医学生社会实践论文范文10篇

医学生社会实践论文范文篇1

ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells

【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.

【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis

【摘要】目的：表达具备生物活性的重组小鼠Wnt3a信号蛋白.方法：应用脂质体转染试剂将重组真核表达载体pSecTag2/HygroBWnt3a转染并筛选稳定表达的NIH3T3细胞，WesternBlot鉴定重组Wnt3a蛋白的表达，并对Wnt3a/NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力给予检测.结果：Wnt3a信号蛋白在Wnt3a/NIH3T3细胞中获得稳定表达，Wnt3a信号蛋白能够明显提高NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力.结论：在NIH3T3细胞中表达的重组Wnt3a信号蛋白具备生物活性.

【关键词】Wnt3a；真核表达；接触抑制；细胞凋亡

0引言

小鼠Wnt3a基因是Wnt基因家族中的重要成员，其编码表达Wnt3a信号蛋白.Wnt3a信号蛋白可以激活经典的Wnt/βcatenin信号通路.Wnt3a信号蛋白对神经干细胞表现出明显的促神经元分化的作用.我们应用基因重组的方法，从小鼠胚脑中克隆Wnt3acDNA，构建真核表达载体，通过阳离子脂质体试剂将目的基因导入NIH3T3细胞中，建立稳定表达Wnt3a信号蛋白的NIH3T3细胞株，并对其生物学活性进行初步分析.

1材料和方法

1.1材料真核表达载体pSecTag2/HygroBWnt3a由本研究室构建.NIH3T3细胞株由安徽医科大学病理教研室吴强教授惠赠.多聚赖氨酸购自博士德公司；胎牛血清及DMEM购自Gibco公司.潮霉素及LipofectamineTM2000转染试剂盒、购自Invitrogen公司.质粒小量提取试剂盒WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationsystem,ReverseTranscriptionSystemRTPCR试剂盒购自Promega公司；鼠抗mycmAb、鼠抗βcateninmAb购自SantaCruz公司，FITC标记的兔抗鼠二抗、TRITC标记的兔抗鼠二抗购自北京中山公司；台盼蓝购自sigma公司.其他试剂均为进口分装或国产分析纯.

1.2方法

1.2.1NIH3T3细胞的培养将冻存的NIH3T3细胞复苏后用含100g/L的胎牛血清的DMEM培养液，在37℃50mL/LCO2培养箱中培养，3d换液1次,传代3至4次使细胞达到良好的生长状态.

1.2.2NIH3T3细胞的转染按LipofectamineTM2000试剂说明书操作进行.转染前24h用胰蛋白酶消化贴壁的NIH3T3细胞，再以无血清及无双抗的DMEM培养基重悬，并按1×105的细胞密度接种于6孔培养板，培养24h后，当细胞生长至85%～90%融合度时，取纯化的重组质粒pSecTag2/HygroBWnt3a2μg，溶于250μL无血清的DMEM培养基中，得到A液.取3μLLipofectamineTM2000加于97μL无血清的DMEM培养基中，得到B液.将A,B液混匀，室温放置30min后加入0.8mL含100g/L胎牛血清的DMEM培养基，轻轻混匀，均匀滴加于经无血清培养基洗涤的贴壁细胞表面，于37℃50mL/LCO2培养箱中培养24h.弃去转染液，加2mL完全培养液继续培养.转染后48h，待细胞生长至接近融合时收集上清，并按1∶3的密度传代.继续培养至细胞密度达50%～70%.弃去培养液，更换浓度为600mg/L的潮霉素培养液进行筛选.转染时，设置转染空载体pSecTag2/HygroB的组和正常细胞阴性对照组.约14d后，可见有阳性克隆形成，继续扩增培养.稳定表达Wnt3a蛋白的细胞株命名为Wnt3a/NIH3T3（W/3T3），转染空载体的细胞株命名为empty/NIH3T3（E/3T3），正常细胞阴性对照组命名为control/NIH3T3（C/3T3）.

1.2.3重组Wnt3a蛋白鉴定转染48h后，分别收集C/3T3,E/3T3和W/3T3细胞各约1×106及其培养上清液.以SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，并将其与细胞培养上清液真空冷冻干燥，浓缩至1/2体积，以鼠抗mycmAb为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，使用WesternBlot方法行重组Wnt3a蛋白的鉴定.

1.2.4βcatenin的表达鉴定分别在转染后6,12,24h收集W/3T3,E/3T3及C/3T3细胞各约1×106，以SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，以鼠抗βcateninmAb为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，使用WesternBlot方法进行鉴定.

1.2.5Wnt3a/NIH3T3细胞增殖特性的鉴定以密度约1×105接种W/3T3,E/3T3及C/3T3细胞于24孔培养板，隔日观察，台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞.

1.2.6Wnt3a/NIH3T3细胞抗凋亡实验以密度约1×105接种W/3T3,E/3T3及C/3T3细胞于24孔培养板，24h后台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞数，同时更换含10g/L胎牛血清的DMEM培养液，定时观察并台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞，计算存活细胞与原始细胞数的比值.

统计学处理：用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析.

2结果

2.1重组Wnt3a蛋白在的NIH3T3细胞中获得表达WesternBlot鉴定发现转染Wnt3a基因的NIH3T3细胞裂解液中有一Mr约为45×103的特异性条带，在转染Wnt3a基因的NIH3T3细胞培养上清液、E/3T3及C/3T3细胞裂解液和细胞培养上清液中，均未发现相应条带(图1).

1:W/3T3组细胞裂解液；2：W/3T3组细胞培养上清液；3：E/3T3组细胞裂解液；4：C/3T3组细胞裂解液.

图1WestemBlot鉴定Wnt3a信号蛋白的表达（略）

2.2Wnt3a/NIH3T3细胞中βcatenin的表达上调对Wnt信号通路中的重要信息分子βcatenin的表达情况进行WesternBlot鉴定，在Mr约90×103处出现特异性条带(图2)，但无时间依赖性.

1~3:培养6,12,24h.

图2各实验组βcatenin表达（略）

2.3Wnt3a/NIH3T3细胞融合密度明显增高经台盼蓝染色计数活细胞，以密度约1×105接种的E/3T3及C/3T3细胞3d后生长至融合密度，此时细胞融合密度约4.6×105，但W/3T3细胞继续生长至第6d，细胞融合密度约13×105，与另外两组相比，W/3T3细胞融合密度明显增高（P<0.01）(图3，4).

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

图3各实验组细胞融合密度观察(倒置×100)（略）

2.4W/3T3细胞抗凋亡能力明显增高经台盼蓝染色计数活细胞，更换含10g/L胎牛血清的培养液48h后，E/3T3及C/3T3细胞大量凋亡，细胞数明显减少，但W/3T3细胞数无明显减少，抗凋亡能力明显提高（P<0.01）(图5，6).

图4实验组细胞数变化（略）

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

图5各实验组细胞抗凋亡能力观察(倒置×100)（略）

图6实验组存活细胞比例（略）

3讨论

Wnt信号蛋白为含有23～24个保守型半胱氨酸残基,在人类的基因组中已经发现Wnt基因19种［1-2］.Wnt3a是Wnt基因家族的重要成员，其基因早在1992年就已经被发现，而且多种的真核细胞被用于它的表达，但由于其低溶解度及疏水性等特点，一直未能纯化出具备生物活性的Wnt3a信号蛋白.1998年，Shibamoto等［3］使用L细胞（鼠胸腺激酶缺陷细胞株；LMTK）作为表达细胞时，在培养上清中发现了大量具备生物活性的Wnt3a蛋白，约400μg/L.Willert等［4］所纯化的Wnt3a信号蛋白通过激活Wnt信号通路促使骨髓中的造血干细胞分裂和自我复制，认为Wnt可能在一系列组织的自我更新中起信号作用.

βcatenin是经典的Wnt/βcatenin信号通路中重要的信息分子［5］，其在Wnt信号通路关闭的情况下，βcatenin被磷酸化而迅速降解.Wnt信号通路被激活后，βcatenin在胞内大量聚集，并进入细胞核，启动下游靶基因的转录，产生生物学效应.βcatenin表达的明显上调代表Wnt信号通路被激活.实验中WesternBlot鉴定发现βcatenin表达明显上调，但没有发现与时间有依赖关系.实验中表达的重组Wnt3a信号蛋白带有myc标签，Burrus等［6］认为如果Wnt3a信号蛋白带有标签将影响其活性，甚至失活.但同样有文献［7,8］中应用的Wnt3a信号蛋白带有myc,HA等标签，而且文献中对其活性同样做了详细的描述.本实验够构建的重组Wnt3a信号蛋白具备生物学活性，但未能与野生型（wildtype）Wnt3a信号蛋白活性做详细的比较，其生物学活性的变化有待进一步分析.

Wnt3a蛋白可以促进神经干细胞向神经元分化.在使用含有Wnt3a信号蛋白的条件培养液培养E11.5d的胎鼠前脑神经干细胞发现，神经干细胞大量分化成为MAP2阳性的神经元.去除Wnt3a信号蛋白后，神经干细胞恢复增殖能力，而且当条件培养液中的FGF2去除后，分化的神经元形态更为成熟［8-9］.来源于小鼠大脑皮质的神经干细胞转基因后超表达Wnt信号蛋白，即使在培养液中加入FGF2，依然大量向神经元分化，但阻断Wnt信号通路后神经元的分化被抑制［10］.

Wnt信号通路的生物学作用十分复杂，不同的Wnt基因，不同的细胞，甚至不同的细胞状态都有可能产生不同的作用［11］.在本实验中我们采用pSecTag2/HygroBWnt3a真核表达载体，NIH3T3细胞作为表达细胞，成功表达重组Wnt3a信号蛋白，初步探讨了Wnt3a信号蛋白的生物学活性，为进一步建立用于以治疗为目的的分子移植的方法奠定基础.

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医学生社会实践论文范文篇2

EffectsofoctylphenoloncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercells

【Abstract】AIM:Toobservetheeffectsofoctylphenol(OP)oncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercellsandtoprobethemolecularmechanismsofOPinhibitingMDAMB231breastcancercellproliferation.METHODS:Thechangesofcellproliferation,cellcycle,cyclinD1mRNA,cyclinD3mRNA,CDK2mRNA,CDK4mRNAandcyclinD1proteinexpressionsofMDAMB231cellstreatedwithOPwereobservedbyusingMTTtest,flowcytometry,immunocytochemistryandRTPCR.RESULTS:WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith4or8μmol/LOPfor48h,thecellinhibitionrateswere(17.13±4.1)%,(40.25±8.7)%,andthefluorescencevaluesofcyclinD1were55.1±10.2,41.4±11.2,significantlydecreasedascomparedwithcontrolgroup(89.9±11.2,P<0.05).WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith8μmol/LOPfor24and72h,thecellratiosintheG0/G1phasewere(67.0±17.6)%and(44.4±11.9)%，significantlyincreasedascomparedwithcontrolgroup［(46.6±12.8)%at24h,(15.3±3.1)%at72h,P<0.05］.OPinhibitedthemRNAexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4andtheproteinexpressionofcyclinD1.CONCLUSION：OPcaninhibittheproliferationofMDAMB231breastcancercells,whichmayberelatedtodownregulatingtheexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4mRNAandcyclinD1protein.

【Keywords】cellproliferation;breastneoplasms;octylphenol;cyclinD1；cylindependentkinases

【摘要】目的:观察辛基酚(OP)对细胞周期及周期蛋白表达的影响，探讨OP抑制MDAMB231乳腺癌细胞增殖的可能分子机制.方法：以MTT试验、流式细胞分析、免疫细胞化学和RTPCR等方法观察OP对MDAMB231乳腺癌细胞增殖、细胞周期、CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3表达的影响.结果：4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌细胞48h时，其抑制率为(17.1±4.1)%,(40.3±8.7)%，cyclinD1表达量荧光值为55.1±10.2，41.4±11.2，比对照组(89.9±11.2)明显降低(P<0.05).8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌细胞24h和72h，G0/G1期细胞为(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期细胞比对照组［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明显增高(P<0.05).OP导致MDAMB231乳腺癌细胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA的表达降低，且cyclinD1蛋白的表达也降低.结论：OP能抑制MDAMB231乳腺癌细胞增殖，其机制可能与OP能降低乳腺癌细胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA及其蛋白的表达有关.

【关键词】细胞增殖;乳腺癌;辛基酚；细胞周期蛋白D1;细胞周期蛋白质依赖激酶类

0引言

辛基酚（octylphenols,OP）是一种环境雌激素，近年来对它的雌激素活性检测及其生殖毒性效应研究较多［1］.OP能促进ERα+MCF7乳腺癌细胞的增殖，表现雌激素活性，却抑制ERα-MDAMB231乳腺癌细胞的增殖［2］.细胞增殖与细胞周期密切相关，本研究将OP作用于MDAMB231乳腺癌细胞，观察细胞的增殖和CDK2,CDK4,cyclinD1，cyclinD3表达的改变，探讨OP影响MDAMB231乳腺癌细胞增殖的作用机制.

1材料和方法

1.1材料试剂中，OP纯度>98%，sigma产品.cyclinD1抗体为兔抗人抗体，使用浓度为1∶75倍稀释，FITC标记羊抗兔抗体，北京中杉产品.RTPCR试剂盒，上海sangon产品.二甲亚砜(DMSO)，纯度>98%，进口分装试剂，用于配制OP.MDAMB231乳腺癌细胞由中科院上海细胞所提供.实验前将MDAMB231乳腺癌细胞在无酚红的DMEM/F12中培养24h以耗尽细胞的内源性雌激素，然后以该培养基进行实验.实验分为3组：对照组，给予DMSO；4μmol/LOP组；8μmol/LOP组.

1.2方法

1.2.1MTT试验以492nm波长测定活细胞的吸光度（A），抑制率（PR）=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%，每次试验设2个平行孔，试验重复3次［3］.

1.2.2细胞周期相及凋亡检测实验各组细胞处理24,48和72h，收获细胞，700mL/L冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测，每次试验设2个平行孔，试验重复3次.

1.2.3cyclinD1表达分析细胞生长于小盖玻片上，多聚甲醛固定，血清封闭，加一抗于37℃孵育50min，加荧光素标记二抗孵育20min，甘油封片，LeicaNT激光共聚焦显微镜观察、照相及数据分析，实验重复2次.计算荧光强度时每组实验取3张片子，每张片子取36个视野，每个视野取5个细胞，计算其平均荧光强度.

1.2.4RTPCR检测CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3的mRNA表达实验各组细胞处理24h，收获细胞，用Trizol试剂一步法提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA，置-80℃备用.引物由上海sangon合成，CDK2：F5′GCTCTCACTGGCATTCCTCCT3′，R5′5′CGAAATGAAGGCACTAGAGC3′，产物546bp；CDK4：F5′CTACCTCTCGATATGAGCCAGT3′，R5′CATCTGGTAGCTGTAGATTCTG3′，产物563bp；cyclinD1：F5′GAGGAACAGAAGTGCGAGGA3′，R5′TCTGGAGAGGAAGCGTGTGA3′，产物501bp；cyclinD3：F5′TGTCAGGAGCAGATCGAAGC3′，R5′CCTTTAGAAGGCACTAGAGC3′，产物453bp；βactin：F5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′，R5′GGCGGCACCACCATGTACCCT3′，产物202bp.25μL体系加样本总cDNA，上游和下游引物各1.5μL，依次加入试剂盒其他成分.反应条件为94℃灭活40s，60℃或61℃退火40s，72℃延伸40s，22个循环，20g/L琼脂糖电泳，照相，半定量分析以凝胶成像系统的分析软件Q1来分析其灰度值，每实验重复3次，以目的条带/βactin之比值为结果，各组间进行单因素方差分析.

统计学处理：数据用x±s表示，组间比较用SPSS10.0软件进行单因素方差分析.

2结果

2.1MDAMB231乳腺癌细胞增殖以4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌细胞48h，细胞抑制率为(17.1±4.1)%，(40.3±8.7)%.

2.2MDAMB231乳腺癌细胞周期相分布8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌细胞24h和72h，G0/G1期细胞分别为(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期细胞比对照组［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明显增高(P<0.05).

2.3MDAMB231乳腺癌细胞中cyclinD1蛋白表达cyclinD1蛋白主要表达于细胞的胞浆中(图1)，4,8μmol/LOP组cyclinD1表达量荧光值分别为55.1±10.2，41.4±11.2，比对照组(89.9±11.2)明显降低(P<0.05).

A：对照组；B：4μmol/LOP组；C：μmol/LOP.

图1OP对MDAMB231乳腺癌细胞中cyclinD1表达的影响SPFITC×400（略）

2.4MDAMB231乳腺癌细胞中CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3mRNA表达mRNA的表达以电泳条带的亮度来判断，亮度值越强，mRNA量越高，经凝胶成像系统软件处理，与对照组比较，OP组CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA表达均降低(图2).

M:marker;1:8μmol/LOP;2:4μmol/LOP;3:对照.aP<0.05vs对照.

图2OP对MDAMB231乳腺癌细胞中cyclinD3,cyclinD1,CDK2,CDK4mRNA表达的影响（略）

3讨论

雌激素是哺乳动物体内分泌的一种性激素，起着调节动物生长、分化和生殖的作用.OP是一种苯环类化合物，能与ERα结合，显示出雌激素活性.OP主要用于生产非离子表面活性剂、增塑剂、热稳定剂、光稳定剂等，广泛存在于生活、工作环境的水体、淤泥、土壤和食物如鱼类、贝类及饮用水中［4］.MDAMB231乳腺癌细胞是一株ERα-的细胞，>15μmol/LOP对MCF7乳腺癌细胞会产生毒性作用，1~10μmol/LOP会对MDAMB231乳腺癌细胞产生毒性效应，抑制MDAMB231乳腺癌细胞的增殖［1］.以植物雌激素三羟异黄酮作用184B5/HER细胞，结果发现活细胞数量减少，呈剂量效应关系，同时G0/G1期细胞增高，细胞凋亡也增多.本研究结果显示4，8μmol/LOP均能抑制MDAMB231乳腺癌细胞增殖，并呈时间效应和剂量效应.

细胞增殖依赖于细胞周期的顺利进行，该过程受G1/S，G2/M两个关健点调控.植物雌激素三羟异黄酮能将MDAMB231乳腺癌细胞阻滞于G2/M期，细胞凋亡增加［5］，超二倍体增加.本研究结果显示OP作用MDAMB231乳腺癌细胞24h，G0/G1期细胞(凋亡峰)明显增加(P<0.05)，表明OP具有急性毒性作用，细胞迅速凋亡.OP引起MDAMB231乳腺癌细胞周期阻滞与三羟异黄酮不同，这可能与三羟异黄酮具有多种生物活性有关.

细胞增殖依赖于细胞周期的顺利进行，细胞周期的正常进行又依赖于细胞周期调控蛋白如cyclinD，cyclinA，cyclinE等及细胞周期依赖性激酶(CDK)的正常表达.cyclinDCDK4是G0/G1期的限速步骤，过度表达G1期的周期蛋白如cyclinD，cyclinE能加速细胞快速通过G1期.cyclinD1蛋白表达与细胞周期运行有关［6］，抑制肿瘤组织生长与P53的高表达及cyclinD1低表达相关［7］.以17羟雌二醇作用雌性Wistar大鼠60d，发现雌二醇通过减少CDK2，CDK4的表达以及降低CDK2活性，将细胞阻滞于G1/S期［8］.本研究结果表明，OP作用MDAMB231乳腺癌细胞后，能降低CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA的表达，降低cyclinD1蛋白的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖，细胞阻滞于G1/S期，导致MDAMB231乳腺癌细胞的增殖受抑，并呈剂量效应和时间效应.

【参考文献】

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医学生社会实践论文范文篇3

EffectofVHLmRNAandFIH1mRNAexpressionsincolorectalcarcinomaonHIF1αproteinlevel

【Abstract】AIM:TodetectmRNAexpressionsofVHLandFIH1incolorectalcancer,andexploretheireffectonHIF1αproteinlevel.METHODS:SemiquantitativeRTPCRassaywasusedtodetecttheexpressionsofVHLmRNA,FIH1mRNAin42patientswithcolorectalcancer;ExpressionofHIF1αproteinwasmeasuredbySPimmunohistochemistry;Spearmanrankcorrelationwasusedtoanalyzethecorrelationbetweenthem.RESULTS:mRNAlevelsofVHLandFIH1incolorectalcancerweresignificantlylowerthanthoseinadjacenttissue（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；BothexpressionsdecreasedasDukesstageincreased,andtheexpressionsinDukesA+BstageweresignificantlyhigherthanthoseinDukesC+Dstage（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；Theirexpressionshadnorelationshipwithtumorlocationandgender.In42casesofcolorectalcancer,positiverateofHIF1αproteinwas69.1%(29/42),theexpressioninDukesC+Dstage(80.0%,24/30)wassignificantlyhigherthanthatinDukesA+Bstage(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02);itwasnegativeinadjacenttissue;SpearmanrankcorrelationdisplayedthattheexpressionsofVHLmRNAandFIH1mRNAwerenegativelycorrelatedwiththeHIF1αproteinlevel(rs=-0.97,P=0.01;rs=-0.66,P=0.01).CONCLUSION:TheoverexpressionofHIF1αmayplayanimportantroleinthedevelopmentandmatastasisofcolorectalcancer；ThedecreaseofVHLmRNAandFIH1mRNAexpressionsiscloselycorrelatedwiththeincreaseofHIF1αproteinlevelincolorectalcancer.

【Keywords】colorectalneoplasms;HIF1α;VHL;FIH1

【摘要】目的：检测大肠癌中VHLmRNA，FIH1mRNA以及HIF1α蛋白的表达,探讨VHL，FIH1对HIF1α蛋白水平的影响.方法：采用RTPCR技术检测42例大肠癌组织和相应的癌旁正常粘膜组织中VHLmRNA，FIH1mRNA的表达，采用免疫组化SP法检测HIF1α蛋白在大肠癌和癌旁正常组织中的表达，Spearman相关关系检验分析其之间的相关性.结果：大肠癌组织VHLmRNA和FIH1mRNA的表达水平显著低于癌旁正常组织（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；二者的表达水平随Dukes分期而降低，DukesA+B期显著高于DukesC+D期（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；它们的表达水平与与肿瘤部位、性别无关.大肠癌组织HIF1α蛋白表达阳性率为69.1%(29/42),在癌旁正常组织中均为阴性；DukesC+D期(80.0%,24/30)显著高于DukesA+B期(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02)；Spearman相关分析显示，HIF1α表达水平与VHLmRNA，FIH1mRNA的表达水平显著负相关（rs=-0.97,P=0.01，rs=-0.66,P=0.01）.结论：HIF1α的过表达在大肠癌的发生发展、浸润转移过程中起着重要作用，大肠癌组织中VHL以及FIH1的水平下降与HIF1α蛋白水平的升高之间存在密切相关.

【关键词】结直肠肿瘤；低氧诱导因子1α；VHL基因；缺氧诱导因子抑制因子1

低氧诱导因子1（hypoxiainduciblefactor1，HIF1）在低氧状态下通过对靶基因的转录激活，调控着血管发生、红细胞生成以及糖酵解等过程［1］.希佩尔林道病(vonHippelLindau,VHL)希佩尔林道病肿瘤抑制蛋白(proteinvonHippelLindau,pVHL)在依赖于氧的条件下作用于HIF1的α亚单位，促使其发生泛素化和蛋白酶体的降解［2］.低氧诱导因子1抑制因子(factorinhibitingHIF1,FIH1)能结合HIF1α并抑制其转录激活功能［3］.我们采用RTPCR法检测了大肠癌组织和相应癌旁正常组织中VHLmRNA,FIH1mRNA的表达水平，同时采用免疫组化方法检测HIF1α蛋白的表达，并进一步分析探讨它们之间的相关性.

1材料和方法

1．1材料甘肃省人民医院肛肠科200410/200504手术切除并经病理证实的新鲜大肠腺癌标本42(男27，女15)例，年龄31～76（中位56)岁.其中结肠癌7例，直肠癌35例.DukesA期5例，B期7例，C期18例，D期12例(有7例发生转移),术前未做化放疗.同时距肿瘤边缘5～10cm以上切取正常组织作为自身对照.标本离体后5min内即投入液氮罐并转至-80℃冰箱冻存.RNA提取试剂,饱和酚,100bpDNAladder购自上海生工;逆转录酶MMLV(RNaseH)，Taq酶，AgaroseGel，MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)，RNA酶抑制剂，琼脂糖（Agarose）均购自大连宝生物公司;兔抗人HIF1α多克隆抗体购自武汉博士德公司;生物素链霉素抗生物素蛋白检测系统(SP)试剂盒均购自福州迈新公司;根据从NCBI的Nucleotide数据库中所查到VHL和FIH1mRNA序列，经计算机辅助设计引物，内参对照选用磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh).引物均由上海生工合成，使用浓度均50μmol/L(表1).

1．2方法

1．2.1VHL及FIH1的RTPCR检测从-80℃冰箱中取出冻存的新鲜组织(癌及癌旁正常组织)200mg，采用Trizol法提取组织总RNA，测定总RNA浓度及纯度.使用Takara的MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)反转录合成cDNA的第1链，接着合成第2链（均照说明书操作）.将所得30μL产物冻存于-20℃以备进行PCR.PCR反应体系50μL，包括10×Buffer5μL,25mmoldNTPmixture0.5μL,TaqDNA酶1μL，目的引物（VHL或FIH1）上下游各1μL，Gapdh引物上下游各1μL，cDNA模板1μL，无菌水38.5μL.反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s,退火30s(退火温度VHL55℃,FIH158℃)，72℃延伸45s，30个循环；72℃10min后终止反应.PCR产物于20g/L的琼脂糖凝胶做电泳,以无菌水代替cDNA模板的PCR管为阴性对照，天能凝胶成像系统对电泳条带拍照并进行半定量分析.VHLmRNA,FIHmRNA相对表达量以同一反应体系中目的产物电泳条带密度指数与内参对照Gapdh电泳条带密度指数的比值来表示.

1.2.2HIF1α免疫组化染色取出冻存的新鲜标本迅速置于40g/L甲醛中固定，制成石蜡块.先行HE染色确定,取标本无出血、坏死区域,组织厚度5μm连续切片,HIF1α稀释度1∶50,SP法染色，用PBS液代替一抗作阴性对照.DAB作底物显色,苏木素复染核,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树脂胶封片,显微镜下观察.HIF1α判断标准按文献［4］:阳性细胞胞核呈棕黄色颗粒着色,阴性(-)为肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数<5%；阳性(+)为肿瘤组织阳性细胞数的范围为5%～25%；阳性()为肿瘤组织阳性细胞数的范围为>25%～50%；阳性()为肿瘤组织阳性细胞数>50%.

统计学处理:数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验.计数资料两组率的比较采用四格表的校正卡方检验，RTPCR结果和免疫组化结果的相关性采用Spearman等级相关分析，按α=0.05的水准判断是否具有统计学意义.

2结果

2．1RTPCRVHLmRNA在大肠癌组织中的表达水平为0.51±0.08，癌旁正常组织中的表达水平为0.63±0.11，配对t检验结果显示差异有显著性（t=-10.14,P=0.00）；FIH1mRNA在大肠癌组织中的表达水平为0.52±0.05，癌旁正常组织中的表达水平为0.60±0.14，配对t检验结果显示差异有显著性（t=-15.26,P=0.00）.VHLmRNA，FIH1mRNA表达水平与发病部位，性别，Dukes分期以及有无转移等临床病理资料之间有关(图1,2,表2).表2大肠癌组织VHLmRNA与FIH1mRNA的表达与临床病理的关系

2．2免疫组化染色癌旁正常组织HIF1α免疫组化染色均为阴性（图3）；癌组织中29例（69.1%）HIF1α阳性(图4)，其中(+)16例，()10例，()3例.HIF1α表达与Dukes分期明显相关，DukesA+B期和DukesC+D期的阳性率分别为41.7%(5/12),80.0%(24/30),两者差异具有显著性(P<0.05).无转移者HIF1α阳性率为65.7%(23/35),有转移者阳性率为85.7%(6/7),两者差异无统计学意义.

2．3VHLmRNA，FIH1mRNA表达与HIF1α蛋白水平的关系我们采用非参数检验的Spearman等级相关分析，结果显示，大肠癌组织中HIF1α表达水平与VHLmRNA和FIH1mRNA的表达水平呈显著负相关(rs=-0.97,P<0.01；rs=-0.66,P<0.01).图3癌旁正常组织HIF1α的表达SP×400

3讨论

HIF1是一个异二聚体，由对氧敏感的α亚单位(HIF1α或HIF2α)和组成性表达的β亚单位(HIF1β,也称之为芳香烃受体核转位分子，ARNT)构成［5］.HIF1调节通路的失调对于癌症以及缺血性疾病的发生发展有着重要的影响作用［6］.VHL基因定位于染色体3p2526区域,包含3个外显子，编码由284个氨基酸残基组成的pVHL［7］.FHI1基因定位于染色体10q24，它在生物工程信息数据库国家中心的基因座ID为55662.此基因有8个外显子，全长14kb，可以编码一种特异性的天冬酰胺羟化酶，属于2酮戊二酸依赖性双加氧酶家族［8］.我们用RTPCR法检测了大肠癌和癌旁正常组织中VHLmRNA和FIH1mRNA的水平，同时用免疫组化法检测了HIF1α蛋白在癌组织和癌旁正常组织中的表达.结果表明，VHLmRNA和FIH1mRNA在癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织；二者的表达水平随Dukes分期而降低，DukesA+B期显著高于DukesC+D期；FIH1mRNA在有转移的病例中显著低于无转移的病例；它们的表达水平与与肿瘤部位、性别无关.而HIF1α蛋白表达在癌组织中总阳性率为69.1%(29/42),在癌旁正常组织中均为阴性；在DukesC+D期显著高于DukesA+B期；HIF1α蛋白的表达在转移的病例中高达85.7%(6/7)，而未转移者为68.6%(23/35)，但却无统计学意义，可能是样本量过少的缘故.

Spearman等级相关分析显示，HIF1α表达水平与VHLmRNA，FIH1mRNA的表达水平显著负相关，这表明大肠癌组织中抑癌基因VHL以及FIH1的水平下降与HIF1α蛋白水平的升高之间存在密切相关.HIF1α的过表达在大肠癌的发生发展，浸润转移过程中起着重要作用，HIF1α高表达的癌组织具有较强的浸润和转移能力.提示HIF1α的表达可反映结直肠癌的生物学行为，可以作为判断结直肠癌浸润、转移和预后的有价值指标.此外，低氧适应性反应在肿瘤发生发展中起着重要作用，而HIF1α是此过程中的枢纽环节，利用反义核酸抑制HIF1α的转录活性已经成为治疗肿瘤的一个重要切入点［9-11］，随着对VHL和FIH1作为HIF1α负性调节子功能的逐步阐明［12］，进一步探讨联合应用VHL基因治疗和FIH1的拟似物，以降低HIF1α的表达和转录活性，抑制癌细胞的低氧适应反应，在防治大肠癌的发生发展，浸润转移方面将会有更广阔的前景.

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医学生社会实践论文范文篇4

ExpressionofMMP9inskinsquamouscellcarcinomaanditssignificanceinmicroangiogenesis

【Abstract】AIM:TodetecttheroleandthesignificanceofMMP9inmicroangiogenesisinskinsquamouscellcarcinoma(SCC)andtoobservetherelationbetweentheexpressionofMMP9andmicrovesseldensity(MVD)inSCC.METHODS：ImmunohistochemicalSPstainingwasusedtoexamineMMP9expressionandthechangeofMVDunderlightmicroscopein45casesofSCC,19casesofBowendisease,and10casesofnormalskin.RESULTS：TheexpressionofMMP9inSCCgroupwassignificantlyhigherthanthatinBowendiseasegroup（P<0.05）,whilethelatterwasalsosignificantlyhigherthanthatinnormalskingroup（P=0.028，P<0.05）.ThelevelofMVDinSCCgroupwassignificantlyhigherthanthatinBowendiseasegroup（P<0.05）,andthelatterwassignificantlyhigherthanthatinnormalskingroup（P<0.05）.CONCLUSION：MMP9ishighlyexpressedinSCC,andmaybeoneofimportantfactorsinangiogenesisofSCC.

【Keywords】skinneoplasms;carcinoma,squamouscellimmunohistochemistry;gelatinaseB;antigens,CD34;microvesseldensity

【摘要】目的：探讨皮肤鳞状细胞癌（SCC）发生发展过程中基质金属蛋白酶9（MMP9）对微血管生成的意义.方法：SCC45例,Bowen病19例、正常皮肤10例进行CD34,MMP9免疫组化染色.检测MMP9的表达和微血管密度（MVD）的变化，分析MMP9的表达与MVD之间，及它们与SCC临床病理特征之间的关系.结果：在SCC组中MMP9表达高于Bowen病组（P<0.05）,Bowen病组中MMP9表达高于正常皮肤组（P=0.028,P<0.05）.在SCC组中MVD值高于Bowen病组(P<0.05)，Bowen病组中MVD值高于正常皮肤组（P<0.05）.结论：MMP9可能是SCC促进微血管生成因子之一，与SCC的侵袭性相关.

【关键词】皮肤肿瘤；免疫组织化学；明胶酶B；抗原CD34；微血管密度

0引言

癌细胞侵袭和转移能力与其诱导产生蛋白酶降解细胞外基质（ECM），基底膜（BM）的能力密切相关.基质金属蛋白酶（MMP）是其中最为重要的一组蛋白酶，研究表明［1-2］，MMP对肿瘤的侵袭和转移起重要的作用.Guttman等［1］研究表明MMPs在肿瘤血管生成中也有重要作用.明胶酶是MMPs的一个亚类，包括基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9），近年MMP9与肿瘤血管生成的关系逐渐被重视.MMP9不仅是降解基底膜和ECM的关键酶，而且在肿瘤间质血管生成中起重要作用.在皮肤鳞癌中，有关MMP9的研究报道很少，其结果也不完全一致.我们通过免疫组织化学技术检测Bowen病(BD)，鳞状细胞癌（squamouscellcarcinoma,SCC）组织中MMP9和CD34的表达，并对MMP9的表达与微血管密度（MVD）做定量分析，探讨皮肤鳞状细胞癌、Bowen病、基底细胞癌组织中MMP9对血管生成的作用及其临床意义.

1材料和方法

1.1材料石蜡包埋组织标本选自西安交通大学第二附属医院199901/200605病理确诊手术患者.SCC45例，年龄45～95(平均68.8)岁，男27例，女18例.Bowen病19例，年龄45～87(平均65.2)岁，男12例，女7例.正常人皮肤10例对照，年龄46～78（平均62.5）岁，男5例，女5例作鼠抗人MMP9mAb（MAB0245）和CD34mAb（(MAB0034)，免疫组化SP试剂盒(KIT9710)及DAB试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司.

1.2方法所有组织均经40g/L甲醛液固定，常规石蜡包埋切片，连续切片5张，厚约4μm.采用SP法，免疫组化染色程序按试剂盒说明书进行.阳性对照采用自身对照,用PBS代替一抗和二抗进行阴性对照.MMP9和CD34均采用高温高压抗原修复.MMP9结果判定：在不知任何背景资料的情形下,采用双盲法进行判定,以肿瘤细胞膜和/或细胞质出现淡棕黄色颗粒为阳性，并按着色强弱分级：无色为0，浅黄色为1，深黄色为2，棕黄色为3；着色范围以在10×40高倍镜下随机选区5个视野（每个视野记数100个细胞）计数阳性细胞所占的百分数均值：＜25%为1,25%~49%为2，50%为3.上述两项相加为MMP9的表达强度积分：＜2为阴性，＜3为弱阳性（+），3~4为阳性（），＞4为强阳性（）.MVD计数参照文献［3-4］方法进行微血管计数，先在低倍镜（×100）下观察确定血管密度最高处，在（×200）视野下选择3个高血管密度区，计算单位视野（×200）平均血管数.单个内皮细胞或内皮细胞簇，均作为一个血管计数，而直径大于约8个红细胞的血管，有较厚肌层的血管以及硬化区的血管不在计数范围内.

统计学处理:采用SPSS10.0统计软件包进行处理,根据资料类型组间比较分别采用方差分析和χ2检验，P<0.05为有统计学意义.

2结果

2.1MMP9MMP9阳性改变为细胞质或细胞膜呈棕黄色，偶尔可见细胞核着色，阳性颗粒多呈团块状.正常人皮肤组织中MMP9呈弱阳性表达，主要表达于颗粒层和棘细胞层，真皮层中纤维样细胞、单一核细胞等见阳性染色.BD组织中表皮全层均有MMP9均匀弥漫表达.SCC中MMP9在癌巢组织弥漫分布，以肿瘤周边表达强烈（图1）MMP9表达在正常皮肤组、Bowen病组、SCC组依次增高（表1）.MMP9在SCC组中高于Bowen病组织（χ2=6.667,P<0.05），Bowen病组中MMP9高于正常皮肤组（P=0.028，P<0.05）.在SCC组中MMP9的表达与患者的年龄、性别、肿瘤组织的病理分级均无关（P＞0.05）.

表1MMP9在正常皮肤组、Bowen病组和SCC表达(略)

2.2MVD计数CD34标记的微血管呈点状分布，血管内皮细胞膜被染成褐色.在SCC组织中微血管形态不规则，部分血管呈现发芽状，血管分布不均匀，在SCC的边缘区域最为密集，呈簇状(图2).Bowen病组织中微血管形态较规则，但分布不均，血管簇偶见.正常皮肤组织内的微血管形态规则，分布均匀.Bowen病组中和SCC组中MVD明显升高（表3）.

图1SCC组织MMP9表达SP×400(略)

表2SCC组织MMP9表达与患者年龄、性别及鳞癌分期的关系(略)

图2SCC组织MVD计数SP×100(略)

表3CD34和MVD在Bowen病和SCC中表达(略)

aP<0.05vs正常皮肤.

3讨论

本研究结果显示,MMP9在SCC组中高于Bowen病组织（P<0.05），Bowen病组中MMP9高于正常皮肤组（P<0.05）.Bowen病MMP9在增生表皮细胞质或细胞核表达；在SCC组织中MMP9在肿瘤细胞，增生上皮细胞和间质细胞均有阳性表达，在表达的强度、阳性细胞的种类、数量上均高于Bowen病组，提示MMP9高表达可能是SCC转移、侵袭能力的分子基础.同时观察到仅有部分有肿瘤细胞能表达MMP9，且表达MMP9的肿瘤细胞多位于癌巢的外周部分和毛细血管、淋巴管管腔周围，提示MMP9表达的肿瘤细胞可能具有更强的侵袭能力.实体肿瘤的新生血管提供了更多与体循环连接的通路，这使肿瘤细胞更容易从原发灶向远隔部位转移.肿瘤组织中微血管密度越大，肿瘤细胞进入血循环及淋巴循环的机会越多，淋巴结及邻近脏器转移的机会也增大.在许多肿瘤中都发现：微血管密度与肿瘤侵袭性与肿瘤转移的发生率相关［1,5-6］.近来研究表明，MMP9不仅是降解基底膜和ECM的关键酶，而且在肿瘤间质血管生成中起重要作用［1，5］.Wang等［7］人的研究表明,存在于细胞外基质的VEGF能够通过存在于血管平滑肌细胞上的VEGFR1受体调节MMPs的表达.而MMPs又能降解细胞外基质释放更多的VEGF,这便建立了一个正反馈调节环路来促进新生血管的形成.Naglich等［8］研究发现MMP1,MMP2,MMP9诱发和促进血管生成，TIMP1,TIMP2,TIMP3,TIMP4抑制新血管生成.

本实验显示，在SCC组织中微血管形态不规则，血管分布不均匀，在SCC的边缘区域最为密集，呈簇状.Bowen病组织中微血管形态较规则，但分布不均.正常皮肤组织内的微血管形态规则，分布均匀.SCC组中MVD高于Bowen病组织（P<0.05），Bowen病组中MVD高于正常皮肤组（P<0.05），提示细胞在发生恶性转化之前已有血管生成增多，这很可能是SCC血管生成的启动阶段.我们发现在SCC组、Bowen病和正常皮肤组中MMP9表达高者MVD表达亦高，且MMP9的高表达的部位与MVD高密度区具有一致性，均位于癌巢边缘地区，提示：肿瘤的浸润生长与新生血管生成是同步进行的，MMP9的表达与肿瘤血管形成有关.本研究结果表明，SCC的发生和侵袭转移与肿瘤细胞的分化程度及新生血管的密度密切相关，MMP9可能是SCC的重要促血管生成因子之一.阻断MMP9的表达，抑制MMP9的活化可能对抑制SCC转移具有重要意义.

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