微生物多样性分析十篇

微生物多样性分析篇1

关键词：微透析；植物；质外体；HPLC；GC；CE

中图分类号：O652 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）12-2733-04

Application of Microdialysis Technique in Physiology and Biochemistry of Plant Research

MA Jin-long1，2b，JIANG Guo-bin2a，YAO Shan-jing1，JIN Hua2a，DENG Shao-li2a

（1.Department of Chemical and Biological Engineering， Zhejiang University，Hangzhou 310027，China； 2a. Environment and Resources College； 2b.Life Science College， Dalian Nationalities University， Dalian 116600，Liaoning，China）

Abstract： Microdialysis is a sampling technique that can be employed to monitor biological events both in vivo and in vitro， it can be coupled with a variety of analytical instruments， can provide monitoring information for biological active substances changed with time and concentration in other aqueous environment or outside the cells dynamically in realtime. It is advantageous in fast， selective and sensitive analysis while preserving temporal information without affecting the growth of organisms. At the same time， the changes of analyte can be detected immediately in external environment. Furthermore， microdialysis samples without pretreatment， which are coupled with high-precise analytical systems， will realize truly real-time， online and cheap tracking detection.Although microdialysis sampling focusing on intercellular matrix has been applied in animals and human， it has not been extensively employed to detect various material changes in plant apoplast. So microdialysis sampling technique can overcome the bottleneck of previous research on plants. An overview of microdialysis system about principle， probe， membrane and parameters， furthermore sampling for plants and analytical methods employed for online analysis， including gas chromatography （GC）， high performance liquid chromatography （HPLC）， capillary electrophoresis （CE）， and so on， were reviewed.

Key words： microdialysis；plant；apoplast； high performance liquid chromatography （HPLC）； gas chromatography （GC）； capillary electrophoresis （CE）

生物体作为一个活的个体，每时每刻都在进行着各种生物、物理、化学的变化，只有极少数具有时间上的高分辨率的仪器可以连续监测生物体发生的变化。微透析仪就是很有力的一种采样仪器，无论在体内还是体外都可以实现连续监测生物活性分子等物质的浓度。自从1996年Bito等[1]首次提出微透析仪器，微透析仪器得到了广泛应用。目前，绝大多数的应用领域为人体、神经学科、组织药代动力学和药物区域代谢等方面，可以说主要集中在动物方面。遍及动物体各部位器官包括肝脏、心脏、皮肤、胎盘血、胃和耳朵等。在植物方面的应用较少，主要用于监测欧洲云杉中乙烯含量[2]， 以及欧洲云杉生长区中乙烯和玉米素核苷含量变化[3]， 还有植物中Cu2+和Ni+含量的监测[4]。

有学者将微透析技术应用于鹅掌柴和杨树上取得了一定的进展，实现了植物质外体内含物的实时、在线监测[5]，本文主要介绍微透析与多种传统分析仪器联用，在植物生理生化研究中实现实时、在线、无损监测，从而深入研究植物的抗逆机理。

1 微透析系统

1.1 微透析基本原理

微透析（Microdialysis）起源于20世纪50年代末期，用来描述一种类似于透析的萃取技术[6]。微透析技术的基本原理与透析原理相同，即小分子物质顺着浓度梯度通过半透膜进行扩散，只是装置更精巧，采用一种新型同心圆探针，膜区采用具有不同截留分子量的半透膜材料制成，埋入待测的生物组织区域内，再以恒定的速率向探针内灌注等渗灌流液，微透析探针如图1，当灌流液流经探针前端透析膜时，探针膜外侧组织内可透过半透膜的相对分子质量较小的生物活性物质，依浓度梯度从膜外扩散进入透析管内，并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。

微透析样品中待测物质浓度不能确切代表组织中该物质的实际浓度，而且试验过程中使用空白灌流液不间断透析，因此不会达到平衡状态，微透析样品浓度只是该组织部位真实浓度的“片段”，实际浓度应恒定地大于透析液中浓度，二者的比率即为相对回收率。

1.2 微透析探针

微透析探针是一段管式半透膜与石英、不锈钢或者塑料材质的管相连，常规使用的探针外径一般为200～500 μm，半透膜的截留分子量（MWCO）范围为5 000～100 000 Da。根据使用对象的不同，常规的微透析探针分为两种4个式样，即并联和串联2种，并联探针根据使用材质不同分为刚性和柔性2个式样；串联探针根据使用部位不同，分为线性和环行2个式样。在植物中广泛使用的共3种（图2），即圆柱型套管探针、线型探针和柔韧型探针。

目前国际上生产微透析探针和系统的公司主要有瑞典CMA和Agnthos公司、美国BAS公司、荷兰Brainlink BV公司、日本EICOM公司和德国Enka Glantzoff公司，由于微透析一直以来主要应用在动物和人体当中，因此还没有生产专门用于植物的微透析探针的公司，现在绝大多数研究植物微透析都采用动物探针或者自制探针。

1.3 微透析膜

微透析膜主要有如下几种：亲水性透析膜、纳米孔透析膜、均质膜和离子交换膜。微孔膜的结构类似于一个传统的过滤装置，且基本操作原理也相同。孔径大小通常在1～10 nm，比传统的过滤装置小得多。通常制作透析膜的材料是聚四氟乙烯，还有纤维素酯、聚碳酸酯、聚砜、丙烯腈共聚物、聚缩醛、聚丙烯酸酯、聚电解质复合物、交联聚乙烯醇和丙烯酸共聚物如全氟磺酸等，这些材料制作的微透析膜得到广泛的应用。均质膜是由均匀的薄膜平均分布在整个界面上。在膜的周围通过分子扩散进行传质过程，透析效率取决于溶解度和目标物在膜的界面扩散程度。离子交换膜没有常规的大孔径，全部是微孔径，但在成膜聚合物里包含有正电荷或负电荷离子吸附在孔隙壁上[9]。

影响膜分离效果的因素主要在分离模式或者是探针种类上：膜表面（特殊功能的膜材料）；膜路径长度（长度越长效果越好）；膜的孔隙率（最重要的影响因素）；膜厚度（考虑传质效率和膜的寿命，选取最适区间）；膜的几何形状（决定接触面积大小）。

在透析过程中一个重要但容易被忽视的参数，就是截留分子量（MWCO），这个参数是由孔径尺寸决定的。为了在目标组分和大分子基质之间保证最佳分离效果并且保证时间相对较短，就需要选择一个最佳的孔径。这需要在高通量分析和充分去除干扰物之间需求一个平衡。膜厚度和孔隙率（即每单位膜面积的孔隙数量）往往不出现在科学文献中，尽管这些参数对透析效率影响很大，但是为了获得样品高通量分析，很明显需要使用薄且高度多孔膜[10]。

随着纳米技术如采用原位影印多孔聚合物集成芯片级微透析膜，使得微透析技术获得长足进步，纳米孔径微透析膜芯片可以使用相分离聚合技术即通过一固定形状的紫外激光束快速而廉价地制作出来。控制相分离过程可以定制不同MWCO的工程膜应用到相关领域。采用两个不同MWCO的膜，进行反向流动模式微透析从样品中分离出低分子量的目标物；第一步采用低的MWCO进行蛋白脱盐，第二步采用较高的MWCO以目标物大小为基础分离蛋白质。几次测试证明了膜均一性、重复性和低分子量组分通过膜可以快速扩散等特性[11]。

1.4 微透析相关参数

在微透析技术中，涉及到如下几个参数，需要在试验操作过程中优化和注意：灌流速度；可用于分析的透析液体积；透析液中目标物的浓度范围；分析方法的敏感度和检测限；灌流液种类；得到有效结果的测试频率（有时间限制样品）。

2 微透析在植物研究方面的优缺点

2.1 优点

对于生物组织和液体取样，微透析有几个明显的优点，特别是与分离分析方法联用的时候。透析液通常是含盐水溶液，其中只含有小分子量物质，而细胞和大分子量物质被排除在外，这样在分析之前则无需离心或者蛋白沉淀的步骤。此外，透析液是通过透析膜扩散，流动相没有去除，因此可以不断检测细胞外液中的物质持续几个月[12]。这在动物方面可以节省试验动物数量，在植物方面也同样如此，可以利用少量样本进行长时间检测，得到可靠的数据用以统计分析。由于微透析技术的微创性，对目标生物损害微小，在一株植物上也可放置多个探针，因此可以同时在嫩茎、根部、厚实叶片上同时检测，并且不影响植株生长，其他检测植物生理的技术也可以同时开展，比如叶绿素荧光检测、气孔检测、外观变化等，尤其在研究胁迫下植物生理变化时有着得天独厚的优势。

2.2 局限性

首先，微透析探针的插入需要熟练的技巧，操作不同对检测结果会有不同，尤其在植物表面硬度高的部位需要导引针，并且需要采用生物相容性较好且对结果影响小的高分子物质封闭探针与植物结合处，保证密封性的同时还方便探针的摘取。其次，微透析灌流液通常都是水溶液，因此分析物被局限于水溶性物质。一些检测高疏水性物质的尝试或多或少有些失败，但是也有一些报道成功地测量了疏水性物质，为了能够成功地检测疏水性物质，体外试验表明灌流液采用脂质分散剂代替水溶液会起到很好效果。再有，微透析对生物体是一种微创检测，组织部位不同恢复情况不同，且需要一定时间。最后，微透析技术的瓶颈就是传统分析方法的低灵敏性，因微透析样品体积少单位以微升记，目标物浓度极低。随着分析检测技术的发展，与HPLC、CE、MS等联用可以克服这个困难[13]。

3 微透析与现代分析仪器联用的效果

3.1 微透析与气相色谱（GC）联用

在植物生理生化研究中，乙烯是重要的信号分子，因此检测乙烯含量也是植物生理研究的重点，微透析可以用于植物不同部位，通过与气相色谱（GC）联用，可以检测乙烯气体含量的变化。

3.2 微透析与高效液相色谱（HPLC）联用

高效液相色谱（HPLC）是微透析样品分析中比较传统的检测分离方法之一。同样也分为在线和离线两种联用方式，HPLC进样量一般要求在20 μL左右，因此在传统植物微透析试验中，灌流液速度为1 μL/min，需要30 min取样1次进行HPLC检测。HPLC具有高压、高效、高速的特点，适合于生化样品的高效分离分析，且操作简便。微透析样品的最大优点是进样前不需要进行任何预处理，因此也可以在线与HPLC联用进行检测。透析液通常属于亲水性溶液，因此HPLC中反相色谱和离子交换色谱适合于微透析样品的直接分析[14]。

3.3 微透析与毛细管电泳（CE）联用

毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）是近年发展起来的一种痕量、高效、快速的分析方法，分析只需要纳升或皮升数量级体积的样品，并使时间分辨率提高10 s以上[15]。分析速度和分离效率与场强成正比，因此微透析样品可采用短的毛细管和高的场强就可达到非常快速和高效的分离，电泳分析时间从几秒钟到几分钟即可完毕，这就使得微透析样品取样和分析同步进行，是分析微透析样品的理想方法。与HPLC相比，虽然分离效率略差一些，但进样量少，在一定试验条件下灵敏度强于HPLC。同样微透析与毛细管电泳联用分为离线和在线两种。因CE系统仅需几纳升样品，因此在植物微透析中以1 μL/min速度灌流，通常以5 min为单位收集样品用于分析，可以检测快速变化的物质，也能采用更低的灌流速度，以增加透析效果，使微透析取样中得到较高的相对回收率，这是其他分析仪器所无法比拟的。常用的检测仪器有UV、LIF、ECD和MS等。微透析与CE联用最大的优势就是可以实现在线分析，首先样品不需要纯化，CE的即时高分辨率可在短时间内同时测定透析液中多种分析物，因而能捕捉植物体内瞬间的变化，尤其植物在外界非生物胁迫时，某些信号物质浓度变化可精确捕捉。

4 展望

微透析作为一种取样技术已被广泛应用到各个领域，是一门多学科相结合的取样技术，尤其是在体内各种内源活性生化物质的检测中使用优势更为突出，有着广阔的应用前景。微透析过程可以明显减少取样时对生物体的伤害和正常状态的影响，使得取样结果最大限度地接近所测物质在生物体内的真实状态，可以实现实时、在线取样和检测，更可以明确某种活性物质在同一生物个体体内的随时间的变化过程，最大可能地消除各种复杂操作的影响，避免样本的浪费，而且微透析还有包括成本低廉、分析快速和装置简单且易操作等优点[6]。尤其在分析技术突飞猛进的今天，与多种精密分析仪器的联用，更加显示出其无可比拟的优越性。目前微透析技术还主要集中在动物、人体试验当中，在植物研究中鲜有报道，植物质外体一直是植物生理生化研究的热点和难点，微透析可以很好地解决这一问题，未来可以优化微透析装置设计，以及和多种分析仪器偶联在线使用，可以发展植入式或外挂式微透析装置，以方便各种情况下生物体的取样分析。在植物生理研究中，不仅可以检测质外体各种物质的变化，还可以与其他传统检测同时进行，将各种指标全方位进行综合检测对比分析，可以为生理生化研究提供更为立体的研究数据，揭示出更多信号转导的生理生化机制。

参考文献：

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微生物多样性分析篇2

关键词：固相微萃取；分配系数

1固相微萃取

固相微萃取(Solid-phasemicroextraction,SPME)是一项新型的无溶剂化样品前处理技术。固相微萃取以特定的固体（一般为纤维状萃取材料）作为固相提取器将其浸入样品溶液或顶空提取，然后直接进行GC、HPLC等分析。SPME由Pawliszyn在1989年首次报道，近10年来固相微萃取技术已成功应用于气体，液体及固体样品的前处理。

1.1固相微萃取技术及原理

固相微萃取法是以固相萃取为基础发展起来的方法，固相微萃取利用了固相萃取吸附的几何效应，其装置结构的超微化决定了它能避开经典固相萃取的许多弱点。固相微萃取技术多在一根纤细的熔融石英纤维表面涂布一层聚合物并将其作为萃取介质(萃取头)，再将萃取头直接浸入样品溶液(直接浸没－固相微萃取方法，简称DI－SPME)或采用顶空－固相微萃取方法(HS－SPME)采样。由于聚合物涂层的种类很多，因而可对样品组分进行选择性富集和采集。固相微萃取的原理是一个基于待测物质在样品及萃取涂层中分配平衡的萃取过程。

固相微萃取利用表面未涂渍或涂渍吸附剂的熔融石英纤维或其它纤维材料作为固定相，当涂渍纤维暴露于样品时，根据“相似相溶”原理，水中或溶液中的有机物以及挥发性物质，从试样基质中扩散吸附在萃取纤维上逐渐浓缩富集。萃取时，被测物的分布受其在样品基质和萃取介质中的分配平衡所控制，被萃取量(n)与其他因素的关系可以用下式描述：

n=kVfC0Vs/（kVf+Vs）

式中：k为被测物在基质和涂层间的分配系数，Vf和Vs分别为涂层和样品的体积，C0为被测物在样品中的浓度。如果样品体积很大时(Vs>>kVf)上式可以简化成：

n=kVfC0

萃取的被测物量与样品的体积无关，而与其浓度呈线性关系，因而从分析结果中得到的萃取纤维表面的吸附量，就能算出被萃取物在样品中的含量，可方便地进行定量分析。

1.2固相微萃取操作条件的选择

萃取头的构成应由萃取组分的分配系数、极性、沸点等参数来确定，在同一个样品中，因萃取头的不同可使其中一个组分得到最佳萃取而使其他组分受到抑制。平衡时间往往由众多因素所决定，如分配系数、物质扩散速度、样品基质等。此外，温度、离子浓度、样品的搅拌效率和pH值等因素都可影响萃取效率。

1.3影响固相微萃取萃取率的因素

1.3.1萃取头的种类及膜厚

固相微萃取的核心部分－萃取头材料特性或涂层的种类和厚度对灵敏度的影响最为关键，因此，对其选择要十分慎重。

目前，世界上已有七种商品萃取头问世，固定相可分为非键合型、键合型、部分交联型以及交联型四种。非键合型固定相对于某些水溶性有机溶剂是稳定的，但是当使用非极性有机溶剂时会引起轻度溶胀现象。对于键合型固定相，除了某些非极性溶剂以外，对所有的有机溶剂均很稳定。部分交联型固定相在大多数水溶性有机溶剂和某些非极性有机溶剂中很稳定。高度交联固定相类似于部分交联固定相，只不过在同一交联中心产生了多个交联键。

最常用的也是最早使用的高分子涂层材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PA)。其中，100μm的PDMS适用于分析低沸点、低极性物质，7μm的PDMS适用于分析中沸点及高沸点物质，PA适用于分析强极性物质。以后，又陆续出现了聚酰亚胺、聚乙二醇等涂层材料。混合固定相应用也较广泛，如聚乙二醇——膜板树脂，聚乙二醇——二乙烯基苯，聚二甲基硅氧烷——模板树脂以及环糊精等。为了开发聚合物的导电性质，一些科学家还尝试用聚砒咯涂层来萃取极性甚至离子型待测物。此外，还开发了纤维双液相涂层，它可以克服单一液相涂层萃取有机化合物范围狭窄的缺点，萃取范围更广，是目前研究和发展的趋势和方向。萃取头涂层越厚，对待测物吸附量越大，可降低最低检出限。但涂层越厚，所需平衡萃取时间越长，使分析速度减慢。因此，应综合考虑各种情况。

1.3.2萃取时间

萃取时间即萃取达到平衡所需的时间由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定。一般萃取过程均在刚开始时吸附量迅速增加，出现一转折点后上升就很缓慢。因此，可根据实际操作目的对灵敏度的需求不同，适当缩短萃取时间。

1.3.3搅拌和加热

在萃取过程中对样品进行搅拌和加热有助于样品均一化，缩短平衡时间。对顶空固相微萃取(HS－SPME)加热可提高液面上易挥发有机化合物的浓度，而提高萃取效率。

1.3.4无机盐

向样品中加入(NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl和K2CO3等无机盐可降低有机化合物与基质的亲和力而提高萃取效率。

1.3.5pH缓冲溶液

萃取酸性或碱性物质时，通过调节样品的pH值可改善组分的亲脂性，从而大大提高萃取效率。

1.4固相微萃取操作模式

根据被分析样品的物理性质和状态，进行固相微萃取时可以采取不同的操作方式，常见的操作方式有如下三种。

1.4.1固相微萃取直接法

将固相微萃取的纤维头直接浸入水相或暴露于气体中进行萃取的方法称为SPME直接法，对于气体样品或较干净的水样，能在1min内迅速达到萃取平衡，因而常使用直接固相微萃取模式。

1.4.2顶空固相微萃取法

把萃取头置于待分析物样品的上部空间进行萃取的方法叫做固相微萃取顶空法。这种方法只适于被分析物容易逸出样品进入上部空间的挥发性分析物，对黏度大的废水、体液、泥浆或固体样品，则只能采用上空取样的顶空固相微萃取模式，萃取从基质中释放到样品上空的化合物。

1.4.3衍生化固相微萃取法

通过衍生化作用来降低极性化合物的极性后进行固相微萃取的方法叫做衍生化固相微萃取法，极性化合物通过在其水溶液基质中加入衍生剂或将纤维涂层浸入适当的衍生化试剂被衍生后进行萃取，衍生化后极性分析物极性降低，萃取后更适于色谱分析。

1.5固相微萃取与其它分析方法相结合

固相微萃取萃取待测物可与气相色谱(GC)、液相色谱(LC)等分析分离技术联用进行分离。使用的检测器可以是质谱(MS)、氢火焰离子化检测器(FID)、火焰光度检测器(EPD)、电子捕获检测器(ECD)、原子发射光谱检测器(AED)、紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)以及离子淌度谱仪等。

1.6固相微萃取的应用

1.6.1固相微萃取在有机金属形态分析中的应用

样品预处理对于得到准确而又重现性好的分析结果非常重要。在进行形态分析时，为保证样品中各种形态在样品预处理过程中不发生变化，一般需要采用较为温和的消化或浸提的方法将待测有机金属化合物释放到液相中，常用的有酸／碱(常用HC1)浸提、微波或超声波辅助消化、CO2超临界流体萃取等技术，浸提法简便但结果的准确性难以考证，后几种方法需要借助于其它仪器，操作不便，费用较高。固相微萃取用于样品中金属及有机金属形态分析是最近几年才开始，其应用具有很大的潜力。将SPME用于有机金属的分析最早是由CaiY等人于1994年在第十六届国际毛细管色谱大会上提出的，将SPME用于鱼体和水样中汞及水体中的有机锡的萃取，降低了测定的检测限，但精密度差，RSD在24.1～68.8之间。1995年报导了汞及甲基汞中加人四乙基硼化钠衍生，而后由SPME萃取，GC－MS进行测定的方法。从此，SPME用于各种有机金属的萃取方法逐渐建立。

Tutschku等研究了环境样品中有机锡和有机铅的萃取方法，TadeuszGorecki和JanuszPawliszyn用SPME－GC测定了水中四乙基铅及无机物。Dumemann等人将SPME用于烷基铅、汞、锡的分离，样品被消化和分解后加入四乙基硼化钠衍生(pH值在4～5)以提高分析物的挥发性，10min后室温下将SPME萃取头放在样品的上部空间。Mester和Pawlisyzn将SPME萃取头直接浸入样品溶液，对尿液中的一甲基肿和二甲基肿进行了分析。

1.6.2在天然产物分析中的应用

对于分析中草药及中药材中的挥发性成分来说，SPME是一种很有用的方法。在中药分析方面，马长华等人使用固相微萃取技术测定中药石菖蒲中挥发性成分并鉴定出16种化合物。运用HS－SPME－GC－MS方法可从新鲜的紫苏中鉴定出20多种挥发性成分。刘百战等使用HS－SPME－GC－MS方法分离栀子鲜花头香成分，并鉴定了54种化学成分。Miller等测定了肉桂中的香豆素、醋酸桂皮酯、石竹烯、2－甲氧桂皮醛等成分，以此来确定肉桂类植物的植物学起源及鉴别。Winkle等人使用技术分析了人工麝香的水溶液。使用SPME技术可从冷杉叶中提取挥发性成分，以及蛇麻草中的各种挥发性成分。Schafer等人应用HS－SPME分析了针叶松叶中的蒎烯、樟烯、月桂烯等单萜类成分。应用HS－SPME法可萃取脱氧麻黄碱及其主要代谢产物苯异丙胺，方法快速、灵敏、准确，可避免常用测定方法所遇到的干扰。PDMS纤维可从中药丸中顶空萃取出17种萜类化合物。

在天然香料分析方面，刘扬岷等用SPME－GC－MS分析白兰花的香气成分，分离了114个色谱峰并鉴定了其中的75个成分。An等人使用HS－SPME－GC－MS方法从新鲜的熏衣草中分离测定了香气成分。Jan等人从青霉菌和尼日尔黑霉菌的表面测定到了经过生物转化的柠檬醛、香叶醇和橙花醇。

SPME技术可以用于从食品中提取分析组分。SPME技术可检测曲奇饼上薄荷油的含量，薄荷油中基本的成分是薄荷醇，前处理简单而干扰较少。Garcl等人对葡萄酒中的酒香组分进行了分析，建立了固相微萃取(SPME)和甲基硅烷化结合新的样品预处理方法，并应用气相色谱——质谱联用技术对葡萄酒中极性有机物进行了分析，对其中的白藜芦醇苷进行了定量分析，方法简单快速，灵敏度高。Hmenryk等人用HS－SPME技术(用PA作液相)与静态顶空法(SHS)对比研究啤酒的香味物质发现，对于低浓度的香味化合物，二种方法都具有较高的可重复性，与啤酒香味的分析结果也高度相关。1996年Coleman用SPME提取mailard反应产物中的香味成分，检测灵敏度可达ng/L级水平。Clark等采用HS－SPME技术分析了烤烟、白肋烟、马里兰烟的顶空挥发物。衍生化法是用于分析极性较强的半挥发、不挥发有机物。Lin等人进行了衍生化SPME－GC联用萃取水样中的脂肪酸，待测物为乙酸、丙酸、辛酸等11种脂肪酸，衍生试剂为芘基重氮甲烷。实验结果为衍生化SPME对含较长碳链的(C6～C10)脂肪酸检测限为pg/L级，对含较短链的(C2～C4)的脂肪酸在ng/L级。如果在涂层上完成衍生化反应，则检测限还可以进一步降低。

1.6.3在医学中的应用

随着SPME与其他分析仪器或分析方法联用技术的不断发展和成熟，SPME正逐步在医药学分析领域得到广泛的应用。

（1）基础医学中的应用。

随着固相微萃取技术的广泛应用，必将会对生理、病理、毒理学等基础医学的研究和发展起着较大的推动作用，如应用SPME检测人体体液中抗组胺类化合物以及细菌代谢产物等。RalfEiscrt等采用管内自动SPME－HPLC联用与强极性萃取涂层和手性涂层分别对多种维生素和手性药物进行了分析。Lillian等对人体尿液、血液和乳汁中的单环芳香胺(monocyclearomaticamines)及芳香胺(aromaticamine)的代谢产物进行了研究，认为这些检材可以用作生物监测指标。这必将在预防医学特别是职业病防治方面发挥重要作用。

（2）在临床医学中的应用。

随着SPME与其他分析仪器或分析方法联用技术的不断发展和成熟，SPME正逐步在医药学分析领域得到广泛的应用。

（3）在法医学中的应用。

由于法医毒(药)物分析所用检材的特殊性和复杂性，自1993年美国Supelco公司推出商品化的SPME装置后，SPME就很快应用到毒物分析中。ChristophGrote等就曾用SPME－GC－MS通过测定呼出气体中乙醇含量而可以换算出血液中乙醇含量10min内便可以完成。如果将SPME－GC便携仪用于酒后驾车肇事现场检测，必将给交通事故的处理带来极大的方便。目前,SPME已成功的分析了血液、尿液、脏器组织等生物检材中的毒鼠强、氰化物、有机磷农药、乙醇、麻醉剂等。Watanabe等人应用顶空——固相微萃取——气相色谱——质谱联用的方法(HS－SPME－GC－MS)分析血液中的5种麻醉剂，该方法已成功地应用到法医学鉴定中。

1.6.4SPME在环境分析中的应用

在应用研究领域，大量学者将SPME技术应用于各个分析领域，对大量的待测物质进行了分析测定，得到了令人满意的分析结果。其中又以其在环境分析中的应用最多，主要有：

在气态样品的分析方面：研究者对空气中的BTEX类化合物，甲醛，胺类物质，石油烃化合物等进行了分析研究。而GorloDanuta等人通过利用SPME－GC－MS方法对几种有机污染物的分析，建立了一种评估室内空气质量的方法。

在液态样品的分析方面：主要用于分析水中的有机氯化台物，BTEX类化合物，脂肪酸及脂肪酸盐，15种甘油醚，氯苯类化合物，杀虫剂，环境水样中的有机磷农药和除草剂等。我国的李攻科等人利用SPME－GC－MS联用检测了赤潮海水中的有机物，研究了其种类和含量的变化规律。陈文锐等人用SPME技术代替传统的进样技术，对污染棕桐油中的低浓度二甲苯进行了测定。此外，对水中和沉积物中的有机金属化合物的分析也有大量报道。

在固态样品的分析方面：土壤样品中的氯代苯，对三嗪在沉积物中的吸附系数的测定，固体样中的卤代苯，卤代酚，污泥及沉积物中脂肪酸与洗涤剂组分，纺织品及皮革品中的禁用偶氨染料的测定。

参考文献

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微生物多样性分析篇3

关键词：分子生物技术；环境工程；微生物领域

前言：环境工程微生物是一个综合性的学科，涉及到很多相关联的学科，比如微生物学、环境工程学、环境保护学等。同时，在微生物领域中，环境工程微生物又是一个非常重要的组成部分，在对其进行研究时，应用了分子生物技术，这样一来，在进行环境监测时，提升了监测的效果，进而在很大程度上实现了环境保护。

一、分子生物技术

（一）PCR核酸技术

在PCR核酸技术中，包含了三种不同的技术。第一，PCR―SSCP技术，在利用此种技术进行环境监测时，首先要选取监测环境的DNA样本，随后，通过PCR扩增技术，得到SSCP凝胶DNA谱带，最后，对其进行分析，采用的方法为银染法、荧光的检测技术；第二，PCR―DGGE技术，对于检测的环境，首先将样本基本组DNA提取出来，接着利用PCR扩增技术进行扩增，随后，将DNA谱带经过电泳后形成，最后，利用此项技术进行割带回收工作，将微生物的种属准确的确定；第三，PCR―RFLP技术，与前两种技术不同，此种技术在进行DNA谱带切割时，利用限制性核酸内切酶，通过与某段DNA识别序列相结合，实现最终的切割工作。

（二）PCR的测序技术

通过分子生物技术的分离，微生物环境中会出现新的群体或者生命特征，这时，就需要对新的群体或者生命特征进行类别鉴定工作，为了准确的识别，就需要相应的技术提供支持，分子生物技术中的PCR测序技术恰好可以应用在此，在进行测序工作时，此项技术依赖于转DNA，这是因为转DNA具备的稳定性是比较好的，同时，在所有的生物序列中，同源性是一个显著的特征，基于此，在对新的群体或生命特征进行研究时，具备比较好的研究效果。

（三）基因探针测试技术

所谓基因探针，是指一个单链DN段，不过，此片段具备特异性。在对微生物环境进行检测时，首要的工作就是样品的选取，样品选取完成之后，通过解链以及相应的原理，对样品进行分析。在利用基因探针进行测试时，需要进行标记工作，这样一来，即使经过杂交之后，对比工作也可以顺利的展开。近年来，基因探针测试技术所具备的应用范围越来越广，在环境工程微生物领域中将会起到非常重要的作用。

二、分子生物技术在环境工程微生物领域中的应用

（一）检测环境中的致病菌和指示微生物

在环境中，致病菌是一定存在的，近年来，随着空气污染的加剧，致病菌的数量不断地增多，通过空气、水、土壤等介质的传播，导致人类患上各种疾病，比如2003年的SARS，进而产生非常严重的影响。在环境工程中，污水处理完成之后，在进行指示微生物时，通过大肠杆菌来实现。在不同的环境中，微生物的多样性和种群是不相同的，为了对其进行分析，采用了PCR―DGGE技术与16SrRNA基因相结合的办法，分析结果表明，在传统的微生物培养中，很多微生物种群是无法进行检测的，对此，应用了PCR扩增技术，再次进行检测，这样一来，检测的效果得到显著地提升，同时，所需的检测时间也比较短。

（二）分析环境工程微生物种群的多样性和丰度

一般说来，微生物会生存在污泥、生物膜、土壤等物质中，而且生存的数量是非常多的。在对微生物种群的多样性进行分析时，同样应用了分子生物技术，首先，对地下水微生物进行收集，同时，在陶瓷表面上让其形成生物膜，通过PCR-SSCP技术，将微生物种群的多样性分析出来；其次，对微生物种群的结构进行分析，分析时，应用了测序技术，并通过16SrRNA的抽取来完成。通过分子生物技术的应用，有效的对生物膜、污泥等物质的微生物种群多样性和丰度进行了分析，在定性检测与定量检测充分结合之后，有效的支持了分析的结果。

（三）培养环境工程功能微生物

随着化学工程的发展，化学工程也逐渐的实现了现代化，在进行有机化合物的合成时，复杂程度提升，同时，排入环境的物质可降解性越来越差，这样一来，环境中的微生物就无法实现有效降解，进而对环境造成污染。为了避免环境污染的发生，提升微生物的降解能力，应用了DNA印迹技术，同时，通过分子生物技术的应用，进行了微生物的培养，培养出来的微生物具备环境工程功能，能够有效且快速的实现降解，进而有效的保护环境。

结论：分子生物技术是一项先进的技术，通过分子生物技术，能够有效地对环境中的微生物属性进行测试，基于此，在环境工程微生物领域中，大力的应用了分子生物技术，不过，由于分析生物技术应用的普及程度比较差，进而导致应用中还存在一定的问题，因此，就必须要加大对分子生物技术在环境工程微生物学领域的研究力度，从而有效地提升应用的效果，加强对环境的检测，降低环境污染。在分子生物技术不断成熟的过程中，其应用范围会变得越来越广，与此同时，环境工程微生物领域也必然会产生革命性的变化。

参考文献

[1]于洁，冯裕解玉红等.PCR-DGGE技术及其在环境微生物领域中的应用[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2010，12（06）：227-234.

微生物多样性分析篇4

关键词：微透析； 药动学； 药物代谢

微透析(Microdialysis，MD)技术是近些年来临床上发展起来的一种新型取样技术，其原理与透析相同，可通过器官与组织中的体液进行连续、动态取样，取得的透析液较为纯净，且均为小分子物质，能与HPLC/MS或HPLC联用,组成HPLC/MS或HPLC联用新技术进行原位在线分析，具有“微创、高效、实时、活体”等特点。在麻醉或清醒的生物体上进行深部组织的操作以及重要器官的生化研究具有重要的意义。随着近年来微透析技术的不断发展，该项技术在临床上的推行也越来越广泛。目前微透析技术在药物代谢和中药药动学研究领域同样发挥着重要的作用[1]。

1基本原理

微透析技术是以透析原理作为基础的在体取样技术，是在非平衡条件下即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中的浓度，灌注埋在组织中的微透析探针，组织中的待测化合物沿浓度梯度扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的[2]，通过测定流出液即透析液中待测物的浓度来研究组织中待测物的水平。这是一种动态连续的取样方法。简单地说，微透析技术的原理就相当于在组织中创造了一个“毛细血管”[3]，使化合物在浓度差的作用下扩散而进入此毛细血管,然后随液体流动带出体外进行检测原理及其系统组成微透析技术不同于以往传统的研究手段,它是一种动态连续取样方法。简单地说,微透析技术的原理就是创造一个“人造血管”[1],使待测化合物在浓度差的作用下扩散而出入此“人造血管”。在体微透析技术首先在组织中植入具有半透膜的探头(probe)装置，透析膜能允许小分子物质及水分通过，体外微流泵能允许一定的灌流也通过探头，由于透析膜两侧存在浓度差，物质会从高浓度方向向低浓度方向扩散。膜外的浓度通常会高于膜内，能穿过透析膜的小分子会随之扩散进入透析管，同时随着透析管内的液体持续性的流动被不断带出，以此获取活体组织中的样本 [2]。

2微透析系统

微透析系统通常由连接管、微透析探针、灌流液、收集器及微量注射泵构成。微透析探针是整个系统的核心组成，通常是将管式透析膜置入由钢、塑料或石英毛细管制成的双层套管中。探针是微透析系统中最关键的部分，随着近年来微透析技术在各个领域中不断推行，促进了探针技术的发展。现阶段常用的探针主要包含以下几种：①柔性探针：多用于血液；②同心圆形探针：多用于脑部；③分流探针：多用于胆管等流体；④线性探针：多用于皮肤、肌肉、肿瘤、肝脏等外周组织。临床上会根据患者的组织生理特点的不同进行合适类型的探针选择。

3技术特点

微透析技术是一种在体取样技术，具有以下显著特点：①对机体造成的损伤小，能在自由活动、清醒的动物体内进行同一器官的多个位点或是进行多个器官的连续取样。②微透析作为一种给药途径，可将药物直接传送到用药的指定位置，对药物疗效进行直接研究，能降低药物通过血液循环对全身造成的不良反应。③透析膜能有效的对大分子进行滤过，提取液中不含有酶与蛋白质等物质，可无需二次处理进行直接的测定，也不会出现酶解现象，提高样品的稳定性，轻松的进行分离和测定。④取样对正常生命活动基本不会造成任何影响，可实时、在体及在线取样。⑤具有时间分辨性，能连续性的跟踪体内多种化合物在一定时间内发生的变化。⑥具有空间分辨性，取样时无需进行匀浆，取样位点目标化合物的浓度能真实的表现出来，且能根据目标化合物在体内的分布对不同部位进行探针的插入。

4微透析技术在药物代谢和药物动力学研究中的应用

4.1研究药物向中枢神经系统(CNS)分布和转运微透析在药动力学中的研究主要来源于药物向脑组织的转用及分布，①在于早期微透析的探针设置主要适用于脑组织内，②在于微透析技术最初的发展初衷就在于脑神经化学方面的研究。相比其他方法测定药物对脑组织的影响及转运，脑微透析具有以下优点，能对动物体进行动态、连续性的取样，通过良好的时间及空间分辨率测定药物的游离浓度，并且采用脑微透析法，不会受到药物代谢产物的影响。利用脑微透析取样技术对药物的分布和转运测定在大量临床研究中已有详尽的介绍 [3]。李菊等[4]用微透析技术观察到五菟颗粒剂与丹参注射液联用能有效降低脑缺血时海马细胞兴奋性氨基酸的释放，起到保护脑组织的作用。而程敬君等[5]人采用脑内微透析技术动态发现，脑缺血后细胞外液中的谷胱甘肽、半胱氨酸、兴奋性氨基酸及NO代谢产物浓度迅速升高。

5结论与展望

微透析技术用于临床研究中最早是药物在脑组织中的分布情况，现阶段有大量文献报道发现微探针能埋入各种不同组织中，并进行相对的研究。利用多个微透析探针能在同一器官的不同组织或是在不同器官中进行取样。微透析技术相比传统方法对于药物浓度的分布，能有效降低研究时所需的动物数量。随着生物分析化学、聚合物技术、工程科学及理论药动学的发展，也促进了微透析技术在药动学领域内的迅速发展。微透析技术除了用于动物模型的研究外，在对人体的研究中也取得了迅速的发展。采用组织微透析能直接测定药物在靶器官中的浓度及分布情况，为其提供了更有效的手段。但微透析在使用过程中存在一定的缺点，例如探针置入机体内造成的损伤是否对药物动力学及代谢造成一定的影响、由于水溶性差或是蛋白结合率较高的药物在测定时需要极高的灵敏度、更优良的与组织相溶的探针的开发，以上问题都需要有待相关人员进一步的研究。

微透析虽然有许多优点，但也存在相应的不足。由于透析膜的体积较小，所以灌流速度相对较低，只有1～5μL/min，无法采用秒进行动态观测。探针置入机体内部会造成局部轻微的损伤，尤其是某些记性试验会对结果造成不同程度的影响。虽然微透析测定的种类多样，但每种测定方法均不够完善，在实际浓度的计算中存在一定的偏差。在对于浓度极低的生物活性物质的检测中，由于检测方法不同，所以结果上往往存在一个数量级的差距。对于很小的脑内神经核团取样，微透析技术并不适用，其原因在于微透析技术必须要将探头准确的插入同一部位。

微透析技术为“药物浓度-时间”的动态变化提供了完整的资料，在实验过程中能有效减少动物的使用数量，同时其时间及空间分辨率还能提高药动力学资料的准确性，能通过动态层次分析中药的药效与浓度分布情况。微透析技术在中药中的研究提供了重要的途径，是中药对靶器官中的代谢及分布研究中的有力工具。该技术在中药药动力学及药物代谢中的应用具有广阔的发展前景。随着现阶段微透析技术的不断深入及发展，必定会为药学工作带来更广阔的的天地。

参考文献：

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[4]李菊,杨期东.微透析技术和丹参注射液对Wistar大鼠脑缺血时海马细胞外液兴奋性氨基酸释放的影响[J].中风与神经疾病杂志, 1995, 12(5): 258.

微生物多样性分析篇5

［关键词］微量物证 检测 分析 仪器 方法

［中图分类号］D918 ［文献标识码］A ［文章编号］1009－5349（2012）07－0103－03

随着科学技术的发展，犯罪分子的犯罪手法也在不断进步，侦查人员如想在犯罪现场收取到传统意义上的证据变得越来越难。由于犯罪行为人的伪装与销毁痕迹，这些证据不仅在犯罪现场出现率变低，进行同一认定也变得尤为困难。微量物证因其自身所蕴含的丰富信息，拥有其独特地位，日益成为证据体系中举足轻重、不可或缺的一环。

一、微量物证概述

（一）微量物证及微量物证分析

微量物证是那些没有在显微镜和显微技术的帮助下无法清楚观察、收集或分析的物证。刑事和法医科学家用微量物证来形容任何体积小、质量微、较隐蔽、不易毁灭、易被忽视的物质，尤其那些用显微或其他技术分析的证据。

微量物证分析是运用现代仪器及分析方法，对犯罪现场上提取的各种微量物证进行结构、组分及表面形貌的分析测试，从而从检测分析中得到的信息来确定微量物证的种属或与嫌疑样本比对以进行认定相同、同一或不同。

（二）微量物证检测的理论基础

“转移的证据”是微量物证检测的理论基础，指从一个人或一个地方转移到另一个人或另一个地方的物质材料。对转移的证据的检验是传统法庭科学的“心脏”，并且这些检测以前经常用显微镜进行。爱德蒙?洛卡德（1877～1966）因其著名的Locard交换原理而为现代法庭科学家所称道，其原理意译为“每一个接触都会留下痕迹”。洛卡德尤其对日常生活中的材料感兴趣，如尘埃就是转移证据的最常见形式。还有其他无处不在的被称为微量物证的物质，如毛发、纤维、玻璃、土壤、油漆等。我们可以以发生在两个人之间的争斗而产生身体上的接触为例，二者的毛发可以交换，服装纤维亦如此。一旦两人分开后，每个人都可能携带他们接触时交换的微量物证。然而，转移的证据不是永久性的。从定义上看，转移证据很容易被交换，在几个小时内，原有的毛发和纤维转移可能会丢失，从而成为二次转移。初次接触后经历的时间越长，越来越多的微量物证便会丢失。

（三）微量物证的种类

微量物证的种类很广泛，在法庭科学检测中，关键的测试目的是比较样本以测试他们是否有一个共同的来源。例如，如果在疑似窃贼的衣服上发现一个鲜明的尘埃，那么调查它是否从发生盗窃的地方转移而来就很有意义。

常见的微量物证可分为：1.文化用品类：纸张、墨水、圆珠笔油、浆糊与胶水等；2.油脂及其斑痕类：动植物油脂、矿物油、香精油等；3.纤维材料类：纤维、纱线与绳索、纺织品等；4.染料和涂料类；5.土壤类：土壤中的胶体、磷化合物、酸碱度、主要离子等；6.爆炸残留物类：炸药、火药、导火索、雷管、爆炸残留物等；7.聚合物类：如橡胶、树脂（塑料）等；8.其他类物品：包含化妆品、染料、禽羽、叶片、鱼鳞、瓜果皮屑、动物皮革、植物种子等。

（四）微量物证分析的作用

微量物证分析的鉴定结论是一种科学的物证结论，其科学性与客观性能确定其为法定证据，同时能证实不同证据的真伪。

从微量物证个体角度具体分析，对尘埃、泥土等现场残留物的分析可发现其来源地、所有物，通过因转移而携带这些物质发现嫌疑人，也为判断原始现场提供依据；对爆炸残留物的分析可鉴别其物理性质、生产厂家、冲击力的方向（流动）来找寻线索；对玻璃的鉴别可通过发现打击力的方向等；对油漆的检测可找寻其来源（购买、用途、厂家），从而为侦查提供方向等等。微量物证经勘验人员发现、提取后，用现代检测方法进行检验、鉴定以及认定，所得信息有助于提供侦查方向、缩小侦查范围，其中有的还能成为揭露和证实犯罪的有力证据。

二、微量物证检测方法分析

（一）一般物理检验

借助肉眼及简易仪器（如放大镜、厚度计、比重计、多波段光源等），先确定现场微量物证的附着位置，然后对检材进行表面结构、厚度、重量、透明度、熔点、比重等特征的观察与比对检验。

（二）简易化学检验

即用简单的化学实验等方法以观察、比较发生沉淀反应、焰色反应、显色反应、显微结晶反应等来判断某种物质是否存在，从而进行定性分析。同时，以容量、重量、简易仪器分析来进行定量分析。

（三）仪器分析

微量物证分析中仪器分析扮演了很重要的角色。计算机毫无疑问地在实验室中承担着重要任务，很多仪器分析的结果可以通过计算机被数据化，并且存入电脑并被继续细化。对于微量物证的检测，很多仪器分析都依赖于计算机快速，准确的分析。

微量物证仪器分析方法既可分为有机分析、无机分析、显微分析，也可分为物理性检测、化学性检测、生物性检测等。

1.有机分析

微生物多样性分析篇6

摘要：该文介绍了微透析取样技术的原理，组成以及微透析探针的类型，对常用测定微透析探针回收率方法的优点缺点进行了比较，综述了近年来国内外有关微透析技术的应用进展，显示该项技术在研究领域具有广阔的应用前景。

关键词：微透析； 回收率； 应用

微透析(microdialysis) 技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种新型生物采样技术， 可在麻醉或清醒的生物体上使用， 特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。目前已成为实验神经生理学和神经化学的重要研究工具之一， 它可提供递质释放、摄取和代谢的必要信息。随着微透析采样和检测灵敏度的不断提高， 微透析技术迅速发展起来， 成为生物化学研究中一个引人注目的新领域。从20世纪90 年代起这项技术在生命科学研究中进入高潮。微透析取样装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备［1］组成。微量泵以注射泵为佳，有利于减少恒流泵和蠕动泵的波动， 流速一般为1~5 μl/min。微透析探头有直线性探头、环形探头、同心型探头等不同的类型(微透析管因实验对象不同而形状大小各异)；按照探头的形状分为穿颅探头、U型探头、I型探头、环形探头等（图1）。目前普遍应用的是同心型探头，微透析探头通常是由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道； 长度一般为1～10 cm。半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成（图2）， 载留分子量5～10 KD不等。实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的微透析探头。

图1 探头类型（略）

图2 微透析探针（略）

微透析主要原理是以透析原理作为基础，通过对插入生物体内中的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内，并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体( in vivo)、实时( real time) 和在线(on line) 取样， 特别适用于研究生命过程的动态变化。微透析技术的优点是活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。该技术的另一大优点是样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行。此外微透析技术的独到之处是可以单独取得细胞外液， 因此可对体内神经递质的释放量进行动态监测， 具有重要的生物学意义。在国外已成功地用于测定细胞外液中的多种神经递质［2］、氨基酸［3］、葡萄糖［4］、腺苷及其代谢产物［5］等小分子化合物。然而微透析技术一直困扰人们的问题就是如何对取出的样品进行准确可靠的校正，这就涉及到对探针的回收率的测定。探针回收率是指从灌流液中流出的待测组分与标准浓度之比的百分数。探针回收率是影响微透析结果的重要因素， 取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质(材料、孔径、长度及几何形状等)、待测物质的分子量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等。目前测定回收率的方法主要有以下几种：

1 外标法

只需要计算被测物质相对浓度的变化时， 可简单地采用体外回收率法。测定宜在取样后立即进行， 将探针放入已知浓度的标准溶液中， 用与体内实验相同的流速灌流探针。达到稳定状态后收集灌流液并进行检测。测定浓度与标准溶液浓度之比就是体外回收率。此法虽简单易行， 但由于被测物质在体外时与体内的环境状况不同， 检测结果不能严格地等同于实际的回收率。

2 内标法

［6］是往灌流液中加入已知浓度且性质与被分析物质相似的另一种物质做内标，内标物不仅在扩散性质上与被分析物一致，而且还要在体内的代谢过程中也尽可能一致，测出透析率即作为被分析物的回收率。由于选择内标的局限性很大， 限制了此法的应用。

3 反透析法

［7］假设被测物从两个方向通过半透膜是同等的。在灌流液中加入一定浓度的内标物(Cic) ，在与体内透析相同的条件下操作， 测定透析液中内标物的浓度(Cec) ，体内回收率(Rin ，vivo ) 可用下式计算：Rin vivo = (1 Cec/ Cic) ×100 %本法要求内标物具有生物惰性， 尽可能与被测物相似。

4 低流速法

［8］低流速法是将灌流速度尽量降低， 一般控制在50 nl/min 以下， 使回收率尽量达到100% ， 此时便无需进行回收率校正了。此法取样体积很少(一般在5 μl以下) ， 不但对仪器的检测灵敏度要求极高， 而且取样时间长易造成样品的挥发或氧化。此外还有外推至零流速法(extrapolation to zero flow)［9］和零净通量法(zero - net flux)［10］。微透析只是一项取样技术，要进行体内物质测定必须要与分析仪器联用，以便于有利于对微量样品进行实时和在线分析测定，减少操作误差。微透析时选取适当微透析膜的截留分子量， 免除了复杂的样品前处理及由此而产生的样品损失和误差， 也不会因在室温取样而酶解， 提高了样品的稳定性，使微透析液中可不含蛋白质和酶等生物大分子， 同时由于微透析取出的样品体积小，约为μl级，易于挥发，因此取出后不易久放，能直接进入分析仪器进行测定。常用的有高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电泳(CE) 、质谱（MS）及激光诱导的荧光检测器等，可从容地进行分离和测定。利用微透析技术进行动物实验主要是在被限制动物或麻醉动物身上，也可用于自由活动的清醒动物，应用最多的脑功能的研究，近年来该技术的应用已取得很多的科研成果。脑：在颅内手术，Hutchinson等［11］利用微透析方法与其他监测手段研究动脉瘤手术的情况，得出:患者稳定期脑氧压2.0~6.0kPa(15~45 mmHg)之间；葡萄糖含量在0.5~3 mmol/L之间，乳酸/丙酮酸比值＞30，在32~65之间则暗示有厌氧代谢，3 min＜的短暂夹闭不会引起脑氧量减少或乳酸/葡萄糖比值的升高；长时间夹闭则会有副作用。万登峰［12］等应用微透析技术动态收集大鼠轻、重度脑损伤局部的细胞外液(ECF)透析液，观察其葡萄糖含量(［Glu］d)和乳酸含量(［Lac］d)变化。透析管插入引起［Glu］d和 ［Lac］d的变化很小(P＜0.05)；脑损伤后［Glu］d下降，与对照组及损伤前相比相差显著(P＜0.05)，且损伤越重其变化越显著(P＜0.05)；而脑损伤后［Lac］d 则上升，与对照组及损伤前相比相差显著(P＜0.05)，且损伤越重其变化亦越显著(P＜0.05)；脑损伤后［Glu］d和 ［Lac］d的变化分别与脑组织含水量呈显著负相关(P＜0.05)和显著正相关(P＜0.05)。皮肤：Sjogren等［13］选用聚乙烯砜膜(100 kD) 探针测定皮肤在探针插入这一微创条件下白介素- 6的产生，为测定复杂的细胞因子系统提供了技术参考。金属离子与一些皮肤病的发病有关，但活体皮肤离子浓度测定一直较难实施，Leveque等［14］以该技术联用原子吸收光度计测定真皮铁离子浓度，证实微透析可用于皮肤离子测定。此外还可进行血液、脂肪、肌肉中药物浓度的变化。由于物质跨膜扩散是双向性的，微透析技术除了可用于监测体内环境的生化改变外，还可作为一种给药途径。可将药物缓慢、直接地作用于靶器官，提高药效分析和药物代谢动力学研究的水平，特别是局部直接给药更能显示出这种方法的优越性。阳晓等［15］研究发现，在实验性大鼠的腹透液中加入川芎嗪长期进行腹膜透析(PD)，腹膜间皮细胞结构基本完好，间皮下无明显的基质沉积，且大鼠PD的超滤量显著提高，小分子物质的清除率增加，而对透出液中蛋白质浓度则无明显影响。微透析技术已用于测定直接人脑实质的药物浓度［16］，并可帮助诸如爱滋病毒（HIV）感染病人选择合适的穿透血脑屏障的药物。但微透析技术仍存在一些不足，微透析技术的不足之处在于探针的植入会造成局部轻微的损伤。特别是对急性实验可能有一定程度的影响。回收率的测定虽然种类繁多， 但每种方法都不够完善， 影响了实际浓度的计算。由于采用的方法不同在检测浓度极低的生理活性物质时不同作者的报告有时可能相差近一个数量级。微透析技术要求探头必须准确插在同一取样部位， 因此不适合对很小的脑内神经核团采样。由于透析膜体积小， 灌流液的流速低(一般1～ 5 μl/min)，很难进行以秒为单位的动态观察。

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微生物多样性分析篇7

关键词：微生物检测技术；食品检验；应用方法

微生物检测技术是依据微生物学理论，结合现代免疫学和自动化仪器等理论知识与技术，通过科学检测方法进行病原微生物种类、数量和性质等方面的研究，具有检测速度快、检验的灵敏度高和检验结果准确等优点。因此，分析微生物检测技术在食品检验中的应用方法，对保障食品安全性，为社会民众创造良好食品环境有着重要的意义。

1 食品检验的重要性及操作基础

1.1食品检验的重要性 食品检验不仅关系到社会民众的身体健康，而且在市场监管、产品贸易和食品质量的安全评价中起着重要的支撑作用，对食品行业的持续健康发展有着积极的推动作用。同时，食品检验与社会民众的身体素质息息相关如果食品检验没有做到规范与合格，会降低社会民众的工作效率，进而对社会的发展产生不利影响。

1.2食品检验中的操作基础 食品检验的操作基础主要包括样品采集与保管、试样制备与预处理和食品检测技术的选择等。在样品采集的过程中，采集人员需要保证采集样品的代表性，并妥善保管采集的样品，避免因外界因素对样品造成干扰。在进行样品检测前，检测人员可以采用蒸馏、层析、透析、沉析和浓缩干燥等方法，去除样品中无分析价值的杂质，以保证检测结果的准确性与可靠性。在选择检测技术和检测方法时，检测人员需要考虑样品的特性、检测的要求和实验室条件等多方面的因素，保证检测技术与检测方法的适用性。

2 微生物检测技术的特点与基本的检测技术

2.1微生物检测技术的特点 在食品检验中，微生物检测技术主要有如下特点：①检验的范围比较广，包括有食品工业的微生物，如保健食品中的双歧杆菌和乳酸菌等；人类疾病、畜禽疫病和共有传染病中的病原微生物，可以通过食物途径进行传播，数量高达数百种；可以引起食品腐败和变质的微生物等；②食品维生素的检验需要保证快速准确，并且检验样品需要有一定的数量，检验的结果需要赋予法律性质，且受到的干扰因素较多。

2.2微生物基本检测技术 在食品检验中，微生物检验的流程为常见的致病菌检验大肠杆菌菌群计数菌落总数的计数。其中常见致病菌主要指致病性的大肠菌、沙门氏菌、弯曲菌属和肠炎弧菌等。传统检验方法为血清试管凝聚实验、血清学分型、生化试验、毒性试验、噬菌体分型和微生物的形态检查等；常用的试验操作为明胶试验、甲基红试验、V-P试验、淀粉水试验、硝酸盐的还原试验和糖酵解试验等。传统的微生物检验方法准确性较高，检验结果相对可靠，但是其操作繁琐，耗费时间较长，涉及的试验比较多，无法满足食品检验的快速便捷要求。

3 微生物的快速检测技术

微生物快速检测技术主要为如下三种方法：①电阻电导测定法。该方法是利用全自动微生物检测计数仪，通过分析食品样品的电容抗、电阻抗和总阻抗等不同参数，测定样品的污染程度，其原理是在细菌进行防治和生产时，将蛋白质和糖类等大分子物质分解为有机酸和氨基酸等小分子物质，改变并测量培养液的导电度与电阻变化，从而推算出其原样品的含菌数；②生物传感器法。生物传感是利用与生物活性物质进行物理变化和化学变化时产生的感应，以物理换能器和化学换能器对其进行捕捉，并通过离散或连续数字电信号将反应程度表达出俩，从而得到分析物浓度。生物传感器法的优势是特异性较高，灵敏度较高，可以满足复杂样品检测的要求。

4 微生物检测技术在食品检验中的应用

4.1食源性病原菌免疫学检测技术在食品检验中的应用 在免疫学的检测技术中，很多造价低的检验仪器设备得到很好应用，其操作简单便捷，检验的实用性比较强。在检测食品中的微生物时，免疫学检测技术应用非常广泛，如检测食源性寄生虫和葡萄球菌菌素等，在保障食品免疫中发挥着重要作用。

4.2核酸探针技术在食品检验中的应用 在食品检验中，核酸探针可以快速检测食品中大肠杆菌的情况，从而对食品安全性提供正确评价。例如在检测单增李斯特菌时，可以直接利用核酸探针进行检测。核酸探针检测技术比较复杂，需要的检测费用与成本也较高，所以很多时候的检测主要是在实验室中完成，在一定程度上制约了其在食品检验中的普及度。

4.3多聚酶链反应技术在食品检验中的应用 多聚酶链反应技术的特异性较强，敏感度也比较高，在食品检验中的应用比较广泛。曾有检测证明，在检测31株不同的菌株时，利用FQ-PCR检测技术，最终发现其中23株菌株为阴性，8株副溶血弧菌检测为阳性。同时，多聚酶链反应技术可以检测食品中金黄色葡萄球菌和肠出血性大肠杆菌等，检测结果的准确性也比较高。

4.4生物芯片技术在食品检验中的应用 在一次性食品检验中，生物芯片技术既能检测出食品中致病菌，而且可以检测出许多隐藏致病菌，其操作简单，检测的敏感性高，可以通过一次检测得到全部检测结果。曾有检测证明，将15种细菌的16srDNA通过引物扩增，让后与芯片探针进行杂交，从而检测出食品中致病菌。虽然生物芯片技术的优点很多，但是由于芯片比较复杂，该技术仍然在试验阶段，其应用范围也不太广泛。

4.5生物传感器检测技术在食品检验中的应用 导致食品腐败变质的微生物多种多样，如真菌、细菌和病毒等，其中因细菌导致食品变质情况最为常见。病原菌和腐败菌是造成食物污染的微生物组成部分，腐败菌自身并不会致病，只是通过将食品成分分解与破坏，从而使食物腐败变质，进而产生有害物质而危害人们身体健康。生物传感器检测技术可以准确检验出食品中的微生物，如乳酸菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌等腐败菌数量；沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等病原菌；真菌毒素、藻类毒素、新军毒素等生物毒素等。但是由于该技术还需要进一步完善，所以在实际的食品检验中应用有限。

5 结语

在食品检验中，传统检测技术和方法不仅检测时间长，而且检测过程复杂繁琐，检测的结果也不易判断，而借助新检测技术与检测仪器设备，可以有效提高食品检验检测技术的实用性与准确性。检测人员只有把握各种检测技术的特点及适用范围，在检测时做到细致认真、规范操作，才能真正保障检测质量，对食品的安全性给出正确评价，为社会民众创造安全的食品环境。

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微生物多样性分析篇8

临床研究[4]发现，人类对感染性疾病的敏感性与个体年龄有关，一些疾病主要发生在幼儿，而另一些疾病主要发生在成年人和老年人。目前关于微生物多样性的研究多局限于人体某一特定发育阶段[5]，并不能代表整个人群的真实情况；因此，针对不同年龄阶段人群进行采样分析，对于全面认识微生物的组成具有重要意义。

人类口腔是一个非均质的环境，既有非脱落固体表面（如牙齿），也有脱落表面。口腔黏膜为口腔内的脱落表面，该生境表面上皮细胞持续脱落可使黏附的细菌快速更替[6]。了解口腔黏膜表面微生物群落的组成对黏膜感染性疾病的诊断和防治具有重要意义[7]。本试验以口腔黏膜疾病好发部位——颊黏膜[8]为研究对象，采用聚合酶链式反应（polyme-rase chain reaction，PCR）-变性梯度凝胶电泳（de-naturing gradient gel electrophoresis，DGGE）指纹图谱技术对不同年龄及牙列阶段人群颊黏膜样本进行研究，通过分析不同年龄及牙列阶段人群颊黏膜微生物的多样性，探索颊黏膜微生物群落组成随年龄产生的演替趋势。

1 材料和方法

1.1 研究对象的选择

从四川大学华西口腔医院初诊人群中纳入25例健康研究对象，分为5个年龄组：乳牙列组（3～5岁），混合牙列组（6～12岁），青少年组（15～18岁），青年组（30～44岁），老年组（>60岁）。研究对象无全身性疾病，无口腔局部疾病，近6个月内未使用抗生素等药物。本研究经过四川大学华西口腔医院伦理委员会批准。研究对象或其监护人在取样前均签署知情同意书。

1.2 样本采集

使用消毒棉签在研究对象左右两侧颊黏膜区域各擦拭10 s（避免接触到牙面），将棉签置于含750 μL TE缓冲液（pH=7.4）的离心管内，冰浴下4 h内运送至实验室，-80 ℃保存备用。

1.3 基因组DNA的提取和 PCR 扩增

所有样本室温解冻，涡旋3 min使样本充分分散至TE 缓冲液内，弃棉签留菌悬液备用。使用 QIAamp DNA Micro Kit（Qiagen公司，美国）提取细菌全基因组DNA作为模板，通用细菌16S rRNA引物Bac1和Bac2作为引物[9]进行扩增。引物Bac1的5’端包含DGGE所需40 bp的“GC夹”[10]，其作用是增加扩增片段的GC含量，防止DNA双链完全解离。PCR扩增细菌16S核糖体DNA基因，具体方法见文献[11]。引物序列如下。Bac1：5’-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3’[9-10]，Bac2：5’-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’ [9]；扩增产物长度约为300 bp。每50 μL PCR 反应体系包含：纯化基因组DNA（10 ng·μL-1）2 μL、上游及下游PCR引物（25 μmol·L-1）各1 μL、无酶水21 μL、DreamTaqTM PCR Master Mix（2×）（Fermentas公司，立陶宛）25 μL。使用Gradient PCR Thermal Cycle （Eppendorf公司，德国）进行聚合。循环条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。取PCR扩增产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，Goldview Ⅰ型核酸染料染色后置长波紫外光下观察，采用Mole-cular Imager Gel Documentation system（Bio-Rad公司，美国）凝胶成像系统采集图像。

1.4 DGGE

使用Bio-Rad D-Code system（Bio-Rad公司，美国）对PCR扩增产物进行DGGE。丙烯酰胺凝胶质量分数为8%，变性剂浓度梯度质量分数为40%～60%（100%变性剂包含体积分数为40%的甲酰胺与7 mol·L-1的尿素），变性胶上表面加入5 mL无变性作用的积层凝胶。60 V恒定电压、58 ℃条件下，在1×TAE缓冲液（pH=8.5）中电泳16 h。电泳完成后，采用0.5 μg·mL-1溴化乙锭染色15 min，然后用1×TAE缓冲液漂洗去除多余染料，Molecular Imager Gel Do-cumentation system采集并记录 DGGE 凝胶的数码图像。

1.5 DGGE凝胶微生物图谱分析

使用Quantity One软件（Bio-Rad公司，美国）标准化DGGE凝胶图像用于分析条带模式，得到的最终参数包括检测到的条带数、条带分布的频率等。

1.5.1 Sh[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]annon指数 Shannon指数（H）代表微生物群落多样性的丰富程度。公式为：H=-∑PilnPi，H的计算是基于DGGE胶条带的位置和条带的强度，条带的强度（Pi）由经凝胶分析软件Quantity One分析后得到的波峰面积来表示，即Pi=ni/N，其中ni为峰面积，N为所有峰的总面积。

1.5.2 非加权组平均法（unweighted pair-group me-thod with arithmetic means，UPGMA）聚类分析 使用UPGMA聚类分析构建系统进化树。

1.6 统计学分析

应用SPSS 19.0软件分析数据，多组间的条带数和Shannon指数的比较采用独立样本Kruskal Wallis检验，组间多重比较采用Student-Newman-Keuls检验（SNK检验），检验效能α=0.05。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

经PCR扩增各颊黏膜菌群的16S rDNA，25例样本均得到预期长度约300 bp的产物（图1），扩增产物无明显拖尾及引物二聚体形成。

2.2 DGGE图谱总体特征

图2为5个年龄组的颊黏膜菌群DGGE指纹图谱。图2每一泳道代表一个研究对象颊黏膜细菌样本的DGGE指纹图谱，不同位置的条带代表不同的优势细菌，泳道的条带数代表该样本中的优势菌种的数量。分析图2可以看出：1）个体间唾液微生物中共享的优势菌群数量较多，图谱表现为相同位置的 条带在各个体中均有出现；2）唾液微生物的组成同时具有个体差异性，未见有完全相同的泳道出现。

2.3 条带数比较

5个年龄组DGGE 图谱经标准化后，得到64个不同条带，条带平均数介于10～31之间。乳牙列组、混合牙列组、青少年组、青年组和老年组检测到的平均条带数分别为21.2±4.0、17.8±3.9、15.8±4.3、16.8±3.7、22.2±6.5。乳牙列组、混合牙列组和青少年组颊黏膜优势菌群的种类随着年龄的增加而呈递减趋势；进入青年阶段以后，这种趋势得以逆转，表现为青年组、老年组优势菌群种类随着年龄的增加而逐渐增加。虽然可看出这种趋势，但经Kruskal-Wallis秩和检验，各组间的差异并无统计学意义（P>0.05）。

2.4 Shannon指数比较

乳牙列组、混合牙列组、青少年组、青年组和老年组的Shannon指数分别为1.73±0.2、1.43±0.1、1.05±0.2、1.45±0.2和1.63±0.3。经Kruskal-Wallis秩和检验，5组间的总体差异具有统计学意义（P=

0.003）。与微生物种类数目的改变相似，颊黏膜优势菌群的多样性随着年龄的增加而呈现递减趋势；进入青年阶段以后，这种趋势改变，青年组、老年组优势菌群种类随着年龄的增加而逐渐增加。组间比较显示，青少年组与其他4个年龄组相比，其差异有统计学意义，提示青少年期是颊黏膜微生物多样性改变的转折点。

2.5 群落结构分析

为了解颊黏膜菌斑微生物多样性随年龄增加而发生的群体性改变，本研究对得到的DGGE图谱进行了UPGMA聚类分析，依据不同样本的条带分布相似程度构建了系统进化树（图3）。从UPGMA聚类分析结果看出：11、[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]12、13、15和22号样本在树图中聚成一簇，除22号样本外，其余4个样本都来自青少年组；2、3和4号样本在树图中聚成一簇，都来自乳牙列组；6、7、8和9号样本在树图中聚成一簇，都来自混合牙列组；16、17、18和20号样本在树图中聚成一簇，都来自青年组。由此可见：相同分组内大部分样本聚类位置相近的群落结构表现出较高的相似性；不同分组的大部分样本未聚类在一起，群落结构呈现出一定的差异。该结果提示：颊黏膜微生物的群落结构随着年龄和牙列的改变存在演替现象；但是从图3中也可以看到，每个节点处代表相似性的数字并不是很大，对聚类分析结果的可信度会造成一定的影响。

3 讨论

口腔黏膜的细菌感染，是除牙齿及其支持组织感染外最常见的口腔感染[8]，多为机会致病菌（如大肠杆菌群，假单胞菌属，肠球菌等）导致的混合性感染。疾病发生时，感染部位的菌群组成发生变化[8]，正常黏膜菌群（链球菌属、奈瑟菌属、嗜血菌属等）丰度显著减少，而机会致病菌丰度显著升高。了解健康及疾病状态下黏膜菌群的组成改变，可对微生物学诊断技术的发展，疾病的早期治疗及预防产生重要影响[7]。

目前已从人类口腔中检测出700多种微生物，口腔微生态群落的物种复杂性在口腔多菌种感染性疾病研究中的重要性日益突出[12]。研究[12]发现，口腔中50%以上的微生物不能依靠传统方法进行培养和分类，这限制了对口腔微生态群落结构的全面了解。近年来非培养分子生物学检测技术迅速发展，PCR-DGGE技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域。目前，PCR-DGGE技术主要应用于微生物群落多样性和群落变化，细菌富集和分离检测，rRNA编码基因的微观异质性检测，克隆文库筛选，PCR和克隆偏倚的确定等研究[13]。在口腔医学领域，PCR-DGGE主要用于检测唾液、菌斑等微生物群落结构以及龋病[14]和牙周病[15]患者的口腔微生物群落组成改变。本研究采用PCR-DGGE方法对不同年龄及牙列阶段人群的颊黏膜样本进行研究，克服了传统培养学方法的缺点，使研究结果具有更强的可信性。

伴随年龄增长，口腔结构的一个明显变化是从牙萌出到形成完整牙列，这期间口腔菌群也进行着动态演替[16]。人出生时口腔一般是无菌的，即使有少数细菌，也是在分娩过程中污染所致；与外界接触后，出生6～10 h口腔细菌的数量即有显著增加；幼儿期乳牙萌出，细菌定植的环境增加，口腔微生物的数量明显增加，种类更加复杂；青春期恒牙完全萌出，口腔生态环境相对恒定，几乎所有成人口腔中的菌种都能在青春期口腔中分离到；成年期口腔微生物的定植数量和种类达到高峰，与其他时期相比，该时期的口腔菌群组成更为复杂和多变[16]。本研究使用PCR-DGGE技术从颊黏膜微生物群落组成多样性方面将这种演替过程进行了更直观地描述。本研究未涉及新生儿和婴儿的颊黏膜菌群研究，但已有研究[17]表明，随着婴儿月龄的增加，其口腔中检出细菌的种类和数量均明显增加。Vaahtontemi等[18]检测了5月龄到34岁不同年龄组人群的龈缘、唇黏膜和颊黏膜表面的细菌数量，发现3个部位定植细菌的总量随年龄增加而减少。结合[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]Vaahtontemi等[18]及本试验的研究结果可以看出，随着年龄的增加，颊黏膜表面的细菌总量逐渐减少，但细菌多样性在青少年（15～18岁）及青年（30～44岁）期间呈上升趋势。

造成口腔微生物年龄相关变化的因素有很多：儿童因其黏膜防御机制尚不成熟，口腔黏膜有更多的细菌黏附[18]；老年人免疫力下降，黏膜菌群发生变化[19]；口腔卫生措施也会对黏膜菌群造成影响[20]。本研究发现的颊黏膜微生物群落结构随年龄和牙列改变存在的演替现象很可能与宿主不同年龄阶段免疫力及口腔卫生习惯等因素相关[21]。

综上所述，本研究对不同年龄阶段人群口腔颊黏膜微生物群落的组成差异进行分析，发现颊黏膜微生物的群落结构随着年龄和牙列的改变存在演替现象，青少年期可能是颊黏膜微生物多样性改变的重要转折点。本研究结果为进一步深入研究宿主黏膜微生物组的动态演替过程奠定了基础。但是，本研究样本量较少，其结果只能作为初步参考；此外，虽然PCR-DGGE在口腔微生物群落分析中具有显著优势，但只能检测优势菌群，且无法进行定量分析。在下一步工作中，需扩大样本量，采用更先进的技术，如基于焦磷酸测序技术的宏基因组学[22]等高通量测序技术，对健康人群口腔颊黏膜微生物的演替进行更深入的研究。

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微生物多样性分析篇9

关键词：微卫星标记；遗传多态性；麻城黑山羊

中图分类号：S827 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4454-04

麻城黑山羊产于大别山及其周边的广大地区，主产区在湖北麻城市，是优良的黑色地方品种资源。对于麻城黑山羊的相关研究，过去多限于体型外貌、体尺测量、生产性能测定等方面，很少在分子水平上开展研究，品种的选育尚停留在常规育种领域，严重阻碍了该品种的选育提高和进一步发展。

微卫星（Microsatellite）是广泛分布于生物基因组中的简单重复序列，20世纪80年代，Miesfeld等[1]在人类基因组的研究中首先发现了微卫星DNA，它一般由2～6个碱基组成核心单元，重复几次至几十次不等，数量庞大且分布均匀，在染色体上平均每10kb就出现一个，同时具备保守性、等显性遗传、多态性丰富、易被检测、进化所受选择压力小等特点，在物种遗传图谱构建、品种遗传多样性分析、种间遗传距离估测、亲子鉴定、数量性状基因座（QTL）的检测与定位、杂交优势预测等方面具有很大的应用价值，也使之成为继RFLP之后的第二代分子标记技术，被广泛应用于羊的遗传育种领域，为羊育种开辟了一条新的途径。

遗传多样性（Genetic diversity）是生物多样性的基础和核心。最初采用血液蛋白多态性、酶多态性等来研究群体的遗传多样性，但结果的可信度不高。随着育种技术的发展，从分子水平上为群体遗传多态性的研究提供了更好的途径，如微卫星标记既可反映个体的遗传相似程度，又能反映群体之间的遗传相似程度，在遗传多样性评估、畜禽品种资源的分类、保护和利用等方面具有重要价值。国内外利用微卫星标记对羊品种的遗传多态性研究非常普遍。Luikart等[2]用22个微卫星标记检测山羊家系，22个标记的平均杂合度为0.611 0，等位基因数2～11，其中安哥拉山羊平均杂合度为最高。Kim[3]用9个微卫星标记分析朝鲜和中国山羊，共检出62个等位基因，每个标记都具多态性，等位基因数4～10。Chenyambuga[4]用19个微卫星标记分析非洲山羊品种遗传多样性，结果每个标记均表现多态性，等位基因数均大于4。兰蓉等[5]用11个微卫星标记分析了云南肉山羊黑色品系，得到了品系内不同家系的遗传多态性信息和公羊间的亲缘关系。汤存伟等[6]研究了10个微卫星标记在新疆13个绵羊群体中的遗传多态性，计算得到的群体平均多态信息含量为0.680 3，平均杂合度为0.719 2。郎侠等[7]用15个微卫星标记分析兰州大尾羊，共检测到153个等位基因，群体多态信息含量0.776 2。郭丹等[8]用微卫星标记研究了辽宁绒山羊的遗传多样性，7个标记均呈高度多态性，遗传多样性丰富。毛杨毅等[9]用微卫星标记研究吕梁黑山羊等4个山西地方山羊品种，5个基因座共检测到67个等位基因，多态性丰富。

本研究选择10个微卫星标记，对麻城黑山羊群体进行检测，统计分析标记的多态性、基因杂合度等，为了解麻城黑山羊的群体遗传多样性，进一步寻找与麻城黑山羊毛色、生长、繁殖等相关的遗传标记提供理论依据，为麻城黑山羊新品系的培育提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

麻城黑山羊血样，在湖北省麻城黑山羊种羊场采集。所用的试剂包括Tris、EDTA、SDS、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTPs等购自生工生物工程（上海）股份有限公司，微卫星引物10对（引物信息见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 仪器设备

数显pH计、高速台式离心机、PCR扩增仪（普通、梯度）、电泳仪、凝胶成像仪等。

1.3 血样采集及DNA提取

采集麻城黑山羊静脉血199头份，置于低温保温箱带回实验室。提取DNA，溶解于TE。最终提取出可用的基因组DNA样品为189头份。

1.4 PCR扩增

PCR反应体系20 μL：10×Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.0～2.4 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，8 pmol/μL两侧引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，双蒸水补充至20 μL。

反应程序：95 ℃预变性8 min；94 ℃变性30 s，53.0～60.0 ℃退火30 s（因标记而异），72 ℃延伸40 s，共38个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。各反应体系引物的MgCl2用量、退火温度见表2。以2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.5 统计分析

1.5.1 统计软件 用Band Scan 5.0软件获得等位基因的大小，根据公式计算各微卫星座位的等位基因频率、 多态信息含量、 杂合度等。

1.5.2 多态信息含量 采用以下公式计算多态信息含量（PIC）。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物的电泳结果

由图1可知，BM1329等10个微卫星标记的PCR扩增产物的条带均为一条或两条，符合微卫星标记的基本特征，可用于后续的遗传信息分析。

2.2 微卫星标记的等位基因分析

利用Band Scan 5.0软件进行微卫星标记的等位基因及基因频率分析，经统计得知，BM1329等10个微卫星标记共检测到171个等位基因，每个标记都检测到9个以上的等位基因，说明所选择的微卫星标记遗传信息比较丰富。在所有微卫星标记中，以BMS1591标记检测到的等位基因数目最多，为23个，其片段大小为187～273 bp；其次是BM143标记，为22个等位基因，其片段大小为78～170 bp；OarHH35标记的等位基因数目最少，只检测到9个等位基因，片段大小为97～125 bp。

在所有检测到的等位基因中，以OarAE101标记、100 bp片段的基因频率最高，为0.239 1，其次是OarHH35标记、97 bp片段的基因频率（0.234 0）；而BMS2508标记的135 bp片段、OarHH55标记的150 bp片段的基因频率最低，均为0.002 7。可以看到，所有基因的基因频率都不高（最高者仅0.239 1），这可能是群体基因分布较均匀等因素所造成。

每个微卫星标记上观察到的等位基因数及统计后的有效等位基因数如表3所示。有效等位基因数（Ne）反映了群体遗传变异大小。有效等位基因数接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因分布均匀。根据表3中的数据，BM1329、BM3413、BMS2508和BM143等标记的等位基因观察数和有效等位基因数都相差较大（绝对相差值在6.7～8.1），说明在这些基因座上，群体的等位基因分布不均匀，遗传差异较大，这可能是由于地理隔离以及人工选择所造成。

2.3 多态信息含量与杂合度

多态信息含量（PIC）用来描述微卫星标记的变异程度，用于估计群体内的遗传变异程度。一般认为，当PIC>0.5时为高度多态标记，0.25

由表4可知，本研究中的10个微卫星标记均为高度多态标记，多态信息含量都在0.95以上，说明基因变异较大，遗传多样性丰富，同时也说明本研究所选用的微卫星标记均能提供较好的遗传信息，可以反映麻城黑山羊群体的遗传多样性。其中BMS1591标记的多态信息含量最高，为0.996 9，其次是BM143标记，为0.995 7；OarAE101标记的多态信息含量最低，为0.980 1。10个微卫星标记的平均杂合度（H）在0.707 4～0.976 5之间，群体遗传杂合度（h）在0.859 0～0.944 6之间，品种的平均群体遗传杂合度为0.906 7，均属于高度杂合标记和高度杂合品种。较高的品种杂合度，表明品种的遗传多样性信息丰富；较高的微卫星标记杂合度，说明该标记所能提供的遗传信息量更大。同时，杂合度的高低，还在一定程度上反映了品种的选育过程，如所用的亲本材料来源广泛、或导入了外血、选育时间短，均会提高杂合度。

3 小结与讨论

3.1 小结

BM1329等10个微卫星标记共检测到171个等位基因，平均为17.1个，其中以BMS1591标记检测到的等位基因数目最多（为23个），其次是BM143标记（22个），OarHH35标记的等位基因数目最少（9个）。基因频率最高的是OarAE101标记的100 bp片段（0.239 1），其次是OarHH35标记的97 bp片段（0.234 0），而BMS2508标记的135 bp片段、OarHH55标记的150 bp片段的基因频率最低，均为0.002 7。

10个微卫星标记多态信息含量都在0.95以上，均为高度多态标记，其中BMS1591标记的多态信息含量最高，为0.996 9，其次是BM143标记，为0.995 7；OarAE101标记的多态信息含量最低，为0.980 1。平均杂合度在0.707 4～0.976 5之间，群体遗传杂合度在0.859 0～0.944 6之间，平均群体遗传杂合度为0.906 7，属于高度杂合标记和高度杂合品种，遗传变异大。

3.2 讨论

3.2.1 微卫星座位的选择 大量的理论研究和实践表明，研究群体的杂合度、群体间遗传距离时，所用标记的数目对结果的精确性和可靠性非常重要，数目越多则结果的精确性越高，但工作量和费用相应较高。在本研究中，选用了分布在不同染色体上（10个微卫星标记分别分布在6条染色体上）、多态性较高的标记，以尽可能提供较多的遗传信息，且扩增产物的片段大小多在80～270 bp之间，便于获得扩增产物和结果统计。同时，这10个标记已有对羊的生长发育、繁殖等性状具有正效应的研究结果，便于下一步开展此方面的研究。本研究结果表明，10个微卫星标记均检测到9个及以上（平均17.1个）的等位基因，多态信息含量非常丰富，客观地反映了麻城黑山羊的遗传信息。

3.2.2 电泳 微卫星的PCR扩增产物多采用聚丙烯酰胺凝胶作为载体，在垂直槽上进行电泳，它的分析结果在精确度上高于琼脂糖法，但凝胶的制备非常麻烦，电泳过程耗时很长，成本也较高。近年来也有采用毛细管电泳的[5]，它是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，采用毛细管电泳原理制作的全自动分析仪，具有自动上样、高通量、检测灵敏度高、分辨率高、样本消耗少、分析快速等优点，并可进行全自动数据记录和输出胶图、条带长度和浓度。本研究采用的是较为传统的琼脂糖法，虽然其分辨效果不如前两种方法，但制胶容易、电泳时间短、效率也较高、成本较低，只要掌握好凝胶浓度、电压和电泳时间，避免出现条带未分开、边缘效应等问题，同样可取得较理想的分析结果。

3.2.3 关于群体遗传多样性 多态信息含量和群体遗传杂合度都不同程度地反映出品种的遗传多样性。在本研究中，麻城黑山羊的平均PIC在0.980 1～0.996 9之间，平均遗传杂合度在0.859 0～0.944 6之间，说明其遗传基础广泛、遗传多样性丰富。而平均杂合度低于平均遗传杂合度，表明品种中用于配种的种公羊数量较少，存在一定程度的近交，也可能是长期对某一性状的选择，造成整体血统狭隘，或是品种曾经历过始祖效应，这些都会造成基因纯合较多。

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[7] 郎 侠，吕潇潇.兰州大尾羊微卫星DNA多态性研究[J].中国畜牧杂志，2011（1）：14-17.

微生物多样性分析篇10

光合自养型真核超微藻(PhotosyntheticPicoeukaryotes，PPEs)为粒径小于2μm的自养型真核原生生物［1］，其广泛分布于海洋和淡水生态系统中，作为重要的初级生产者，在水生生态系统的物质循环和能量流动中起着十分重要的作用．尤其在热带、亚热带贫营养海域是重要的初级生产者，对其所在海域的生物量贡献巨大［2］． 1994年Li首次揭示了光合自养型真核超微藻由于具有较大的比表面积和高的碳吸收效率，是海洋初级生产力的重要贡献者［3］．国际上关于真核超微藻遗传多样性的调查和研究多集中于海洋，近几年才有少量关于湖泊的研究报道［4-5］．国内关于真核超微藻遗传多样性的研究才刚刚起步［6］，袁洁等［7］构建了我国南沙海域真核超微藻基因克隆库，发现了大量新型基因序列;王建等［8］对武汉东湖超微藻生态学进行初步研究;陈美军等［9-11］对太湖不同湖区真核微型浮游生物基因多样性进行研究，其中涉及部分微型藻类． 调查真核超微藻多样性，一般将水样经过一定孔径的滤膜抽滤，然后用真核生物18SrRNA基因的通用引物扩增和克隆滤膜上的DNA，最后进行测序和序列比对、生物进化分析［12］．该方法得到的海洋和湖泊样品的克隆库中，三分之二以上的基因序列属于异养真核微生物，但荧光原位杂交方法却发现，在适宜藻类生长的水环境中，通常自养型真核超微藻相对异养真核微生物在数量上占绝对优势［13］．为了更好地揭示光合自养型超微藻的遗传多样性，Fuller等设计了针对真核藻类叶绿体16SrRNA的引物来构建基因克隆库［14］．该引物能够特异性地扩增自养真核藻类，较好地克服传统方法对异样真核微藻较高的扩增率． 本研究采用真核藻类叶绿体16SrRNA的引物来构建基因克隆库，以揭示太湖自养真核超微藻的遗传多样性，从而帮助我们更全面地了解湖泊浮游藻类的群落结构及生态功能，同时为湖泊超微藻的研究和开发利用提供一定的依据． 1材料与方法 1．1藻样采集 梅梁湾位于太湖北部，是目前太湖富营养化程度最高的区域之一，而东太湖的富营养水平在太湖几个湖区中最低［9］．2010年3月采集太湖梅梁湾(T1点)、东太湖(T2点)水样各500ml(图1)．用20μm的滤膜粗滤后分别用2μm、0．2μm的滤膜逐级抽滤，得到粒径范围为0．2～2μm的超微浮游藻类［13］．用10ml离心管收集0．2μm滤膜，加3ml细胞溶解液，－20℃保存． 1．2藻样总DNA提取 将加有细胞溶解液的离心管从－20℃取出，室温溶解．加入350μl10%的SDS，33．5μl10mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃水浴50min后55℃水浴20min，期间每隔10min摇匀，使反应充分．加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，10000转/min、4℃下离心5min．取上清至新离心管中，同样的方法再次抽提．将上清转移至新离心管中，加入等体积异丙醇和0．4倍体积的7．5mol/L的醋酸铵，室温静置10min后，10000转/min、4℃下离心30min．弃溶液，加入1ml的70%乙醇洗涤，10000转/min、4℃下离心15min，弃乙醇．干燥30min，使酒精充分挥发后，每管加入30μl的TE悬浮沉淀，－20℃保存． 1．3PCR反应与产物的纯化 以上提取的藻样总DNA用于目的片段扩增．50μlPCR反应液中含有25mmol/LMgCl2，2．5mmol/LdNTP，10×buffer，5U/μlTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)．采用真核藻类16SrRNA基因的引物对PLA491F:5'GAGGAATAAGCATCGGCTAA3'，OXY1313R:5'CTTCACGTAGGCGAGTTGCAGC3'［14］进行扩增．扩增反应程序:95℃，5min;95℃，1min;55℃，1min;72℃，1min，循环30次，最后72℃，6min．扩增完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取PCR产物目的片段(约822bp)，用Promega公司的PCR纯化试剂盒(Wiz-ard?SVGelandPCRClean-UpSystem)进行纯化． 1．4克隆子筛选 PCR产物经纯化回收后与载体pGEM-TEasy连接，并转化感受态大肠杆菌，涂布于含有Amp、IPTG及X-gal的LB培养平板上，置于37℃培养箱中倒置过夜．在平板上挑取白斑单菌落转移至含有Amp的液体LB培养基中37℃，150转/min振荡培养6～8h．取1μl菌液，用pGEM-TEasy载体的通用引物T7、SP6扩增，电泳检测，对扩增出目的片段的菌液进行测序． 1．5序列分析 将测序获得的序列剪切掉载体和引物区，采用Bellerophon在线软件分析，随后利用核苷酸序列进行分子遗传多样性和分子系统学分析．我们将核苷酸序列相似度为98%的克隆定为属于同一OTU，代表相同的属或种［15］，否则将被认为是不同的藻．本研究共得到14个真核超微藻序列，Cluster软件分析后发现有10个OTU．采用MAFFT5．8软件(align．bmr．kyushu-u．ac．jp/mafft/online/server/)对本研究得到的10个OTU和34个参考序列进行比对，Gblocks软件剪切掉变异较大的区域，Modeltest软件计算得到针对该44个序列构建进化树的最佳参数，最后用PAUP4．0构建NeighbourJoining生物进化树，重复1000次得到Bootstrap值，用MEGA4．1软件对进化树进行编辑． 2结果与分析 2．1DNA的扩增与阳性克隆子筛选结果显示在822bp左右有特异性的扩增片段条带，与预期片段相符(图2)．目的片段纯化后直接与载体pGEM-TEasy连接转化获得数百个克隆，最后每个样品挑出46个阳性克隆进行测序． 2．216SrRNA部分序列分析将得到的序列在NCBI上进行比较分析，发现自养型真核超微藻优势种群为隐藻(Cryptophyta)，占71．4%，其次是硅藻(Bacillariophyta)占14．3%，最后为金藻(Chrysophyta)和定鞭藻(Haptophyta)，分别占7．1%(表1)．构建NeighbourJoining生物进化树(图3)．与国内外研究结果比较，确定了部分藻的具体分类，但大部分为未培养的藻类，无法进行精确定位．分析发现本研究中得到的金藻序列EF052122、定鞭藻序列EF051968及隐藻序列如EF052243、EF052214等均与意大利Naples近海湾藻类亲缘性较近［16］，除金藻相似度为96%，其他藻类的相似度均达到98%～99%．可见湖泊与海洋的藻类组成具有一定的相似性，且隐藻等广泛分布于海洋及淡水湖泊中．硅藻序列EU580495与德国Constance湖及美国Horsetooth水库的硅藻相似度较高［17-18］，说明硅藻在全球分布广泛，且本研究发现的硅藻也多存在于湖泊中．分析发现目前国际上关于超微藻的研究也较少且相对集中，超微藻的已知种类较少．此外在本研究的克隆文库中还发现了一些序列。#p#分页标题#e# 3讨论 3．1方法选择 本研究采用了真核藻类16SrRNA基因的引物对PLA491F、OXY1313R［14］，近年来该引物在海洋真核超微藻研究中得到了广泛应用，弥补了18SrRNA通用引物构建的基因克隆库中大部分属于异养真核微生物而非自养真核藻类的不足，较好地反映了海洋真核超微藻的遗传多样性［19-20］．由于太湖富营养化程度高，细菌含量高，实验中也扩增出部分光合细菌，但目前国际分子生物学数据库中已有大量序列可进行比较，因此可有效排除光合细菌．PCR产物克隆法构建文库是研究超微型真核生物分子多样性的传统方法［21-22］．Zuendorf等对丹麦Mari-ager海峡样品进行克隆文库的构建，对随机选取的400个克隆进行测序，最后获得70个属于不同种类超微型真核生物的OTUs［23］．这些研究均获得了丰富的超微型真核生物多样性，表明克隆文库构建方法适用于本研究，为我们客观认识环境中真核生物多样性提供途径．但构建克隆文库直接测序耗时且花费较大．DGGE是检测微生物多样性的一种快速可靠的方法，其带谱中条带的数量和亮度可相应地反映环境样品中微生物物种的数量和优势种群［24］．此方法的优点是可以同时对大量不同的环境样品比较分析，缺点是不知道样品中具体的生物组成［25］．而构建克隆文库，通过测序及网上比对，能够知道样品中主要的物种组成与相对丰度．结合两种方法，能够扬长避短，即可对不同时空的样品进行分析，也可了解样品的主要物种组成［26］．所以我们将结合这两种方法进一步研究太湖自养真核超微藻的遗传多样性．本研究目前只对太湖2010年3月份T1、T2点的样品进行初次分析，但可以推测湖泊中自养真核超微藻具有复杂的遗传多样性．我们将对太湖这些位点的水样进行进一步调查，系统地研究太湖自养真核超微藻的遗传多样性． 3．2太湖不同湖区自养真核超微藻的分布 T1点位于太湖污染最为严重的梅梁湾，T2点位于水质相对最好的东太湖，本文以这两个富营养化程度相差较大的湖区作为代表来反映太湖不同湖区自养真核超微藻的分布情况．结果表明T1、T2点均有隐藻和硅藻，可见春季隐藻与硅藻分布较为广泛，可能在太湖的其他湖区也存在．其中优势种群为隐藻，说明隐藻适应性强，生长旺盛．金藻多生活在透明度高，有机质含量低的水体中［27］，东太湖金藻的发现，验证了东太湖水质相对较好，能够为金藻的生长提供适宜的环境．已发现的定鞭藻主要存在于海洋中，在淡水生态系统中很少［28］．太湖梅梁湾发现定鞭藻，说明定鞭藻的生境可能比以往认识得更为广泛，还可存在于富营养化的湖泊中．本研究得到的序列经比对后发现很多未培养、系统分类未定的藻类，说明我们对于真核超微藻的研究还很有限，需要进一步加深对其的认识．