透析正交实验法优选金芍胶囊的醇提工艺

摘要：对金芍胶囊的醇提工艺进行优选。以盐酸小檗碱的含量和得膏率为考查指标，采用正交试验法对提取工艺进行优选。与乙醇用量、提取次数相比，乙醇浓度对盐酸小檗碱的提取影响较大，优选出的最佳提取工艺为：采用为药材8、6倍量的体积分数70%乙醇分别回流提取2次，每次1h。该工艺盐酸小檗碱提取率较高，有较好的稳定性，且工艺简便经济，适合于生产。

关键词：金芍胶囊盐酸小檗碱正交试验色谱法高压液

金芍胶囊是广州中医药大学新药开发研究中心与广东德鑫制药有限公司合作开发的中药6类新药，主要由赤芍、当归、莪术、黄柏、延胡索、香附、菝葜、千斤拔等13味药物组成。其功能为理气化瘀止痛、燥湿健脾，用于治疗气滞血瘀所致妇女下腹胀痛或刺痛、腰骶酸痛、经行加重、白带异常等症及慢性盆腔炎见上述症候者。

本研究采用正交试验设计优选金芍胶囊中黄柏、延胡索、莪术、苍术、当归、香附等药材的最佳醇提工艺。方中黄柏为抗菌消炎的主要药物，盐酸小檗碱为黄柏的主要有效成分之一［1］，因此以黄柏中盐酸小檗碱含量和提取得膏率为指标，对金芍胶囊醇提工艺进行优选，为金芍胶囊生产工艺提供科学依据，现报道如下。

一、仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪(HPLC，美国安捷伦科技公司)，DAD检测器，Agilent1100化学工作站；BP110S电子天平(德国赛多利斯公司)，CP225D电子天平(德国赛多利斯公司)；药材均由广东德鑫制药有限公司提供；盐酸小檗碱对照品(购自中国药品生物制品检定所提供，批号：110713??200609)；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

二、方法与结果

1、HPLC测定提取液中盐酸小檗碱含量

1.1色谱条件［2］色谱柱：KromasilC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：乙腈—体积分数0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100mL加十二烷基磺酸钠0.1g)，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，检测波长：265nm。

1.2对照品溶液的制备精密称取在100℃干燥5h的盐酸小檗碱对照品13.73mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇匀，作为对照品母液。精密量取对照品母液5.0mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜，即得。

1.3黄柏药材含量测定按文献［2］方法测定，平行3份，测定结果为35.32、34.46、34.74g/kg，平均含量为34.84g/kg。

1.4供试品溶液的制备精密量取提取液5.0mL，置25mL量瓶中，加体积分数70%乙醇稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜，即得。

1.5缺黄柏阴性样品溶液的制备取缺黄柏阴性提取液，按2.1.4项下方法制备，即得。各溶液HPLC色谱图见图1。

2、计算方法

2.1得膏率精密量取提取液25mL，置于恒质量蒸发皿中，水浴蒸干，放入105℃的烘箱中，烘3h，取出，置干燥器中，放置30min，迅速称定质量，计算得膏率：w得膏＝(m干膏+蒸发皿-m蒸发皿)×V溶液总/(25×m药材)。

2.2含量计算w含量＝（A样×ρ对×V样×B×1000)/(A对×m药)，其中A样为供试品峰面积，A对为对照品峰面积，V样为提取液总体积（mL），ρ对为对照品浓度（mg/mL），m药为黄柏药材投料量（kg），B为稀释倍数（B＝5）。

3、提取次数的筛选按处方比例取黄柏、当归等药材粗粉，加10倍量体积分数70%乙醇回流提取3次，每次1h，滤过。依法制备3份，按2.2项下方法分别测定各次提取率及得膏率。表1结果显示：提取2次与3次提取率及得膏率相差不大，为了节约成本，因此确定提取次数为2次。表1提取次数筛选结果(略)

4、乙醇浓度的筛选按处方比例取黄柏、当归等药材粗粉，分别加入10倍量体积分数60%、70%、80%、90%的乙醇回流提取2次，每次1h，滤过，合并滤液，摇匀。平行制备3份，按下方法分别测定并计算提取率及得膏率。表2结果显示：提取率以体积分数70%、80%乙醇最高，得膏率体积分数60%乙醇最高，体积分数90%乙醇提取率及得膏率均较低，因此确定以体积分数60%、70%、80%乙醇进行正交试验。表2乙醇浓度的筛选结果(略)

5、正交试验

5.1试验设计以乙醇用量、乙醇浓度、提取时间为因素采用3因素3水平正交设计表确定最终提取工艺。见表3。表3因素水平表（略）。

5.2正交试验方法与结果按处方比例称取黄柏、当归等药材粗粉，根据上述正交表进行试验，按2.2项下方法分别测定提取率及得膏率，采用综合评分法进行数据统计分析(其权重指数分别为0.8、0.2)，以确定最佳提取工艺，数据及结果见表4，方差分析见表5。表5方差分析表（略）从正交试验结果和方差分析可知，3个因素对盐酸小檗碱的提取率无显著性影响；得膏率中各因素的影响程度依次为B>A>C。体积分数60%乙醇提取，得膏率高但提取率较低，体积分数80%、70%乙醇提取结果相差不大，综合考虑，确定最佳提取工艺为A3B2C1，即用体积分数70％乙醇回流提取2次，每次1h。表4正交试验数据及结果（略）注：s综合=s盐酸小檗碱提取率+s得膏率；s盐酸小檗碱提取率=p盐酸小檗碱提取/p最大盐酸小檗碱提取×0.8×100；s得膏率=p得膏/p得膏率最大值×0.2×100

5.3中试放大试验按处方比例称取黄柏、当归等药材粗粉，共25.5kg，加体积分数70%乙醇(8、6倍量)回流提取2次，每次1h。

表6结果显示：中试放大试验验证了上述正交试验法确认的提取工艺参数可行，其中盐酸小檗碱的含量为30.38g/kg，提取率为87.29%。表63批中试结果（略）。

三、讨论

黄柏具有抗菌消炎、降压等作用，其药理、临床作用之强弱，与盐酸小檗碱含量高低有直接关系［3］，而盐酸小檗碱易溶于热水、乙醇，且在浓缩过程中易损失，在中药复方制剂中常单独提取。据文献报道［4-5］，对于黄柏生物碱，乙醇提取优于酸水渗漉和水提取，乙醇回流优于其他提取方法。本工艺选择乙醇回流提取，能有效提取盐酸小檗碱，且工艺简便、经济。

为合理选择正交设计各水平，先对加醇量进行了预试，由于药材的吸附作用，通常第1次乙醇提取液比加入液减少的体积大约相当于药材量的2倍体积，为提高生产时提取罐的利用率，本实验采用第2次提取溶剂加入量比第1次少2倍量的方式（如12、10或者10、8），使提取罐的使用率高达100%。

色谱条件参照中国药典（2005年版）一部黄柏药材项下含量测定方法，经试验用于本品提取液含量测定，盐酸小檗碱峰尖锐，分离度大于1.5，且阴性无干扰。本试验确定的工艺简便、稳定，盐酸小檗碱提取率高，适用于工业生产。

参考文献：

［1］王典瑜，黄巧文，廖彬初.HPLC法测定黄柏炮制前后盐酸小檗碱的含量［J］.海峡药学，2008，20(1)：47．

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：化学工业出版社，2005：214.

［3］冯飞.炮制对黄柏小檗碱含量的影响［J］.中药材，1995，18(11)：566.

［4］赵骏，齐喜红.生物碱提取方法研究概述［J］.天津中医学院学报，2003，10(4)：4.

［5］俞丹，尹莲.黄柏总生物碱提取工艺的优化研究［J］.海峡医学，2008，20(7)：19.