整合子系统与铜绿假单胞菌多重耐药性

［摘要］多重耐药性铜绿假单胞菌是临床抗感染治疗中的一个棘手的问题，除了外排系统，外膜通透性障碍等天然耐药机制之外，整合子介导的多重耐药基因也是造成铜绿假单胞菌多重耐药的主要原因之一。本文就整合子的结构与分类、基因盒的种类与表达以及与铜绿假单胞多重耐药性的关系进行综述。

［关键词］多重耐药性；铜绿假单胞菌；整合子；基因盒

整合子(Integron)是1989年由StokesHW等首次提出的一个与细菌耐药性传播有关的基因系统，可捕获和整合细菌耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起了重要的作用。质粒和转座子携带整合子增加了抗生素耐药基因在细菌之间的传播。整合子通过位点特异性的基因重组可整合多种耐药基因对细菌多重耐药性的形成起着重要作用，整合子介导的多重耐药基因也是造成铜绿假单胞菌多重耐药性的原因。

1整合子的结构与种类

整合子由整合酶基因(IntI)，重组位点(attI)，1个或2个负责插入基因盒表达的启动子所组成［1］。整合子根据整合酶基因不同分为6种类型，但研究较为详尽的是前4种类型，临床分离的多重耐药性铜绿假单胞菌主要含有Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合子基本结构由三部分组成，两端是一段高度保守的序列，分别称作5’CS和3’CS，5’CS和3’CS之间的区域称作可变区，可变区由一个或多个外来插入的基因盒组成。5’CS区有一个编码整合酶的IntI基因，一个基因重组位点attI及启动子(P1和P2)。3’CS包括三个开放阅读框架：季铵盐化合物及溴乙锭耐药基因，磺胺耐药基因。基因盒由一个结构基因和59碱基单元即attC组成［2］。Ⅰ型整合子的整合酶主要催化attI和attC位点间的重组，可将外源性耐药基因扑获并整合入整合子，两个attC位点间或attI位点间也可被催化重组［3］;Ⅱ类整合子常与Tn7有关［4］，基整合酶基因是缺陷的INTI基因，它的产物INTI1的产物有40％同源性，3保守末端包括5个tns基因，协助转座子的移动;Ⅲ类整合子携带仅发现在一型整合子中出现的碳青霉烯类耐药性金属酶基因blaIMP，基整合酶基因intI3与intI1有61％同源性;Ⅳ类整合子又称为超级整合子，在霍乱弧菌基因组中首次发现。最近假单胞菌中发现的In5504被认为介于多重耐药整合子与霍乱弧菌超级整合子之间。

2基因盒的结构和种类

基因盒由一个结构基因和3端的一个回文序列attC组成，attC位点有1个59碱基长的片段，所以attC以前被称为“59片段”。attC由1个可被整合酶识别的特异性重组位点组成，attC位点的长度从576bp到141bp不等［5］。迄今报道在整合子上发现几十种耐药性基因盒，不同的基因盒有不同功能和结构，基因盒一般由一个或多个编码不同的抗性的基因组成，包括最初发现的编码氨基糖苷类和氯霉素钝化酶的基因，编码磺胺类，β内酰胺类耐药的基因，以及近来发现的编码超谱β内酰胺酶及碳青霉烯类水解的基因［6］。铜绿假单胞菌多重耐药性菌株中含有介导氨基糖苷类耐药的aac296基因，AAC(6)296能紧密接合隔绝药物，而介导对抗生素的耐药性［6］，目前发现的IMP1、VIM1、VIM2这3种金属酶基因均位于Ⅰ类整合子的可变区，可以在不同铜绿假单胞菌和不同的细菌间传播，造成耐药性播散［7］，BlavEM1是位于整合子的基因所编码的一种EsBL，介导铜绿假单胞对B内酰胺类抗生素耐药。铜绿假单胞菌染色体中发现的介导对氯霉素耐药CatBl基因和CatB7基因与CatB2、CatB3及CatB5等基因盒关系密切［8］。

3基因盒的表述

细菌通过整合酶的作用，捕获外来的耐药基因，并在位于整合子上游的启动因子作用下得到表述，使细菌具有耐药性和多重耐药性［9］，由于绝大多数基因盒不含有启动因子，自身并不能表述，因而总是以相同的方向插入整合子，且其从5’保守片段中的启动因子开始转录，整合子通过位点特异性的基因重组于整合多种耐药基因，对细菌多重耐药性的形成起重要作用［10］。由于基因盒按照从5’到3’的方向整合于attI位点，所以启动区可使插入其中的基因盒共表达，在整合子5’CS含有P1和P2两种启动因子，P1是共同启动因子，也是主要启动因子。目前发现P1有几种变异体，他们都有含有一段6个碱基的共同序列。TTGACA(35)和TAAACT(10)为强启动因子。少数整合子还有P2启动因子，位于P1的下游119碱基处，17碱基的P2变异体是强动子，当P1为弱变异体时，基因盒的表达主要依赖P2的作用。启动因子的强弱会影响基因盒的表达水平，而且基因盒插入整合子的位置也会影响基因盒的表达。目前研究发现，靠近启动因子的基因盒表达水平最强，位于一个或多个其他基因盒的下游会逐渐减弱。极少数基因盒自身含有启动因子，不依赖于5’CS的启动因子而自身可以表达。弱启动因子下游或处于基因盒下游的耐药性基因盒在抗生素选择性压力下，有可能借助整盒酶介导的基因重组，插入到强启动因子下或靠近P1的位置，从而由低水平转为高效表达，耐药性水平随之增强。

4基因盒—整合子系统和铜绿假单胞多重耐药性

多重耐药革兰阴性杆菌特别是铜绿假单胞菌感染在全世界不断增加，临床出现的多重耐药的铜绿假单胞菌与整合子对耐药基因的积累分不开的，整合子上常常有新的整合子结构。它是有强的整合酶的结合位点和新的可变区结构，该可变区除有携带VIM2型金属酶基因外，还携有一个新的AACA4等位基因，编码对氨基糖苷类抗生素的耐药性，这表明整合子结构与基因酶的铜绿假单胞菌多重耐药的获得有关。基因盒整合子属于可移动基因元件，可位于细菌的质粒或染色体上，能整合不同的耐药基因盒，且一个整合又可捕获多个基因盒，因此，可表达出对抗生素的多重耐药性。Sckiguchi等［2］对引起尿路感染爆发的多重耐药性铜绿假单胞菌进行分析，发现多重耐药性的铜绿假单胞菌IMCJZ。S1菌株存在克隆扩增，对氨基糖苷类、β内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类等抗生素具有广谱的耐药性。IMCJZ，S1菌株含有存在于染色体而不存在质粒上新Ⅰ类整合子，它有三种耐药基因即bla、aadal和aac(6’)Iae。Poerec等［13］发现铜绿假单胞菌表达超广谱B内酰酶(GES9)基因，这种基因位于Ⅰ类整合子上，介导对多种B内酰类抗生素的耐药性。近年来，由整合子携带多重耐药性铜绿假单胞菌引起的医院感染爆发流行，与金属酶不断出现和编码金属酶的基因定位于整合子上有关［14］。Pagani等［15］对意大利南部医院引起下呼吸道感染的多重耐药性铜绿假单胞菌进行分析，发现多重耐药性铜绿假单胞菌有金属β内酰胺酶活性。这种金属酶基因(IMP13)，由Ⅰ类整合子所携带，同时Ⅰ类整合子携带编码AAC(6’)Ib酶的aacA4氨基糖苷类基因盒。铜绿假单胞菌耐药机制日趋复杂，是其耐药性常为多种机制并存。研究细菌整合子性质和种类，基因盒的种类和表达，有利于对铜绿假单胞菌多重耐药性的发生和转移机制的了解。目前认为抗生素的广泛应用和不合理应用，形成强选择性压力是铜绿假单胞菌多重耐药菌株出现的主要原因，因此加强临床合理、有序应用抗生素，提高抗生素的有效性，同时减低抗生素的压力，削弱整合子的发生从而减少铜绿假单胞菌多重耐药性菌株的产生。

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