基因重组十篇

基因重组篇1

[关键词] 企业基因 重组 实施 程序

一、企业基因重组理论

基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。Aurik等人把生物基因概念运用于企业研究中，认为企业基因是指企业价值链上一组可以为企业带来特定产出有独立价值贡献的一个基本组成部分，就是企业能力要素，这些能力要素基于一定的资源基础，如知识，资产或流程等能力要素。就像人类的某些基因决定了眼睛的颜色是灰色还是蓝色一样，企业内具有差异性的能力要素对企业的产出也起着决定性的作用。企业基因重组就是指把企业价值链进行重新分解，把企业战略建立在更为基础的业务构成层面，也就是能力要素层面上，通过对能力要素的识别、评估，把自身或其它企业的单个或多个的最优能力要素进行重组。其目的是通过企业基因重组以创建更具竞争性的实体―将单个基因进行重新排列以形成新的更有效力的基因组，以释放企业的价值潜力。

二、企业基因重组程序的缺陷

Aurik等人在企业重组理论中提出了企业基因重组程序，他们认为企业基因重组程序包括识别能力要素、企业基因重组战略的制定、企业基因重组战略的实施三个阶段。这种企业基因重组程序存在一定的缺陷。首先，缺乏优良基因的获取程序，基因发生在企业内部和不同的企业之间，获取优良基因的途径是有差异的。其次，缺乏重组效果的检查，并非所有的企业基因重组都是有效的，同时企业基因重组后整合是非常关键的步骤。最后，按照这种程序不便于实际操作。本文根据生物基因重组过程提出了一种新的企业基因重组程序。

三、基于生物基因重组程序的企业基因重组程序

生物基因重组是把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，发生遗传物质的交换，经过遗传分子的重新组合，形成新遗传型个体的过程，包括目的基因的选择与识别、目的基因的获取、重组方法的确定、重组实施、重组效果的检查等五个过程。企业具有生物的一些特征，企业基因重组类似生物基因重组过程，因此企业基因重组过程也应该包括企业目的基因的选择与识别、目的基因的获取、确定重组方法、重组实施、重组效果的检查等五个过程。

1.企业目的基因的选择与识别

企业目的基因的来源是多方面的，但最好是选择那些经过实践证明并取得成功的企业目的基因，同时企业之间互补性要明显。包括同一地区企业成功的基因架构、同一行业企业成功的基因架构、同一成长阶段企业成功的基因架构、同一规模的企业成功的基因架构、同一性质的企业成功的基因架构等。可以在同行业的企业中普遍进行寻求，寻求那些与本企业能够互补的能力要素。

2.目的基因的获取

如企业基因重组发生在同一企业内部，则在对企业内部各能力要素进行充分的分析后，直接选取各能力要素进行重组。如企业基因重组发生在不同的企业之间，目的基因的获取可以通过多种方式进行。首先，可以进行整体并购重组。通过整体并购可以直接获取目的基因。其次，可以进行部分购买重组。对一些企业的能力要素可以通过购买的形式获得。最后，可以进行培育重组。对于企业确定的目的基因，在其他途径无法获得时，只有进行逐渐培育，这正如生物基因重组中的合成基因方法。

3.确定基因重组方法

生物基因重组方法有自发重组、胁迫重组、人工基因重组等方式，企业基因重组方法与其类似，也有自发重组、胁迫重组、人工重组等方法。自发基因重组是企业在发展过程中逐渐形成的重组结果，是顺理成章的事情。企业胁迫基因重组是企业在发展过程中由于外界环境的突然变化或者激烈的竞争使企业面临生存危机时进行的基因重组。企业人工基因重组是企业在发展过程中，企业管理人员，尤其市高层管理者由于对行业和企业前景的预测主动作出的基因重组。

4.基因重组实施

在前一步完成之后，我们已经有了一个将要付诸于实施的、排好优先顺序的能力要素战略。对于许多战略来说，战略的成功实施有赖于业务发展规划及详细的实施计划的制定。在战略实施前，还应该从整个公司的角度对以下问题进行一次思考：公司能够给予多大支持？无论新的战略机会是什么，有哪些问题是一定要解决的？短期内会碰到什么样的市场需求？为了保持组织稳定性需要对哪些敏感问题特别注意？还有种种其他类似的问题需要被考虑。因此,战略实施前的第一项任务是做好变革的计划，要确定公司未来所面临的关键问题和局限性，还要评估这一最有吸引力的能力要素战略的所带来的组织影响。只有确信至关重要的因素都被考虑到了以后，才能更好的实施战略。

5.重组效果的检查

企业基因重组后还必须进行效果评价，只有通过效果评价才能检验出有效的基因重组，正如生物基因重组后必须进行稳定性培养，只有能稳定地存在的基因重组才是有效的基因重组。对于企业基因重组的检验可以通过对企业并购整合的评价来判断或者通过对重组企业能力要素是否发挥超过其单一要素时的价值来判断。

参考文献:

[1]Aurik Johan C. Jonk Gillis J, Willen Roert E..Rebuilding the Corporate Genome : nlocking the Real Value of Your Business.New York: John Wiley Sons,2003

基因重组篇2

《基因突变和基因重组》是《高中生物必修2（遗传与进化）》第五章第一节内容。本节内容是对基因与性状关系的拓展与深入学习，并为学习生物的进化和生物与环境的关系打下了基础。基因重组实质是基因的自由组合，这里只是对自由组合定律的再学习过程，所以教材没有过多叙述，在学习本节内容时可重点介绍基因突变的知识、基因重组以引导学生温故而知新即可。

【学情分析】

生物的变异现象对于学生而言并不陌生，学生通过报纸、杂志、电影、广播等多种传播媒体的介绍以及初中生物课的学习，已经初步形成了有关基因突变的相关知识。高中阶段学生的思维水平、学习能力已经发展到了较高阶段，基因突变的特点和意义这些简单易懂的内容完全可以自学完成。另外，旁栏设置的思考题和小资料也有助于学生加深对基因突变特点的理解。

【设计思路】

本节课的教学设计以新《课程标准》提出的“自主、合作、探究”的学习理念为指导，充分发挥教师的引导作用，以“掌握知识，发展能力，培育品德”的三维教学目标为核心，体现学生“学贵善思，学贵善悟”的指导思想。叶圣陶先生说过：“教师之为教，不在全盘授与，而在相机诱导。”“所谓教师的主导作用，意在善于引导启迪，使学生自奋其力，自致其知。非谓教师滔滔讲说，学生默默聆受。”要使学生主动参与学习，必须使学生对学习有兴趣;要使学生有兴趣，必须留给学生学习的自由。让学生五官并用，全身心投入整个学习过程，亲身体验，主动探究，进而促进学生的全面发展。

【学习目标】

1.能够举例说明基因突变的概念、原因、特点。

2.能说出基因突变和基因重组的意义。

3.知道人工诱变在育种上的应用及其成就。

【教学流程】

一、创设情境，导入新课

课件投影：日本广岛的原子弹爆炸和切尔诺贝利核电站爆炸对人们的健康造成怎样的威胁？

1945年8月6日，美国在日本广岛投掷了第一颗原子弹。8月9日，又在日本长崎投下第二颗原子弹，从此拉开了人类核灾难的序幕。由于受到辐射远期效应的影响，当地居民肿瘤、白血病的发病率明显增高。1986年3月26日，乌克兰境内切尔诺贝利核电站发生大爆炸，数十万人受到辐射伤害。

（设计意图：法国教育家第斯多惠说：“一个不好的教师奉送真理，一个好的教师则教人发现真理。”在教学中不仅要让学生了解一些现成的知识，更要引导学生懂得这些理论的获取过程。以境激情，情景交融，开启学习之门。）

二、合作探究，把握实质

基因突变的实例――镰刀型细胞贫血症

1.观察教材图片，说出两种红细胞的形状有什么区别？

2.自主阅读教材第81页，说出镰刀型红细胞的功能发生了怎样的变化？

（设计意图：通过观察图片，引起学生的探究兴趣。学生自然会产生疑问：人的红细胞为什么会变成镰刀型的呢？）

课件投影：参阅课本，先独立思考，再小组内合作探究，最后选一代表到黑板上写出图解。

1.病人的血红蛋白发生了什么变化？

2.缬氨酸取代谷氨酸的根本原因是什么？

3.请同学们写出中心法则图解，回忆不起来的同学可以查阅课本第68页。

4.查出谷氨酸和缬氨酸的密码子。

（设计意图：先让学生自己带着问题讨论病因，在寻求问题答案的同时，既获得了知识，又提高了能力。）

结论：控制血红蛋白的基因碱基发生了改变，而导致合成的血红蛋白改变，蛋白质是性状的体现者，所以镰刀型细胞贫血症的红细胞出现了异常。

比一比：基因结构改变除了碱基对的替换，还会不会有其他可能？

指导学生写一DN段，分析说明当DNA中碱基对增加或减少时，也会导致基因结构的改变，进而影响到性状的表现。也就是说，DNA碱基对的替换、增添和缺失均会引起基因结构的改变，即基因中脱氧核苷酸顺序发生了改变，因而遗传信息也随之改变，通过转录、翻译形成的蛋白质也发生了改变，性状自然会发生改变。

（设计意图：在教师导向性信息诱导下，学生独立完成学习任务。培养学生提取有效信息的能力，充分实现学生自主学习的能力。）

请学生用自己的语言总结基因突变的概念。然后阅读课本第82页相关内容，结合具体事例和同桌一起讨论并积极回答以下问题：

1.基因突变的原因是什么？

2.基因突变的特点？

3.基因突变的意义？

（设计意图：这是本节课需要掌握的基础知识，同学们只要认真阅读课本并略加思考，就可以轻松解决。设计本坏节的目的是让学生自学教材，主动获取知识。）

自由回答下面每组体现了基因突变的哪个特点？

第一组：高产青霉菌、植物白化苗和人类多指。

第二组：玉米籽粒有多种颜色，鼠的多种毛色。

第三组：人类白化病的概率万分之一。

（设计意图：巩固所学知识，用现实生活中的实例调动学生积极性。）

三、迁移升华，提高能力

议一议：你知道基因突变在育种上的应用吗？

（设计意图：把课本知识进一步过渡到现实生活中，体现了《课程标准》中“理论联系实际”的指导思想。教师教学的重点应该放在探究来源、点拨思路上，而不能仅限于书本知识掌握情况，即给出的不仅是要记忆的知识，更多的是解决问题的思路、方法、策略上，从而使学生接触到大量新知识，同时能够触类旁通，举一反三。）

教学反思：本节课对我最大的启发是：教师在教学过程中一定要多考虑如何让“学生学”，而不单单是“如何教”。学生自主学习能力的培养十分重要，如何让学生“学会学习”是我们每一位教师面临的最大挑战，实现真正意义上的“要我学”为“我要学”，达到“轻负担、高质量、低耗时、高效率”的课堂教学目标。

参考文献：

基因重组篇3

摘要： 目的 建立一种简便、快速基因分型方法，对广西人类免疫缺陷病毒（HIV-1）重组毒株gag基因区进行亚型鉴定。方法 从HIV阳性样本中提取核酸，使用HIV-1 M组通用引物对gag区进行第1轮扩增，第2轮使用分别检测C亚型和CRF01-AE重组型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增，根据不同亚型扩增的目的带位置不同判断亚型。另外设计了一套引物，专门用于检测B'/C重组毒株。扩增出的所有样本均进行基因测序和系统树分析以验证结果。结果 54份样本中，经基因测序和系统树分析证实CRF08-BC样本4份（741%), CRF01-AE样本46份（8518%), 4份（741）无法确定亚型。经亚型特异性引物PCR法检测出4份（100%) B'/C重组毒株，45份（9783%) CRF01-AE重组毒株，灵敏度为98%，特异性为100%。2种方法检测结果经差异性检验显示，P>005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。与基因分析结果吻合。重复实验显示，B'/C的平均重复性为100% (20/20),CRF01-AE为983% (59/60)。结论 该方法具有简便、快速，高度灵敏度和特异性的特点，可直接对广西HIV -1重组毒株CRFO 1-AE gag基因区进行分型。

关键词：人类免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶链反应

Rapid identification for gag region of circulating recombinant form of humanimmunodeficiency virus type 1

Abstract： Objective To develope a simple and rapid subtype-screening assay for the gag region of the circulating recombinant form (CRF) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1）in Guangxi.Methods Proviral DNA from HIV-positive samples were extracted and subjected to the first round PCR with universal primers for the gag region that can detect HIV-1 M group isolates.In the second round PCR,two pairs of subtype-specific primers that were designed to detect subtype C and CRF01-AE respectively were added into one tube.The PCR products of different subtypes could be distinguished in agarose-gel electrophoresis.Another pair of subtype-specific primers exclusively detecting the the prevalent recombinantstrains CRF07-BC and CRF08-BC was designed and used.Additionally,all of these samples were sequenced and analyzed phylogenetically.Results DNA sequencing and phylogenetic analysis of the gag region of the 54 samples showed that 4 samples (7.41%) were infected with CRF08-BC,46 (85.18%) with CRF01-AE and 4 (7.41%) remained unclassifiable.Detection of the subtype-specific primer sets revealed that 4 were B'/C (100%),and 45 were CRF01-AE (97.83%),with an adequate sensitivity (98%) and a high specificity (100%).Non-specific bands occasionally appeared but did not interfere with interpretation of the results.The phylogenetic analysis was consistent with subtype-specific primer sets and the consistent rate was 98.15%.The average reproducibility was 100% for B'/C samples and 98.3% for CRF01-AE samples.Conclusion A simple,rapid and low cost assay is developed for subtype-screening of CRFO1-AE in Guangxi.For the B'/C strains in Guangxi,it needs to be verified further by increasing samples.

Key words： human immunodeficiency virus type 1(HIV-1）；genetic subtype；polymerase chain reaction (PCR)

人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）高度变异，不同亚型毒株其生物学特性及；分子流行病学特征均有所不同〔1〕，若能快速、准确地对HIV进行基因分型不仅有助于了解HIV-1转播规律，而且可为阐明HIV基因型与生物表型关系、药物耐药性等研究提供资料。近年来，我国学者〔2〕建立了一种多重巢式PCR法对我国HIV-1主要流行株进行鉴定亚型。然而，由于HIV-1的基因变异度极高，在传播过程中可产生许多具有相对独立的基因序列型别，使得不同地区各亚型间具有其自身的特异性。广西壮族自治区为国内HIV感染的高发区，大部分感染发生在经济尚不发达地区的人群中。因此，建立广西HIV-1主要流行株快速基因分型方法十分必要。目前，广西的优势流行株为CRF01-AE和CRF08-BC重组毒株〔3,4〕。为此，本研究针对这2种重组毒株gag基因区建立了一种亚型特异性引物PCR法的快速基因分型法。

1 材料与方法

11 样本来源 从广西HIV-I主要流行区采集54份样本，经ELISA初筛和免疫蛋白印迹（WB）确认为HIV阳性样本。

12 核酸提取 采用QIAamp Bloodes Mini Kit试剂盒（德国QiaGen公司）从每位感染者的抗凝全血中提取细胞DNA，并冻存于-80℃冰柜备用。

13 HIV-1亚型特异性引物的设计 亚型特异性引物的设计是整个方法建立的关键。设计的基本原则：设计的引物位点必须在各个亚型间高度特异，而在同一种亚型内部高度保守。在Primer50软件的帮助下设计出gag区的亚型特异性引物（表1)。

14 HIV-1 gag基因区的扩增 用nested-PCR对HIV-1 gag基因区进行扩增，第1轮使用引物GagF2/Gage2，模板15μl，反应条件：94℃ 5min,52℃ 1min,72℃ 2min 30s,1个循环；94℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 1min 30s,30个循环；72℃ 10min。第2轮模板5μl，使用分别检测C亚型和CRF01-AE重组型的2套亚型特异性引物（Cag-c1/Cag-c2,Cag-ae1/Cag-ae2) ,争套引物放入同一反应管中，为减少非特异性反应，使用热启动和降落PCR (TD-PCR）技术〔5〕，94℃ 5min，52℃ 1min,72℃ 2min 30s,1个循环；94℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 1min,3个循环；94℃ 30s,51℃ 30s,72℃ 1min,3个循环；94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 1min,3个循环；94℃ 30s,49℃ 30s,72℃ 1min,3个循环；94℃ 30s,48℃ 30s,72℃ 1min,25个循环，72℃ 10min。如果特异性引物PCR扩增出的目的条带判断为C亚型，则用专门用于检测B'/C重组毒株（包括CRF07-BC和CRF08-BC）的亚型特异性引物Cgag-c1/Cgag-bc为内侧引物再进行PCR扩增，以判断是否为重组形式。反应条件：94℃ 2min,48℃ 1min,72℃ 2min,1个循环；94℃ 30s,48℃ 30s,72℃ 1min,35个循环；72℃ 10min。同时使用引物306/Cn-gag扩增所有样本并进行基因测序，用于系统树分析及亚型鉴定以验证特异性引物分型结果是否正确。反应条件：94℃ 2min,50℃ 50s,72℃ 1min,1个循环；94℃ 30s, 50℃ 30s, 72℃ 1min,35个循环；72℃ 10min。第1轮和第2轮PCR反应体系均为50μl,dNT/P浓度为200μmol/L,Taq酶为25U，引物浓度为04μmol/L,MgCl2浓度为15mmol/L。表1 gag区PCR扩增使用的引物 （略）内侧特异性引物注：R=A或G

15 PCR产物检测 取5μl第2轮PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭（EB）染色检测，紫外摄影拍照，根据Markers分子量大小来判定结果。C亚型片段190bp;CRF01-AE片段881bp;B' /C片段1079bp。

16 序列测定 对于全部经引物306/Cn-gag扩增的样本，经切胶，纯化后，以306为测序引物，提纯的PCR产物为模板，采用DNA测序试剂盒（美国ABI公司）,在PTC-220型多通道PCR仪（美国MJ公司）上进行测序反应。反应产物经提纯后，采用310型全自动毛细管DNA测序仪（美国ABI公司）进行序列测定和分析。

17 序列分析 （美国Los Alamos国家实验室HIV核酸序列库中提供）基因分型工具BLAST程序进行基因型鉴定；用Clustal X进行排序和MEGA version 21软件进行分析。亚型分析使用的各个亚型参考序列来自美国Los Alamos HIV基因数据库。

18 检测该方法的重复性 在CRF01-AE样本中随机选取12份，CRF08-BC 4份，共16份样本使用上述方法重复5次。

2 结果

21 样本基因测序和系统树分析 54份阳性样本中通过引物306/Cn-gag扩增最终获得50份样本的基因序列，经BLAST程序鉴定出4份样本gxmu0402,gxmu0416、gxmu0418和gxmu0419为CRF08-BC重组毒株，余下46份为CRF01-AE重组毒株。将50份基因序列与国际各亚型标准株的基因序列进行系统树分析显示。4份CRF08-BC样本与CRF08-BC98CN006和CRF08-BC97CNGX7f靠得很近，而46份CRF01-AE中，有44份与CRF01-AE97CNGX2f聚成一簇，另外2份样本gxmu0432和gxmu0439与CRF01-AE93JPNH 1和CRF01-AE93TH057十分接近。

22 亚型特异性引物PCR扩增 部分样本经亚型特异性引物PCR扩增后的电泳结果见图1和图2。根据不同亚型扩增出的目的带位点不同，判断出亚型结果。54份样本中，采用特异性引物共扩增出49份样本，其中C亚型4份，CRF01-AE重组毒株45份（9783%,45/46)。进一步使用B'/C重组特异性引物扩增C亚型特异性引物鉴定出来的4份样本，发现这4分样本均为B'/C重组毒株（100%,4/4)。以基因测序法为金标准，可知亚型特异性引物PCR法的灵敏度为98%，特异性为100%。

23 亚型特异性引物PCR法的重复性 重复实验采用4份CRF08-BC样本和12份CRF01-AE随机样本进行5次重复。结果显示，CRF08-BC重组毒株平均重复性为100%（20/20），而CRF01-AE在5次重复中有1次出现1份样本检测不出，其平均重复性为983%（59/60）。M：DNA分子量；1：H2O；2：阴性对照；3：xmu0433;4:gxmu0440;5:gxmu0451;6:gxmu0462图1 部分CRF01-AE样本琼脂糖电泳结果（略） M：DNA分子量；1：H2O；2：阴性对照；3:gxmu0418;4:gxmu0419　图2 B'/C样本琼脂糖电泳结果

24 基因测序法与亚型特异性引物PCR法比较 54份己确认的阳性样本，基因测序法检测并正确分型的样本是50份，检出率为9260%，特异性引物PCR法为49份，检出率为9074%。2种方法检测结果经差异性检验显示，χ2=0,P>005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。

3 讨论

本研究结果表明，亚型特异性引物PCR方法对于亚型的鉴定结果与基因测序、系统树分析得到的结果是吻合的，该方法的特异性达100%。用亚型特异性引物扩增样本时，有时一会出现非特异性扩增条带，干扰实验结果。非特异性条带位置一般不在特异性位置。为防止误判，可以通过跑厚胶并且延长电泳时间，使目的条带与非特异性条带充分分开。通常在紫外灯下，非特异性条带要比目的条带弱。出现非特异性扩增条带通常有如下的原因：(1)引物与模板错配扩增产生，引物与模板亚型相符，不仅能在特异性位点上与模板结合，亦能在远离特异性位点的地方与模板结合，这种情况错配通常靠近引物5′端的位置，电泳时会出现两条带；(2)引物之间形成的引物二聚体，一般出现在80bp左右的位置，通过长时间电泳可使此条带消失；(3)某一亚型的特异性引物与另一亚型的模板错配扩增产生，因2套引物放入同一反应管中，所以可能出现此情况，为了避免此情况发生，因此，在设计引物时使引物在3′端与别亚型的模板至少有2个碱基产生错配。用本研究所建立起的方法对54份样本的gag基因区进行检测，发现有些样本在1200bp左右的位置会出现一条非特异性扩增，因第1轮PCR扩增的条带位置在1242bp,因此怀疑此非特异性扩增条带为第1轮PCR扩增出的目的带，将第1轮PCR产物与用亚型特异性引物扩增出的第2轮产物同时进行电泳，证实了这一推测。为了减少此情况的发生，可减少第1轮反应的模板量，同时在加入反应体系、模板和酶后尽量减少室温放置时间或在冰盒上操作。本实验结果表明，亚型特异性引物PCR法，灵敏度为98%，特异性为100%，结果显示，其灵敏度和特异性均较好。重复性实验显示，B'/C亚型的平均重复性为100%,CRF01-AE重组毒株为983%,说明一该方法在实际中是可行的。但由于CRF08-BC样本例数不多，因此，本研究所建立起的方法对于HIV-1 B'/C重组毒株分型的准确性有待扩大样本量进一步证实。

参考文献

〔1〕 杰伊A，利维.艾滋病病毒与艾滋病的发病机制［J］.2版.北京：科学出版社，2000：126-132.

〔2〕 Wei M,Guang Q,Liang H,et al.Simple subtyping assay for human immunodeficiency virus type 1 subtypes B,C,CRF01-AE,CRF07-BC,and CRF08-BC［J］.J Clin Microbiol,2004,42:4261-4267.

〔3〕 Yang R,Kusagawa S,Zhang C,et al.Identification and characterization of a new class of human immunodeficiency virus type 1 recombinants comprised of two circulating recombinant forms,CRF07-BC and CRF08-BC,in China［J］.J Virol,2003,77:685-695.

基因重组篇4

目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1（DMT1）编码基因的重组腺病毒。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1IRE的cDNA，亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中，形成转移质粒pAdTrackCMVDMT1IRE，在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组，利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆，经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1DMT1IRE。线性化的重组质粒转染HEK293细胞，获得高滴度的重组腺病毒。结果 RTPCR反应扩增出1 841 bp的片段，重组质粒阳性克隆pAdEasy1DMT1IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段，PCR鉴定扩增出DMT1的片段，证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因DMT1IRE。转染293细胞后细胞表达GFP荧光，显示293细胞稳定表达外源性的DMT1IRE基因。结论 携带DMT1IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功，获得高滴度的重组腺病毒，为DMT1基因进一步功能的研究提供基础。

【关键词】 阳离子转运蛋白质类 重组 遗传 腺病毒科

［ABSTRACT］ Objective To construct a recombinant adenovirus containing gene of DMT1 without IRE. Methods The DMT1 without IRE gene was obtained by RTPCR， which was then cloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV containing green fluorescent protein (GFP) reporter gene， followed by linearization of the resultant plasmid pAdTrackCMVDMT1IRE by Pme Ⅰ digestion and subsequent cotransformation into E.coli BJ5183 cells along with an adenoviral backbone plasmid pAdEasy1. The recombinant plasmid pAd easy1DMT1IRE was selected for kanamycin resistance. The recombination pAdeasy1DMT1IRE was cleaved with Pac Ⅰ to expose inverted terminal repeats. Pac Ⅰdigested pAdEasy1DMT1IRE was transfected into 293 cells， in which， recombinant adenovirus was generated within 7 to 10 days. Results RTPCR showed DMT1IRE was 1 841 bp， pAdEasy1DMT1IRE yielded a large fragment， plus a smaller fragment of 4.5 kb digested by Pac Ⅰ. PCR， showing that pAdEasy1DMT1IRE contained gene DMT1 without IRE. GFP expression was visualized by fluorescence microscopy. Conclusion The recombinant adenovirus is successfully constructed and can efficiently express DMT1 without IRE. It offers a foundation for further study of the function of DMT1.

［KEY WORDS］ DMT1; Homologous recombination; Recombinant adenovirus

近年来的研究显示，帕金森病（PD）病人脑内有铁代谢的改变，铁离子含量在黑质致密带显著增高，而在黑质网状带无明显变化[1，2]。但铁在黑质的选择性聚积的原因至今还不是十分清楚。新的铁转运蛋白的发现是铁代谢领域的重大突破，为解释这一问题提供了重要的理论依据。二价金属离子转运蛋白1（DMT1）曾被称为具有天然抗性的巨噬细胞蛋白2（Nramp2），是新近发现的铁转运蛋白[3]。研究发现DMT1在脑内广泛表达[4]，提示DMT1在脑铁转运中起到非常重要的作用，可能参与了黑质内的铁聚积。本研究构建了携带DMT1IRE的重组腺病毒，为研究DMT1在铁聚积中的作用提供实验依据，有利于进一步阐明PD的神经元损伤机制。

1 材料与方法

1.1 材料

实验能用携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdeasy1，大肠杆菌BJ5183、JM109和DH10B由本室保存。兔抗鼠DMT1IRE单克隆抗体购自Alpha Diagnostic公司。βactin抗体为Sigma公司产品，HRP标记的goat antirabbit IgG购自中山公司。人胚肾293细胞由本室保存。人胚肾293细胞用含体积分数为0.10的胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液，于37 ℃、体积分数0.05 CO2温箱中培养。

1.2 方法

1.2.1 RTPCR扩增目的基因 应用Trizol提取RNA， 应用巢式PCR的方法扩增DMT1IRE基因，外侧引物：5′AGGGTACCTCTAAGAACTCAGCCACTCAG3′，3′GGATACCCGAACACAGAACTTCGAACCA5′；内侧引物：5′AAGGTACCACCATGGTGCTGGGTCCTG3′，3′GTCTGCAAAACTTGTTTTCCGTTTTCGAACG5′。第一轮PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃ 1 min，63 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，扩增30个循环；最后72 ℃延伸10 min。将第一轮PCR产物以1∶100稀释后用于第二轮PCR扩增。扩增产物于含溴化乙锭（0.5 mg/L）的12 g/L的琼脂糖凝胶中电泳进行检测，紫外线透射仪下观察电泳结果。

1.2.2 载体双酶切 将DMT1IRE插入pMD18T载体测序，测序结果显示DMT1IRE序列正确，将载体pMD18TDMT1IRE和pAdTrackCMV分别用限制性核酸内切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切，37 ℃水浴5 h。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，待DNA完全消化后（电泳显示单一条带），回收纯化酶切产物。

1.2.3 目的基因与载体连接 将目的基因定向亚克隆到pAdTrackCMV质粒上（质粒pAdTrackCMV含有CMV启动子、GFP报告基因、卡那霉素Kan抗性标志、PacⅠ酶切位点、PmeⅠ酶切位点）。将酶切后的目的基因和载体按1∶1、2∶1、3∶1的摩尔比混合，用T4 DNA Ligase 进行连接反应，将上述各种试剂加至0.5 mL离心管中混匀，16 ℃过夜反应。

1.2.4 穿梭质粒与腺病毒骨架载体的共转化 取上述线性化和磷酸化处理的质粒pAdTrackCMVDMT1IRE与1 μL(0.1 μg) pAdEasy1质粒同时加入到用TSS法制备的感受态E.coli BJ5183中，将转化的BJ5183感受态菌液全部涂布于2～3个含有35 mg/L卡那霉素的LB平板，37 ℃培养16～20 h。挑取10～20个较小菌落，在含有35 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中37 ℃振摇培养10～15 h，碱裂解法小量提取质粒DNA。用8 g/L琼脂糖凝胶电泳进行电泳迁移率分析，挑选质粒大小大于pAdEasy1的质粒，并用限制性内切酶PacⅠ酶切进行鉴定。

1.2.5 重组腺病毒的包装 重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后，用脂质体法转染293细胞，转染48 h后在荧光显微镜下观察细胞内的绿色荧光的表达。之后表达绿色荧光蛋白的细胞数目逐渐增多，转染后6 d达高峰，细胞开始变圆、脱落，此时收获细胞，反复冻融3次后离心除去细胞碎片，取上清的1/3继续感染293细胞以扩增病毒，24 h后细胞内开始出现荧光并逐渐增多，说明包装出的重组腺病毒具有感染性且在细胞内不断增殖。重复上述过程3～4次即可获得大量具有稳定感染性的重组腺病毒。

2 结果

2.1 重组腺病毒质粒的构建

RTPCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，DMT1IRE为1 841 bp（图1A）。将目的基因片段重组到高效克隆载体pMD18T simple vector进行测序，双酶切结果显示连接成功（图1B）。将重组质粒pAdTrackCMVDMT1IRE行限制性核酸内切酶KpnⅠ和 HindⅢ 双酶切分析，得到目的基因和长约9 200 bp穿梭载体片段（图1C），说明目的基因已连接到穿梭载体上。将重组腺病毒载体pAdDMT1IRE经PacⅠ酶切后行电泳检测，可观察到一条大于20 kb的大片段和一条较小的DNA片段（4.5 kb）（图1D），提示重组质粒构建成功。

图1 重组腺病毒质粒构建琼脂糖凝胶电泳图基础研究（略）

A： PCR扩增目的基因DMT1IRE; B： pMD18T simple vectorDMT1IRE重组质粒双酶切; C： pAdTrackCMVDMT1IRE重组腺病毒穿梭质粒双酶切; D： PacⅠ酶切鉴定

2.2 重组腺病毒的包装

重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后，用脂质体法转染293细胞，转染48 h后在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光，表明质粒转染成功，外源基因开始表达。之后表达绿色荧光蛋白（GFP）的 细胞数目逐渐增多，转染后6 d达高峰，细胞开始变圆、脱落，此时收获细胞，反复冻融3次后离心除去细胞碎片，取上清的1/3继续感染293细胞以扩增病毒，培养24 h后细胞内开始出现荧光并逐渐增多，说明包装出的重组腺病毒具有感染性且在细胞内不断增殖。重复上述过程3～4次即可获得大量具有稳定感染性的重组腺病毒，所获病毒命名为AdDMT1IRE。

转贴于 　3 讨论

PD病人脑内有铁代谢的改变，铁离子含量在黑质致密带显著增高，而在黑质网状带无明显变化。由于铁离子的细胞毒作用和它能够促进羟自由基的产生，成为PD不容忽视的一个关键因素。目前已有足够的证据证实铁离子在神经退行性疾病中的现实意义[5，6]。

DMT1是GRUENHEID等[7]在1995年研究具天然抗性的巨噬细胞蛋白1（Nramp1）的过程中发现的一种新蛋白质，与Nramp1有高度同源性（达78％）和相似的二级结构。DMT1参与Fe2+转运，对系统性的铁摄取及细胞水平的铁摄取都起了至关重要的作用。已有报道PD病人脑黑质DMT1表达异常增高，这与PD病人脑内铁的异常沉积恰巧在同一个部位。因此，推断因DMT1的表达失控引起的脑铁代谢紊乱可能与PD的发生、发展有关，DMT1表达异常可能是导致PD病人黑质内铁增多的原因。对于DMT1在脑内的功能及其表达调控尚需进一步的研究证实，也许通过对其功能的进一步认识，将为阐明PD的神经元损伤机制提供有价值的理论依据。

重组腺病毒为基因表达研究与基因治疗提供了一种通用的方法。本实验首次采用了腺病毒载体系统来构建DMT1IRE的瞬时高表达载体，进而为研究DMT1的功能提供条件。构建重组腺病毒的方法有多种，用传统的方法构建重组腺病毒载体时，重组的过程是在真核细胞内完成的。该法需要同时向真核细胞内共转染两种质粒，分别是含大部分腺病毒基因组的骨架质粒和含有外源性目的基因的穿梭质粒。该法同源重组效率低，获得重组病毒有一定难度，而且不能完全避免野生型病毒的产生；需要多次空斑筛选，因而制备出腺病毒的时间较长，妨碍其广泛应用。1998年，国外首次报道了AdEasy系统， AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，极大简化了载体的构建过程[8，9]。

本研究采用AdEasy系统，在较短的时间内成功地构建了重组腺病毒AdDMT1IRE，由于其携带GFP的编码基因，因此可在包装增殖的同时直接用荧光显微镜观察转染和感染效率，是高效便捷的重组腺病毒系统。重组腺病毒感染HEK293细胞后，在共聚焦显微镜下可观察到GFP表达随时间增加而增加。证明重组腺病毒可以成功感染HEK293细胞，并伴有GFP蛋白的正确表达。

综上所述，本实验成功地获得了高滴度的携带DMT1IRE基因的重组腺病毒，为DMT1基因的功能研究提供了基础，为研究脑铁转运、高铁对神经细胞的损伤及药物作用靶点提供实验依据。

【参考文献】

[1]ATASOY H T， NUYAN O， TUNC T， et al. T2weighted MRI in Parkinson’s disease: substantia nigra pars compacta hypointensity correlates with the clinical scores[J]. Neurology India， 2004，52:332337.

[2]GERLACH M， DOUBLE K L， YOUDIM M B， et al. Potential sources of increased iron in the substantia nigra of parkinsonian patients[J]. Journal of Neural Transmission Supplementum， 2006，70:133142.

[3]GUNSHIN H， MACKENZIE B， BERGER U V， et al. Cloning and characterization of a mammalian protoncoupled metalion transporter[J]. Nature， 1997，388(6641):482488.

[4]GARRICK M D， DOLAN K G， HORBINSKI C. DMT1: a mammalian transporter for multiple metals[J]. Biometals， 2003，16:4154.

[5]JIANG H， LUAN Z， WANG J， et al. Neuroprotective effects of iron chelator desferal on dopaminergic neurons in the substantia nigra of rats with iron overload[J]. Neurochemistry International， 2006，49:605609.

[6]WANG J， JIANG H， XIE J X. Ferroportin1 and hephaestin are involved in the nigral iron accumulation of 6OHDAlesioned rats[J]. European Journal of Neuroscience， 2007，25:27662772.

[7]GRUENHEID S， CELLIER M， VIDAL S， et al. Identification and characterization of a second mouse Nramp gene[J]. Genomics， 1995，25:514525.

[8]HE T C. A simplified system for generation recombinant adenoviruses[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998，95:25092514.

基因重组篇5

关键词：  乙型肝炎病毒;HBx基因;腺病毒载体

原发性肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV) 感染与HCC的发生密切相关，而HBV X基因编码的HBx蛋白在HBV相关性肝癌发生发展中起关键作用[1]。本实验采用pAdEasyTM重组腺病毒系统，构建HBx基因重组腺病毒载体(Ad-HBx)，为进一步研究 HBx 基因对肝癌发展的影响提供可靠的基因转移工具。

1 材料和方法

1.1 材料 真核表达载体质粒pCDNA3.l-HBx由本实验室构建并保存[2]， pAdTrack-CMV腺病毒质粒、含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌、人胚肾293细胞株及空白对照腺病毒Ad由徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心胡书群博士惠赠。PmeⅠ酶、PacⅠ酶购自 NEB，其余限制性核酸内切酶及T4DNA 连接酶、PCR试剂盒、质粒DNA回收纯化试剂盒为美国Promega公司产品，Effectence转染试剂盒为德国Qiagene公司产品。

1.2 方法

1.2.1 pAdTrack-CMV-HBx重组穿梭质粒的构建 用HindⅢ和EcoRⅤ双酶切pcDNA3.1-HBx，获取HBx基因，克隆到腺病毒载体pAdTrack-CMV(同样HindⅢ/EcoRⅤ双酶切)中。得到重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx。经PCR、酶切验证后送invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司测序。

1.2.2 pAdTrack-CMV-HBX与pAdEasy的同源重组 将正确重组的穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx用PmeⅠ酶切线性化，电转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183细菌。卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取最小的克隆扩增培养，提纯质粒。用PacⅠ酶切鉴定质粒，鉴定成功的重组子再次转化感受态DH5α细菌，筛选阳性克隆并提取纯化，得到含HBx基因的重组腺病毒质粒pAd-HBx。

1.2.3 重组腺病毒在293细胞内的包装和扩增 经PacⅠ酶切线性化的重组腺病毒质粒pAd -HBx转染293细胞，按照Effectence转染试剂说明书操作。37℃、5% CO2培养箱中孵育，24～48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，7～10天后收集包装细胞，反复冻融4次以收获重组腺病毒Ad-HBx，将病毒冻融上清液反复感染293细胞以大量扩增并收获病毒。

1.2.4 重组腺病毒Ad-HBx目的基因鉴定 5 μl病毒上清液加上10 μl PCR-grade Protease K，55℃消化1 h，然后煮沸样品5 min，离心后取1～2 μl进行PCR反应，证实重组腺病毒基因组中含有HBx基因。

2 结 果

2.1 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx的鉴定 用HindⅢ/EcoRⅤ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱以及采用HBx基因全序列的上下游引物其PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱上都可见一条465 bp的条带，与目的基因HBx的DNA片段一致。测序结果也证实重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx中HBx的碱基序列与文献报道一致。

2.2 重组腺病毒表达质粒pAd-HBx的鉴定 用PmeⅠ酶切线性化pAdTrack-CMV-HBx与pAdEasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，结果得到重组腺病毒载体质粒pAd-HBx。用PacⅠ酶切重组腺病毒表达质粒pAd-HBx，0.8%琼脂糖凝胶电泳显示，有30 kb和3.0 kb的2个条带(图1)，证实穿梭质粒和骨架质粒同源重组成功。

2.3 重组腺病毒Ad-HBx的包装 含重组腺病毒的质粒pAd-HBx转染包装细胞293，在24～48 h后，荧光显微镜下可观察到GFP的表达(图2)，表明重组腺病毒在293细胞中已开始病毒包装。7～10天后可观察到细胞病变(CPE)，大部分包装细胞肿胀脱落。

2.4 重组腺病毒Ad-HBx的鉴定 PCR鉴定结果证实重组病毒Ad-HBx基因组中含有目的基因，电泳显示465 bp的单一条带(图3)。

3 讨 论

HBx基因编码的X蛋白是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质直接作用，从而调节基因表达及宿主细胞蛋白质功能，进而影响病毒的复制、宿主细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌变等[3]。

本实验采用限制性内切酶从重组质粒pcDNA3.1-HBx得到HBx基因，应用pAdEasyTM重组腺病毒系统在原核细胞大肠杆菌BJ5183内进行同源重组[4]， 大大提高了病毒的重组效率。AdEasyTM重组腺病毒系统中腺病毒骨架质粒含有不完整的腺病毒基因，缺失E1区(1-3533)和E3区。E1区为病毒复制所必需，人胚肾细胞293细胞可以补充E1区。重组穿梭质粒含有目的基因HBx基因、CMV启动子、GFP基因、卡那霉素(Kana)耐药基因、限制性内切酶PacⅠ位点和PmeⅠ位点。将穿梭质粒用PmeⅠ酶切线性化后，电转化至含有骨架质粒的感受态细菌BJ5183中进行同源重组[5]，利用卡那霉素抗性筛选重组体。重组成功的质粒用PacⅠ线性化，转染293细胞，得到可表达HBx蛋白的重组腺病毒载体。观察其在293细胞中GFP的表达情况，检测HBx蛋白的表达，从而确定重组腺病毒Ad-HBx构建成功。本实验构建的携带HBx基因的重组腺病毒载体，具有转染效率高、易检测观察(GFP为报告基因)的优点，为下一步研究HBx对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程的机制建立基础。

基因重组篇6

Cloning and sequencing of recombinant plasmid affecting survivin gene translation by RNA interference technique

【Abstract】 AIM: To clone the recombinant plasmid affecting survivin gene translation by RNA interference and to analyze the nucleic acid sequence of the recombinant plasmid for new gene therapy for tumors. METHODS: Two DNA sequences containing small hairpin structure were designed and synthesized. The complement form was obtained by annealing and being cloned into vector pSilencer 3.1H1 hygro and the recombinant plasmid was transformed into strain DH5α. The plasmid identified by restriction enzyme was used for sequencing. RESULTS: The recombinant plasmid was cloned and the aimed sequence was obtained. CONCLUSION: Successful cloning of the recombinant plasmid helps to find a new gene therapy for tumors.

【Keywords】 survivin gene; RNA interfering; recombinant plasmid

【摘要】 目的：利用RNA干扰(RNAi)技术，以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体，并进行测序鉴定. 方法：设计具有短发夹结构的两条DNA序列，经退火成互补双链，再克隆至载体pSilencer3.1H1hygro中构建重组表达载体，转化DH5α菌株，提取质粒行酶切鉴定后，并进行序列测定. 结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体上，经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论：Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功，可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录，供抗肿瘤研究参考.

【关键词】 survivin基因；RNA干扰；重组表达载体

0引言

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近几年发展起来的新技术. 用小片段RNA二聚体(small interfering RNA, siRNA)对高等哺乳动物细胞进行转导，成功排除了长片段双链RNA (doublestranded RNA, dsRNA)在哺乳动物细胞内引起非特异性干扰的现象，但其主要障碍是长于30 nt的双链RNA将激活抗病毒机制，导致非特异性的RNA转录降解. 而体外合成21 nt的siRNA能够成功地特异性抑制哺乳动物的基因表达［1-3］. 本实验我们针对凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein, IAP)基因家族的survivin基因的短发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)构建重组表达载体，为体外和体内抗肿瘤研究提供平台.

1材料和方法

1.1材料

含有人H1启动子的pSilencer 3.1H1hygro质粒为美国Ambion公司产品，由西南医院皮肤科王继文博士赠送. 克隆用大肠杆菌DH5α由本校烧伤科实验室董征学硕士赠送. 限制性内切酶BamHⅠ,HindⅢ及T4 DNA连接酶、核酸分子质量标准λHindⅢ digest, DL2000均为TaKaRa公司产品. E.Z.N.AR质粒小量抽提试剂盒、E.Z.N.AR胶回收试剂盒均为美国Omega公司产品.

1.2方法

1.2.1Survivin基因干扰片段shRNA的设计与合成氯化钙法制备DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃备用；扩增和纯化质粒 pSilencer3.1H1hygro. 根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列(No NM 001168)，参考shRNA设计原则进行设计［4］ ，最后选择出三条片段作为survivin基因干扰片段. 以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列，两端加酶切位点，最后得到具有回文结构和发夹结构(hairpin siRNA)的干扰片段序列，并将其送北京赛百盛生物试剂公司合成.

1.2.2pSilencer3.1H1hygrosiRNA表达载体的构建将每对要退火的两条片段分别取2 μL与46 μL退火缓冲液混合，利用PCR仪加热至95℃ 3 min，然后70℃水浴,自然冷却至室温. 用45 μL的无酶去离子水稀释5 μL的退火双链，使其终浓度为8 mg/L. 载体pSilencer3.1H1hygro经BamHⅠ和HindⅢ双酶切. 将退火片段与经酶切后的载体按摩尔比3∶1的比例进行连接反应，同时设立阴性对照和质粒pSilencer3.1H1hygro的阳性对照反应，置16℃过夜. 将连接产物各取4 μL分别接种于100 μL的DH5α感受态细胞中进行转化. 挑取单菌落扩增培养，E.Z.N.AR质粒小量抽提试剂盒进行质粒试抽提. 用限制性内切酶BglⅡ分别对重组质粒进行单酶切(此位点为目的序列所特有的酶切位点)鉴定. 得到的重组质粒分别命名为pSilencer3.1H1hygrosiRNA1, pSilencer3.1H1hygrosiRNA2,pSilencer3.1H1hygrosiRNA3.

1.2.3重组质粒测序鉴定将鉴定证实后的三个重组质粒各取1管菌液送大连宝生物工程有限公司测序. 所用引物为M13+.

2结果

2.1载体双酶切鉴定回收酶切产物行12 g/L琼脂糖凝胶电泳后，可见环状质粒已被切开,大片段约为4.491 kb，小片段为61 bp因太小而无法检测（图1）.

2.2筛选重组质粒pSilencer3.1H1hygrosiRNA1，pSilencer 3.1H1hygrosiRNA2，pSilencer 3.1H1hygrosiRNA3培养板上均有细菌克隆长出，形态和大小基本一致；pSilencer3.1H1hygro质粒的阳性转化对照有大量细菌克隆长出；阴性对照培养板上无细菌克隆长出，连接转化可能成功.

2.3单酶切鉴定重组质粒第2孔经BglⅡ单酶切的pSilencer3.1H1hygro，因该质粒无此酶切位点故仍保持环状结构；第4，6，8孔为经BglⅡ单酶切的三个重组质粒，因该重组质粒含有此酶切位点故可被酶切成线状结构（图2）.

2.4重组质粒测序鉴定测序结果均包含目的序列(图3）.

3讨论

肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病. 肿瘤中细胞凋亡现象很可能是机体对抗肿瘤的主动措施，因此细胞凋亡在肿瘤的发生发展及治疗中起着关键性的作用. 细胞凋亡(apoptosis)受多个基因的凋控，抑制凋亡的基因主要包括bcl2基因家族和IAP家族. 其中，survivin基因是IAP基因家族的新成员. 1997年Ambrosini等［5］利用效应细胞蛋白酶受体1（effector cell protease receptor1，EPR）cDNA在人类基因组文库中筛选克隆得到的新基因. Survivin N端含有一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)分子，其中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基Trp67，Pro33和Cys84，survivin通过这些氨基酸残基与Caspase3和Caspase7结合抑制Caspase的活性，在COOH端有一个由40个氨基酸组成的α螺旋结构，通过α螺旋结构与细胞分裂微管结合，从而抑制细胞凋亡. Survivin基因特异性表达于人和鼠的胚胎发育组织，在终末分化的成人组织中不表达，而在转化细胞株和人体内大多数恶性肿瘤组织中明显表达［6］. 它与细胞凋亡和增殖、肿瘤血管的生成密切相关，还参与细胞周期凋控，并影响着肿瘤的发生发展. 因此，以survivin为靶点的肿瘤基因治疗成为肿瘤治疗研究的重要方面.

3.1H1hygrosiRNA3测序鉴定

抑制基因表达的方法很多，目前研究使用较多的主要有反义RNA技术、RNA干扰技术、基因敲除等. 反义RNA技术的使用量较大，抑癌效率低. 而RNAi则具有选择余地大和扩增放大效应［7］，只需微量特异的dsRNA即可产生明显的抑癌效果，具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点. 除了技术方面的差别，两者的作用机制也不同. RNAi技术中siRNA序列选择余地大，21~23 nts中如果改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶向mRNA起作用，因此RNAi可以应用于单个核苷酸突变基因的抑制表达. 以质粒为载体将siRNA导入细胞内，所形成的siRNA专一作用于靶向基因的细胞系可用于较长时间的功能研究［8-9］. RNAi技术与基因敲除技术相比，后者往往需要较长时间才能了解所缺失功能基因后的生物学现象，而前者则在转染细胞48 h后即可了解抑制靶向基因表达后的生物学现象.

质粒pSilencer3.1H1hygro包括一种人H1 RNA聚合酶Ⅲ启动子，利用相对单一的启动子和终止序列产生大量的小RNA. 同时，位于启动子下游的shRNA是为了在RNAi质粒进入宿主表达后，单链的RNA配对形成短的dsRNA，引发RNA干扰. 而且，该载体中含有可供筛选的潮霉素耐药基因和氨卞青霉素耐药基因，利于阳性重组子的克隆筛选. 因此，我们根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列，参考shRNA设计原则设计出了三条阻断survivin基因表达的RNAi序列，并成功克隆至载体pSilencer3.1H1hygro，为进一步研究体内外抗肿瘤治疗提供新方法.

【参考文献】

［1］ Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］.Nature, 2001, 411(6836): 494-498.

［2］ Caplen NJ, Parrish S, Imani F, et al. Specific inhibition of gene expression by small doublestranded RNAs in invertebrate systems［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(17):9742-9747.

［3］ Elbashir SM, Martinez J, Patkaniowska A, et al. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate［J］. EMBO J, 2001, 20(23): 6877-6888.

［4］ Tuschl T, Zamore PD, Lehmann R,et al. Targeted mRNA degradation by doublestranded RNA in vitro［J］. Genes Dev, 1999, 13(24): 3191-3197.

［5］ Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel antiapoptosis gene, surviving, expressed in cancer and lymphoma［J］. Nat Med, 1997, 3(8): 917.

［6］ Adida C, Crotty PL, McGrath J, et al. Developmentally regulated expression of the novel cancer antiapoptosis gene surviving in human and mouse differentiation［J］. Am J Pathol, 1998, 152(1): 43.

［7］ Sui GH, Soohoo C, Shi Y, et al. A DNA vectorbased RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(8): 5515-5520.

基因重组篇7

【摘要】 目的：构建NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作，采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列(533bp)，插入质粒pGL3basic载体，构建重组质粒pGL3NOX4，重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3NOX4转染A549细胞，通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激，结果显示NOX4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。

【关键词】 NOX4;报告基因;表达调控

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶首先发现于中性粒细胞和单核/巨噬细胞，在吞噬微生物病原体时，NADPH氧化酶被激活，细胞发生呼吸爆发，产生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，成为机体抵抗微生物感染的重要成分[1]。近年，在非吞噬细胞质膜上发现了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名为NOX(NADPH oxidase)蛋白家族。人类基因组同源性检索发现了7种NADPH氧化酶，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[2-4]。。NOX家族广泛表达于机体的组织器官，它们的生物学功能成为当前研究的热点领域。为了探讨NOX家族中NOX4在机体炎症和免疫反应中的作用，我们构建NOX4报告基因重组质粒pGL3NOX4，并初步观察了炎症细胞因子对该基因表达水平的影响。

1 主要材料和试剂

A549上皮细胞株、E.coli DH5α为本实验室保存。荧光素酶报告基因载体pGL3basic，海肾荧光素酶内对照报告载体pRLTK及DualLuciferase Report Assay System为Promega产品。质粒提取，PCR产物纯化及凝胶回收试剂盒购自Omega公司。DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，细胞因子TNFα、IFNγ购自PeproTech公司。Pfu酶，dNTP，限制性内切酶(Xho1，BamHⅠ)，T4DNA连接酶等购自Takara公司。基因组DNA提取试剂盒，DL2000 DNA Marker购自天根生物技术有限公司。

2 方法

2.1 质粒载体的构建

2.1.1 引物合成 通过GenBank检索NOX4基因全序列，参考相关文献，设计扩增出含有NFκB结合位点的NOX4基因上游调控序列。引物设计采用Primer5.0软件，其序列如下：

P1：CCTCTCGAGGAGGGTCCCCACTTTTAGTATGAG

P2：GGTGGATCCCATCCTACCAGGCAGAGGTGTTTA

引物分别含限制性内切酶Xho1，BamHⅠ酶切位点，扩增片段全长533bp。引物由大连宝生物技术有限公司合成。

2.1.2 PCR 以细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为25μL，含10×PCR反应buffer2.5μL; dNTP 2μL;上下游引物各0.5μL;Pfu高保真酶0.2μL;DNA模板0.5μL;其余加水补足。反应条件为94℃变性3min，之后进行30个循环(94℃ 30s，.51℃ 30s，72℃ 4min，，)，72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物做电泳胶回收。pGL3basic载体用Xho1，BamHⅠ双酶切，小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒载体。

2.1.3 重组质粒的构建 经酶切纯化后的PCR产物和pGL3basic载体用T4DNA连接酶连接，转化到E.coli DH5α感受态细菌中，涂布于LB培养板，37℃孵育过夜，挑取细菌克隆提质粒，用Xho1，BamHⅠ进行双酶切鉴定，最后经ABI 3730全自动DNA测序仪进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。

2.2 细胞转染及报告基因活性检测

2.2.1 细胞转染 用含10%新生小牛血清的DMEM培养基培养A549细胞。将对数生长期的细胞于转染前24小时，按每孔10×104个细胞密度接种于48孔培养板，当细胞达85-95%时，按照Lipofectamine 2000说明书进行重组质粒pGL3basicNOX4和pRLTK载体转染。具体操作为将细胞培养基换为无血清的DMEM( 100μL/孔)，Lipofectamine 2000与质粒DNA(报告基因重组质粒和内对照质粒pRLTK)以一定比例各加入100μL无血清的DMEM中，5min后混合，室温孵育20min，再加入细胞培养孔，37℃，5%CO2的孵箱中培养24-48h。

2.2.2 细胞因子刺激试验 实验分组为TNFα组，IFNγ组，TNFα+IFNγ组，空白对照组。TNFα终浓度为25ng·mL-1，IFNγ终浓度为10ng·mL-1，在细胞因子刺激A549细胞的不同时间点(6h，12h，24h)，裂解细胞检测NOX4报告基因表达水平。实验均设3复孔。

2.2.3 报告基因活性检测 在细胞因子刺激细胞后的不时间点吸去培养基，PBS洗涤细胞。每孔加入60μL的1×PLB细胞裂解液(按DualLuciferase Report Assay System试剂盒说明配备)，孵育30min，收集裂解液，10000转4℃离心10min，上请储存于-20℃备用。取20μL细胞裂解上请，根据DualLuciferase Report Assay System试剂盒说明进行报告基因萤火虫荧光素酶及内对照海肾荧光素酶检测，仪器采用Beckman Coulter DTX880。实验数据采用SPSS软件进行分析，采用T检验。

3 结果

3.1 报告基因重组质粒(pGL3NOX4)的构建和鉴定

以基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增。产物于1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果在约533bp处可以见到与预期大小相符的目的片段(图1)。PCR产物插入pGL3basic载体，得到重组质粒pGL3NOX4经XhoⅠ，BamHⅠ双酶切鉴定，显示有一条为约533bp片段(图2)，通过上海英俊生物公司测序证实，重组质粒目的片段与Genbank报道序列一致。

3.2 细胞因子刺激A549细胞报告基因活性检测

用细胞因子TNFα，IFNγ刺激转染了报告基因pGL3NOX4的A549细胞，分别于刺激6、12、24小时裂解细胞测定荧光素酶活性。结果显示单独采用TNFα或IFNγ都能够刺激报告基因的表达，而联合使用两种细胞因子的刺激作用更强。在刺激6、12、24小时，两种细胞因子刺激实验组荧光素酶活性分别为未加细胞因子的阴性对照组(DMEM对照)荧光素酶活性的2.6、2.2、2.0倍。实验数值经SPSS软件分析，各实验组与对照组相比，P

4 讨论

表达于中性粒细胞和单核/巨噬细胞的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶最先被发现，该酶是吞噬细胞呼吸爆发的关键分子，吞噬细胞通过呼吸爆发产生大量活性氧(ROS)，成为依赖氧杀菌机制的重要介质[1]。吞噬细胞NADPH氧化酶的催化亚基gp91 phox位于细胞质膜，当细胞受刺激后，gp91phox与胞浆中其他亚基(p22phox，p47phox，p40phox，p67phox，和Rac)共同形成有活性的NADPH氧化酶复合体。

吞噬细胞gp91 phox现在称为NOX2。与gp91 phox结构同源的分子共同组成NOX蛋白家族，他们包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5，Duox1和Duox2。他们与NOX2一样均参与细胞ROS生成，所不同的是，NOX2似特异表达于吞噬细胞，而NOX蛋白家族其他成员在组织细胞有广泛表达，由于他们发现较晚，其生理功能研究有待深入[2-3]。活性氧往往作为第二信使参与细胞信号转导，在MAPKs信号通路、JAKSTAT信号通路、NFκB信号通路等，都有活性氧参与其中，这些信号传导与细胞分裂分化，转化，迁移，凋亡等过程密切相关，由此也提示NOX蛋白家族与上述重要生命现象关联[4-6]。

最初研究表明，NOX4在肾脏组织中大量的表达，它可能作为一种敏感性氧感受器，NOX4主要分布在鼠肾的近端小管和人肾单位远端，而促红细胞生成素(EPO)的生成与管周细胞相邻。在肝脏也表达少量NOX4的mRNA，提示N0X4可能作为EPO合成的氧感受器[7-8]。最近有研究发现，NOX4在中枢神经系统的神经元中也有一定表达。除了NOX2，NOX家族其他分子在机体天然免疫及炎症中的作用仍有待研究[9-10]。本实验构建了NOX4荧光素酶报告基因重组质粒，成功转染A549细胞，以此为模型，观察炎症细胞因子对NOX4表达的影响，结果发现TNFα、IFNγ刺激NOX4基因表达，这不但提示NOX4参与细胞炎症反应，同时为我们进一步探讨NOX家族在机体对抗微生物感染过程中的作用奠定了很好的基础。

参考文献

1 Clark RA. Activation of the neutrophil respiratory burst oxidase[J]. J Infect Dis， 1999， 179(Suppl 2): S309-S317.

2Kikuchi H， Hikage M， Miyashita H， et a1. NADPH oxidase subunit， gp91(phox) homologue， preferentially expressed in human colon epithelial cells[J]. Gene， 2000， 254(1，2): 237-243.

3Cheng GJ， Cao ZH， Xu XX， et a1.Homologs of gp91phox: cloning and tissue expression of NOX3， NOX4， and NOX5[J]. Gene， 2001， 269(1):131-140.

4Clempus RE， Griendling KK. Reactive oxygen species signaling in vascular smooth muscle cells[J]. Cardiovasc Res， 2006， 71(1): 216-225.

5Gu Y， Xu YC， Wu RF， et al. TNFalpha activates cJun amino terminal kinase through p47(Phox) [J]. Exp Cell Res， 2002， 272(1): 62-74.

6Madamanchi NR， Li S， Patterson C， et al. Reactive oxygen species regulate heatshock protein70 via the JAK/STAT pathway[J]. Arterioscler ThrombVasc Biol， 2001， 21(2): 321-326.

7GeisztM， Kopp J B， Vamal P， et a1.Identification of Renox， an NAD(P)H oxidase in kidney[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97(15):8010-8014.

8Shiose A， Kuroda J， Tsuruya K， et a1. A novel superoxideproducing NAD(P)H oxidase in kidney[J]. J Biol Chem， 200l， 276(2):1417-l423.

基因重组篇8

作者：姜立 马文丽 柯杰兵 彭翼飞 李晋 徐兵 郑文岭

【摘要】 目的 构建人鸟氨酸脱羧酶抗酶（OAZ）突变基因，重组至原核表达载体中并表达出重组蛋白。方法 采用基因定点突变技术在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位碱基T碱基缺失，使核糖体的阅读框+1移位，连续表达OAZ基因的ORF2部分。测序鉴定后，重组质粒转化BL21菌，进行突变基因的蛋白表达。结果 重组质粒经测序后确认202位碱基T缺失，其余碱基序列无变化。重组的突变基因转入BL21后在IPTG诱导下表达OAZ全长蛋白，SDS-PAGE分析在相对分子质量45 900左右出现新的蛋白条带。结论 成功构建人OAZ突变基因重组质粒，转化BL21后表达出融合的OAZ全长蛋白，为进一步研究其临床应用打下基础。

【关键词】 鸟氨酸脱羧酶抗；突变；蛋白表达

鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多聚胺生物合成中的关键酶，催化多聚胺生物合成途径中的第一步——鸟氨酸向腐胺的转变。随后，腐胺再转变为亚精胺、精胺。ODC是该代谢途径的限速酶，在此过程中扮演着重要的调控酶角色，其活性可在转录、翻译和翻译后水平受到精确的调控。鸟氨酸脱羧酶抗酶（ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）是在翻译后水平的一种调控形式，它可以连接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，从而负性调控细胞内多聚胺含量。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达在降低细胞内多胺水平的同时还能抑制细胞的生长。由此推测，OAZ在细胞的生长与分化过程中担任着重要的角色［1~3］。OAZ蛋白的表达有一个非常有趣的移位翻译现象，其表达受到精胺的一个称之为frame-shifting的核糖体移位的调控。多聚胺通过这种较罕见的调控机制诱导OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在细胞内的浓度，使细胞在一个稳定的多聚胺水平进行正常生长分化。OAZ转录本的编码存在两个不同的阅读框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其实是一个由短的非保守的ORF1产物和高度保守的ORF2产物的组合。在OAZ mRNA的阅读框中，需要有一个+1的翻译移码过程。在ORF1的5′端终止密码子处，通常序列为TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻译框架达到TGA时，如果没有精胺的存在，核糖体将接受TGA为终止密码子，翻译到此终止。当精胺浓度一定时，核糖体的翻译即可受到精胺的调控进行+1移码，跃过终止密码子TGA上的T，以GAT指导的天冬氨酸为后续，翻译合成ORF2［4-5］。翻译框架移码受到细胞内多聚胺水平上升的正调控，表达出的OAZ蛋白又能调节ODC的酶活性，反向调节细胞内多聚胺的水平，从而影响到细胞的生长及分化。在生长旺盛的肿瘤组织中，普遍发现了ODC的高表达，因此，OAZ蛋白特有的调控ODC活性的功能，就使之成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表达受到精胺的诱导，缺乏精胺时，核糖体将不能进行+1的移位，翻译完整的全长OAZ蛋白。为此，本研究对OAZ基因进行了特定T碱基的缺失突变，成功构建至表达载体pET-32a中，测序确认后命名为pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表达出OAZ全长蛋白，将对进一步研究该基因的功能以及以OAZ为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备，具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试剂 大肠杆菌DH5α、BL21和表达质粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild质粒由本实验室保存。QuikChange定点突变试剂盒购自Stratagene公司。质粒纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、XhoⅠ和EcoRⅠ内切酶均购自TaKaRa公司，其余生化试剂均为国产分析纯。 引物根据OAZ基因所需点缺失碱基处进行设计2条反向互补引物对P1与P2。 P1：5′-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3′；P2：5′-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3′。

1.2 方法

1.2.1 反向PCR扩增 以pET-32a-OAZ-wild质粒为模板进行PCR 反应: 将pET-32a-OAZ-wild质粒(10 mg/L) 1 μl、dNTP 1 μl、10×Buffer 5 μl、P1与P2 引物 ( 100 mg/L)各2.5 μl、PfuTurbo DNA多聚酶(2.5 ×106 U/L) 1 μl、双蒸馏水37 μl 加入PCR 管; 95℃预变性30 s后， 95℃ 30 s、55℃ 1 min、68℃ 6 min ，共 18个循环。PCR 产物置于冰上2 min ， 加入1.5 μl DpnⅠ内切酶(106 U/L)， 37 ℃水浴2 h，酶解模板DNA。

1.2.2 转化大肠杆菌DH5α 取感受态大肠杆菌50 μl， 加入上述DpnⅠ处理液10 μl， 轻轻混匀， 冰浴30 min 42℃热休克45 s 冰上2 min，加入预热的LB 培养液0.5 ml， 置于37℃恒温摇床中， 200 r/min 振摇1 h。

1.2.3 质粒扩增、提取及鉴定 取200 μl 菌液铺到LB 琼脂培养板( 含Amp) 上， 37℃培养12～16 h。挑取单菌落，提取质粒。取质粒5 μl， 选取插入片段两端的酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ 双酶切，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶进行分析鉴定。含目的基因的质粒经测序验证目标碱基缺失后，命名为pET-32a-OAZ-mutation。

1.2.4 重组蛋白表达 将含有pET-32a-OAZ-mutation的质粒转化BL21菌，铺板挑阳性菌落并酶切鉴定为阳性菌落后，接种至含5 ml LB培养基中（含氨苄青霉素）振培过夜。次晨取100 μl接种至新的5 ml LB培养基中，37℃振培3～4 h，至D值约为0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mmol/L，继续培养2 h和4 h后取菌液1 ml，进行15%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物，以转染空pET-32a质粒的BL21菌在同等条件下用IPTG诱导为阴性对照。

2 结 果

2.1 pET-32a-OAZ-mutation测序图 PCR扩增后，DpnⅠ酶切产物并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，鉴定含有目的基因后，抽提质粒，以T7启动子序列为测序引物序列于ABI3730测序仪进行DNA序列测定，确定OAZ基因的TGCTCCTGATGCC(196~208)处的202位T已缺失，其余序列没有变化(测序图中的第312~323号序列为TGCTCC GATGCC，显示T已缺失)。见图1。

2.2 重组pET-32a-OAZ-mutation在BL21宿主菌中的蛋白表达 SDS-PAGE分析结果显示，经IPTG诱导的含重组质粒BL21与对照菌相比，在相对分子质量为45 900位置上出现1条新带。见图2。图1 T7启动子测序结果图

图2 表达产物SDS-PAGE图

MMarker；1BL21菌；2转化pET-32a质粒的BL21菌；3转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌，经IPTG诱导后2 h；4转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌，经IPTG诱导后4 h

3 讨 论

细胞的生命活动需要多聚胺(polyamine)类物质，包括腐胺(putrescine)、亚精胺(spermidine)和精胺(spermine)。多聚胺几乎是所有活细胞的必要组分，它们的缺失将导致细胞生长减少甚至死亡，但是当它们的含量升高时也会有致癌作用并且可以诱导细胞凋亡［6-7］。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达除了能降低细胞内多胺水平，还能抑制细胞的生长。而OAZ能够特异地拮抗ODC的催化活性，减少细胞内多胺的生成，因此成为研究抑制肿瘤细胞恶性增殖的切入点［8］。

从最初哺乳类动物细胞中克隆出OAZ基因至今，已陆续发现有OAZ1、OAZ2和精子特异性的OAZ3基因。其中OAZ1，也就是通常所说的OAZ基因，其表达的蛋白产物对于ODC有特异性的拮抗作用。OAZ的的抑制作用不是直接降解ODC，而是OAZ与ODC结合后，通过26S蛋白酶降解ODC，是一种在翻译后水平调节酶活性的机制。ODC是一个二聚体酶，亚基间的聚合与解聚非常迅速。OAZ对于ODC单体蛋白有非常高的亲和力，形成AZ∶ODC的蛋白聚合体，促进ODC被26S蛋白酶降解［7～11］。人OAZ蛋白是由两段ORF的表达框所翻译表达，在第一个表达框的终止密码子处，有一个核糖体移位位点，在精胺诱导下，出现程序性的阅读框的移位。越过终止密码子，继续住下游翻译，直至第2个表达框的终止密码子处。全部蛋白共由228个氨基酸所组成，其中ORF1编码N末端68个氨基酸，ORF2编码C末端160个氨基酸。ORF2编码的C末端氨基酸序列是真正发挥抗酶活性的肽链区段，但是该区段的蛋白表达需要在精胺的诱导下才能出现，因此增加了对于OAZ全长蛋白调控机制的研究难度。

故此，本研究通过定点突变技术，成功地使OAZ基因ORF1与ORF2间的核糖体移位位点发生缺失，也就是使ORF1的终止密码子的TCCTGATGCC的T发生缺失，使核糖体按照随后GAT GCC的三联体顺序进行翻译，无需精胺的诱导即可表达出完整的OAZ蛋白。由于选用质粒pET-32a作为原核表达载体，OAZ蛋白表达的同时，还在其C末端携带有多聚组氨酸的标签，可通过His标签蛋白进行纯化，为进一步研究其在肿瘤细胞中的调控机制提供了条件，为开发其临床应用奠定了基础。

参考文献

［1］ Schipper RG， Cuijpers VM， De Groot LH， et al. Intracellular localization of ornithine decarboxylase and its regulatory protein， antizyme-1［J］. J Histochem Cytochem， 2004，52(10):1259-1266. ［2］ Mangold U. The antizyme family: polyamines and beyond［J］. IUBMB Life， 2005，57(10):671-676.

［3］ Newman RM， Mobascher A， Mangold U， et al. Antizyme targets cyclin D1 for degradation. A novel mechanism for cell growth repression［J］. J Biol Chem，2004，279(40):41504-41511.

［4］ Schenkel H， Hanke S， Cecilia De Lorenzo， et al. P elements inserted in the vicinity of or within the Drosophila snRNP SmD3 gene nested in the first intron of the Ornithine Decarboxylase Antizyme gene affect only the expression of SmD3 ［J］. Genetics， 2002， 161(2):763-722.

［5］ Gerner E， Meyskens F Jr. Polyamines and cancer: old molecules， new understanding［J］. Nat Rev Cancer， 2004，4(10):781-792.

［6］ Fong LY， Feith DJ， Pegg AE， et al. Antizyme overexpression in transgenic mice reduces cell proliferation， increases apoptosis， and reduces N-nitrosomethylbenzylamine-induced forestomach carcinogenesis ［J］. Cancer Res，2003，63(14):3945-3954.

［7］ Sakata K， Kashiwagi K， Igarashi K. Properties of a polyamine transporter regulated by antizyme［J］. Biochem J， 2000， 347 Pt 1:297-303.

［8］ Hoffman DW， Carroll D， Martinez N， et al. Solution structure of a conserved domain of antizyme: a protein regulator of polyamines ［J］. Biochemistry， 2005，44(35):11777-11785.

［9］ Gandre S， Bercovich Z， Kahana C. Ornithine decarboxylase-antizyme is rapidly degraded through a mechanism that requires functional ubiquitin-dependent proteolytic activity ［J］. Eur J Biochem， 2002，269(4):1316-1322.

［10］ Murai N， Murakami Y， Matsufuji S. Identification of nuclear export signals in antizyme-1［J］. J Biol Chem， 2003，278 (45):44791-44798.

基因重组篇9

（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心／生命科学学院植物遗传育种研究所，贵阳 550001）

摘要：以贵州师范大学荞麦产业技术研究中心建立的两个甜荞（Fagopyrum esculentum）重组自交系群体（Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1）的亲本为研究对象，选取了5个多态性好、带型清楚的随机引物进行RAPD分析，计算了每对亲本之间的相似度系数，并构建了各亲本的RAPD指纹图谱。结果表明，在Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1的亲本中，平均相似度系数分别为39．13％和42．69％；在构建的RAPD指纹图谱中，有29条谱带为Homo（P1）所独有，27条谱带为甜自100（P2）所特有；有26条谱带为Lorena－3（P1）所独有，25条谱带为甜自21－1（P2）所特有。荞麦特异谱带可以作为品种鉴定的分子标记。

关键词 ：甜荞（Fagopyrum esculentum）；RAPD；多样性；DNA指纹图谱

中图分类号：S517 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）02－0284-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.008

甜荞（Fagopyrum esculentum）为荞麦大粒组类群7个生物学物种之一［1］。Chen［2，3］的试验研究表明，普通荞麦中存在着大量的形态变异，而对这些变异进行深入研究将在很大程度上有利于遗传育种。基因控制着生物体的性状表达和变异，研究DNA分子的多态性也会促进对形态变异的进一步探索，并在遗传育种中为选择强优势组合的亲本进行杂交和荞麦资源的鉴定提供科学依据［4］。

RAPD技术是以PCR为基础的一项检测物种DNA多态性的分子技术［5］。该技术的优点是DNA样品需求量小；无种属和基因组结构特异性，一套引物可用于不同生物基因组分析；试验成本低；试验技术简单，检测速度较快。RAPD在荞麦中应用主要集中在荞麦的遗传多样性和种间系统关系研究方面［6］。通过建立RAPD指纹图谱，寻找每个种类的恒定谱带和独特谱带，可以迅速准确地对荞麦种类进行鉴别。近年来，RAPD技术已应用于多种植物杂交组合后代鉴定［7，8］和种子纯度的检测等。Ohinshi等［9］、Tsuji等［10］利用AFLP和RAPD技术研究苦荞栽培品系和天然种群间的系统发育关系。Sharma［11］应用RAPD技术研究了荞麦属14个种之间的遗传多样性。Kump等［12，13］采用RAPD技术进行了苦荞33个栽培种之间遗传关系的分析。许瑾等［4］利用RAPD技术对荞麦属的9个品种进行基因组指纹图谱分析。谭萍等［14］采用RAPD方法对国内10个荞麦栽培种进行基因型分析，并建立了指纹图谱。Pan等［15］以F． esculentum Moench， F． esculentum var． homotropicum 及其杂交所建立的 225 株 F2代分离群体为材料，进行了 RAPD 与 STS 标记分析和重要形态性状遗传分析，并由此构建遗传标记连锁图谱，共涉及87个RAPD标记，12个STS标记。覆盖基因组长度655．2 cM。总的说来，由于普通荞麦自交不亲和，相关研究主要以荞麦品种或品系为材料，主要运用RAPD等标记。

在重组自交系中，利用亲本DNA样品进行RAPD 标记引物筛选，并将重复性好的引物进行其可育F2代分离群体样本的PCR扩增，用以分析甜荞RAPD标记多态性和构建起分子遗传连锁图谱。本研究对普通荞麦重组自交系群体亲本组合（Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1）的亲本用5种随机引物的RAPD谱带进行多态性分析和指纹图谱建立，以期为其F2代自交系群体的进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1．1 试验材料

本研究选用了甜荞重组自交系的4个亲本甜荞种，分别为Lorena－3、甜自21－1、甜自100和Homo。重组自交系的亲本组合为：Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1。甜荞品种由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供。

1．2 DNA提取

取2～3周苗龄的新鲜健康叶片约300 mg置于研钵中，倒入液氮，研成粉末。将该粉末直接转入装有预热的含有15 μL β－巯基乙醇的1 000 μL 2％ CTAB提取缓冲液（质量浓度2％ CTAB，100 mmol／L pH 8．0 Tris－HCl，50 mmol／L EDTA－Na2，1．4 mol／L NaCl，质量浓度2％ PVP）的5 mL离心管中，轻轻摇动使其充分混匀，置于65 ℃水浴中保温60 min（每隔20 min轻轻颠倒混匀1次），加入酚／氯仿／异戊醇混合液（25∶24∶1，V／V／V），充分混匀，常温下静置10 min，10 000 r／min 离心10 min。将上清液加入氯仿／异戊醇混合液（24∶1，V／V），轻轻混匀，室温下10 000 r／min离心10 min。将上清液转移到干净的离心管中，加入2倍体积－20 ℃冰冻的无水乙醇，轻轻颠倒离心管直至出现白色絮状沉淀，将离心管放在 －20 ℃中沉淀10 min。离心沉淀DNA并将沉淀用 －20 ℃冰冻的体积分数为70％的乙醇洗涤两次，在室温下使DNA沉淀干燥。加入600 μL TE缓冲液，完全溶解后，置于－20 ℃冰箱保存备用。

1．3 引物

共使用了5个随机引物，各引物序列见表1。该引物从贵州师范大学荞麦产业技术研究中心设计的25个引物中选取，以亲本间多态性好、电泳带型清晰、重复性好为主要筛选原则。

1．4 PCR反应体系

试验中，RAPD检测使用的PCR反应体系见表2。PCR反应程序为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性1 min，Tm（引物不同温度不同）退火1 min，72 ℃延伸2 min，38个循环；72 ℃延伸10 min。

1．5 统计分析方法

扩增产物于0．8％的琼脂糖凝胶中电泳，在BioSenSC805型全自动凝胶成像系统的Analysis工具栏中，点击消除背景图标以消除图像本底的干扰；点击自动检测所有泳道的条带图标以进行各泳道内条带检测；点击相对分子质量计算图标，以Marker泳道内的Marker条带的相对分子质量为标准设定相对分子量曲线图，关闭Marker窗口，则会显示各个条带的相对分子质量，统计各泳道内的条带数。

参考文献［16］，采用条带相似度系数分析条带的多样性。相似度系数SD＝（2nAB）／（nA＋nB），nA为A泳道内的DNA条带数，nB为B泳道内的DNA条带数，nAB是A、B泳道内共有的条带数。

2 结果与分析

2．1 亲本甜荞的RAPD电泳图谱

不同引物扩增的亲本甜荞的RAPD电泳图谱如图1和图2所示。

2．2 亲本甜荞RAPD标记的多样性分析

根据筛选出的5个随机引物的RAPD扩增结果，可以对每对杂交组合中的两个亲本进行扩增条带的多样性分析，两对杂交组合亲本中各引物的扩增情况与相似度系数见表3和表4。

由表3可知，对亲本Homo（P1）×甜自100（P2）的组合进行RAPD扩增，5个引物共扩增出92条谱带，平均每个随机引物产生了18．4条谱带。这些引物的扩增产物为17～20条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物R1182，共有20条谱带；其次为引物R52和R428，均为19条谱带；最少的为引物R41和R353，扩增出17条谱带。

对亲本Homo（P1）×甜自100（P2）组合的所有随机引物的RAPD标记多样性进行检测，结果（表3）表明，在5个随机引物获得的92条谱带中，有18条谱带在两亲本间表现为相同谱带，RAPD标记的相似度系数为39．13％（36／92）。对于每一条引物的相似度系数来说，其变化范围为31．58％（6／19）～50．00％（10／20）。其中RAPD标记的相似度系数最高的引物是R1182，达到了50．00％，引物R428的标记相似度系数最低，为31．58％（6／19）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Homo（P1）×甜自100（P2）在基因组DNA水平上存在较低的RAPD标记相似度系数，即DNA水平上条带的多样性较为丰富。有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。

由表4可知，对亲本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的组合进行RAPD扩增，5个引物共扩增出89条谱带，平均每个随机引物产生了17．8条谱带。这些引物的扩增产物为15～20条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物R1182，共有20条谱带；而后依次为R52、R353、R41、R428，扩增出的谱带数分别为19、18、17、15。

对Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的亲本组合所有随机引物的RAPD标记多样性进行检测，结果（表4）表明，在5个随机引物获得的89条谱带中，有51条谱带在两亲本间的表现存在差异性，RAPD标记的相似度系数为42．69％（38／89）。对每条引物的标记相似度系数来说，其变化范围为40．0％（6／15）～47．06％（8／17）。其中RAPD标记的相似度系数最低的引物为R428和R1182，相似度系数为40．00％，R41的标记相似度系数最高，达47．06％（8／17）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）基因组DNA水平上同样存在较低的RAPD标记相似度，也存在较高的多样性，将有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。

2．3 亲本甜荞的RAPD指纹图谱

根据全部随机引物扩增产物的数据统计分析结果，将能在亲本组合中稳定扩增出现的、且具有差异的特异性谱带用来构建亲本组内P1和P2的RAPD标记指纹图谱。在Homo（P1）×甜自100（P2）的亲本中，共扩增出56条差异性谱带（表5）；在Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的亲本中，共扩增出51条差异性谱带（表6）。

由表5和表6可知，Homo（P1）×甜自100（P2）和Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）组合亲本RAPD指纹图谱存在较明显的差异性。前者中有28条谱带为Homo（P1）所独有，27条谱带为甜自100（P2）所特有；后者中有24条谱带为Lorena－3（P1）所独有，24条谱带为甜自21－1（P2）所特有。因此，在每对杂交组合中，存在差异的谱带可看作是两亲本的特征性谱带，而由RAPD指纹图谱所反应的这些特征谱带可以作为鉴别亲本的依据，也可为进一步对杂交组合中亲本的DNA多态性及其他分子遗传研究打下基础。

3 讨论

Deng等［17］利用7个随机引物对19个荞麦（包括甜荞和苦荞）品种进行RAPD分析，结果表明其平均多态性达94．89％，而本研究结果表明，甜荞重组自交系的两对亲本组合的平均相似度系数分别为39．13％（Homo×甜自100）和42．69％（Lorena－3×甜自21－1），再次在DNA水平上说明荞麦种间的多态性远高于种内多态性。同时，对同属甜荞品种的两个亲本组合而言，其低于50％的相似度系数也从DNA的角度解释了甜荞异花授粉、自交不亲和等生殖学特征所带来的物种基因重组的多态性现象。在对荞麦进行种类划分的研究中，部分种类难以从形态学上进行识别，分类特征也常存在较大变异，难以把握。本研究在DNA水平上进行的RAPD遗传标记分析可对荞麦品种鉴别和遗传歧化研究提供依据。

此外，本研究以重组自交系亲本为研究对象进行RAPD分析，发现自交系群体亲本之间存在较多的特异RAPD谱带，也可为以重组自交系为研究对象进行的相关农艺学特征遗传及分子标记研究奠定基础。

参考文献：

［1］ 陈庆富．荞麦属植物科学［M］．北京：科学出版社，2012．

［2］ CHEN Q F． Hybridization between Fagopyrum（Polygonaceae） species native to China［J］． Botanical Journal of the Linnean Society，1999，131：177－185．

［3］ CHEN Q F．A study of resource of Fagopyrum（Polygonaceae） native to China［J］． Botanical Journal of the Linncan Socicty，l999，130：53－64．

［4］ 许 瑾，周小梅，范玲娟，等．荞麦RAPD指纹图谱的建立及在品种鉴定中的应用［J］．山西大学学报（自然科学版），2006，29（2）：194－197．

［5］ WILLIAMS J G K，KUBELIK A R，LIVAK K J，et al． DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］． Nucleic Acids Res，1990，18：6531－6535．

［6］ SHARMA T R，JANA S．Random amplified polymorphic DNA（RAPD）variation in Fagopyrum tataricum Gaerm．accessions from China and the Himalayan region［J］． Euphytica，2002，127：327－333．

［7］ 李文彬，梁红健，孙勇如，等．RAPD鉴定栽培稻和野生稻体细胞杂种［J］． 生物工程学报，1996，12（4）：390－393．

［8］ 赵同金，向凤宁，聂 卉，等．5SrDNA间隔序列分析和RAPD技术用于鉴定体细胞杂种［J］．植物研究，2004，24（1）：120－124．

［9］ OHINSHI O，MATSUOKA Y．Search for the wild ancestor of buchwheat ll．Taxonomy of Fagopyrum（Polygonaeeae） species based on morphology， isozymes and cpDNA variability［J］．Genes Genet．Syst，1996，71：383－390．

［10］ TSUJI K，OHNISHI O． Origin of cultivated Tartary buckwheat（Fagopyrum tarieum Gaertn．） revealed by RAPD analyses［J］． Genetics Resources and Crop Evolution， 2000，47：431－438．

［11］ SHARMA T R． Species relationships in Fagopyrum revealed by PCR－based DNA fingerprinting［J］． Theor APPl Genet，2002，105：306－312．

［12］ KUMP B，JAVORNIK B．Evaluation of genetic vaiability among common buckwheat（Fagopyrum eseulentum Moeneh）， population by RAPD makers［J］． Plant seience，1996，114：149－158．

［13］ KUMP B， JAVORNIK B． Genetic diversity and relationships among cultivated and wild aceessions of tartary buckwheat （Fagopyrum tataricum Gaertn．） as revealed by RAPD markers［J］．Genetic Resources and Crop Evolution，2002，49：565－572．

［14］ 谭 萍，王玉株．十种栽培苦荞麦的随机扩增多态性DNA（RAPD）研究［J］，种子，2006，25（7）：46－49．

［15］ PAN S J， CHEN Q F． Genetic mapping of common buckwheat using DNA，protein and morphological markers［J］． Hereditas，2010，147：27－33．

基因重组篇10

【摘要】 目的: 观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten)体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞后的表达，并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用. 方法: 利用AdEasy腺病毒载体系统构建Adpten，体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞，荧光显微镜检测Adpten的转染效率. Western印迹检测pten在HO8910PM细胞中的表达；MTT实验观察pten对细胞生长的影响；HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响；细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色检测pten基因对HO8910PM细胞凋亡的诱导作用. 结果: 外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO8910PM细胞，Western印迹检测出有PTEN蛋白的表达，当感染复数MOI为100时，体外转染效率高达90%以上. pten显著抑制HO8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移. 结论: 重组腺病毒是高效的基因转移系统，能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO8910PM细胞中，对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用，并能抑制其迁移.

【关键词】 卵巢肿瘤；基因治疗；pten基因；腺病毒；细胞凋亡；迁移抑制

0引言

抑癌基因pten，即第10号染色体缺失的与张力蛋白同源的基因，是继p53后又一个与多种肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因，其编码具有双重特异磷酸酶活性的蛋白，可以反向调控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）/AKt信号传导途径，从而抑制细胞生长增殖. 其突变和缺失多发于乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等［1-3］. 在某些pten基因突变或缺失的癌细胞中过表达PTEN蛋白能抑制细胞增殖和肿瘤的形成，使其细胞周期停滞在G1期并发生细胞凋亡［4-5］，而且在某些没有pten基因突变的癌细胞中，使pten基因过表达也能抑制这些癌细胞生长，诱导其发生凋亡［6］；另外，pten基因还能抑制癌细胞的侵润转移，降低其迁移能力. 这就提示pten基因用于癌症基因治疗有着重要意义. 而基因治疗载体的选择最为重要，当今运用最多最广泛的就是腺病毒(adenovirus， Ad)载体，其具有在哺乳动物及其他多种生物细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性和不整合宿主细胞的性质，是一种比较安全，转染效率又高的载体［7］. 本研究采用携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten)，将pten基因导入人高转移卵巢癌HO8910PM细胞，观察其在卵巢癌细胞中的表达，研究其对卵巢癌细胞生长抑制、迁移抑制、诱导凋亡的作用，对卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意义的参考数据.

1材料和方法

1.1材料人高转移卵巢癌HO8910PM细胞和人胚肾细胞293T购自中国科学院上海细胞生物学研究所；野生型pten表达质粒（wtpten）为美国加州大学Frank Furnari教授惠赠；AdEasy腺病 毒表达载体系统由美国休斯霍华德医学院及John Hopkins肿瘤中心Bert Vogelstein教授惠赠，其中穿梭载体pAdTrackCMV带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)，在表达外源基因同时也能单独表达gfp，用于重组腺病毒的快速筛选以及转染率的测定；抗PTEN抗体为美国Santa Cruz公司产品; HRP标记羊抗鼠IgG抗体和马抗山羊IgG均购自北京生物技术有限公司；MTT为美国Amerson公司产品. Hoechst33258 细胞凋亡染色试剂盒购于武汉碧云天生物技术公司.

1.2方法

1.2.1重组腺病毒载体的构建及细胞培养应用细菌内同源重组的方法，构建携带野生型pten基因的重组腺病毒Adpten及阴性对照Adgfp ［8］. HO8910PM细胞培养于含100 mL/L小牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养液中，置50 mL/L CO2， 37℃孵箱培养.

1.2.2Adpten转染效率的测定取指数生长期的高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104/孔接种于6孔培养板中，24 h后吸弃培养基，换无血清RPMI1640培养基，用25，50，100感染复数(multiplicity of infection， MOI=病毒颗粒数/转染的细胞数)的腺病毒感染， 培养6 h后，换完全培养液继续培养. 24 h后在荧光显微镜下计数gfp阳性细胞百分率. 确定HO8910PM细胞转染所需的MOI值，使得转染效率＞90%.

1.2.3Western Blot检测转染细胞表达的PTEN蛋白取对数生长期细胞，按2×106接种于25 cm2培养瓶中. 常规条件培养24 h后，按MOI=100加入病毒，设Adpten 组和Adgfp 组，培养6 h后，换完全培养液继续培养. 48 h后提取细胞总蛋白；以Bradford酶标仪蛋白定量法测定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12 g/L），于4℃冰箱中90 mA恒流电转过夜，使目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭液于4℃封闭过夜，将膜转至新的封袋中，按0.1 mL/cm2加入适量的一抗稀释液（小鼠抗人PTEN单抗按1∶300封闭液稀释，山羊抗人Actin多抗按1∶500封闭液稀释），封口后，室温下平缓摇动反应4 h. TBS洗涤后加入二抗稀释液（PTEN， Actin的二抗均按1∶2000封闭液稀释），同条件反应1 h. 大量TBS洗涤去除未结合的二抗. ECL（化学发光）处理，暗箱中以X光胶片曝光，显影、定影.

1.2.4MTT法测定HO8910PM细胞增殖抑制率取对数生长期细胞，以5×103/孔接种于96孔板培养，常规条件培养24 h后，吸弃培养基，换无血清RPMI1640培养基，按MOI=100加入病毒，设Adpten 组，Adgfp组，PBS空白对照组和本底对照组(只加完全培养液，不种细胞)，培养6 h后，换完全培养液继续培养. 每个时间点设6个平行孔，在指定时间(24，48，72 h)加入MTT (5 mg/mL) 20 μL/孔，孵育4 h后，小心吸弃孔内上清液，加入DMSO 150 μL/孔，振荡10 min，490 nm作为测定波长，570 nm作为参比波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值. 细胞增殖抑制率=［1-实验组（A570 nm-A490 nm）/本底对照组（A570 nm-A490 nm）］×100%.

1.2.5HE染色观察细胞形态取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104接种于35 mm培养皿中，24 h贴壁后，加入Adpten或Adgfp感染，并设加PBS为空白对照；病毒感染方法同1.2.4，24 h后弃培养基，生理盐水漂洗，950 mL/L乙醇固定15 min，苏木素染色3～10 min，自来水冲洗5～8 min， 5～10 mL/L盐酸酒精分化数分钟，自来水冲洗5～8 min，然后加温热水5～10 min显蓝，自来水充分冲洗，伊红复染2 min，再次用自来水充分冲洗，普通光学显微镜下观察.

1.2.6细胞划痕试验取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞，按2×104/孔接种于6孔培养板，用RPMI 1640完全培养基孵育24 h后，用移液枪枪尖在细胞培养基表面划一条痕迹（长约2 cm），用PBS洗3次后加入无血清RPMI1640培养基，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，继续培养48 h后镜下观察.

1.2.7Hoechst33258凋亡染色取对数生长期HO8910PM细胞2×104/孔接种于6孔板，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，48 h后用固定液固定10 min，PBS洗2次，Hoechst33258 染色5 min，荧光显微镜下观察.

统计学处理: 本实验采用SAS 8.0统计软件进行统计分析，用单因素方差分析(ANOVA)， P

2结果

2.1Adpten对HO8910PM细胞体外转染效率的测定Adpten在体外感染人高转移卵巢癌HO8910PM细胞具有较高的转染效率. 在MOI=100时可以达到90%以上（图1）.

A: 荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达; B: 同一视野下光学显微镜观察.

图1Adpten(MOI=100)感染HO8910PM细胞的效果×200

2.2Western检测转染后PTEN蛋白的表达Western印迹分析结果表明，Adgfp感染后的HO8910PM细胞未见特异性条带；而Adpten感染后的HO8910PM细胞，则见到特异性条带，而且Pten蛋白表达量也较高（图2）.

图2Western Blot检测PTEN蛋白的表达

2.3Adpten对HO8910PM细胞增殖的影响以MOI=100病毒感染后24，48，72 h，通过吸光度值计算，Adpten的抑制率分别为(89.76±1.49)%， (91.11±1.38)%， (92.38±1.78)%， 而Adgfp感染组分别为(8.14±2.16)%， (7.82±2.32)%， (6.16±2.86)%，二者比较，差异有统计学意义（P

2.4Adpten对HO8910PM细胞形态的影响重组腺病毒Adpten感染及非病毒感染(对照)的3组HO8910PM细胞， 经HE染色光镜下观察可见，正常对照及Adgfp处理组细胞成片生长，细胞间隙紧密，胞质舒展，核分裂现象明显. Adpten处理组细胞则细胞间隙变大，胞质红，核固缩，易见凋亡小体(图3).

A: PBS对照组; B: Adgfp处理组; C: Adpten处理组.

图3Adpten感染对HO8910PM细胞形态的影响HE ×400

2.5Adpten对HO8910PM细胞迁移能力的影响重组腺病毒Adpten感染后的指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞与对照组(PBS空白组和Adgfp组)比较，Adpten能有效地抑制HO8910PM细胞的迁移（图4）.

2.6Adpten诱导HO8910PM细胞凋亡Hoechst 33258荧光染色结果显示， 重组腺病毒Adpten感染HO8910PM细胞48 h后，Adpten感染组出现典型的凋亡形态学改变，可见胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩，还可见膜包裹的凋亡小体. 而PBS对照组和Adgfp组的细胞均未发生形态学的改变（图5）.

3讨论

随着分子生物学及分子遗传学的发展，癌基因的激活和抑癌基因的突变失活，是目前较为公认的肿瘤发生发展的重要原因之一. 本文研究的抑癌基因pten，其突变和缺失常见于多种恶性肿瘤，与肿瘤的发生发展有着密切关系. 目前普遍使用的肿瘤的基因治疗方法是导入外源性野生型抑癌基因补充或替代突变的抑癌基因.我们选用重组腺病毒载体导入抑A0，A1: PBS对照组; B0，B1: Adgfp处理组; C0，C1: Adpten处理组; A0， B0， C0: 0 h; A1， B1， C1: 感染后48 h.

癌基因pten，其极少发生插入突变，载体操作方便、宿主广泛、容易繁殖，并具有携带外源基因容量大，可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等特点，已广泛用于多种疾病的体内基因治疗. 国外报道的AdEasy系统［9］除具有腺病毒载体的一般优点外，还具备以下优点：①在细菌体内完成同源重组，重组效率高，周期短；②利用含不同抗生素筛选重组子，简化了筛选工作；③经重组的腺病毒带有gfp基因，可直接通过荧光显微镜监测病毒的生成，病毒滴度的测定和对宿主细胞的转导效率的检测都较传统方法简便易行. 我们利用AdEasy腺病毒载体系统构建了携带野生型pten基因的重组腺病毒，导入人高转移卵巢癌HO8910PM细胞，证实pten 基因在HO8910PM细胞中能高效地表达. 通过MTT比色检测，发现Adpten 对HO8910PM细胞具有显著的增殖抑制作用，能有效地抑制该癌细胞生长. 细胞划痕实验证明Adpten能有效地抑制该癌细胞的迁移. Hoechst 33258 凋亡染色结果也表明pten具有诱导该癌细胞凋亡的作用.

本研究结果表明，携带野生型pten基因的重组腺病毒是一种高效的基因转移系统，能将pten目的基因转移到受体细胞中，对人高转移卵巢癌HO8910PM细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导效应，并能抑制该癌细胞迁移，为进一步的基因治疗卵巢癌的研究奠定了基础.

【参考文献】

［1］ 马佳佳， 陈必良， 马向东，等. 抑癌基因PTEN在子宫内膜癌组织中的表达 ［J］. 第四军医大学学报， 2004， 11:1015-1018.

［2］ Haiman CA， Stram DO， Cheng I， et al. Common genetic variation at PTEN and risk of sporadic breast and prostate Cancer ［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2006， 15:1021-1025.

［3］ Tsuruta H， Kishimoto H， Sasaki T， et al. Hyperplasia and carcinomas in Ptendeficient mice and reduced PTEN protein in human bladder cancer patients ［J］.Cancer Res， 2006，66:8389-8396.

［4］ Furnari FB， Huang HJ， Cavenee WK. The phosphoinositol phosphatase activity of PTEN mediates a serumsensitive G1 growth arrest in glioma cells ［J］. Cancer Res， 1998， 58(22): 5002-5008.

［5］ Zhu XY， Kwon CH， Schlosshauer PW， et al. PTEN Induces G1 cell cycle arrest and decreases cyclin D3 levels in endometrial carcinoma cells ［J］. Cancer Res， 2001， 61: 4569-4575.

［6］Saito Y， Swanson X， Mhashilkar AM， et al. Adenovirusmediated transfer of the PTEN gene inhibits human colorectal cancer growth in vitro and in vivo［J］. Gene Ther， 2003， 10(23):1961-1969.

［7］ Majhen D， AmbriovicRistov A. Adenoviral vectors-How to use them in cancer gene therapy［J］? Virus Res， 2006， 119(2):121-133.