细胞增殖论文范文10篇

细胞增殖论文范文篇1

【关键词】骨髓内皮细胞GMCSF细胞增殖

EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.

Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation

JExpHematol2007;15(3):622-625

目前，已有许多报道证明内皮细胞（endothelialcells,EC）、内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用来治疗缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血［1,2］也可以用于组织工程的血管构建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］报道，EPC对缺血心脏病进行治疗具有良好的效果，一方面减少了缺血组织的面积，同时改善了心脏的功能。Kalka等［5］则报道了利用EPC对肢体缺血的小鼠模型进行治疗，实验结果表明了EPC能显著增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。内皮细胞的来源有多种，可以从外周血、脐血及骨髓中获得［6］，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液（EndoM）体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞治疗疾病有一定的指导意义。

动物

昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。

主要试剂和仪器

IMDM为Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子（rmGMCSF）为R&D公司产品；vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；MTT、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；酶标仪为Awarens公司产品；CO2培养箱购自美国Forma。

小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养

用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取1×106个小鼠骨髓单个核细胞种入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培养体系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔1×104个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养15天后计数内皮细胞集落数，以≥50个细胞的聚合计为1个集落。

内皮细胞的形态观察及vWF的检测

培养的骨髓内皮细胞集落经WrightGiemsa染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免疫荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小时，加入vWF抗体，4℃过夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分钟,PBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株［7］为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。

不同浓度的GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响

取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5000个细胞，在基本培养体系（含1%浓度EndoM）的基础上分别加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，对照组不加入GMCSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养15天，于倒置显微镜下记数集落数，≥50个细胞的聚合计为1个内皮细胞集落。

GMCSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定

将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5000个/孔培养于96孔板，每孔0.2ml，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，对照组内不加。在37℃、5%CO2、饱和湿度下分别培养5天和10天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO150μl，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD492）。

生长曲线

纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5000个细胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。

细胞周期的流式细胞术检测

无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml培养体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的IMDM，实验组加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每组各10孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞，200×g,离心5分钟，用PBS洗涤细胞2次之后，用300μlPBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）约700μl（终浓度为70%），将细胞放于-20℃过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。

细胞传代培养

取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的IMDM培养液和100ng/ml的rmGMCSF，促使细胞融合，再按1∶4传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等细胞生长至融合，按1∶4传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。

统计学处理

实验数据为3次结果，以mean±SD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SPSS软件分析，P<0.05表示有统计学意义。

结果

细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（图3），说明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。

rmGMCSF对内皮细胞增殖的影响

小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行MTT的检测，结果表明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（P<0.01）（图4）。

GMCSF对EC细胞周期的影响

运用流式细胞仪检测细胞周期，观察GMCSF对EC细胞周期的影响。结果显示GMCSF使细胞进入S期的比例为9.3%，与对照组2.1%相比有明显差别。此结果说明GMCSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖（图5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.

体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响

图6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为30.25±0.55小时、31.67±0.26小时。第1代与第4代的细胞倍增时间相比，无明显差异，表明经体外扩增传代4次，仍能保持传代早期的增殖潜能。

Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.讨论

国内外对于骨髓内皮细胞的纯化报道较少，但已经进行了一些关于细胞因子对内皮细胞增殖影响的研究，如Yonekura等［8］报道VEGF可以促进内皮细胞的增殖，Rieck等［9］则报道bFGF可促进角膜内皮细胞的生长。我们此前曾报道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等对内皮细胞株的增殖有促进作用［10］。GMCSF对未经转化的骨髓内皮细胞增殖的作用尚未见报道。本研究中，我们用本室配制的培养基在较短的时间内纯化了小鼠的骨髓内皮细胞，vWF为阳性，并在此基础上观察了GMCSF对骨髓内皮细胞增殖的影响。应用基本培养基培养内皮细胞集落时，形成的集落数较少，加入rmGMCSF后，集落生成明显增多。MTT的结果亦支持GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长的刺激作用。细胞生长曲线的结果表明，在含GMCSF培养的条件下，内皮细胞生长的倍增时间为30.25±0.55小时，经4次传代后细胞倍增时间无明显延长，表明体外培养扩增4代后，细胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF对骨髓内皮细胞的体外增殖有明显刺激作用。文献报道内皮细胞表面有GMCSFR的存在，而内皮细胞本身也可以分泌GMCSF［11］。结合细胞周期测定的结果，可以认为，GMCSF促内皮细胞增殖的机制可能是GMCSF与GMCSFR结合，通过细胞内信号传递使更多的细胞进入S期来实现的。

【参考文献】

1LuttunA,CarmelietG,CarmelietP.Vascularprogenitors:frombiologytotreatment.TrendsCardiovascMed,2002;12:88-96

2RafiiS,LydenD.Therapeuticstemandprogenitorcelltransplantationfororganvascularizationandregeneration.NatMed,2003;9:702-712

3ZammarettiP,ZaischAH.Adult‘endothelialprogenitorcells’.Renewingvasculature.IntJBiochemCellBiol,2005;37:493-503

4KalkaC,MasudaH,TakahashiT,etal.Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization.ProcNatlAcadSciUSA,2000;97:3422-3427

5KawamotoA,TkebuchavaT,YamaguchiJ,etal.Intramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemia.Circulation,2003;107:461-468

6HristovM,ErlW,WeberPC.EndothelialProgenitorCells:isolationandcharacterization.TrendsCardiovascMed,2003;13:201-206

7王绮如，严燕，汪保和.小鼠骨髓内皮细胞系的建立.中国实验血液学杂志，1997；5：360-366

8YonekuraH,SakuraiS,LiuX,etal.PlacentagrowthfactorandvascularendothelialgrowthfactorBandCexpressioninmicrovascularendothelialcellsandpericyts.Implicationinautocrineandparacrineregulationofangiogenesis.JBiolChem,1999;274:35172-35178

9RieckP,OliverL,EngelmannK,etal.Theroleofexogenous/endogenousbasicfibroblastgrowthfactor(FGF2)andtransforminggrowthfactorsbeta(TGFbeta1)onhumancornealendothelialcellsproliferationinvitro.ExpCellRes,1995;220:36-46

细胞增殖论文范文篇2

论文摘要目的：探讨糖尿病足中医辨证分型与血管细胞核增殖相关抗原的表达差异。方法：对32例截肢的糖尿病足患者按中医辨证分为气血两虚瘀阻证、脉络瘀热证、脉络热毒证和气阴两虚瘀阻证，分别对其截肢肢体的胫后动脉应用免疫组化法对细胞核增殖相关抗原（Ki67）的表达进行观察、分析。结果：Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关，与血管炎症病变程度呈正相关。结论：炎症在糖尿症的大血管病变的过程中起到了重要的作用。

糠尿病足是糖尿病的严重并发症，据统计1996年全球糖尿病患者1．2亿，预计到2025年，将达到2．5亿以上，而大约15％的糖尿病患者将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽[1]。目前对于糖尿病足病因及发病机制虽然还不是完全清楚，但大家公认糖尿病合并大血管病变导致动脉粥样硬化是糖尿病足发病的最主要因素。现将2004年10月～2005年5月间我们收治的32例糖尿病足患者的截肢动脉标本的血管细胞核增殖相关抗原(Ki67)与其中医辨证分型的相关性研究情况报告如下。

1临床资料

1．1一般资料：32例均为天津医科大学代谢病医院和天津中医学院第一附属医院2004年10月～2005年5月间的住院患者，其中男性24例，女性8例；年龄50～86岁，平均年龄69．2岁；糖尿病病程最长30年，最短6年，平均18±2．4年。

1．2诊断标准：糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学会第二届糖尿病足会议所制订的“糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。

1．3截肢标准：参照国际糖尿病足工作组编写的《糖尿病足国际共识》中关于“大截肢的定义、标准和指标”[2]执行。

1．4中医辨证分型标准：参照《中医外科学(第七版)》及《中药新药临床研究指导原则·脱疽》之中医辨证分型方案分为气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证、脉络热毒证四型。

2观察方法

2．1标本取材：坏疽截肢标本32例，其中按中医辨证分型气血两虚瘀阻组10例，脉络瘀热组10例，气阴两虚瘀阻组4例，脉络热毒组8例，取各例标本下肢胫后动脉。标本经过10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，备用。

2．2设备、试剂：美国PENGUIN-600CL自动图像分析系统，细胞核增殖相关抗原(Ki67)抗体PV9000试剂盒DAB购于北京中山生物技术有限公司。

2．3免疫组织化学法：标本常规石蜡包埋，4μm连续切片，采用PV法进行免疫组化染色，染色过程严格按试剂盒染色程序进行，选取已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。观察细胞核增殖相关抗原(Ki67)，阳性物质呈棕黄色细颗粒状于细胞核表达，采用美国PENGUIN-600CL图像分析系统进行图像分析，选取病变处每500个细胞Ki67的阳性表达率作为其阳性表达指数。统计学处理应用SPSS10．0软件包进行方差分析。

3结果

3．1中医各证型所占比例以及年龄、性别分布：各证型比例，气血两虚瘀阻组10例（31．25%），脉络瘀热组10

例（31．25%），气阴两虚瘀阻组4例（12．5%），脉络热毒组8例（25．0%）。年龄、性别分布情况，见表1。

表132例患者年龄、性别分布n（%）

性别n50~60岁61~70岁71~80岁80岁以上男24（75．0）4（12．5）8（25．0）11（34．4）1（3．1）女8（25．0）1（3．1）3（9．3）4（12．5）0总计32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2免疫组织化学法观察各证型Ki67表达差异：具体情况见表2。

表2各证型Ki67阳性表达指数比较（%）

证型Ki67阳性表达指数脉络热毒4．87±1．01*气阴两虚瘀阻1．86±0．47脉络瘀热1．49±0．13气血两虚瘀阻0．30±0．18注：与气血两虚瘀阻型比较，*P<0．05。

气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中均可见部分细胞Ki67呈阳性表达，在脉络热毒证中表达指数最高，气血两虚瘀阻证中表达指数最低，二者比较具有显著性差异(P<0．05)。

4讨论

Ki67抗原为细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，分子量为345kd和395kd，其编码基因位于第10号染色体上。Ki67的表达出现于G1中期到晚期，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇，到G0期则不表达，半衰期为lh或更短[3]。有人认为它可能是具有蛋白结合特性的重要结构，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[4]，是一个反映细胞增殖的敏感指标。

在糖尿病足的不同辨证分型中气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中Ki67表达均呈阳性，在脉络热毒证中表达最强、气血两虚瘀阻证中表达最弱，二者相比具有显著性差异(P＜0．05)。根据Ki67阳性指数可以判断细胞增殖的活性，指明细胞增殖与糖尿病足动脉病变的关系。在糖尿病足的不同辨证分型中动脉的硬化闭塞程度由轻到重依次是脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证。Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关。而在通过对32例糖尿病足截肢的动脉进行病理学观察的过程中发现糖尿病足血管病变主要体现在中动脉的病理学变化，其中脉络热毒、气阴两虚瘀阻两证型以动脉周围及全层的炎症性改变为主；脉络瘀热、气血两虚瘀阻证以中膜钙化、平滑肌细胞萎缩、变性、坏死及胶原纤维增多及内膜粥样斑块形成为主，炎症表现不明显；而Ki67的阳性指数与血管炎症病变程度呈正相关。这说明炎症在糖尿病的大血管病变的过程中起了重要的作用，特别是在脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证两型，这对临床具有重要的指导意义。

5参考文献

1BoultonAJ.Thediabeticfoot：aglobalview.DiabetelMetabResRev，2000，16(1)：2．

2许樟荣，敬华．糖尿病足国际共识．中华糖尿病学会第二届足病第一次足病研讨会．2002，435．

细胞增殖论文范文篇3

【关键词】人乳铁蛋白；癌细胞；细胞增殖

人乳铁蛋白(HumanLactoferrin，hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白，乳汁中特别是初乳中含量最高，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。国外有学者将其应用于肿瘤患者的治疗，但是对其作用机制的研究较少。目前国内较少有关于hLF作用于细胞的报道，我们选用易早期转移的鼻咽癌(NPC)细胞作为研究对象，以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)作为正常细胞对照，观察hLF在体外是否具有抑制癌细胞生长的作用，探讨hLF抗肿瘤的作用机制，从而为肿瘤的治疗提供研究基础，为临床实验及应用提供新的理论依据。

一、材料与方法

1.1材料人鼻咽癌细胞(CNE)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)均购自中国科学院上海细胞资源中心。重组hLF(Lot:L0520，溶于PBS中，储存浓度5mg/ml，-20℃储存备用)和噻唑蓝(MTT，Lot:M2128)均购自Sigma公司。RPMI1640、胎牛血清购自HyClone公司。其他试剂均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养各细胞系均应用含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI1640培养基，5%CO2，37℃培养。

1.2.2MTT法检测细胞增殖设空白对照组和hLF干预组。待细胞生长至对数生长期，接种于96孔细胞培养板，接种数为5×104/孔。每组细胞设5个平行孔，各组细胞分别加入不同浓度的hLF(0，1.25×10-3,2.5×10-3，5×10-3，10×10-3，20×10-3，40×10-3g/L)，每孔均为200μl。作用24h后，加入MTT(5g/L，每孔20μl)，继续培养4h，测定A570nm吸光度。公务员之家

1.2.3细胞形态观察细胞经hLF处理后，倾去上层悬浮死细胞并用PBS洗两遍，加入新鲜培养基。同样处理对照孔细胞，将细胞置于倒置显微镜下，观察细胞形态的变化。

1.3统计学处理数据用x±s表示，组间比较用方差分析。

二、结果

2.1重组hLF对鼻咽癌细胞CNE、人肝脏细胞L02、中国仓鼠细胞CHO系的增殖能力的影响对CNE呈现剂量依赖性的抑制作用，而对正常细胞无抑制作用。人乳铁蛋白对各细胞体外增殖的影响与空白对照比较:1)P<0.05

2.2细胞形态学观察显微镜镜下可见，空白对照组癌细胞密集成片生长，如铺路卵石状，细胞膜圆润，透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。hLF处理组癌细胞形态发生明显的改变，随hLF浓度增加，细胞从正常的增殖旺盛的贴壁生长，逐渐表现为生长缓慢，黏附力降低，细胞变圆，细胞胞质粗糙，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差，细胞形态完整性受损，而正常细胞在细胞镜检图hLF作用下无显著变化。

三、讨论

hLF多种生物学功能通过免疫系统的激活与调节得以实现。Bezaul研究发现，乳铁蛋白能抑制鼠实体瘤的生长和转移。肿瘤内注射LF，可以明显的减小实体瘤的体积，且作用效果与LF干预天数相关。研究发现，乳铁蛋白的抗头颈部肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞增殖实现的。Wolf等发现，人乳铁蛋白通过阻断头颈部肿瘤细胞由G0到G1期的转化来抑制肿瘤细胞的增殖。人乳铁蛋白对鼠的SCC细胞系生长的抑制作用，与剂量成正相关；而且人乳铁蛋白抑制头颈部细胞癌的作用是通过直接的细胞毒作用及系统性的免疫调节作用实现的。

Varadhachary等人做了大量的口服临床试验，证实乳铁蛋白无药物相关的有害作用。鼻咽癌作为头颈部肿瘤之一，其恶性程度较高，早期即可出现颈部淋巴结转移，临床上有转移至骨盆、肺、肝等多器官的病例。选用鼻咽癌细胞作为研究对象，具有一定的代表意义。

本研究结果显示，人乳铁蛋白可以抑制鼻咽癌细胞增殖，且呈剂量依赖性，对正常细胞的增殖无明显抑制作用。这一结果，为开发乳铁蛋白的抗癌功效提供了理论依据。

【参考文献】

细胞增殖论文范文篇4

HBV感染患者和几乎全部HCV携带者有可能发展为肝硬化，亦是造成肝硬化发病率居高不下的主要原因，而肝硬化中约30%患者可并发肝癌［1］.AFP升高、肝硬化伴细胞不典型增生或细胞增殖活性增高成为肝癌发病的高危因素［2］，因而慢性肝病、肝硬化的防治十分重要论文.如何延缓肝纤维化形成进程或逆转至正常，已成为肝硬化及肝癌防治的中心问题.因此，研制有效且可长期服用的预防制剂也越来越引起人们的关注.健脾扶正法是中医临床防治肝硬化与肝癌常用的方法之一［3］.本科室根据中医基础理论及临床实践研制的以健脾益气立法，由淮山药、山楂、大枣等药食同源中药组成的肝复健冲剂，在临床肝硬化防治过程中取得较好疗效.

1材料和方法

1.1材料SD雄性大鼠，体质量150~180g，由第四军医大学实验动物中心提供.二乙基亚硝胺(DEN)购自Sigma公司.天狼红（解放军第475医院赠送）.PCNA检测试剂盒购自DAKO公司.中药饲料：肝复健冲剂按30.4g・kg-1均匀混合于基础饲料中压制而成（第四军医大学实验动物中心提供）.

1.2方法

1.2.1模型建立大鼠适应环境3d随机分为模型组（Model）及中药组(Ganfujian，GFJ)，每组各30只，分别以0.1g・L-1DEN自由饮水，同时分别给予基础饲料或含中药的饲料喂养.16wk时停用DEN饮水及中药饲料.考虑到造模过程大鼠有一定死亡率，分别于建模开始后每4wk两组各处死5只大鼠，剩余大鼠留继续观察.取肝组织固定于100g・L-1甲醛溶液，石蜡包埋，切片厚4μm.常规HE染色、切片胶原特殊染色及免疫组化染色.

1.2.2切片胶原染色按天狼红饱和苦味酸法［4］.普通石蜡切片,厚4μm;常规脱蜡至水,0.1mol・L-1天狼红饱和苦味酸,避光室温孵育20min;不洗,950mL・L-1乙醇脱水,二甲苯透明,封片.

1.2.3PCNA免疫组织化学染色取材肝组织固定于100mL・L-1缓冲甲醛溶液24h，常规石蜡包埋，切4μm厚切片，二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水；染色方法为免疫ABC法.以0.1mol・L-1PBS取代一抗作阴性对照，以正常大鼠肝组织作正常对照.

1.2.4染色结果判定及计算机图像分析肝脏背景为淡黄色，胶原阳性着色呈红色,采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统,随机选择5个汇管区进行染色胶原的定量分析(面积占视野面积),取其均值.PCNA阳性着色为覆盖胞核的棕黄色颗粒.用网格（10×10）测试法计数阳性肝细胞.切片各选择10个按同一方向移行、不重叠的高倍镜视野（×40），记数阳性及阴性细胞数（100个细胞）.

统计学处理：采用SPSS统计分析软件对所获得的数据进行组间秩和检验.

2结果

2.1大鼠肝纤维化过程组织形态学变化模型组大鼠使用DEN4~8wk时肝表面由平滑逐渐变为粗糙，可见小颗粒，呈局灶性.光镜下肝细胞肿胀，空泡变性，局灶性坏死，伴炎细胞浸润，并逐渐出现纤维组织增生.12wk时40%大鼠已出现明显肝硬化，肝表面更加粗糙，肝脏增大、肿胀，色暗或淡.16wk时大鼠均有肝硬化表现，结节增多变大，肝脏缩小，组织学有大量形态不一，大小排列不齐的假小叶形成.部分大鼠肝脏已出现早期癌结节，镜下可见少量癌细胞增生.中药组大鼠各时期肝脏损害均较单纯诱导组轻，12wk无肝硬化大鼠，16wk50%大鼠出现肝硬化，但未发现癌变.

2.2大鼠肝纤维化过程肝内胶原沉积变化模型组大鼠4wk肝内即出现少量红色胶原阳性染色，多集中于汇管区.随着肝内病变加重，假小叶的形成，肝脏沉积的胶原逐渐增多，16wk病变以结节性肝硬化为主，切片胶原沉积量亦达到顶峰.中药组大鼠肝内病变较模型组明显减轻，肝硬化发生晚，肝内胶原沉积量少，在4wk及12wk两组间差异有统计学意义(P<0.05,Tab1).

表1两组大鼠肝脏胶原沉积的比较(略)

2.3大鼠肝纤维化过程肝细胞阳性表达PCNA情况在模型初期即可见少量肝细胞PCNA阳性着色，随着模型进展，大鼠肝脏PCNA阳性表达的肝细胞数目逐渐增加，并在12～16wk呈明显攀升趋势.中药组大鼠PCNA阳性的肝细胞数在各期均低于模型组，其中12～16wk差异显著(P<0.05,Tab2).

表2大鼠肝细胞阳性表达PCNA的比较(略)

3讨论

肝纤维化是许多慢性肝病重要的中间环节，是由于肝内纤维生成与降解失衡，致使过多的胶原在肝内沉积，常伴于炎症并可发展为肝硬化.肝纤维化形成作为肝硬化发展过程中的一个重要现象，与肝硬变的发展是平行的［5］,因此肝纤维化程度的精确了解是慢性肝病研究不可少的.然而常用的血清学指标和组织学纤维化分级标准却难以直接、准确反映肝脏内

胶原沉积变化.本文采用切片胶原图像定量处理方法具有准确、客观、数据可信度高等特点，能精确反映肝内胶原沉积（主要为I,III型胶原）变化［4］.本实验中应用该法检测DEN诱导大鼠肝纤维化过程中肝内胶原沉积的变化，结果显示随着肝细胞变性、炎症高峰到桥接性坏死、肝硬化形成，肝脏形态学改变与胶原沉积呈同步变化.

细胞的异常增殖是癌变发生的主要特征.PCNA是一种从细胞核中分离纯化出来的多肽链，直接参与细胞增殖过程中的DNA复制，其含量和阳性表达是反应G1晚期和S早期肝细胞增殖的常用指标［6-8］.在本模型中初期即出现少量肝细胞PCNA阳性着色，而随着模型进展，尤其在12~16wk（肝硬化期）PCNA阳性肝细胞数明显增加，与肝内病变进展呈一致变化.即随着肝硬化的形成，异常增殖肝细胞数目呈明显增加趋势，提示从肝脏炎性改变、肝纤维化至肝硬化的形成，异常增殖的肝细胞数目不断增加，癌变的可能性亦逐渐增加.

近年来中医药防治肝纤维化取得了不少进展，也积累了丰富的经验，从单味药、复方及其有效成份等入手，初步发现活血化瘀与扶正补虚两类中药具有良好的防治肝纤维化作用.由于采用中草药治疗慢性肝病在临床上有肯定疗效，且又具有无明显毒性反应或副作用的优点，因此，是防治肝纤维化较有希望的治疗手段，已引起国内外肝病研究人员的极大兴趣［9］.健脾扶正法是防治肝硬化与肝癌最常用的方法之一，曾证明对肝硬化和DEN致大鼠肝癌前病变的发生可能有一定的预防作用［10-12］.肝复健冲剂以健脾益气立法，组方均为药食同源中药，具有低毒、可长期服用的特点.本实验结果显示该冲剂可明显减少肝内胶原沉积，延缓化学致癌物DEN所致大鼠肝纤维化过程，同时对肝硬化形成期阳性表达PCNA的肝细胞数目亦有显著抑制作用.提示该冲剂可通过减轻化学物质引起的肝内炎性病变，减少肝内以I、III型为主的胶原沉积，延缓和减轻肝纤维化过程，同时可抑制肝硬化形成及演变期肝细胞可能的恶性增殖，达到阻抑肝硬化形成及其继续发展为肝癌的作用.

【参考文献】

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细胞增殖论文范文篇5

【关键词】大蒜素;胃癌;BGC823细胞

大蒜在我国民间药用已有三千多年的历史，在《本草纲目》和《验方新编》中就有关于大蒜药用价值的记载[1]。大蒜素(又名大蒜注射液)是对大蒜进行重整获得的挥发油，有效成分为大蒜辣素。大蒜辣素不仅具有抗菌消炎的作用，而且可以抑制多种癌细胞的生长并诱导其凋亡。胃癌的发生和发展与细胞凋亡关系密切，诱导细胞凋亡已成为治疗胃癌的新手段。大蒜素作为一种可诱导细胞凋亡的天然药物，有望为胃癌治疗开辟一条新途径[2]。本研究将对大蒜素抑制胃癌细胞的生长作用加以探讨论文。

1材料与方法

1.1材料

大蒜素注射液(三硫二丙烯)购自安徽华源医药有限公司，BGC823细胞为吉林医药学院检验系细胞培养室冻存细胞株。

1.2细胞生长状态观察

常规培养胃癌细胞至对数生长期[3]，将对数生长期细胞均匀的分成7组(每组设有1个对照孔和5个实验复孔)，以每孔106个细胞接种于96孔细胞培养板中，分别向7组中加入大蒜素使终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、40μg/mL，其中对照孔中只加入相同体积含10%小牛血清的1640完全培养液，分别于培养24h、48h、72h和96h时在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。

1.3瑞氏染色观察

取对数生长期细胞,同样将细胞均匀分成7组，分别接种于灭菌处理后放有盖玻片的细胞培养皿中,加入大蒜素使终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、40μg/mL，培养24h、48h、72h和96h。终止培养后取出盖玻片，自然干燥，滴加瑞氏染液染色1min，再滴加等量的PBS(磷酸盐缓冲液)，轻轻晃动玻片，混匀，静置5min;水洗、吸干、镜检观察并照相。

1.4MTT法检测

取对数生长期细胞，以106个/mL细胞接种到96孔板，每孔体积200μL。按照药物作用浓度设置7个实验组，使大蒜素终浓度为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、40μg/mL。每个浓度组分别设置5个实验复孔，并设置1个调零孔。分别于培养24h、48h、72h加20μLMTT溶液,继续培养4h后加二甲基亚砜，微量振荡器振荡10min，在490nm酶联免疫检测仪检测,记录OD值，并求出生长抑制率(IR),IR(%)=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%,以时间为横轴，IR为纵轴绘制细胞生长的抑制曲线,并计算出药物的半数抑制浓度(IC50)[4]。

2结果

2.1大蒜素对BGC823细胞生长状态的影响

倒置显微镜观察经不同浓度大蒜素作用后48h细胞的形态，与对照组对比，细胞间隙变大，细胞浆中出现颗粒样变化，细胞形态改变，体积变小、变圆，有的呈悬浮状态，见图1。对照组15mg/L大蒜素组图1BGC823细胞生长状态(40×)

2.2瑞氏染色

瑞氏染色法染色后，经大蒜素作用48h的细胞出现退行性变，细胞体积变小、变圆，胞质浓染、结构模糊、边缘不清晰、核固缩、深染等特征,见图2。对照组15mg/L大蒜素组图2BGC823细胞生长状态(40×)

2.3MTT检测

MTT检测结果显示：大蒜素对胃癌细胞具有明显的抑制增殖作用，并且随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用越强、抑制率越大，并求得药物半数抑制浓度(IC50)为15mg/L。见图3。图3不同浓度大蒜素对BGC823细胞的抑制作用

3讨论

胃癌是常见的消化道肿瘤，在我国发病率较高，临床上主要采用外科切除、药物化疗和放射治疗等方法治疗胃癌，手术切除如不彻底,易复发，而药物化疗和放射治疗手段除了杀伤肿瘤细胞以外，对宿主的免疫系统也造成了伤害，且治疗效果不甚理想。而大蒜作为日常生活中常见的食物，不仅仅价格低廉，而且其主要成分大蒜素，含有一些特殊的具有生物活性的物质，如含硫化合物(蒜氨酸、蒜油、蒜素、阿霍烯等)、微量元素(高含量的锗、硒、磷、镁等)、超氧化物歧化酶(SOD)等，使大蒜具有广泛的药效，尤其具有良好的抗菌消炎和抗肿瘤的作用[5]，先前已有资料证明大蒜素对肝、胃、结肠、宫颈、乳房等多种肿瘤均有抗癌活性,作用广泛[6]。

本实验观察到胃癌细胞经不同浓度的大蒜素作用后，细胞形态发生明显的改变，与对照组的细胞相比可见细胞体积明显变小、变圆，胞浆中出现明显颗粒样和空泡样改变，有的甚至悬浮，说明不同浓度的大蒜素对胃癌细胞都具有杀伤作用[7]。另外，通过细胞生长曲线的绘制、MTT检测，进一步证明了大蒜素对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用，并且随着大蒜素浓度的梯度增加和作用时间的延长，其抑制作用也随之增大。生长曲线是观测细胞在一代生存期内增生过程的重要指标，MTT比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法,通过这些实验方法都能进一步证明不同浓度大蒜素对胃癌细胞增殖具有抑制作用，为进一步研究大蒜素抑制胃癌细胞生长机制奠定基础。

本实验证明了大蒜素对胃癌细胞BGC823增殖具有抑制作用，随着免疫组化技术、分子生物学等技术的发展，对各种药物的药理作用机制研究已经广泛而深入，所以应进一步明确大蒜素中各种成分的药理作用，并且进一步探讨大蒜素抑制胃癌细胞生长机制，从而开发出新的抗癌药物，对肿瘤的治疗产生深刻的影响。

【参考文献】

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细胞增殖论文范文篇6

【关键词】孕中期羊水;间充质干细胞;脐血

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有多向分化潜能,是细胞治疗及基因治疗的理想种子细胞。已有研究显示羊水[1]和脐血[2]可以分离出MSCs，那么这两种来源的MSCs有哪些异同呢?为此本研究将对孕中期人的羊水及新生儿的脐血进行间充质干细胞的分离与培养，并对其基本生物学特性进行了比较研究，为组织工程选取种子细胞提供基础性实验依据，现报告如下论文。

1材料与方法

1.1标本来源

羊水标本取自2008年3月至2010年3月吉林医药学院附属465医院妇产科，妊娠在15～22周的引产羊水35份;32份脐带血标本取自正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性的孕妇。取标本前均征得孕妇本人同意，研究获得吉林医药学院附属465医院道德伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器

PRMI1640(GIBCOBRL)，胎牛血清(GIBCOBRL)，马血清(GIBCOBRL)，1.077×103g/LFicoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，细胞化学染色试剂盒(BASO公司)，CO2培养箱(FormaScientific公司)，荧光倒置显微镜(TE300,Nikon公司)。

1.3孕中期羊水MSCs的分离与培养羊水标本在室温下1500r/min离心5min，弃上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI1640培养液，制成密度为(1～5)×105个/mL的单细胞悬液，接种到φ60mm塑料培养皿中，置饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养。第3天首次换液，去除非贴壁细胞，当类成纤维样细胞铺满平皿达80%时，用0.25%的胰酶消化，用PRMI1640培养液制成浓度为4×104个/mL的细胞悬液，接种到新培养皿中，记为第1代(P1)。每3d用含10%FBS的PRMI1640培养液换液1次，细胞生长达到90%融合时按1∶4的比例传代。

1.4新生儿脐带血MSCs的分离与培养无菌条件下取正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血50～80mL，放于含CPDA1复合抗凝剂的采血袋中，所有样本均在采集后12h内进行分离;将脐血用等量的DHank′s液稀释制成细胞悬液,细胞悬液沿管壁缓慢加入到相对密度为1.077×103g/LFicoll人淋巴细胞分离液上层,其比例为2∶1,注意液面清晰分层，以1500r/min进行梯度离心20min，然后缓慢吸取中间交界面细胞悬液至另一离心管，获得含人MSCs的单个核细胞悬液，加入含10%FBS的PRMI1640完全培养基,吹打并计数。以5×105个/mL的密度接种到φ60mm培养皿中，48h首次换液,以后每3d换液。换液用含10%FBS的PRMI1640完全培养基。在细胞80%左右融合时,用0.25%胰酶室温消化5min，适量小牛血清终止消化反应，吸管轻轻吹打，转入离心管中1500r/min离心10min，弃上清，按1∶3比例传代。

1.5MSCs的生长曲线测定将传至3、5、8代的MSCs制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/mL，接种于24孔培养板，每孔0.5mL;每天取3孔，消化后进行细胞计数，共8d。以时间(d)为横坐标,细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

1.6MSCs的代谢情况检测传3代的羊水MSCs按5×104/mL密度接种于φ35mm的培养皿中。2d后分别对培养皿中的细胞进行POX、SB、PAS、αNAE和ALP细胞化学染色，显微镜观察、拍照。同样，新生儿脐血源性MSCs取第3代以后细胞进行细胞化学染色分析。

2结果

2.1羊水MSCs

从羊水中分离出的细胞,将之接种于PRMI1640培养基中,2～3d部分细胞开始贴壁,4～7d逐渐出现贴壁的MSCs,开始为圆形,逐渐伸出突起,呈成纤维样、梭形，最初散在分布,后逐渐在局部形成集落生长(图1)。一周以后MSCs迅速扩增(图2),约10d后可达80%～90%融合,扩增变缓,即可传代。传代后羊水MSCs5～6h即可贴壁,2～4d生长迅速,1周后即可再次传代。形态为均一的成纤维样的MSCs，呈漩涡样生长,即为羊水源性的MSCs(图3)。

2.2新生儿脐血MSCs

脐血的单个核细胞悬液接种于φ60mm的塑料培养皿中，原代培养6d后，在倒置显微镜下可见单个或少量呈集落生长的贴壁细胞，形态大多为椭圆形或短梭形，凸出于培养皿表面。粘附于贴壁细胞之上的造血细胞和其他细胞在换液的过程中逐渐被清除，10d后就形成细小纤维状小集落，20～25d后细胞集落不断地扩大并形成融合超过80%，细胞形态大多呈短梭形。传代培养后的脐血MSCs12h即可贴壁，4～14d生长迅速,10d后即可再次传代,细胞呈短梭形生长(图4，25×)。10代左右细胞生长状态开始急剧衰退,细胞颗粒化严重，增殖速度严重放慢。

2.3MSCs的生长曲线

人羊水源性MSCs生长曲线呈“S”形，传代后第1、2天为潜伏适应期，从第3天开始细胞增殖加速并进入对数生长期，第6至7天达到高峰，以后进入平台期。通过对第3、5、8代新生儿脐血源性的MSCs细胞计数,绘制的生长曲线形状与羊水源性MSCs生长曲线形状相似，呈S形(图5);传代第1至3天为生长停滞期，第4对14天为快速增殖期，后即进入平台期。随传代次数增加,MSCs的增殖能力有所减弱。第3、5代细胞增殖能力最强,第8代细胞较第3、5代细胞增殖能力减弱较明显，但亦呈“S”形。

2.4不同源性MSCs的生物化学特征

羊水源性MSCs及脐血源性MSCs具有相同的生物化学特征，染色结果都显示：POX、SB染色为阴性，αNAE、PAS为强阳性，ALP染色有1%为弱阳性，这与文献报道的MSCs的染色特点相一致[34]。进一步证明了培养出的成纤维样细胞为MSCs。图1.4d羊水贴壁细胞图2.7d羊水贴壁细胞图3.10d羊水贴壁细胞图4.10d脐血贴壁细胞图5.羊水脐血MSCs生长曲线

3讨论

间质干细胞具有多向分化潜能，是细胞组织工程的首选种子细胞之一。然而人骨髓中的MSCs含量较少，大约104～105个骨髓单个核细胞中只含有一个MSCs[5],这显然难以满足细胞组织工程的实际需要，因此寻找MSCs的来源和如何在体外分离扩增MSCs就显得较为重要。为了更好的得到MSCs，我们分别对孕妇的羊水和新生儿脐带血进行了MSCs的分离，并对所得的MSCs生物学特性进行了比较，以期得到更好的MSCs来源。

间充质干细胞的分离,我们主要参考了Friedenstein建立的MSC分离方法并做了适当的改进，利用MSCs的粘附性来获得MSCs。本实验将羊水细胞和脐血单个核细胞接种于含10%胎牛血清PRMI1640培养基中，3d后去除未贴壁细胞，待细胞单层长满80%后，用胰酶消化传代，本法可去除一些贴壁的非间质干细胞，经过几次传代后即可得到相对较纯的MSCs。

本研究中采用孕妇的羊水和新生儿脐带血标本都可以成功地得到MSCs，这与国外报道的相一致[6]，可作为未来组织工程学的一个不可或缺的来源[7]。两者在形态和生物学特性上都非常类似，但是脐血源性的MSCs形态呈短梭形。明显不同的就是人羊水源性MSCs增殖能力明显要优于脐血源性MSCs,这一点可以从生长曲线与传代能力都得到较好体现。人羊水源性MSCs群体倍增时间较脐血源性MSCs倍增时间短，且人羊水源性MSCs的传代能力明显强于脐血源性MSCs。

综上所述，与脐血源性间充质干细胞增殖能力相比,羊水MSCs的获得更为可观，是组织工程种子细胞的又一可靠来源。

【参考文献】

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细胞增殖论文范文篇7

论文摘要：就近年来中药抑制细胞调亡的文献进行整理，从中药调控细胞凋亡途径、影响凋亡信号传导、调控凋亡相关基因表达、调控细胞因子4个方面进行系统综述。认为中药在抑制细胞凋亡方面有较好的作用。

细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式，是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程，在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞，或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多，研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而抑制细胞凋亡，维持机体内平衡，阻止组织病理过程的恶化。

1通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡

机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径，其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。

1．1通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡许多研究结果均表明，线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用，是最重要的途径之一，其通过Cyt－C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下，会使caspases激活，胞质Ca2+水平升高，产生ceramide，诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放，使能量产生中断，线粒体内膜跨膜电位(△ψm)的下降，并导致外膜破裂，释放出Cyt－C等各种活性蛋白，Cyt－C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt－C在dA7P存在下，与凋亡蛋白酶活化因子－1(Apaf－1)结合，诱导caspase－9前体的寡聚化，并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase－9，继而活化Caspase－3，启动Caspase的级联反应，引起细胞凋亡。

有研究以缺氧／缺糖再给氧为模型，观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca2+浓度，抑制细胞凋亡，提高线粒体膜电位和活性，认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。

1．2通过调控死亡受体途径抑制凋亡凋亡还可以通过死亡受体通路介导，现知死亡受体途径主要包括Fas／FasL途径和TNFa／TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas／CD95、TRAlL－Rs等，当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后，将凋亡信号由胞外传人胞内，在连接分子的媒介下，激活Caspase，导致细胞凋亡。1．2．1通过调控Fas／FasL途径抑制凋亡中药可以通过调控Fas／FasL的表达，抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时凋亡相关基因Fas／FasL蛋白表达影响研究发现，结果缺氧4.5h及10.5h后，心肌细胞Fas／FasL蛋白的阳性表达指数(positiveexpressionindex，PEI)参附注射液组明显低于缺氧组；参附注射液可通过下调Fas／FasL蛋白表达，参附注射液组还见到caspase-3活性下降，提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas／FasL-caspase-3途径实现的。

1．2．2通过调控TNFa／TNFR途径抑制凋亡研究还发现中药通过调控7NFa／TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现，枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达，降低老年大鼠T细胞的过度凋亡，从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。

2通过影响凋亡信号传导抑制凋亡

细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下，激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇－3－激酶(P13K)／蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径，RAS－MAPK途径，NF－κB途径，N()途径等。2．1P13K／PKB途径P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，PKB是P13K的靶蛋白之一，P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子；其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现，认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物－1(IRS－1)、P13K水平，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素信号转导有关。

2．2RAS－MAPK途径丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK，MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK，jNK／SAPK，P38。有研究探讨肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(HSCsMAPK)通路中ERK、JNK的活化情况，以及丹参药物血清对磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P－ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P－JNK)表达，肝纤维化大鼠经丹参药物血清干预后较对照组均显著降低，正常大鼠经丹参药物血清干预后较正常大鼠对照组也均显著减少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持着较高的磷酸化水平，两者介导的信号转导通路是HSCs活化和增殖的重要途径之一；阻断MAPK信号通路可能是丹参治疗肝纤维化的重要作用途径之一。

2．3NF－κB途径在大多数细胞类型中，NF－κB在胞浆中与抑制亚单位lκB结合形成无活性的复合物。在TNF诱导的细胞凋亡过程中，可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF－κB能从复合物中释放并活化，活化的NF-κB迅速转位进入胞核，继而作用于靶基因，诱导基因表达，编码前炎性蛋白，如IFN，细胞因子，生长因子，细胞黏附因子，红细胞生成素与MHC－I类分子等，抑制NOS的生成，并诱导编码凋亡抑制蛋白C－IAPl，C－IAP2基因表达，诱导抗凋亡基因Bcl－2，Bcl－x1的表达。探讨人参皂甙对心血管疾病的保健和防治机制的研究发现，结果显示内毒素脂多糖(LPS)促使HUVECNF－κB向细胞核内转移，人参皂甙则能阻止LPS诱导的NF－κB核内转移；能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF－κBDNA结合活性；IJs能使HUVl3CPAl－1蛋白及mRNA表达显著增强，人参皂甙则使LPS的这种作用明显减弱。认为人参皂甙对心血管疾病的防治机制之一可能是通过NF－κB途径拮抗LPS致HUVECPAI－1的表达。

2．4NO途径NO对细胞的增殖与存活有双重效应。它可以通过多种机制诱导细胞的凋亡，但在一些特定环境中，NO又可在一些细胞类型中作为凋亡的潜在抑制剂。川芎嗪对多巴胺诱导PCI2细胞凋亡的保护作用的研究发现，认为川芎嗪可抑制DA引起的PCI2细胞凋亡，此作用可能与降低NO生成有关。NO的抗凋亡作用还与caspase水平有关。在死亡配体依赖与配体非依赖的凋亡中，NO均能抑制caspase的活性。黄芪、当归注射液可通过促进NO的生成、诱导caspase3表达促进体外培养的血管平滑肌细胞凋亡。同时还可通过上调bcl－2表达而抑制其阻止氧自由基破坏细胞结构，起抗细胞凋亡作用，通过抑制粘着斑激酶的表达，调节其对细胞增殖和凋亡的影响。已发现，NO在某些细胞类型的线粒体中起抗凋亡作用。如在鼠肝线粒体中，生理浓度的NO能可逆性的抑制PTP的开放，机制是通过膜的去极化与Ca2+的积聚作用。

2．5其他胞浆中游离的Ca2+作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用；细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂，钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂，也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶，导致染色质结构完整性的丧失。葛根素及由红参和麦冬有效成分制成的参麦注射液对脑缺血／再灌注中神经细胞均有一定的抑制作用。作用机制可能是阻断Ca2+内流和／或胞内钙库的释放。从抑制神经细胞内钙超载。

目前发现在某些细胞中，cAMP是引起细胞凋亡的信号。细胞内cAMP浓度的上升可激活cAMP依赖性蛋白激酶，使靶细胞上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化，从而影响这些蛋白的生物学功能，引起细胞凋亡。黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响；但可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值；其机制可能是降低肾上腺素模型小鼠肝脏中cAMP的含量，通过抑制凋亡减轻高血糖肝脏的损害。

3通过调控凋亡相关基因表达抑制凋亡

Bcl－2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bcl－2和bcl－xL是Bcl－2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl－2家族中重要的促凋亡基因。另外，p53、c－myc、Fas、c－fos等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究用黄芪注射液进行治疗贫血小鼠，提示黄芪注射液可通过上调抗凋亡蛋白Bcl－XL表达减轻骨髓有核细胞的凋亡，并促进红系、巨核系造血。丹参对持续性非卧床式腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化模型大鼠腹膜间皮细胞凋亡有抑制作用，其机理是下调Fas基因的蛋白表达，上调Bcl－2基因的蛋白表达。c－los是一种转录调节因子，正常情况下在脑内水平极低。c－fos不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能，导致细胞凋亡。有实验表明。c－fos可能诱导脑缺血一再灌流时海马CAl区细胞晚期促凋亡基因的表达，共同调控细胞凋亡，而中药有效成分葛根素可通过下调凋亡相关基因c－fos的表达，减少神经细胞的凋亡，从而具有保护神经的作用。

4通过调控细胞因子抑制凋亡

细胞因子(cytokine，CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等。清热解毒方泻心汤可显著降低实验性AS大鼠血清MAD水平，增强SOD活性，降低OX2LDL及N()水平等，从而抑制血管细胞过度凋亡。细胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多种生物学功能，TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡，其中TNF-α与凋亡的关系更为密切，能与TNF受体结合，引起细胞内贮存Ca释放，引起细胞内游离Ca2+浓度升高，从而激活Ca2+依赖性核酸内切酶，引起DN段断裂和细胞凋亡。此外，与凋亡有关的细胞因子还有IL-2、IFN-γ、TGFβ1，NK细胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白细胞黏附因子)、CAM-1(细胞内黏附分子)、GM-CSF(粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子)、NGF(神经生长因子)、SCF(干细胞因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、核转录因子xu等。黄芪对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(AIJ)后大鼠肺组织细胞有保护作用，其机制是减少促炎因子TNF-α、IL-1β的释放，抑制肺泡上皮细胞凋亡。地黄饮子对阿尔茨海默病动物模型细胞凋亡抑制的机制，与上调核转录因子κB、hsp70mRNA的表达，抑制线粒体释放细胞色素C，控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有关。

细胞增殖论文范文篇8

论文摘要：细胞凋亡是糖尿病慢性并发症发病机制之一。糖尿病肾病(DN)、糖尿病心肌病、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病神经病变等多种DM慢性并发症的发生与细胞凋亡密切相关。其中凋亡相关基因BCL-2、Bax、Fas、BCL-XL、Pax-3及一些胞内信号转导分子等可能对组织细胞的凋亡进行调控。

糖尿病慢性并发症发病机制极为复杂，细胞凋亡是近年来关注的又一热点。由糖尿病引起的细胞凋亡有3种途径：一是有线粒体介导的内源性细胞凋亡激活途径，二是由死亡配体和死亡受体结合的外源性细胞凋亡激活途径，三是由内质网介导的细胞凋亡激活途径。本文对糖尿病肾病(Diabeticnephropathy，DN)、糖尿病心肌病、糖尿病视网膜病变(Diabeticretinopatthy，DR)、糖尿病神经病变等多种糖尿病(DM)慢性并发症与细胞凋亡的关系进行阐述，以期为中医药措施的干预治疗提供参考。

1细胞凋亡与糖尿病肾病

糖尿病肾病(DN)是DM的主要慢性并发症之一，超过了30%的终末期肾功能衰竭是由糖尿病肾病所致。肾小管上皮细胞在高血糖状态下，抗凋亡基因BcL-2、BcL-x表达降低，而促凋亡基因Bax表达增加，从而使细胞凋亡数目增加，故认为DM高血糖状态下的代谢紊乱改变了凋亡调节基因的表达，使细胞凋亡增加是发生DN的原因之一。近来的研究证实肾小球内足细胞的缺失是早期DN的特点，此特点也就决定了DN是一个逐渐加重的过程。那么在DN早期是什么原因引起了肾小球内足细胞的缺失呢?在1型DM(Ins2AkitaAkitamice)和2型DM(Leprdb/dbdb/dbmice)大鼠在高血糖状态下足细胞的凋亡显著增加。由葡萄糖诱导的活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)产物在体内及体外均激发了足细胞的凋亡和衰竭。这一结果暗示足细胞的凋亡和衰竭代表了1型DM和2型DM大鼠糖尿病肾病的一个新的早期的病理机制。首次证明过氧化物酶体增生物激活受体PPARa是核受体家族配体基因的一个成员，其可使过氧化物酶体增殖，这种增殖可在肾脏显著的表达，并且在脂质代谢和血糖内环境的稳定起了很重要的作用。通过使用已敲除PPARa的大鼠及体外培养肾小球系膜细胞，证实PPARa在DN发病机制中的作用，发现PPARa的不足，加速了DN的进展，这是因为PPARa的不足引起了甘油三酯的浓度、循环游离脂肪酸、炎症反应及胞外基质形成增加、肾小球的凋亡所致。提示促PPARa药物可以作为治疗1型糖尿病肾病的一个有效措施。研究发现还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的长期抑制阻止了肾小球足细胞的凋亡，改善了足细胞功能的衰竭、肾小球系膜间质的增厚及单侧丧失排泄能力(VAE)(indb/dbmice)。另外足细胞的凋亡程度与尿蛋白漏出量相一致，并且足细胞的凋亡先于足细胞的丢失(inAkita减少37%，db/db减少27%)[1-2]。

2细胞凋亡与糖尿病心肌病

成年大鼠的心肌细胞对升高的血糖浓度和饱和的十六烷酸(软脂酸)是敏感的。十六烷酸通过重新形成神经酰胺的结构和激活线粒体凋亡通路而诱发心肌细胞凋亡。高血糖和软脂酸促进了肌纤维组织和肌原纤维节的混乱，就象在心衰性心肌病中看到的那样。因此高糖和脂毒性在DM心肌细胞凋亡中起到了关键性作用。高血糖直接诱发了细胞凋亡，高血糖所引起的心肌细胞的凋亡至少部分是通过ROS(Reactiveoxygenspecies)刺激了细胞色素C激活caspase-3通路而形成的[3-4]。

3细胞凋亡与糖尿病视网膜病变

DR的发生发展与视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞、神经细胞的凋亡有着密切的联系。

凋亡相关基因BCL-2和Bax在早期DM大鼠视网膜血管和神经细胞的表达随病程的进展逐渐增强，二者在糖尿病视网膜细胞凋亡中起到重要作用。AR(AlclseRecluctase)在早期DR发病机制中起着主要作用，引起了一系列视网膜损害，包括周细胞(pericytes，PCs)丢失，视网膜神经细胞凋亡，神经胶质再激活以及新血管形成等。周细胞的凋亡是DR的早期事件。PCs的凋亡被认为是持续高血糖的结果。研究发现在高糖状态下培养周细胞7天，发现细胞凋亡显著。为进一步检查软脂酸浓度的升高对DR细胞凋亡的影响，有人用0.4mmol/L软脂酸培养24h周细胞，观察视网膜细胞的氧化应激及细胞凋亡的情况，结果发现软脂酸诱导的PCs细胞凋亡与NAD(D)H氧化酶、NF-Kb激活及神经酰胺的增多有关，这些分子之间的更精确的关系有待进一步的研究。

另外DR患者的结构性视网膜胰岛素受体(AKt)信号传导通路逐渐受到损伤，这种变化是通过AKt激酶的激活而引起，并暗示信号传导通路的丧失多发生在DR初期阶段[5-8]。

4细胞凋亡与糖尿病神经病变

大约50%～80%DM患者都伴有一定的神经性疾病，这主要是由于DM所引发的神经细胞凋亡所致，其中包括大脑中枢神经细胞和外周神经细胞的凋亡。

DM会促进大脑神经细胞的凋亡，凋亡主要发生在大脑局部缺血的阴影区(ischemicpenumbralzone，IPZ)以及大脑中线区域。糖尿病神经病变患者血清中的免疫球蛋白对成神经细胞瘤NIE-115细胞具有毒性作用，病变以细胞凋亡的形式发生，NIE-115细胞膜中包含Fas，糖尿病神经病变患者血中包含Fas调节的凋亡的激活因子，可能参与糖尿病神经病变的发病机制。

糖尿病患者背根神经节(DRG)中神经元细胞凋亡的数目显著增加，认为细胞凋亡同样发生于DM周围神经病变中。通过实验发现DM神经病变患者神经元细胞中BCL-2水平显著下降，而BCL-XL和Bax水平与正常人相比没有什么显著变化，同时伴随着神经元细胞色素C从线粒体向胞质的易位。所有这些变化都联系着线粒体的功能异常[9-11]。

5其他

糖尿病除了会引发上述组织细胞凋亡外，还会引发外周血细胞、性腺细胞、肝细胞和脾细胞等组织细胞的凋亡。把肝细胞和脾细胞分别培养在正常血糖物质的量浓度(5.5mmol/L)和高血糖物质的量浓度(25mmol/L)培养液中96h后进行检测，发现在高浓度葡萄糖培养液中的肝细胞和脾细胞凋亡显著增加，同时BCL-2基因及与其相关的BCL-x基因的表达明显下降，引发肝和脾组织的病变。细胞凋亡也是胚胎形成的一个重要调节机制，某些凋亡调节基因的表达发生变化可导致先天性畸形或其他病理状态[12-13]。

总之，细胞凋亡在糖尿病慢性并发症中发挥着重要的作用，但其机制未完全阐明，凋亡相关基因BCL-2、Bax、Fas、BCL-XL、Pax-3及一些胞内信号转导分子等可能对组织细胞的凋亡进行调控。但其研究大多只限于动物实验阶段，其具体机制尚待进一步探讨。

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细胞增殖论文范文篇9

一、内皮损伤、血栓形成与再狭窄

PTA可造成血管损伤，内皮的剥脱造成内皮下组织的暴露,血小板立即通过VonWillebrand因子（VWF）黏附于内皮下的基质,随后发生聚集并释放α颗粒成分,其释放的血小板衍生生长因子(PDGF)可能与中膜平滑肌细胞的激活和迁移有关［1］。最近的研究表明血小板减少可抑制已激活的平滑肌细胞从中膜向内膜迁移。由内皮损伤引发的凝血过程将形成附壁血栓,血栓的形成不仅可造成血管的急性闭塞,而且为平滑肌细胞内迁提供了框架,血栓的机化可直接引起内膜增厚,而且血栓中的凝血酶本身就是强力的平滑肌细胞致分裂原［2］。实验证明损伤部位内皮的早期重建可抑制血小板附着和血栓形成［3］。

二、内皮细胞和内膜增厚

血管损伤后出现的组织愈合反应可造成不同程度的内膜增厚,其中包括3种主要成分:平滑肌细胞、内皮细胞及细胞外基质。损伤后30分钟就可以检测到平滑肌细胞早期激活的标记——核原癌基因的表达［4］,活化的平滑肌细胞从收缩表型转向合成表型，从而引发平滑肌细胞的增生迁移和基质的合成。平滑肌细胞增生后向内膜迁移，迁移到内膜的平滑肌细胞部分继续增生。有作者认为平滑肌细胞的增生和分裂是两个不同的机制［5］，一些因素只影响其中一个而不影响另一个，PDGF是平滑肌细胞向内膜迁移强力的趋化因子，成纤维细胞生长因子b（bFGF）则是平滑肌细胞的致分裂原。平滑肌细胞要穿过细胞外基质和弹力层才能到达内膜，其迁移过程与纤维蛋白溶解酶原激活物及金属蛋白酶（MMP）的增加有关。

三、内皮细胞与血管重构

四、内皮细胞损伤、修复及功能异常

五、加快重内皮化、促进内皮细胞功能恢复

蛋白激酶C（PKC）是广泛存在于细胞内的信号传递物质，是内皮细胞增殖所必需的,用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波酯直接活化内皮细胞PKC，发现内皮细胞黏附、伸展及移行能力均增强，而用PKC抑制剂则降低了内皮细胞的再生能力，可见PKC激活剂可作为促进重内皮化的一种方法。

六、金属内支架和血管内皮化

金属内支架的应用大大减低了PTA术后的急性动脉闭塞，其形态稳定性限制了血管的回缩，从而防止了不利的血管重构，但金属内支架本身具致凝性，置入血管后需长期抗凝治疗，而且内支架置入并未彻底解决再狭窄的问题，目前认为PTA术后再狭窄是内膜增生和血管重构双重作用的结果，而内支架置入后再狭窄则主要由内膜增生引起［26］。为阻止内膜增厚，许多学者用带有涤纶被膜的内支紲进行实验研究和临床探索，但一直没有肯定的结果，Schurmann等［27］的实验研究发现，与普通支架相比，被膜式支架引起了更严重的内膜增生和炎症反应；Maynar等［28］的一组股动脉临床资料也表明被膜式支架的通畅率并不理想。支架置入部位的早期内皮化可能预防血栓形成和再狭窄。加速支架内皮化的方法目前主要有两种,一是支架置入后局部灌注药物或导入基因,常用的是VEGF；另一方法是支架置入前在体外先种上内皮细胞［29-31］，可选用转基因内皮细胞进行种植［30，31］，此法最大的障碍是支架置入过程中内皮细胞的丢失［30，31］，但支架金属丝侧面往往有内皮细胞残留，这些细胞可重新增殖并覆盖支架［15,31］。

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细胞增殖论文范文篇10

论文摘要:植物组织培养过程中，褐变问题普遍存在,与菌类污染和玻璃话现象并称为植物组织培养的三大难题。针对褐变难题，本文结合相关资料，对影响褐变的因素作了全面分析，褐变的影响因素是复杂的，随植物种类外植体的部位几生理状况培养基及培养条件的不同而危害的程度有所不同，对这些因素是内因外界影响作用作了分析并针对这些因素提出了相应的解决措施。

在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。

1褐变原因及危害

褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物侵染组织。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。

2褐变产生的机理

2.1非酶促褐变

非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。

2.2酶促褐变

目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。

在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。

3褐变产生的影响因素

影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。

3.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。

3.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。

3.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。

3.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。

4防止外植体产生褐变的对策

从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。

4.1适当外植体的选择

取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。

4.2对外植体的处理

通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。

4.3适宜的培养基

培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。

4.3.1适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。

4.3.2适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。

4.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。

4.3.4培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。

4.3.5培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。

4.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。

4.4添加褐变抑制剂和吸附剂

褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2+结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。

4.5进行细胞筛选和多次转移

在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。

参考文献：

[1]徐振彪等.植物组织培养过程中的褐化现象.国外农学——杂粮作物,1997(1):55～56.

[2]符近.三种不同类型种子休眠萌发及马占相思种子老化过程的研究.北京农业大学硕士研究生论文,1996.

[3]傅作申，玉米耐NaCl幼胚愈伤组织的筛选及特性分析，长春农牧大学硕士论文，1996.

[4]颜昌敏编著，植物组织培养手册，上海科学技术出版社,1990.

[5]王异星.荔枝细胞培养的初步研究.暨南大学学报,1997,18(5)：84～85.

[6]何琼英等.抗坏血酸预处理阻止香蕉吸芽外植体褐变的研究初报.华南农业大学学报,1995,16(3):79～82.

[7]张妙霞.柿树组织培养防止外植体褐变的研究.河南农业大学学报,1999,33(1):87～91.

[8]金坚敏.水稻幼穗和成熟种子诱导胚状体时的有关因子探讨.植物学通报，1992,9(2):53～54.

[9]金坚敏.水稻幼稿和成熟种子诱导胚状体时的有关因子探讨.植物学通报,1992.

[10]王东霞等,如何对抗植物组织中的组织褐变，中国花卉盆景,2002,12:29～30.

[11]姚洪军,罗晓芳,田砚亭.植物组织培养外植体褐变的研究进展.北京林业大学学报,1999,21(3):78～83.

[12]蔡金星等.不同品种梨多酚氧化酶特性及其抑制剂的研究.河北农业技术师范学院学报,1999,13(1):55～57.

[13]陈学森,张艳敏等，植酸在银杏组织培养中应用的研究.天然产物研究与开发,1997,9(2):24～27.