类不同的特异性和非特异性的抗肿瘤效应细胞，尤其是肿瘤抗原的鉴定和合成、四聚体检测及分拣以及DC细胞的培养，使得能在体外成功地培养出大量的肿瘤特异性CTL细胞，真正开始了主动免疫和过继性免疫相结合的肿瘤特异性免疫治疗。细胞免疫治疗将与传统的肿瘤治疗(手术，化、放疗)和新的治疗方法如基因治疗、抗血管生成治疗等相联合，使其在肿瘤治疗中发挥重要的作用。
参考文献
细胞免疫篇7
那么，“生物免疫治疗”到底是何方神圣？对肿瘤治疗能起什么作用？哪些病人才适合这样的治疗方式呢？
生物治疗：
对付肿瘤的未来方向
据广州医学院附属肿瘤医院肿瘤内科主任医师金川介绍，手术、放疗和化疗是目前公认的肿瘤治疗“指定动作”。但一个不可回避的事实却是，光靠这些传统的方法，已经难以杀灭患者体内残存的肿瘤细胞。正因如此，随着科技进步，目前肿瘤治疗已进入生物治疗时代，而且生物治疗将成为日后肿瘤治疗的主导。
而“免疫细胞治疗”其实就是生物治疗的一种。“说起‘生物治疗’，大家可能觉得很陌生，但如果提及靶向治疗，相信大家都不陌生，其实靶向治疗就是生物治疗的一种。”金川说。目前临床上比较常见的生物治疗方法，一种是靶向药物，另一种则是免疫细胞治疗。
作用机理：
激发自身抵抗力杀灭癌细胞
金川指出，其实“免疫细胞治疗”并不是什么新鲜事物，它在国内外开展的时间已有三四十年。
金川说，免疫细胞治疗等生物治疗与传统化学药物最大的区别在于，前者主要是利用人体自身的免疫细胞而不是传统的化学药品来杀伤肿瘤细胞的。而且与传统方法相比，生物治疗的针对性更精确，“它瞄准的是肿瘤细胞本身，不会‘伤及无辜’。”
而具体到免疫细胞治疗，其方法就是从患者的外周血中采集单个核细胞，然后送到专业的实验室内进行培养、扩增、诱导，刺激细胞中的肿瘤抗原，从而获得能识别癌细胞的DC细胞和具有高杀瘤活性的CIK细胞，然后如同打点滴一样分次回输到患者体内。这样一来，这些携带了“秘密武器”的免疫细胞就能有效抑制肿瘤细胞生长、消除转移病灶，达到预防和控制肿瘤复发和转移，实现延长患者生存期、提高患者生活质量的多重目标。“值得一提的是，免疫细胞治疗目前已经纳入了广州的医保。”
适应症：
晚期癌症患者获益不大
细胞免疫篇8
造血干细胞移植（HSCT）已成为治疗多种血液病、某些恶性实体肿瘤、部分遗传性疾病、重症免疫缺陷等疾病的最有效措施之一。骨髓、外周血和脐血是造血干细胞的三大来源。但异基因骨髓移植（alloBMT）或外周血干细胞移植（alloPBSCT）受HLA匹配供者来源的限制，自体造血干细胞移植又受到干细胞体外净化等问题的困扰，而脐血造血干细胞因其广泛的来源、较强的增殖分化能力及较弱的免疫原性而日益受到重视。临床应用已证实脐血造血干细胞移植对于重建或改善骨髓造血功能有良好疗效，具有临床应用价值［1］。脐血单个核细胞（CBMNC）是脐血移植的有效成分，因此，本文拟就CBMNC的免疫学特点作一综述。
1 脐血造血干祖细胞（HSPC）的免疫学特性
HSPC是一类具有高度自我更新和定向分化特征的原始细胞，目前尚无直接检测HSPC的方法。CD34被公认为是骨髓、外周血以及脐血的HSPC的表面标志。文献报道，脐血中CD34+细胞占有核细胞总数的2%，与成人骨髓相当（2.1%），高于外周血（0.5%）［2］。近年来，应用单克隆抗体及流式细胞技术研究发现，体内长期植活细胞仅为表达CD34+CD38-OR-Thy-的细胞群，因此检测CD34+CD38-细胞标志，可间接估计HSPC含量。
脐血CD34+细胞亚群分析显示，脐血造血干细胞中的CD34+CD38-细胞的百分比明显高于外周血和骨髓，提示脐血造血干细胞中含有较多更为原始的造血细胞。
体外细胞培养方法测定脐血中HSPC，结果显示，脐血除了含有粒单集落形成单位（CFUGM）外，还含有爆式红系集落形成单位（BFUE）、淋巴系集落形成单位（CFUL）、巨核系集落形成单位（CFUMeg）和混合集落形成单位（CFUMix）。单位数量脐血中CFUGM的含量高于动员后的外周血12～16倍，相当于或超过骨髓；脐血中的BFUE、红系集落形成单位（CFUE）的数量也高于成人外周血及骨髓。另外，脐血样本形成的集落也比骨髓形成的集落大，显示脐血CD34+CD38-细胞群克隆形成能力较成人外周血及骨髓强。
研究发现，尽管脐血中HLADR+和HLADR-两群细胞有97%的细胞处于G0或G1期，但两群细胞增殖很快，经含细胞因子液体培养36 h后仅有50%的细胞处于G0或G1期，而骨髓中80%HLADR+细胞和90%HLADR-细胞处于G0或G1期，经36 h培养后仍有80%处于G0或G1期。表明脐血中CD34+CD38-细胞对集落生长刺激因子具有更高的敏感性，细胞生长周期更短。
端粒是在所有真核生物染色体末端的富含G′C的重复DNA序列，在细胞分裂期间端粒重复序列的丢失被认为可能是细胞衰老的机制。应用DNA印迹法、荧光原位杂交法研究发现，脐血干细胞的端粒平均长度明显较骨髓干细胞的端粒长。另外，脐血HSPC的端粒酶活性高于骨髓及外周血HSPC，脐血HSPC低表达甚或不表达细胞凋亡配基CD95/Fas，因此脐血的造血增殖潜能要高于骨髓，其移植存活期比骨髓更长、更稳定。
2 脐血T淋巴细胞的免疫学特性
脐血T淋巴细胞在移植物抗宿主病（GVHD）、移植物抗白血病（GVL）和免疫调节中发挥重要作用。研究表明，脐血T淋巴细胞在表型、功能、免疫效应分子及许多膜受体的表达等方面，与成人外周血T淋巴细胞存在许多差异。脐血成熟T细胞数量不足，T细胞表面抗原标记和T细胞亚群发育不成熟，且呈异质性［3］。
脐血CD4+、CD8+、CD3+淋巴细胞绝对数量低于成人外周血，而CD4+/CD8+比值较外周血高，CD8+T细胞数低于外周血。体外去除CD8+T细胞，定量输入CD4+T细胞的供体淋巴细胞能够有效地介导针对慢性粒细胞性白血病（CML）的GVL，使BMT后复发的病人达到再次诱导缓解的效果，而GVHD的发生率较低［4］。这提示CD8+T细胞在介导人类GVHD中最为重要，而CD4+T细胞则可能有GVL效应。所以脐血CD8+T细胞数较低可能是脐血移植后GVHD发生率低、程度轻的原因之一。
CD45RA+T细胞是未经抗原刺激的原始T细胞，在受抗原刺激后转化为记忆性细胞，即CD45RO+T细胞。文献报道脐血中以CD45RA+T细胞为主，而CD45RO+T细胞显著低下。CD45RA+T细胞没有辅助功能，主要起免疫抑制作用。致使脐血移植后GVHD发生率低，但同时有可能降低GVL。
CD26是T细胞的活化抗原，现已知脐血中以CD26+CD45RA+T细胞为主（超过88%），而CD26+CD45RO+T细胞不到2%，成人外周血中CD26+CD45RA+T细胞占34%，而CD26+CD45RO+T细胞占48%。SEIJI等［5］的研究表明，CD26与CD45RA的共调节可能导致脐血T细胞通过CD26的活化能力下降。
脐血T细胞与成人外周血T细胞免疫功能相差很大。脐血中的T淋巴细胞受1次、2次和3次异体抗原刺激后，相应的细胞毒活性比成人T细胞活性低，并且越来越低，而成人T细胞则逐渐增高。在最初的混合淋巴细胞培养中，脐血和成人T细胞均能产生很强的增殖反应，受第2次刺激后，脐血T细胞出现无反应状态，其增殖反应、细胞毒效应均较成人外周血T细胞弱，而活化诱导的细胞凋亡反应较强［6］，提示脐血中T细胞对于异体抗原能产生耐受性。
与成人T细胞相比，脐血T细胞受刺激后分泌更高水平的IL10，但是分泌较低水平的许多其他细胞因子，包括IL2、IL4、IL8、IFNγ、TGFβ和TNFα［7］。脐血IL2、IL4、IL8和IFNγ等细胞因子含量较低，提示脐血中幼稚、未分化成熟的免疫细胞不能产生足量的细胞因子。脐血淋巴细胞产生细胞因子的细胞群主要为CD4+CD45RA+，而外周血则为CD4+CD45RO+和CD8+CD45RO+细胞群。实验表明，脐血T细胞对细胞因子或化学因子刺激应答反应较迟钝，且分泌细胞因子的能力较成人外周血明显低下。这主要是脐血T细胞的蛋白合成能力、细胞因子mRNA丰度以及转录速度较成人T细胞低。脐血T细胞其他免疫效应分子含量亦与外周血T细胞不同，穿孔素是细胞毒性T细胞发挥细胞毒作用的重要效应分子，文献报道脐血T淋巴细胞穿孔素的含量与成人外周血T细胞相比显著下降。
SATO等［8］研究结果表明，脐血T细胞和成人外周血T细胞对细胞因子反应性不同可能由于它们的受体不同。HODGE等［9］在研究T细胞IL2产生的同时研究IL2R表达情况，发现脐血T细胞和成人外周血T细胞IL2Rα和IL2Rγ比例无差别，但脐血T细胞表现出低IL2Rβ表达，且上调延迟。有研究证实，脐血T淋巴细胞不表达IL1R。
另外，在T细胞亚群中有一类特殊的细胞亚型，它具有自然杀伤（NK）细胞受体和T细胞受体且显示NK细胞和T细胞两方面的性质，能恒定表达Vα24JαQTCR及识别CD1d表达的糖酯，这就是NK T细胞。NK T细胞依赖其接受多克隆激活后产生的IL4［10］，在抑制TH1细胞介导的自身免疫性疾病和GVHD中起重要作用。与成人外周血相比，脐血中NK T细胞的含量显著减少［6］。脐血中的NK T细胞具有较低的免疫原性和较高的分化潜能。成人的NK T细胞有记忆力，呈寡克隆增生，在初次刺激后产生T0型因子。虽然脐血中的NK T细胞也表现出记忆性表型（CD45RO+CD62L-），但有其自身的免疫学特性：①表现活化的标志，如CD25；②是多克隆性的；③在初次刺激后不产生细胞因子［11］。可见，虽然脐血NK T细胞也表现出记忆性，但功能仍不完善。
脐血T淋巴细胞的上述免疫学特性决定了脐血的免疫功能，尤其是特异性细胞免疫功能是不成熟的。
3 脐血B淋巴细胞的免疫学特性
与成人外周血相比，脐血B淋巴细胞的表型、功能相对不成熟。
脐血中B细胞约50%为原始型，由于宫内隔绝环境长期缺乏特异抗原的刺激，不能转化为产生抗体的浆细胞，亦几乎不能产生IgG和IgA，只能产生一定量的IgM和IgD。
CD5+、CD19+是脐血B细胞不成熟亚群标志，CD10是早期B细胞的免疫标志。研究显示，脐血B淋巴细胞数量与成人外周血相当，但不成熟亚群CD5+CD19+和CD10+CD19+的比例显著比外周血高。正常情况下，成人外周血B细胞仅少量表达CD1C、CD38、CD5、CD23抗原，而这些抗原在脐血B淋巴细胞均高表达。功能分析显示，脐血B淋巴细胞受IL2、IL3、有丝分裂原等刺激后的增殖反应较弱。脐血缺乏表达膜IgG和IgA的循环B淋巴细胞；脐血B淋巴细胞所有类型重链的mRNA表达水平仅为成人外周血细胞的1/10，提示脐血B淋巴细胞不能形成IgG和IgA型浆细胞，可能是因为缺乏合适的前体细胞。另外，脐血B淋巴细胞CD27表达缺陷及没有合适T细胞辅助可能也是其功能不成熟的原因。
由此可见，脐血的体液免疫功能也是不成熟的。
4 脐血NK细胞和LAK细胞的免疫学特性
NK细胞是脐血移植后首先恢复的细胞群之一［12］。宿主NK细胞介导抗移植物反应，而供体NK细胞的异基因反应降低了白血病的复发率［13］，并保护病人免于GVHD的损害［14］。
脐血淋巴细胞绝对数比成人外周血高2～3倍，大颗粒淋巴细胞（80%～90%是NK细胞）绝对数也明显增高。COHEN等［15］研究发现，脐血富含原始的CD16+CD56+NK细胞，其具有重要的增殖能力与细胞毒活性，能被IL12或IL15诱导增殖，以达到强有力的移植物抗白血病效应。
与骨髓来源的NK细胞比较，脐血NK细胞与LAK细胞有以下特点：①脐血NK细胞对Daudi靶细胞的致死毒性作用强；LAK细胞有相当高的诱导YAC1靶细胞凋亡的毒性，而骨髓源的LAK细胞无此作用［16］；②新分离的脐血NK细胞可以裂解肿瘤细胞，在多种细胞因子作用下可以分化成LAK细胞，尽管脐血NK细胞产生的细胞毒性低于成人外周血NK细胞，但结合K562细胞的能力相当；③加入IL2或IL2R进行培养，脐血NK细胞活性可达到外周血NK细胞水平，且可增加穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B的mRNA表达，从而产生LAK细胞［17］，进行Westernblotting证实骨髓的NK细胞无颗粒酶B蛋白的表达；④脐血NK细胞能够激活颗粒酶/穿孔素溶解途径及Fas/FasL活动，这被认为与脐血移植后急性GVHD的低发生率有关［12］；⑤研究表明，脐血诱导产生的LAK细胞可裂解新鲜的白血病细胞；⑥脐血NK细胞杀伤性抑制性受体（KIR，包括CD158+a/CD158+b）CD158+b表达明显低于外周血NK细胞［18］。
有学者认为脐血的细胞毒作用主要由NK而非CD8+T细胞介导。此外，BERTHOU等研究发现，穿孔素在脐血CD8+T细胞中表达量极低，而主要表达在CD3+NK细胞和其他不成熟NK细胞亚群，并认为脐血细胞毒作用主要由穿孔素阳性NK细胞，而非CD8+T细胞介导。由此可见，在脐血干细胞移植（UCBSCT）后的GVL作用中，免疫系统非特异反应细胞——NK细胞起重要作用[19]。
5 脐血抗原提呈细胞的免疫学特性
树突状细胞（DCs）是至今所知的功能最强的专职脐血抗原提呈细胞（APC），但DCs在组织中含量甚微，仅占外周血单个核细胞的1%以下。目前，DCs主要由CD34+HSPC或CD14+单个核细胞在细胞因子作用下诱导获得。人DCs的主要特征性标志为CD1a、CD11c及CD83，DCs还表达MHCⅡ分子，共刺激分子CD80及CD86，黏附分子CD54等。脐血DCs的经典培养方法是用GMCSF/TNFα诱导CD34+HSPC生成。SORG等［20］研究表明，脐血中DCs占单个核细胞的0.2%～0.4%，主要表达HLADR、CD4、CD11a、CD45RA、CD50、CD54、以及CD123，低表达CD58、CD102、CD116，而不表达CD11c、CD80和CD86，显示脐血中DCs数量少，并呈现不成熟细胞表型。然而亦有研究显示，新鲜脐血与外周血比较，其CD34、CD38、CD1a阳性细胞数明显高于外周血，CD83、CD11c、CDw123等抗原阳性细胞数亦高于外周血。提示新鲜脐血中含有更多的CD34+细胞和DCs，体外应用细胞因子诱导将可能产生更多的功能性DCs。ZHENG等［21］研究结果表明，GMCSF和IL4诱导脐血和外周血的增殖能力是相同的，但脐血获得高表达CD80、CD83、CD1a DCs时间要较外周血早。更多的研究表明，脐血来源DCs同外周血及骨髓来源DCs一样，具有较强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖及激发T淋巴细胞抗肿瘤免疫反应的功能。
除IL1外，APC产生的细胞因子的量明显低于成人细胞。脐血来源的单核细胞IL1 mRNA、IL1蛋白产量与成人细胞一致；巨噬细胞被脂多糖激活后，IL2、IL15 mRNA转录、翻译速率虽与成人细胞一致，但是脐血APC产生的IL2、IL15蛋白量却不如成人血相应细胞。因而，由于共刺激因子产生不足，脐血APC的抗原提呈能力较成人APC明显低下。
综上所述，由于脐血HSPC含量丰富、细胞较原始、增殖分化能力较强，移植后能够长期重建造血。CBMNC的免疫原性较弱，导致UCBSCT后GVHD发生率低且程度轻，而GVL作用则因存在NK、LAK活性而保留。事物总存在两面性，也正是由于CBMNC的上述特性，UCBSCT后有造血与免疫重建延迟的缺点。相信随着研究的进一步深入，UCBSCT将扬其长而避其短，有着更加广阔的前景。
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细胞免疫篇9
间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是存在于骨髓中具有多向分化能力的一类干细胞。MSCs具有如下特性：具有塑料粘附性;细胞表型为CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-、CD11b-、CD79α-、CD19-、HLADR-;具有多向分化潜能，能分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。除此之外MSCs具有低免疫原性和独特的免疫调节作用，能逃避免疫识别、抑制免疫应答。以上生物学特性使其有望用于组织修复、抑制免疫排斥反应的发生和代谢性疾病的细胞治疗。本文对MSCs的免疫调节作用进行综述。
1 MSCs在体外的免疫调节作用
1.1 MSCs对T淋巴细胞的免疫调节作用
1.1.1 MSCs对不同因素作用下的T细胞增殖均有抑制作用：目前对于MSCs的免疫调节作用的研究大多集中于骨髓MSCs对T细胞的负性调控作用。2002年就有研究证实，人MSCs可以抑制混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reactions， MLRs)中或由多克隆活化剂刺激引起的T细胞增殖[1]。Krampera等[2]进一步证实，小鼠MSCs在抗原特异性反应中，亦能发挥对细胞增殖的具有抑制作用，且MSCs对T细胞的增殖的抑制不受MHC限制。MSCs不仅能够抑制植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激引起的CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖，而且对其活化表型CD25、CD38、CD69的表达也具有抑制作用[3]。Ramasamy等[4]研究了人骨髓MSCs对T细胞反应不同阶段的免疫调节作用，结果显示人骨髓MSCs能抑制CD3mAb联合CD28mAb活化的T细胞的增殖。有研究发现，人胎盘来源的MSCs能直接抑制外周血和脐带血来源的T淋巴细胞的增殖[5]。此外，大鼠骨髓MSCs能抑制刀豆球蛋白A(Con A)刺激引起的淋巴细胞及淋巴母细胞的增殖，该抑制作用呈剂量依赖性，并且对活化的淋巴细胞的抑制作用明显强于对初始淋巴母细胞的抑制作用[6]。
1.1.2 MSCs对T细胞增殖抑制作用的可能机制：MSCs并不是通过诱导增殖细胞的凋亡，而可能是通过抑制细胞的分裂来发挥作用。Magatti等[7]用活化的T细胞与MSCs共培养后，通过对细胞周期的研究发现MSCs可以通过抑制T细胞周期蛋白D2、活化周期蛋白依赖激酶抑制物p27kip1阻断T细胞分化进入G1期，从而抑制T细胞增殖，而且当从体系中移去MSCs后，即使加入外源性的IL2，T细胞仍不能增殖。
MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用与可溶性因子有一定关系。Di Nicola等[1]在实验中分别用转化生长因子(TGFβ1)抗体和肝细胞生长因子(HGF)抗体进行干预，证实TGFβ1和HGF参与了MSCs对T淋巴细胞的增殖的抑制作用。Meisel等[8]研究证实，在IFNγ诱导下MSCs可以表达吲哚胺2，3二氧化酶(indole amine2，3dioxygenase， IDO)，后者可以将色氨酸降解为犬尿氨酸发挥对T淋巴细胞增殖的抑制作用。此外，IDO还能调节血红素加氧酶1(heme oxygenase1，HO1)在人和大鼠骨髓MSCs上的表达，而HO1可以通过抑制淋巴细胞的增殖和TLR的活化介导MSCs的负性免疫调节作用。Selmani等[9]研究表明，人骨髓MSCs分泌的可溶性HLAG5能抑制T细胞的增殖，而HLAG5的分泌有赖于活化的T淋巴细胞与MSCs接触产生的IL10。Sheng等[10]用MSCs与淋巴细胞共培养，刺激淋巴细胞后检测上清液中的细胞因子未发现IL10、IL12及TGFβ，而IFNγ和TNFα有较高水平，且IFNγ可以促使B7H1在MSCs上表达的上调，在触发MSCs的免疫抑制作用中起重要作用。可见，MSCs对T细胞的免疫抑制作用由若干可溶性分子所介导，而对于这些分子的作用，不同的研究得出的结论不尽相同，这可能与实验条件不同有关。
MSCs还可以通过上调调节性T细胞(regulatory T cells， Tregs)来发挥免疫调节作用。Aggrawal等[11]将人骨髓MSCs和同种异体PBMCs在rhIL2刺激的条件下共培养5 d后，发现CD4+、CD25+的Tregs明显增多。Dilanni等[12]用人MSCs和不同Tregs亚群进行共培养，结果证实MSCs能募集Tregs并维持其表型和功能。人胎盘来源的MSCs亦能通过上调Tregs数量来发挥负性免疫调节作用，但Tregs的具体作用机制还有待进一步研究。
1.2 MSCs对B淋巴细胞的调节作用
1.2.1 MSCs对B细胞的增殖和功能均有抑制作用：MSCs不仅可以抑制B淋巴细胞的增殖，而且能影响其功能。研究发现，MSCs对T细胞依赖性刺激和有丝分裂原刺激引起的脾脏B淋巴细胞的增殖均有抑制作用[13]。Corcione等[14]研究表明，人骨髓MSCs对Ig抗体、可溶性CD40配体、IL2和IL4激发下的B淋巴细胞增殖均有抑制作用，且B细胞的功能也受到抑制，包括B细胞向抗体分泌细胞的分化和B细胞的趋化性。而Rasmusson等[15]研究显示，在不同水平脂多糖(LPS)或病毒抗原的刺激下，人骨髓MSCs可以刺激或抑制B细胞分泌IgG，表明MSCs对B细胞功能的调节作用受多种因素的影响。
1.2.2 MSCs对B细胞抑制作用的可能机制：研究表明，小鼠MSCs可以通过上调细胞周期抑制性蛋白p27 kip1以及下调G1 cyclin D2蛋白来抑制B细胞的增殖[13]。与此相似，Corcione等[14]报道人骨髓MSCs是通过使B细胞滞留于G0/G1期，而非诱导凋亡来抑制B淋巴细胞的增殖，且MSCs对B细胞功能的抑制作用有赖于MSCs与B细胞相互作用后产生的可溶性因子，这些因子可能为TGFβ1、HGF、PGE2或吲哚胺2，3二氧化酶(IDO)。
而Krampera等[16]研究表明，人MSCs对B细胞增殖的抑制作用并不依赖于细胞接触，而需要IFNγ的参与，后者能诱导MSCs产生免疫抑制性IDO。因此，对于MSCs对B淋巴细胞的免疫调节作用及相关机制有待进一步研究。
1.3 MSCs 对NK细胞的调节作用
1.3.1 MSCs对NK细胞增殖及其功能的影响：研究表明，人MSCs能抑制由IL2或IL15引起的NK细胞的增殖。Sotiropoulou等[17]研究发现，人骨髓MSCs可以剂量依赖性抑制NK细胞分泌细胞因子、下调NK细胞对靶细胞的杀伤作用。MSCs还可以对NK细胞亚群产生不同的影响[16，17]。Spaggiari等[18]研究表明，人骨髓MSCs不仅能抑制NK细胞的增殖，而且能抑制其效应功能的诱导。
1.3.2 MSCs对NK细胞调节的可能机制：研究[17]表明，人MSCs对NK细胞的抑制作用，需要细胞间接触或可溶性因子TGFβ1和PGE2。MSCs上的iCAM1与NK细胞上的LFA1的相互作用，有助于细胞因子的产生。Poggi等[19]将新分离出的NK细胞与人骨髓MSCs孵育后，前者能表达活化抗原CD69活化标记，并释放IFNγ和TNFα。此外活化的NK细胞受体NKp30、NKG2D和DNAM1在NK细胞介导的对MSCs的细胞毒性中起重要作用，MSCs能依次表达这些受体的相应配体，包括ULBP、PVR和nectin2。
1.4 MSCs对树突状细胞的免疫调节作用 MSCs能够抑制树突状细胞(dendritic cells， DCs)的分化、成熟和功能。Dazzi等[20]报道，与MSCs相互作用后DCs的细胞周期停止在G0/G1期。Jung等[21]研究了人骨髓MSCs对DCs趋化活性的影响，结果显示MSCs能抑制趋化因子CCL21 对DCs的定向迁移作用。Aggrawal等[11]研究表明，MSCs可下调髓样DCs对TNFα的分泌，上调浆细胞样DCs对IL10的分泌，这种效应导致Th1细胞产生的IFNγ减少、Th2细胞分泌的IL4增加以及Tregs数量的增加。MSCs对DCs的抑制作用，可能由可溶性因子所介导，但其具体机制有待深入研究。
2 MSCs在体内的免疫调节作用
MSCs可以通过对T细胞应答和B细胞应答的调节，以及对靶组织的旁邻辅助作用发挥临床疗效。Bartholomew等[22]研究发现，在对灵长类动物进行皮肤移植的同时植入同种异体MSCs，可以延长皮肤移植物的存活时间。Zappia等[23]在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)多发性硬化的发病初期，进行MSCs全身性输注，可以改善髓鞘少突胶质糖蛋白(oligodendrocyte glycoprotein， MOG)引起的EAE，并减轻T细胞、B细胞和巨噬细胞对中枢神经系统(central nervous system， CNS)的浸润。且在体外进行MOG肽再次刺激不能引起经MSCs治疗的小鼠淋巴结内T细胞的增殖，这可能是诱导了T细胞无应答的结果。Uccelli等[24]在被动转移实验中将MSCs注入小鼠体内，结果显示MSCs能抑制其体内致病性蛋白脂质蛋白(proteolipid protein， PLP)特异性抗体的分泌，并抑制PLP专一性T细胞的致脑炎能力。MSCs不仅可以迁移到淋巴器官，而且能进入发生炎症的中枢神经系统发挥对神经轴突的保护效应，且这种效应与MSCs向神经细胞的分化没有关系。此外，在体内对其他实验性疾病的研究也得出类似的结果。在对由链唑霉素诱导的糖尿病小鼠的研究中发现，MSCs能促进胰岛的内生性修复[25]。有研究[26]将MSCs与骨髓细胞同时输注给糖尿病小鼠，可以抑制β细胞特异性T细胞的增殖，并且能通过诱导其胰岛β细胞的再生而恢复胰岛素和葡萄糖水平。
3 MSCs在临床的应用
基于MSCs的体内迁移能力和多向分化能力，MSCs已经被用于治疗儿童严重成骨不全病。结果证实MSCs可以加快骨的生长、增加全身无机物的含量以及减少骨折的发生[27]。但目前MSCs主要应用在对急性、严重性移植物抗宿主病(GVHD)进行治疗的研究中，输注后的MSCs可能是通过抑制供体T细胞对受者正常组织的组织相容性抗原的反应性发挥其对GVHD的负性调节作用。还有研究[28]将MSCs的免疫抑制作用应用于Crohn病的治疗中，发现MSCs可以促进胃肠上皮细胞的再生。以上结论表明，MSCs具有潜在的临床应用价值，但对于在治疗过程中可能出现的不良反应有待进一步的研究。
4 结语
MSCs的研究开拓了干细胞的来源与临床应用的新领域，以其制备简便、来源广泛而日益受到科学界关注。MSCs所具有的多向分化和自我更新的特性，以及所具有的低免疫原性及免疫抑制作用，使得这类细胞在临床的组织再生和修复医学中具有十分广阔的应用前景，并且在免疫相关疾病的治疗中具有潜在的应用价值。因此，对于MSCs的生物学特性及免疫抑制机制的阐明，将对人类克服器官移植中器官短缺将对人类解决器官移植中器官短缺、再生医学中种子细胞来源困难以及自身性免疫疾病的治疗等临床难题，都具有十分重要而深远的意义。
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细胞免疫篇10
【关键词】 抗原递呈细胞 角膜上皮细胞 外周血单个核细胞 共同刺激通路
the immunological character of corneal epithelial cells
wang fan.
university eye hospital hamburgeppendorf,university of hamburg,hamburg 20246,germany
［abstract］objective:to investigate the capability of corneal cells to stimulate lymphocyte proliferation and the expression of costimulatory molecules on primary human corneal epithelial cells.methods:human corneal epithelial cells were cocultivated with peripheral blood mononuclear cells(pbmc). expression of hla class ⅱ antigens, cd40, cd154, cd80 and cd86 was measured by immunohistochemical staining,and the expression of such molecules above on rejected corneal grafts was contrastingly assessed. activation of lymphocytes was determined by measuring upregulation of cd69 by facs analysis.results:hlaⅱ expression was detectable on human primary corneal epithelial cells,and furthermore, upregualtion of costimulatory molecules cd40 and cd80 were also found after induction with γinterferon. both of hla and cd40 were expressed on rejected corneal grafts. t lymphocytes were activated by epithelial cells in the coculture system.conclusion:human corneal epithelial cells are involved in rejection process of the corneal transplantation. the immunological reaction is triggered by epithelial cells,and endothelial cells suffer as the targets.
［key words］antigen presenting cells(apc)；corneal epithelial cells；peripheral blood mononuclear cells(pbmc)；costimulatory pathway
预防和治疗同种移植排斥反应仍然是当今角膜移植术最具有挑战性的领域。WwW.133229.cOM几十年来利用动物模型研究已证实：角膜移植排斥反应像其他的器官移植一样，是个t淋巴细胞介导的免疫过程。同其他的移植组织一样，角膜移植排斥反应主要依赖于t细胞介导的同种异体反应［1］。人类白细胞抗原(hla)是免疫反应中第一信号的主要靶分子，特别是hla ⅱ类抗原在免疫细胞之间的反应中发挥着重要的调节作用［2］。有证据表明hla ⅱ类抗原仅限于角膜朗格罕氏细胞和血管内皮细胞。 但是，hla ⅱ类抗原也表达在同种移植排斥反应后的其他角膜细胞上［3］。除了t细胞活化，一个有效的免疫应答的发展也要求第二信号或共同刺激信号，对于t细胞的增生和细胞因子的分泌，它是非特异性的［4］。这个共同刺激信号是由b71(cd80)或b72(cd86)与t细胞表面它们的受体cd28和ctla4之间的反应所介导的。其他的t细胞表面分子，像cd154(cd40的受体)、cd2、lfa1和icam1构成了第二信号。角膜移植实验模型研究证明，阻断cd80/86cd28和ctla4ig之间的反应延迟了免疫反应，ctla4ig结合抗cd154抗体或者可的松治疗进一步推迟了鼠类角膜移植排斥反应的启动［5］。排斥反应的组织学研究表明，淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞已经被确认为优势的免疫细胞，导致了角膜组织细胞与浸润的淋巴细胞之间的免疫反应参与角膜移植排斥反应机制的假想［6］。但是，角膜细胞导致t淋巴细胞增生的过程尚未明了。本实验中，我们假设在角膜移植排斥反应过程中，角膜上皮细胞同样作为抗原递呈细胞参与了免疫反应。
1 材料与方法
1.1 角膜上皮细胞的培养
角膜上皮细胞来自内皮细胞数量不足、不适于角膜移植术的人供体角膜，或角膜移植术的角巩膜环。细胞培养于0.5 ml的培养液ham’s f12/dmem(gibco invitrogen)，添加10%胎牛血清fcs(gibco invitrogen)，10 ng/ml鼠上皮生长因子(biochrom)，5 μg/ml牛胰岛素(sigma)，0.1 μg/ml霍乱毒素(sigma)，5 mg/l转铁蛋白(sigma)，0.18 mmol/l腺嘌呤(sigma)，0.4 mg/l水合可的松(sigma)，2 nmol/l三碘甲状腺氨酸(sigma)，4 mmol/l谷氨酸(biochrom)和抗生素［7，8］。每周更换2次培养液。
1.2 提取外周血单个核细胞（pbmc）
从健康志愿者采集大约15 ml的新鲜血液，10 ml的histopaque1077缓慢加入10 ml的新鲜血液表面，400 g离心5分钟。将离心后中间的透明相转入另一个干净的离心管，pbs冲洗，细胞悬液250 g离心10分钟。细胞沉淀再次溶解于rpmi1640培养液(gibco invitrogen)，添加2 mmol/l l谷氨酸，1 mmol/l hepes液(gibco)，10%胎牛血清(gibco invitrogen)和抗生素。每次提纯细胞，应用台盼兰染色排除试验测定细胞的完整性和细胞数量。
1.3 共同培养角膜细胞与外周血单个核细胞
2×104人角膜上皮细胞培养于8孔培养板，部分细胞加入1 000 u/ml γ干扰素。3天后，新鲜提纯的pbmc(1×106/孔)和抗cd28单克隆抗体(1 μg/ml)加于角膜上皮细胞培养板中，继续进行无γ干扰素的培养。pbmc与预先固定的抗cd3抗体（4 μg/ml）和抗cd28抗体(1 μg/ml)作为阳性对照，培养无任何添加物的pbmc作为阴性对照。所有共同培养物保持培养在rpmi1640添加10%胎牛血清培养液中，继续培养2天。共同培养系统中的细胞悬液收集后用于荧光辅助细胞筛选分析，用70%甘氨酸乙醇缓冲液固定附着于培养板表面的角膜细胞和pbmc，或者10%的福尔马林固定做免疫组织化学分析。
1.4 免疫组织化学染色
1.4.1 培养2×104人角膜上皮细胞，生长至细胞融合状态后固定于70%甘氨酸乙醇缓冲液或10%的福尔马林。细胞分别与抗hladp、dq、dr(dakocytomation)、cd40(acris)的单克隆抗体孵育。稀释抗体于1∶100室温下孵育30分钟。根据说明书操作步骤应用lsab2试剂盒(dakocytomation)检测已结合的抗体：孵育生物素结合的链接抗体10分钟，碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白孵育10分钟，再伴随10分钟的底物色原溶液反应。苏木精对比染色，干燥后水溶性封片剂(merck)封片。相对染色强度分类为：-（阴性），+（弱阳性，<25%），（中度，25%～50%），（强,50%～75%），（极强，75%～100%）。
1.4.2 γ干扰素刺激的角膜细胞和pbmc共同培养系统实验也同法固定，分析cd80、cd86和cd154共同刺激分子通路表达。另外，检测共计15个来自穿通性角膜移植术患者的角膜植片。其中，10个角膜诊断为角膜内皮功能失代偿，5个角膜诊断为圆锥角膜。角膜植片固定于4%的福尔马林，石蜡包埋切片，检测hladp、dq、dr、cd40和cd154的表达。
1.5 荧光辅助细胞筛选分析（facs）
荧光辅助细胞筛选分析仪(bectondickinson facscalibur)进行双色分析。在pbmc与γ干扰素刺激的人角膜上皮细胞共同培养体系中，用抗cd3fitc（t淋巴细胞）和抗cd69pe单克隆抗体(活化的t淋巴细胞)来定量分析活化的t淋巴细胞的百分比。细胞分别和饱和浓度(1 μg/106 cells)的抗cd3fitc、抗cd69pe抗体以及阴性对照抗体在暗处4℃孵育30分钟。facs分析之前10分钟加propidium iodide(sigma)入样本，至最终浓度为1 mg/ml，根据前向角散射（forward scatter, fsc）的形态特征和propidium iodide的染色来分类淋巴细胞和单核细胞。应用cellquest软件(becton dickinson)进行数据分析。
2 结果
2.1 角膜排斥反应植片
圆锥角膜切片显示角膜各层无炎性细胞和hla ⅱ类分子，而排斥的角膜移植片展示强阳性的hla ⅱ类抗原表达。阳性细胞特别表达在角膜上皮的基底层，甚至在内皮层。在角膜实质层，阳性细胞临近于新生血管区域，另外一些阳性细胞位于血管内皮，还有一些散布于实质层各处，见图1。在植片边缘增生和血管化的结膜组织上，也有强烈的hla ⅱ类抗原阳性细胞。10个排斥反应的植片中有5个显示cd40阳性细胞位于角膜上皮层的表层。角膜各层细胞未见cd154阳性细胞。所有的圆锥角膜均为cd40和cd154阴性。
2.2 角膜上皮细胞的hla、cd40、cd80和cd86表达
无γ干扰素刺激的超过50%的培养的人角膜上皮细胞呈现hla ⅱ类抗原阳性，γ干扰素诱导以后的细胞显示了明显的表达上调，几乎100%的角膜上皮细胞为阳性染色，在样本中，可观察到阳性细胞或在细胞表面或在细胞浆中，见图2。无γ干扰素刺激下，所有的角膜上皮细胞为cd40阳性，γ干扰素处理后进一步提高了阳性表达。无论γ干扰素诱导与否，超过50%的角膜上皮细胞显示cd80阳性，而cd86为阴性，见表1。表1 免疫组化分析hladp、dq、dr(人类白细胞抗原)、cd40、cd80和cd86在角膜上皮细胞的表达（略）
2.3 共同培养系统的cd80、cd86和cd154表达
cd80/cd86、cd40和它的受体cd154是hla信号系统之外的第二信号系统，是t细胞增生和细胞因子分泌所必需的条件。在共同培养系统中，cd80和cd86均可被观察到阳性表达，却无cd154阳性细胞，见表2。表2 角膜上皮细胞和pbmc共同培养体系中的cd80、cd86和cd154的表达（略）
2.4 荧光辅助细胞筛选分析（facs）
cd69作为活化的t淋巴细胞的标记物，在pbmc和角膜上皮细胞共同培养之后被测定。最高水平的应答反应在pbmc与γ干扰素预先诱导的角膜上皮细胞共同孵育系统中被检测到，见图3。
3 讨论
临床上，角膜移植的排斥反应多数被认定为角膜内皮功能的失代偿。在此研究中，我们探讨了角膜上皮细胞的培养以确定它们在体外作为潜在的抗原递呈细胞的分子表达和能力。至今，尚缺乏对这些细胞的功能和免疫学特性的定义。
第一信号：hla ⅱ类抗原。我们发现hla ⅱ类抗原表达在未受诱导的人角膜上皮细胞上，且能够被γ干扰素提高其表达。实验性鼠角膜移植模型显示可诱导新生血管化和淋巴排泄通道发展的外界刺激也可以提高淋巴细胞的活化［9］。本研究中，我们发现排斥反应的移植片增厚，同时有新生血管长入，并有hla ⅱ类抗原表达阳性的细胞浸润。免疫淋巴细胞可以沿着这些新形成的血管从淋巴结循环至角膜并破坏免疫赦免状态，从而导致移植失败，植片被排斥。
第二信号：共同刺激通路。cd154：cd40通路在细胞介导的免疫反应的生成中是重要的，并且被认为是t细胞活化过程中的关键通路［10］。cd40被发现是抗原递呈细胞和间叶细胞的变种，包括b淋巴细胞、树枝状细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和上皮细胞［1114］。cd154是cd40的配体(cd40l)，是肿瘤坏死因子(tnf)家族成员。cd154和cd40结合诱导了信号通道的开启，从而导致cd80和cd86的表达升高［1517］。动物实验模型显示，阻断cd40：cd154通路足以诱导th1介导的接触性超敏反应耐受， 从而有效地延长植片的存活率［1822］。
两条证据强调了在移植排斥过程中，t细胞共同刺激通路中b7：cd28通路的任务。首先，体外药物阻断b7和cd28分子之间的反应，可诱导t细胞递呈同种抗原长时间持续的无反应性应答。其次，在血管化的器官移植后，b7分子可在24小时之内被诱导在血管内皮上，意味着t 细胞能够通过移植的器官本身接受共同刺激信号［23］。实验证明同种角膜移植术后结合抗cd80和抗cd86单克隆抗体治疗可有效地延长角膜移植片的存活［24］。这些结果说明了cd80和cd86共同刺激分子在角膜移植排斥反应中的重要作用。
角膜各层的排斥反应可各层独立发生，也可同时混合发生［25］。 通过共同培养研究得出结论，pbmc和角膜上皮细胞之间的接触可促进共同刺激分子在角膜细胞上的表达。荧光辅助细胞筛选分析和免疫组织化学染色显示人角膜上皮细胞刺激t淋巴细胞表达高水平的cd69。t细胞受体识别角膜上皮细胞上的hla/多肽复合体得到信号1，同时， 提供cd28抗体以结合角膜细胞上的cd80或cd86分子，得到信号2。信号1和信号2导致了t细胞活化和增生的阳性刺激。同理作用于cd40cd154第二通路。本研究阐述了角膜移植排斥反应的机理以及角膜上皮细胞作为潜在抗原递呈细胞的功能，供体角膜上皮细胞和受体t淋巴细胞的接触触发了移植片的同种免疫性反应，最终作用于角膜内皮细胞，导致内皮水肿，功能失代偿，移植失败。
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