细胞生物学的研究方法十篇

细胞生物学的研究方法篇1

晶状体后囊膜混浊（PCO）是现代白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术术后引起视力下降的常见，有多种方法用于研究后囊膜混浊，但各有利弊。细胞调节系统在后囊膜混浊的形成发挥重要作用。本文就后囊膜混浊的不同研究方法及与后囊膜混浊有关的细胞生物学调节方式进行综述，展望防治PCO的前景。

【关键词】 后囊膜混浊　细胞生物学调节　晶状体上皮细胞

Progresses of researching approaches and cell biology researches on posterior capsular opacification

AbstractPosterior capsular opacification is one of the main causes of visual ability decrease after cataract extraction combined with intraocular lens implantation. Its researching approaches are various with different advantages and disadvantages. Cell regulation system plays an important role in the forming of posterior capsular opacification. The present paper reviews the different researching approaches of posterior capsular opacification and related cell biological development.

· KEYWORDS: posterior capsular opcaification; cell biological regulation; lens epithelial cells

0引言

目前治疗白内障唯一有效的方法就是通过手术来恢复视功能。后囊膜混浊（posterior capsular opacification，PCO）是白内障手术的最常见并发症。PCO的出现会引起继发性的视功能丧失，需要进一步应用激光治疗，激光治疗费用较高，术后并不是没有风险[1]。现代白内障手术保留了囊袋，囊袋由部分前囊和整个后囊组成，起到隔离房水和玻璃体的作用，大部分囊袋内放置了人工晶状体。剩余前囊膜的晶状体上皮细胞会顽固地残留，这些残留细胞会重新增殖进入裸露的前囊区域，还会侵入人工晶状体的表面，占据前囊的外表面，最重要的还会分布在原来非细胞成分的后囊。细胞的持续性分化最后覆盖整个后囊而遮挡视轴。一薄层细胞不足以引起影响视路，随后出现的有基质和细胞成分的组织会引起光的散射。如果这些变化不断加重，视力将严重受损并需手术治疗。

1后囊膜混浊的研究方法

目前，用于研究后发性白内障的研究方法主要以下几种方法：细胞培养研究；活体动物研究；囊袋模型；活体观察；尸体眼的分析。这些研究方法各有利弊，却从不同角度为研究PCO提供了可靠的工具。

1.1细胞培养研究 这是最简单的研究方法，一般使用细胞系或从原位获取组织后原代细胞培养来分析其生长特征。这些实验能够确定哪些因子能够刺激或抑制生长。缺点是使用的细胞培养介质不是活体发生后发性白内障眼内环境，同时，培养的介质成分很大程度上不仅决定生长的速度，而且决定细胞的分子特性。例如，原位人晶体上皮细胞主要表达M1毒蕈碱的受体亚型，而人晶体细胞系HLE-B3表达M3亚型[2]。另外，在一些细胞系不表达αA-晶体蛋白，而αB-晶体蛋白和PAX6（眼主导基因）却被发现。并且，细胞培养所受到的干扰因素较大，单纯的晶状体上皮细胞培养必须加入一定浓度的胎牛血清，血清中含有多种生长因子，部分成分不明。但是，细胞系仍旧有许多研究价值，首先它提供哪些分子是有潜在研究价值的，在多大浓度下是有效的。而且，一旦被证实与更复杂的实验模型或尸体材料有相关性，这种易于获取的细胞系就是深入研究的最好体系。

1.2活体动物研究 最普通的动物模型就是兔。主要的缺点除了论理学上的考虑外，兔或猫动物体内细胞生长与于灵长类(动物) 有差别。同时，灵长类不同物种手术造成的创伤后具有不同的特殊表现[3]。另外，大多数信息只能在动物处死后检测到，不利于研究PCO发展的相关细节问题。

1.3囊袋模型 这种模型是在最近出现的，通过模拟一个虚拟的白内障手术获得，这种囊袋与活体的是一致的。囊袋培养体系需要有正常的基质，无血清条件下可生长。这类模型的一个重要方面就是如何维持囊袋的形状。一些研究组将环形结构植入囊袋内[4，5]，而另一些研究组使用细针固定维持环形结构[6，7，8]。同时，可以将IOL植入到这种模型里用来研究其所起到的作用。这种模型研究方法已经应用到人[4，6，7]，犬齿类动物[8]、牛的晶状体[5]上。人和犬齿动物都是接受了常规白内障手术，囊袋培养系提供了目前最直接的临床相关活体资料。国内黄瑾[9]有报道应用囊袋法体外培养晶状体上皮细胞的情况，认为可以建立较为稳定的体外环境，较为真实体现白内障囊外摘除术后的各种变化，体外培养的后囊膜上的晶状体上皮细胞的增殖、移行、皱褶形成、囊膜光散增强均与体内变化相似。

1.4活体观察 随着科学技术的发展，摄影系统已经发展到能够观察到视轴范围内的囊袋的细节改变[10，11]，能够随时观察患者的病情变化。尽管这项技术目前不能提供单一细胞水平的信息，却是观察PCO进展的较好方法。

1.5尸体眼分析 这种方法有利于理解哪些分子在囊袋内出现并参与了PCO。这些分子可能有基质成分、细胞标记物及生长因子。用来分析研究的技术包括；电子显微镜、免疫组织化学、RT-PCR和ELISA。通过这种方法得到的信息可以与其他提到的实验方法相比较。这种研究方法只能提供出与PCO病变相关的致病信息，不提供哪些分子与PCO进展确切的证据。

2细胞生物学调节系统

大多数白内障手术，术后晶状体上皮细胞将粘附于囊膜下，成为发生PCO的隐患。尽管PCO的发生过程，IOL起到重要作用，但PCO的严重程度依赖于细胞调节系统的本身。参与PCO发展的细胞调节信号来源于周围环境。这些调节因子来源于晶状体细胞本身或眼内其他组织，形成了自分泌和旁分泌调节方式。这两种调节系统提供了充足的信号信息进而维持细胞的生存与生长，参与PCO的发展过程。

2.1旁分泌调节 最初人们就认识到血——房水屏障破坏后房水中蛋白质含量增高，出现炎症反应的现象。有些蛋白质仅仅在眼外伤后的房水内存在，产生的多肽与蛋白质具有强大的调节晶状体细胞的功能。大量实验数据表明有多种因子调节控制不同物种的晶状体细胞生物活性。Davidson曾报道使用含有200μg/L的转铁蛋白培养介质能够明显增加LEC细胞的生存时间[12]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，能够以不同浓度使培养的鼠晶状体上皮细胞的增殖、迁移、分化速率达到最大化[13]。酸性成纤维细胞生长因子也有相似的作用，但是有效浓度要更大[14]。转化生长因子TGFβ是一种蛋白质，是参与伤口愈合和肉芽组织形成的重要生长因子之一，后囊膜混浊也是手术性创伤后机体的一种愈合反应过程，对TGFβ和PCO关系的研究一直是热门[15]。TGFβ通常存在于房水中，但多数是以隐匿的形式存在，外伤及手术刺激后其活性增加。 眼内合成的主要以TGFβ2为主，TGFβ1也能从血中进入房水中。将TGFβ加入鼠或牛晶状体上皮细胞胶原伐培养基能够诱导衬(下)层基质的收缩[16]。同时，加入TGFβ后可以诱导鼠晶体上皮细胞转化为平滑肌肌动蛋白SMA[17]，这一诱导过程特异性依赖TGFβ2和TGFβ3，且效果强于TGFβ1的10倍。大多数情况下，TGFβ增加细胞外基质的生成，抑制多数类型细胞的增值，并且诱导许多生长因子如结缔组织生长因子、血小板衍生生长因子，FGF等。Wunderlich等[18]就报道了在尸体眼囊袋内存在结缔组织生长因子，这种特殊因子的表达与 TGFβ有关。

2.2自分泌调节 手术后短期内房水中的蛋白质迅速增高，在数周或数月内缓慢降低恢复正常。PCO出现后并不是需要马上二次手术治疗，这就提示在最初高血清蛋白质的条件下，PCO的不发展可以持续一段时间。这时就有可能存在另一调节系统——自分泌调节机制。由此可以推测，生长因子在正常水平的情况下，由晶状体分泌的大量的可发觉的蛋白质起到缓慢促进PCO进展的作用。Ishizaki等[19]研究鼠的晶状体细胞发现在无蛋白质培养基条件下细胞能够生存，他们也推断之所以避免由凋亡引起的细胞死亡而生存是依赖于下层基质和细胞密度。Wormstone等[7]揭示了用无血清培养基培养的人囊袋模型中晶状体细胞不仅能够抵御手术造成的破坏而且能够活跃地增殖和生长。这个重要发现揭示了晶体上皮细胞自分泌调节系统的存在。在牛、狗的晶状体细胞在类似条件下也能够生存[5]。晶状体细胞能够合成蛋白质，可能与血-房水屏障破坏后，为了适应不利的生存环境，晶状体细胞合成必需蛋白质维持其自身生存。其他的屏障系统（如血-脑屏障）破坏后，也会出现与晶状体相似的自分泌调节机制来维持生存[20]。

已有研究囊袋模型认为原位的晶状体上皮细胞是完整的自分泌系统。EGF和EGF受体在人晶状体上皮细胞表达[21]。应用囊袋培养系，能够鉴定出手术后不同时期的哪些信号成分出现，检测出它们在PCO发展中起到作用。通过RT-PCR技术研究培养的人晶状体囊袋，认为碱性成纤维细胞生长因子bFGF及FGFR1是参与潜在的自分泌途径的成分[22，23]。

转贴于

3防治晶状体后囊膜混浊前景展望

已经有多种不同方法用于防治PCO。术中行晶状体囊膜抛光可以有效减少晶状体上皮细胞的数量。但是，目前看来，通过这种方法不可能完全去除所有细胞，并且少量残留细胞可以引起后囊再生。与手术相关的技术改进主要针对眼内晶状体的创新。制备人工晶状体的材料有多种，各种人工晶状体在防治PCO发生的作用主要是由晶状体的物理特性决定的。现在认为，直角型晶状体能够形成一个屏障阻止细胞向后囊生长。这种设计方法的改进无疑对于防治后发性白内障是有效果的，但是仍不能完全杜绝后发性白内障的发生[24]。

目前有大量的药物通过体外抑制晶状体细胞的增长来防治PCO[25-29]。临床上，目前有3种方法通过药物减少细胞的增长，包括药物直接注入到前房，调整灌注液成分，调整人工晶状体成分。问题是，这些药物释放对其他组织有毒性作用，尤其是对角膜内皮的伤害。目前，释放药物的最佳途径就是通过人工晶状体，这样能便于控制药物的释放，同时局部达到较高浓度有利于原位抑制有潜在增殖能力的细胞。事实上，将人工晶状体的襻修饰上细胞毒性药物能够直接将药物释放到赤道部细胞。Behar-Cohen[26]曾经观了将FGF-皂草素复合物结合到肝素表面处理的人工晶状体后植入兔眼的效果，皂草素通过FGF与上皮细胞受体结合，并杀死细胞。这种方案出现了一些副作用，包括暂时性角膜水肿和虹膜色素沉着。药物释放系统既需要有保护作用有能够保证有用的药物释放。也有一些研究针对了药物缓释系统，这些材料通常是不透明，不能放置视轴部位，但可以应用到囊袋内张力环或襻上。

总之，用于研究防治后发行白内障的研究工作除了在人工晶体的改进方面取得了较大进步外，在研究方法上及细胞分子生物学方面也取得了可喜成绩，但还有许多问题需要解决。应用细胞分子生物学技术治疗后囊膜混浊是未来治疗后发性白内障的有效手段。

【参考文献】

1 Ranta P， Kivela T. Retinal detachment in pseudophakic eyes with and without Nd:YAG laser posterior capsulotomy. Ophthalmology ，1998;105(11):2127-2133

2 Collison DJ， Coleman RA， James RS， Carey J， Duncan G. Characterization of muscarinic receptors in human lens cells by pharmacologic and molecular techniques. Invest Ophthalmol Vis Sci ，2000;41(9):2633-2641

3 Bito LZ. Species differences in the responses of the eye to irritation and trauma:a hypothesis of pergence in ocular defense mechanisms， and the choice of experimental animals for eye research. Exp Eye Res ，1984;39(6):807-829

4 Nagamoto T， Bissen-Miyajima H. A ring to support the capsular bag after continuous curvilinear capsulorhexis. J Cataract Refract Surg ，1994;20(4):417-420

5 Saxby L， Rosen E， Boulton M. Lens epithelial cell proliferation， migration， and metaplasia following capsulorhexis. Br J Ophthalmol ，1998;82(8):945-952

6 Liu CS， Wormstone IM， Duncan G， Marcantonio JM， Webb SF， Davies PD. A study of human lens cell growth in vitro：A model for posterior capsular opacification. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1996;37(5):906-914

7 Wormstone IM， Liu CS， Rakic JM， Marcantonio JM， Vrensen GF， Duncan G. Human lens epithelial cell proliferation in a protein-free medium. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1997;38(2):396-404

8 Davidson MG， Wormstone M， Morgan D， Malakof R， Allen J， McGahan MC. Ex vivo canine lens capsular sac explants. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol ，2000;238(8):708-714

9黄瑾，谢莉娜，卞春及.囊代法观察兔晶体上皮细胞体外和后囊膜混浊.南京医科大学学报(自然科学版)，2004;24(3):259-264

10 Ursell PG， Spalton DJ， Pande MV， Hollick EJ， Barman S， Boyce J， Tilling K. Relationship between intraocular lens biomaterials and posterior capsular opacification. J Cararact Refract Surg ，1998;24(3);352-360

11 Hollick EJ， Spalton DJ， Ursell PG， Pande MV， Barman SA， Boyce JF， Tilling K. The effect of polymethylmethacrylate， silicone， and polyacrylic intraocular lenses on posterior capsular opacification 3 years after cataract surgery. Ophthalmology ，1999;106(1):49-54

12 Davidson MG， Harned J， Grines AM， Duncan G， Wormstone IM， McGahan MC. Transferrin in after-cataract and as a survival factor for lens epithelium. Exp Eye Res ，1998;66(2):207-215

13 McAvoy JW， Chamberlain CG. Fibroblast growth factor induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration. Development ，1989;107(2):221-228

14 Chamberlain CG， McAvoy JW. Induction of lens fibre differentiation by acidic and basic fibroblast growth factor. Growth Factos ，1989;1(2):125-134

15 Moustakas A， Pardali K， Gaal A， Heldin CH. Mechanisms of TG-β signaling in regulation of cell growth and differentiation. Immunol Lett ，2002;82(1-2):85-91

16 Kurosake D， Kato K， Nagamoto T， Negishi K. Growth factors influence contractility and alpha-smooth muscle actin expression in bovine lens epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1995;36(8):1701-1708

17 Gordon-Thomson C， Iongh RU， Hales AM， Chamberlain CG， McAvoy JW. Differential cataractogenic potency of TGF-betal1，-betal2，and -betal3 and their expression in the postnatal rat eye. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1998;39(8):1399-1409

18 Wunderlich K， Pech M， Eberle AN， Mihatsch M， Flammer J， Meyer P. Expression of connective tissue growth factor mRNA in plaques of human anterior subcapsular cataracts and membranes of posterior capsule opacification. Curr Eye Res ，2000;21(2):627-636

19 Ishizaki Y， Voyvodic JT， Burne JF， Raff MC. Control of lens epithelial cell survival. J Cell Biol ，1993;121(4):899-908

20 Espinosa de los MonterosA， Kumar S， Scully S， Cole R， de Vellis J. Transferrin gene expression and secretion by rat brain cells in vitro. J Neurosci Res ，1990;25(4):576-580

21 Majima K. Human lens epithelial cells proliferate in response to exogenous EGF and have EGF receptor. Ophthalmic Res ，1995;27(6):356-365

22 Wormstone IM， Del Rio-Tsonis K， McMahon G， Tamiya S， Davies PD， Marcantonio JM， Duncan，G. FGF: an antocrine regulator of human lens cell growth independent of added stimuli. Invest Ophthalmol Vis Sci ，2001;42(6):1305-1311

23王铮，夏群，刘小伟，崔宝华.人工晶状体后囊混浊对视功能的影响.国际眼科杂志，2006;6(2):377-380

24石海红，管怀进.人工晶状体的设计对后囊膜混浊的影响.国际眼科杂志，2004;4(5):882-886

25 McDonnell PJ， Krause W， Glaster BM. In vitro inhibition of lens epithelial cell proliferation and migration. Ophthalmic Surg ，1988;19(1):25-30

26 Behar-Cohen FF， David T， D'Hermies F， Pouliquen YM， Buechler Y， Nova MP， Houston LL， Courtois Y. In vivo inhibition of lens regrowth by fibroblast growth factor 2-saporin. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1995;36(12):2434-2448

27 Nishi O， Nishi K， Saitoh I， Sakanishi K. Inhibition of migrating lens epithelial cells by sustained release of ethylenediaminetetraacetic acid. J Cataract Refract Surg ，1996;22 (Suppl 1):863-868

细胞生物学的研究方法篇2

关键词：细胞生物学 知识进化动力 知识进化机制 内容分析法 学科建设

中图分类号：G302 文献标志码：A 文章编号：1672-3791（2017）02（b）-0202-03

Abstract：By selecting references for the history of cellular biological development and adopting the methods of content analysis， driving forces for knowledge evolution at the level of cytological communities are handled， and model for knowledge evolution at the level of cellular biological communities are constructed， namely at the level of cellular biological communities， by use of the coordinated effects of such 5 driving forces as immigration of knowledge individuals， alterations of the recognitions in human brains， changes in internal environments， changes in external environments， and work of researchers， and through the alternative formation and development of such 4 periods as cellular period， period of classic cytology， period of experimental cytology and period of cellular biology， changes inside and outside the communities of cellular biology are timely handled， which propels knowledge evolution at the level of the communities of cellular biology and is prominently characterized by the progression of evolutionary paths. This model reveals the mechanism for knowledge evolution at the level of cellular biological communities， provides new theories for the solution of the issues concerning the first-rate disciplinary construction， and can be applied into the construction of original disciplines with middle-scale contents.

Key Words：Cellular Biology； Driving Forces of Knowledge Evolution； Knowledge evolution mechanism； Method of Content Analysis； Disciplinary Construction

胞生物学起源于细胞的原始发现，由细胞时期、古典细胞学时期、实验细胞学时期依次发展而成[1]。细胞生物学在全球具有重大的知识创新影响力，涌现出了众多的诺贝尔奖获得者，恩格斯曾把细胞学说誉为19世纪自然科学的三大发现之一[2]。因此，细胞生物学群落层面的知识进化是一种有代表性的典型类型，揭示其知识进化机制具有重大的应用价值与科学意义。目前，相关研究存在的问题是没有破解细胞生物学群落层面的知识进化动力是五类动力因素的协同作用，因而，细胞生物学群落层面的知识进化机制未被破解。基于以上分析，该文选择细胞生物学发展史文献[1-8]，采用内容分析法即通过对文献内容所含信息量及其变化的分析达到透过现象看本质[9]，提出了细胞生物学群落层面知识进化的动力与模型。该模型揭示了细胞生物学群落层面的知识进化机制，为解决一流学科建设问题提供了新理论，适用于中等内容尺度的原生学科建设。

1 细胞生物学群落层面的知识进化动力分析

首先，细胞时期形成与发展的动力包括5个方面。（1）知识个体的迁入。主要表现在1665年英国物理学家罗伯特・胡克首先引入并应用显微镜，观察了软木薄切片，发现了许多很小的、与蜂窝相似的小室，他将这种小室命名为细胞，开启了细胞时期。（2）人脑认识的改变。主要表现在首次认识到微观细胞的存在，打破了人类思想上的局限性，改变了人类几千年来的认识。（3）内部环境的变化。主要表现在研究人员具有了使用显微镜探索生物结构奥秘的兴趣与热情。（4）外部条件的变化。主要表现在细胞的发现轰动了当时的英国学术界，英国皇家学会与官方均认可。（5）研究人员的工作。主要表现在罗伯特・胡克、列文・虎克、格鲁、马尔比基、布朗等相关人员的研究工作。总之，以上5类动力因素的协同作用，推动着细胞时期的形成与发展。例如，列文・虎克用自制显微镜对多种活细胞进行了大量观察并首次描绘出骨细胞与横纹肌细胞图。该时期延续至1837年，称为先锋期。

其次，古典细胞学时期形成与发展的动力包括5个方面。（1）知识个体的迁入。主要表现在1838年施莱登与施旺首次引入并应用归纳法与解剖观察比较法，基于细胞时期的研究成果，提出了细胞学说，开启了古典细胞学时期。（2）人脑认识的改变。主要表现在首次认识到细胞的统一性和生物体的统一性，了分割动植物界的巨大屏障，对生物结构的认识由器官层次进入到细胞层次。（3）内部环境的变化。主要表现在研究人员完全从生命科学的角度解释生命的基本结构。（4）外部条件的变化。主要表现在恩格斯对细胞学说的高度评价、诺贝尔奖金的设立、以及胚胎学、遗传学、生理学和其他学科的技术与方法都发生了较大变化。（5）研究人员的工作。主要表现在施莱登、施旺、魏尔肖、施特拉斯布格尔等相关人员的研究工作。总之，以上5类动力因素的协同作用，推动着古典细胞学时期的形成与发展。例如，魏尔肖提出了“一切细胞来自细胞”的著名论断，完善了细胞学说；施特拉斯布格尔连续在两种植物中发现了物种染色体数目恒定的规律。该时期延续至1875年，称为发展期Ⅰ。

第三，实验细胞学时期形成与发展的动力包括5个方面。（1）知识个体的迁入。主要表现在1876年赫特维吉首次引入并采用实验方法，基于古典细胞学时期的研究成果，研究了海胆和蛔虫卵发育中的核质关系，发现了受精后两个亲本细胞核合并的现象，开启了实验细胞学时期。（2）人脑认识的改变。主要表现在首次认识到生物学的基础在于研究细胞的特性、结构和机能，扭转了古典细胞学时期忽视细胞质研究的状况。（3）内部环境的变化。主要表现在研究人员广泛应用实验手段、生物化学分析方法以及电子显微镜，研究细胞学的一些根本问题，开辟了一些新方向与领域，形成了一些重要分支。（4）外部条件的变化。主要表现在离心技术的建立和发展，以及电子显微镜的诞生与进步。（5）研究人员的工作。主要表现在赫特维吉、J. von Suchs、高尔基等相关人员的研究工作。总之，以上5类动力因素的协同作用，推动着实验细胞学时期的形成与发展。例如，科学家们相继发现了线粒体、内质网、高尔基体和溶酶体等细胞器的精细结构和功能，以及细胞内的大分子结构体制是细胞内各种代谢功能的基础。该时期延续至1964年，称为发展期Ⅱ。

第四，细胞生物学时期形成与发展的动力包括5个方面。（1）知识个体的迁入。主要表现在1965年布洛贝尔等一批细胞学科学家们引入并应用分子遗传学技术，基于实验细胞学时期的研究成果，确立了细胞生物学，开启了细胞生物学时期。（2）人脑认识的改变。主要表现在首次认识到细胞表达的机理来自分子层面，分子与生物个体之间存在联系。（3）内部环境的变化。主要表现在研究人员在显微水平、亚显微水平和分子水平3个层次上研究细胞的结构、功能和各种生命规律。（4）外部条件的变化。主要表现在设备、技术与思想都发生了巨大变化。（5）研究人员的工作。主要表现在布洛贝尔、De Robertis、 S. B. Prusiner等相关人员的研究工作。总之，以上5类动力因素的协同作用，推动着细胞生物学时期的形成与发展。例如，洛克菲勒大学细胞生物学系的专家们连续发现了细胞的亚显微结构、内质网蛋白质通道等。该时期延续至今，称为顶极期。目前，细胞生物学仍处于自我发展与完善的顶极期。

2 研究结论

综上所述，细胞生物学群落层面的知识进化动力是知识个体迁入、人脑认识改变、内部环境变化、外部条件改变、研究人员工作五类动力因素的协同作用。据此，该文创建了细胞生物学群落层面的知识进化模型，即细胞生物学群落层面，借助知识个体迁入、人脑认识改变、内部环境变化、外部条件改变、研究人员工作五类动力因素的协同作用，通过细胞时期、古典细胞学时期、实验细胞学时期、细胞生物学时期等四个时期的依次形成与发展，及时处理着细胞生物学群落内部与外部的变化，推动着细胞生物学群落层面的知识进化，M化路径递进是其突出特征（如图1）。结果是内容格局逐期增大，其中，细胞时期是观察不同类型的细胞、古典细胞学时期是观察细胞内部的形态结构、实验细胞学时期是分析细胞内部结构与功能的关系、细胞生物学时期是从细胞的角度研究生物学。该模型揭示了细胞生物学群落层面的知识进化机制，为解决一流学科建设问题提供了新理论，适用于中等内容尺度的原生学科建设。又由于，学科尺度层次的知识系统（如细胞生物学）是知识群落[10]，知识群落是科学学研究的前沿问题[11]。因此，细胞生物学群落层面的知识进化模型，在学科方面为建构知识群落层面的促进型进化机制提供了检验案例，意义重大。

参考文献

[1] 王亚辉.细胞生物学的发展历史和现况[J].细胞生物学杂志，1986，8（1）：7-11.

[2] 王宝娟，张盛周，朱国萍.诺贝尔奖在细胞生物学教学中的应用[J].中国细胞生物学学报，2010，32（3）：497-500.

[3] 庄孝德.从胡克到细胞生物学[J].细胞生物学杂志，1986，8（1）：1-6.

[4] 刘学礼.探索细胞世界[J].生物学通报，2004，39（11）：59-62.

[5] 潘承湘.发现细胞的人――罗伯特・胡克[J].植物杂志，1982（4）：38-41.

[6] 汪子春，田铭，易华.世界生物学史[M].长春：吉林教育出版社，1997：162.

[7] 翟中和.细胞生物学[M].北京：高等教育出版社，1995：7.

[8] 鲁白.培养诺贝尔奖获得者的摇篮――从诺贝尔奖得主布洛贝尔教授看洛克菲勒大学[J].生理科学进展，2001，32（2）：185-186.

[9] 邱均平，邹菲.关于内容分析法的研究[J].中国图书馆学报，2004，30（2）：12-17.

细胞生物学的研究方法篇3

论文摘要: 细胞凋亡又叫细胞程序性死亡，是植物正常发育中必不可少的一部分，目前已成为植物细胞生物学研究的一个热点。本文对植物凋亡的一般特征、植物营养和生殖生长中的细胞凋亡以及植物-病原物互作中的细胞凋亡进行了综合评述，并对植物细胞凋亡研究的现实意义进行了探讨。

细胞凋亡是多细胞生物体在生理或病理条件下部分细胞所采取的一种由内在基因编程调节，通过主动的生化过程而自杀死亡的方式[1 ]。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以常常又称为细胞编程性死亡。细胞凋亡的现象最早是Kree在1965年观察到的，经过进一步深入研究之后，他于1972年将其重新命名为细胞凋亡。之后近20年，细胞凋亡的研究主要集中在动物，人们越来越认识到细胞调亡在动物生长发育中、尤其在维持动物体内细胞和组织平衡、特化、形态建成和防病、抗病过程中的重要作用。同动物一样，在植物生长发育中也存在着细胞凋亡现象。但由于植物生长发育和细胞结构的特殊性，有关植物细胞凋亡的研究起步较晚。近年来，随着植物细胞凋亡的研究进展，人们逐渐认识到细胞凋亡是高等植物生长发育的必要组成部分，同时也是植物体度过不良环境的重要手段。目前，植物细胞凋亡的研究已成为近年来植物细胞生物学的新兴研究领域和热点之一。本文就植物细胞凋亡的一般特征、检测方法、在植物中的存在及意义作一综合阐述。

1 植物细胞凋亡的一般特征

经历细胞凋亡过程的细胞呈现一些典型的形态学变化，光学显微镜或电子显微镜观察可见:细胞体积缩小，染色质凝集、断裂、趋边化，细胞器解体、消失，细胞膜发泡形成凋亡小体(其中包含有凝集的细胞核断片和细胞器) [3.4]。随着研究的深入，分子生物学证据也逐步被阐明:细胞染色质DNA 在核小体连接部位断裂，其片段大小为200bp的倍数，经琼脂糖凝胶电泳可见到特征性的DNA 梯度(DNA ladder) ，此特征还可以通过超速离心、末端标记电泳以及原位缺口翻译技术等进行定性、定量测定。细胞形态学和分子生物学的变化是细胞凋亡的重要诊断依据。

2　细胞凋亡的检测方法

2. 1　细胞形态学观察法

苏木素- 伊红(HE) 染色法: 石蜡切片的HE 染色是组织形态学检测的常规方法， 光学显微镜下细胞核呈蓝黑色， 胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布， 表现在核染色质致密浓缩， 核碎裂等。

(1)电子显微镜。电镜观察，凋亡细胞染色质固缩，常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体， 初期细胞可见完整的细胞器， 细胞膜完整， 凋亡小体形成。目前一致认为， 电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞凋亡的最可靠依据。

(2) 荧光显微镜。对体外培养的活细胞经荧光色素处理， 可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有吖啶橙、Hoech st 33258或Hoech st 33342、碘化丙啶(P I)、溴乙锭(EB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞， 而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光， 正常细胞呈均匀荧光染色， 而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。

2. 2　反映凋亡细胞膜改变的方法：染料排斥法。

除了电镜能反映细胞膜完整性外， 还可用染料排斥法， 如台盼蓝、P I 等。坏死细胞膜破损， 被染料着染。而凋亡细胞细胞膜完整， 不被着染。但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死。因此， 此法不能单独用来判断凋亡细胞。另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上， 磷脂酰丝氨酸基团(PS) 位于胞内侧， 而在细胞凋亡早期膜上此基团则转向胞外侧， 以利于被吞噬。因此， 磷脂酰丝氨酸基团位置的改变， 可作为凋亡细胞的一个标志。

2. 3　反映脱氧核糖核酸有规律断裂的方法

细胞凋亡过程中，DNA有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。

(1) 琼脂糖凝胶电泳法。细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后， 于含EB 的琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞DNA呈单一条带。细胞凋亡时呈典型的梯状条带，系180～ 200 bp 左右的及多聚核小体的梯状DNA条带。坏死时则呈现模糊的弥散状条带。DNA电泳法是判断细胞凋亡的经典方法. PEG6000 诱导的小麦叶片[7] 、羟自由基诱导的烟草细胞[8] 、细胞色素c诱导的胡萝卜和烟草原生质体[9] 和乙烯诱导的胡萝卜原生质体[10]发生PCD 时均检测到DNA 梯状条带。

(2) 流式细胞仪检测法。细胞发生凋亡时， 其细胞膜的通透性增加， 但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间， 利用这一特点， 被检测细胞悬液用萤光素染色利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞萤光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

( 3 ) 原位末端标记法( In Situ End2L abeling，ISEL )。通过DNA 多聚酶I 把已标记的核苷酸结合到DNA 的单链断裂处， 以寻找有无Ap 发生。标记的方法有同位素标记、荧光素标记、地高辛或生物素标记等。

(4) 原位切口平移法( In Situ N ick T ran slat ion， IS2N T )。利用DNA 多聚酶将核苷酸整合到Ap 细胞内断裂的DNA 3′羟基末端， 同时水解5′末端，以修复DNA。若用已标记的核苷酸， 即可显示出有断裂DNA 的细胞。该法同样也可用于细胞悬液中Ap 的观察。

( 5) 末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT 2m e2diated X2dU TP n ick end labeling， TUN EL )。末端转移酶(TdT ) 介导的X2dU TP 缺口标记法是目标原位检测Ap 最为敏感、快速、特异的方法， 其具有广泛的应用前景。末端转移酶(TdT ) 可催化在DNA 片段的3′羟基末端合成多核苷酸聚合物的反应， 即DNA 片段加尾。利用末端转移酶(TdT ) 将标记的脱氧核苷酸转移到DNA 缺口或3′羟基末端上， 通常所用的核苷酸为dU TP， 标记物为地戈辛、生物素、荧光素等。

(6) EL ISA 法。对Ap 细胞内DNA 片段的检测还可用EL ISA 法。悬浮细胞经裂解， 高速离心去除核的成分后， 取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板， 反应后再加酶标抗DNA 抗体， 若上清中含断裂的DNA片段， 则可通过此双抗体夹心法得以检出[11]。

3 植物发育过程中的细胞凋亡

萌发的种子中的糊粉层、维管束的木质部、生殖器官的组织(如花药和子房)及根冠等组织中均有细胞凋亡的发生[12]。虽然在细胞水平上， 与细胞凋亡相关联的水解酶的激活、一些蛋白的失活以及核DNA的断裂都可以经常观察到， 但是这些现象的发生机制到近来才有所了解。

3.1 导管的形成

导管是由排列有序的死亡的导管分子(tracheary elements， TEs)构成。王雅清和崔克明[ 13 ]对杜仲木质部导管分化的研究证明，其分化过程也发生了细胞凋亡。所有这些研究都表明木质部导管分化与细胞凋亡有密切关系。玉米生长过程中在一定条件下根部皮层细胞崩溃死亡形成通气组织， 而通气组织与植物的同化、呼吸、蒸腾作用都有密切关系[14 ].

3.2 单性花的形成

许多单性花植物在花原基分化时存在雌蕊和雄蕊原基细胞，在后期发育的特定阶段雌蕊或雄蕊原基细胞出现细胞凋亡，从而最终形成单性花。

3.3 大、小孢子的形成和发育

大多数种子植物中， 大孢子母细胞减数分裂形成4 个大孢子。仅有1 个能发育成雌配子体， 其余的3个大孢子退化。例如， 蕨类植物大孢子母细胞减数分裂产生4个大孢子， 这4个大孢子通常呈线型或T型排列， 仅有1个能继续发育成雌配子体， 其余3个都死亡。对其超微结构的研究表明，其退化解体过程也符合细胞凋亡的基本特征[15] 。

3．3 雌雄配子体的发育

植物中雌雄配子体的发育有细胞凋亡参与其中。裸子植物雄配子体发育过程中， 原叶细胞的退化和雌配子中颈细胞、腹沟细胞的消失及珠心细胞的衰退也是细胞凋亡的结果。在被子植物雌配子体(胚囊)发育过程中，珠心组织被作为营养物质吸收而退化的过程是细胞凋亡[16].

3．4 胚的发育

在胚性细胞分化和发育过程中，存在着细胞凋亡[17]。植物的胚由受精卵发育而成， 在胚的形成过程中，助细胞、反足细胞和胚柄细胞都因发生细胞凋亡而消失。胚柄由受精卵第一次分裂形成，当胚发育到一定阶段，胚柄发生细胞凋亡， 形态上表现为质壁分离， 原生质体固缩。单子叶植物的种子中， 在胚和胚乳之间有一层或几层排列整齐的糊粉层细胞， 含大量糊粉粒。胚胎发育早期由胚柄提供营养形成种子， 后期则通过糊粉层细胞形成分泌组织， 分泌水解酶， 水解胚乳成分， 种子萌发后， 糊粉层功能完成， 便开始凋亡，是典型的细胞凋亡。在种子萌发过程中，其他胚乳和无胚乳种子子叶中一些贮藏细胞也会发生类似的细胞凋亡， 没有这些细胞凋亡，幼苗就不能正常生长发育， 会因饥饿而死亡。

3.5 根冠细胞的死亡

根冠位于根尖的顶部，是由许多薄壁细胞组成的冠状结构。在根的发育过程中，根冠细胞不断脱落，并由顶端分生组织不断产生新的细胞，从内侧补充使根冠细胞得以保持定数。对根冠细胞脱落的研究证明，其脱落过程是典型的细胞凋亡。正是这些细胞的主动死亡，才保证了根顶端分生组织在生长过程中避免与土壤磨擦而受伤，进而保证了根的正常发育。对玉米根尖进行低温胁迫或用细胞毒素类药物如放线菌D、秋水仙碱处理后，这些根尖分生组织细胞同样具有DNA ladder、染色质和细胞核浓缩等特征，说明环境因子和药物也可诱导根尖细胞发生凋亡[19.20] 。

3. 6 　叶发育过程中的细胞凋亡

在叶子的发育过程中，叶缘的各种裂、齿和叶片中的空洞(如龟背竹叶片) 的形成等都是由于相关部位细胞的凋亡所造成的。此外，对叶片衰老过程的研究发现，衰老起始时，叶绿体首先被自体吞噬，此后水解酶、RNA 酶等活性上升，而且以液泡内半胱氨酸蛋白酶活性最为显著[21 ] ，这些都是细胞凋亡的特征。因此，叶子脱落前叶片的衰老过程也是PCD。

4　环境胁迫诱导的植物PCD

4. 1 　植物超敏反应中的PCD

超敏反应(hypersensitive response HR) 是植物被病原物侵染后所引起的适应性反应，其中的细胞死亡被证明是细胞凋亡。在植物超敏反应中，DNA 片段化，特征性切割核小体的核酸酶被激活等生理生化特征和凋亡小体等形态特征都被证实。 转贴于

4. 2 　盐胁迫诱导的PCD

无机盐KCN、NaCl 、CaCl2 和一些重金属离子等在一定条件下均可诱导植物细胞出现与动物细胞凋亡类似的特征。宁顺斌[22]等人的实验证明烟草、玉米的根尖在高盐(NaCl 500mmol/ L)处理后，出现明显的DNA 梯状电泳图谱。林久生和王根轩[23]用20%PEG溶液(-0.63 MPa)对小麦根系进行渗透胁迫，在小麦叶片DNA琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到明显的梯状DNA 条带，表明PEG处理诱发了DNA核小体间的断裂，末端脱氧核糖核酸转移酶介导的3’OH末端标记法(TUNEL)检测出现阳性结果。

4. 3 　活性氧与植物细胞凋亡

活性氧是一类具有强氧化能力的物质，主要包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基等，各种逆境条件，包括冷害、渗透胁迫、低氧、臭氧、紫外线等导致的植物细胞凋亡最终都与活性氧的产生有关。当细胞外一些信息如辐射、高温等通过细胞活性氧传入细胞引起其脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达时，细胞也会凋亡[24]。陈明等[25]研究发现以一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)处理小麦可以明显提高ROS 清除酶，如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等活性，从而清除因盐胁迫产生的氧自由基或活性氧ROS，或直接清除ROS来保持细胞处于还原状态。

5　研究植物细胞凋亡的意义及展望

导管细胞的退化死亡、筛管细胞原生质的自溶，形成了植物体的输导组织;这些细胞死亡之前，细胞内物质可被其他细胞回收利用，这是植物能够独立营养的一个特性，叶片衰老死亡即是适应营养重新分配的结果，但这个过程却影响了农产品的产量。因此，要搞清植物细胞凋亡的发生程序，对粮食生产及作物储藏技术改良都具有重要的现实意义。在超敏反应中，被病原体感染的宿主细胞采取主动死亡的方式，从而限制感染部位病原菌的生长，阻止病原菌的传播，以达到防病抗病的目的。这种植物自身的主动抗病反应，若在植物抗病育种中加以应用，使植物能够自动、有效地抵抗病原物的侵染，就可以减少农药的使用，避免环境污染，从而提高人类生活质量。

由于植物细胞凋亡的同步性很低、凋亡时间很短，同时由于细胞内各种因子相互作用，调控机制及其复杂，使分子生物学技术应用于细胞水平的研究存在很大困难。近年来，利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式的建立和应用弥补了上述不足。有研究表明[26]，利用非细胞体系研究细胞内复杂的生化活动具有独特的优越性，在细胞周期调控、DNA 复制、核小体与染色质构建等研究中发挥了重要作用。非细胞凋亡体系的建立与利用，在很大程度上促进了人们对植物细胞凋亡生化和分子机制的研究，为植物细胞凋亡研究开辟了新途径。

随着植物细胞凋亡的研究的逐步深入，发现植物细胞凋亡需要研究的方面还很多。植物体发生细胞凋亡的机理还不清楚，植物细胞中与细胞凋亡有关的基因研究还远没有动物深入。尽管许多实验表明植物细胞凋亡与动物是相似的，但分子水平共同特征少，目前仅发现少数几个基因参与植物细胞凋亡的过程[27] 。研究过程中常局限于某一特定现象，很少有将这些现象和植物发育的具体过程联系起来，加上植物生长周期较长，给研究带来一定困难。植物细胞凋亡的研究如果能与植物的经济利用联系起来，将具有重要实践价值。如能发现诱导果实发育中细胞凋亡发生的因子，通过人为调控，改变生长发育期，提高果品产量和品质，则将会极大地推动果树现代化生产的发展。

参考文献

[ 1 ] 张亚历等. 编程性细胞死亡及研究方法[J ] . 细胞生物学杂志，17 (3) :127 - 128.

[2] 蒋争凡，翟中和. 细胞凋亡[J ] . 科学通报，1999 ，44 (18) :1 920 - 1 928.

[ 3 ] 宝福凯. 编程性细胞死亡的研究现状及展望[J ] . 1995 年，细胞生物学杂志，17 (3) :122 - 126.

[4]杨帆，王文亮，王伯云. 细胞与分子免疫学杂志，1997，13（1）：8—9

[7]林久生，王根轩. 渗透胁迫诱导的小麦叶片细胞程序性死亡. 植物生理学报，2001 ，27 :221～225.

[8]夏慧莉，陈浩4 华志明，陈睦传，沈明山. 生物工程进展，1998，18（3）：32—36

[9]孙英丽，赵　允，刘春香，翟中和. 细胞色素c 能诱导植物细胞编程性死亡. 植物学报，1999 ，41 :379～383.

[10] 周　军，朱海珍，姜晓芳，戴尧仁. 乙烯诱导胡萝卜原生质体凋亡. 植物学报，1999 ，41 :747～750.

[ 11 ] 　张伟成，严文梅，娄成后. 小麦衰退珠心中解体原生质体向胚囊的迁移及其对增殖中反足细胞的哺育[J ] . 植物学报，1984 ，26 (1) :11221.

[ 12 ] 郭小丁. 植物细胞的编程性死亡[J ] . 1998 年，植物学通报，15 (5) :40 - 43.

[ 13 ] 　王雅清，崔克明. 杜仲次生木质部导管分子分化中的程序性死亡[J ] . 植物学报，1998 ， 40 : 1 102 - 1 107.

[ 14 ] 华志明，陈睦传，沈明山. 细胞生存与死亡的社会控制[J ] . 1998 年，生物工程进展，18 (3) :32 – 36

. [15 ] 　陈朱希昭，陈耀堂，高信曾. 太谷核不育小麦花药组织和小孢子发生的超微结构研究[J ]1 植物学报，1984 ， 26 :235 – 240

[ 16 ] 　尤瑞麟. 小麦珠心细胞衰退过程的超微结构研究[J ] . 植物学报，1985 ， 27 : 345 - 353.

[ 17 ] 　邢更妹，李杉. 植物体细胞胚发生中抗氧化系统代谢动态和细胞程序性死亡[J ] . 生命科学，2000 ，12 (5) :214 - 216..

[ 19 ] 　宁顺斌，宋运淳，王玲，等. 低温胁迫诱导玉米根尖细胞凋亡的形态和生化证据[J ] . 植物生理学报，2000 ，26 (3) :189 - 194.

[ 20 ] 　宁顺斌，宋运淳. 药物诱导的玉米根尖细胞凋亡[J ] . 植物学报，2000 ，42 (7) :693 - 696.

[ 21 ] 　杨征，蔡陈凌，宋运淳. 植物细胞凋亡研究进展[J ] .生物化学和生物物理进展，1999 ，26 (5) :4392443

[22] 　宁顺斌，宋运淳，王玲等. 盐胁迫诱导的植物细胞凋亡———植物抗盐的可能性生理机制[J ] . 实验生物学报，2000 ，33 (3) :6132623.

潘建伟， 陈虹， 顾青 (2002) 环境胁迫诱导的植物细胞程序性死亡. 遗传， 2 4 : 385-388

[23] 林久生， 王根轩. 渗透胁迫诱导的小麦时片细胞程序性死亡. 植物生理学报 ， 2001， 27(3): 221~225

[24]吴　逸，戴尧仁. 羟自由基诱导烟草细胞凋亡.植物生理学报，1999 ，25 :339～342.

[25] 陈　明， 沈文飚， 阮海华， 等. 一氧化氮对盐胁迫下小麦幼苗根生长和氧化损伤的影响. 植物生理与分子生物学学报， 2004， 30(5): 569~576

细胞生物学的研究方法篇4

【关键词】 三维细胞培养； 肿瘤球聚体； 生物材料； 药物筛选

【Abstract】 Three-dimensional cell culture in vitro can not only simulate the microenvironment of intercellular signal transduction between cells and extracellular matrix， but also can reproduce the conditions in cell culture. In recent years， three-dimensional cell culture technology has increasingly widely used in biomedical research， which becomes a powerful tool for drug toxicity assay， tumor multi-drug resistance， high-throughput screening of anticancer drugs and drug metabolism. In this paper， we give a brief review of their latest research progress on construction of three-dimensional tumor spheroid in vitro.

【Key words】 Three-dimensional cell culture； Tumor spheroid； Biomaterial； Drug screening

First-author’s address：He’nan Shuguang HZK Biological Technology Stock Co.，Ltd，Luohe 462332，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.050

细胞的生长环境和培养条件对细胞特定基因的表达及细胞的生物学行为能产生极大的影响，如细胞极性、结构、迁移、侵袭等[1-2]。目前，肿瘤的体外研究依然主要依靠肿瘤细胞的单层平面培养，然而传统单层培养的细胞无论是在形态、结构和功能等方面都与在体内自然生长的细胞有很大的差别，其无法真正反映体内呈三维状态生长的肿瘤。因此，在体外建立适合细胞和组织生长的生理微环境的三维细胞培养体系可方便地用于肿瘤侵袭和转移研究以及药物筛选的体外研究[3-5]。这种特定的类似组织样的三维微空间结构可以为体外生长的细胞提供类似体内生长环境的生物支撑或基质，建立细胞间及细胞与胞外基质间的相互联系。

由于在模拟细胞与细胞间、细胞与细胞外微环境相互作用方面的独特优势，近年来，三维细胞培养在肿瘤体外研究中获得广泛应用，成为肿瘤耐药、药物载体、药物毒理、肿瘤治疗、血管形成、信号转导、干细胞等方面研究不可或缺的有力工具[6-13]。特别是在抗肿瘤药物筛选方面，体外构建三维肿瘤球聚体与动物移植实体瘤模型相比，具有可重复性强、缩短研究时间、降低成本方面的优点，更不致引起动物伦理方面的争议。因而，在肿瘤体外研究中，体外构建三维肿瘤球聚体越来越受到研究者的青睐。

1 体外构建三维肿瘤球聚体主要方法

1.1 多孔支架培养法 体外二维培养肿瘤细胞很难聚集形成球状体，最初一些研究小组开发了支架培养肿瘤细胞成球，这种培养方法是利用体外肿瘤球状体可由生长在预制支架上的肿瘤细胞产生，细胞吸附和移居在缠绕的纤维上，随着细胞的分裂，它们填充支架内的间隙，这样会形成三维球状体[14-15]。不过支架的组成成分会对培养细胞的性能有很大的影响，目前，最常用的支架是胶原，此外，细胞外基质蛋白（ECM）也经常一起使用，同时，辅以必要的生长因子，这能增加细胞生长和含有其他调节因子的可能性。支架也可以用原代细胞和小片组织灌输。这种方法是较早、最常用、也是研究得最多的一类。

1.2 旋转培养法 在旋转培养出现以前，三维细胞培养都是静态培养，静态培养不利于营养物质和代谢废物的运输，妨碍肿瘤实体瘤的生长，为了解决这方面的不足，后来许多研究小组开发了动态培养方法如旋转烧瓶、滚筒试管、回转振荡器等[16-18]。其中美国NASA开发的旋转细胞培养体系是最有效的旋转培养装置，其工作原理是：凭借模仿微重力，保持细胞在动态流体中。培养器皿整体沿着它的水平轴旋转，以便上下颠覆混合细胞。借助于容器内被介质完全填满，能使流体冲击力和剪切力降到最小，通过半透膜能对培养瓶通气，而且半透膜能通过水动力排除气泡。这种培养系统的优点是：成功地实现了三维基质相互作用，但剪切力却较低。它提供了具备物质运输静态的三维球状体培养的环境。这种方法应用较为广泛，但构造较为复杂，实现起来比较繁琐，这一定程度上影响了其应用。

1.3 磁悬浮培养法 在磁悬浮培养提出以前，虽然蛋白质凝胶培养、转动生物反应器培养的多种三维培养方法。但这些方法操作起来有一定难度，而且生物可降解多空支架能使细胞增殖和细胞相互作用延迟的缺点，在实际中未能广泛应用。因此开发一个可操作性强的三维培养技术，仍是非常需要的。后来，有学者提出三维磁悬浮培养方法，这种方法的原理是：依靠磁铁的磁力和细胞的悬浮[19]。噬菌体、磁性四氧化三铁以及金纳米颗粒形成水凝胶，细胞摄取水凝胶，在培养器皿盖上面放一块磁铁，这样培养液处在磁铁的磁场当中，四氧化三铁被磁化，细胞将自动吸附聚集在一起形成球体。这种技术的优点是金噬菌体水凝胶生物兼容性好。所以，这种技术可替代生物可降解多空支架和蛋白质基质培养等技术。细胞培养的实验结果证实这种方法更能维持培养细胞的体内生理、形态等特性。这种方法具有较大的应用潜力。

1.4 纳米印迹培养板培养法 随着研究工作的深入，各种三维培养基质不断出现，如被琼脂、胶原包被的塑料基质，不过这些介质不能保持细胞在体内的增值、生存活性、均一等特性。而且这些介质对显微成像和光谱光度检测产生影响。有学者开发了一种用纳米压印技术形成的无机纳米级支架培养方法[14]。这种培养方法是利用纳米印迹技术把纳米级直角坐标网格式压印在合成树脂底部，其优点是：减少了细胞与基质的直接接触，避免了对细胞生化和生理特性的影响，也能维持细胞的增殖和存活率，便利了三维球体的形成，而且形成的肿瘤细胞球与体内形成的比较类似。也便于显微观察和光谱光度测量。这种方法简便易行、可操作性强，受到不少研究者的青睐，但所形成细胞球的体积有限。

1.5 实体瘤芯片 在实体瘤芯片开发以前，常规悬挂滴注培养被广泛地用于癌症生物医学研究中的三维肿瘤实体瘤构建。但这种用这种方法形成的肿瘤球体需要抽取，之后需转接入其他培养装置中进行灌注培养，为了解决这个问题，后来开发了许多微流体球芯片，但这些芯片有的是静态培养，有的虽然是灌注培养，但需要笨重的流体泵[20-22]。最近，Taeyoon小组开发了一种实体瘤芯片，这种芯片能进行自动介质滴注 [23]。其工作原理是：培养液由滴注分配层滴入，待达到一定的平衡液面，培养废液从排水口排出。该方法设计巧妙、结构简单、经济实用，是目前研究的热点。

2 三维肿瘤球聚体的应用

三维细胞培养技术以其具有模拟体内微环境、较真实再现其功能的优势，现已在生物医学领域中广泛应用，近年来，分子生物学、生物力学、生物材料学、生物化学等诸多学科与组织工程学的不断融合促使体外细胞三维培养技术不断发展完善，培养条件逐渐接近体内环境，使目的细胞的结构和功能更接近体内状况。针对当前抗肿瘤药物筛选中，开大周期长、效率低、投入大等问题，根据具体情况，结合文中提到的这些方法可初步用于药物筛选的三维肿瘤模型及其芯片化装置。如以生物大分子（如蛋白质、多糖等）为主要原料的设计制备细胞培养三维支架方法；研究支架材料负载生物活性物质和支架材料的物理化学修饰对肿瘤细胞生长微环境和实体瘤形成的作用，并初步构建芯片器官综合体（或称芯片人体）中的芯片肿瘤组织单元，揭示肿瘤发生、转移的规律。发展体外自组织形成肿瘤细胞三维球聚体的新方法与新技术，研究肿瘤干细胞小生境的形成规律；发展体内实体肿瘤组织直接在体外培养的新方法与新技术，用于芯片恶性肿瘤模型的构建，研究其生物学特征，并可逐步用于抗肿瘤药物的大规模筛选与评价。

3 展望

体外肿瘤细胞三维培养模型已经从早期的支架培养、旋转培养、磁悬浮培养，发展到实体瘤芯片[24-26]，已广泛应于抗肿瘤药物筛选研究中，其应用价值逐渐被研究者认同。可以预见通过这些方法构建的各种肿瘤模型将会与其他人体器官芯片（如：肝脏芯片、肺脏芯片、肾脏芯片等）整合在一起，为药物筛选及个体化诊疗提供依据[27-30]。同时，将会更有力的推动药物的研发。目前的迫切任务是规范这些研究所用的实验方法并探索实践新的技术方法，使其能被大多数研究机构接受。此外，还需进一步证实其可信性，以此获得管理部门的认可。此外，未来肿瘤细胞三维培养技术要求生物材料除了具有化学和工程学的功能以外，还需具有系统性的可控性，为生物医学研究提供具有良好功能的细胞、功能性三维组织、乃至功能性三维器官，满足大规模药物筛选的需求。

参考文献

[1] Jacquemet G，Humphries M J，Caswell P T.Role of adhesion receptor trafficking in 3D cell migration[J]. Current opinion in cell biology， 2013， 25（5）：627-632.

[2] Kimlin L C，Casagrande G，Virador V M.In vitro three-dimensional （3D） models in cancer research： an update[J].Molecular Carcinogenesis，2013，52（3）：167-182.

[3] Perche F，Torchilin V P. Cancer cell spheroids as a model to evaluate chemotherapy protocols[J]. Cancer Biology & Therapy， 2012， 13（12）：1205-1213.

[4] LaBarbera D V，Reid B G，Yoo B H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery[J]. Expert Opinion on Drug Discovery， 2012， 7（9）：819-830.

[5] Karlsson H. Loss of cancer drug activity in colon cancer HCT-116 cells during spheroid formation in a new 3-D spheroid cell culture system[J]. Experimental Cell Research， 2012， 318（13）：1577-1585.

[6] Jang K.Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2008， 390（3）：825-832.

[7] Hartman O. Microfabricated electrospun collagen membranes for 3-D cancer models and drug screening applications[J].Biomacromolecules，2009，10（8）：2019-2032.

[8] Goodman T T，Ng C P， Pun S H. 3-D Tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers[J]. Bioconjugate Chemistry， 2008， 19（10）：1951-1959.

[9] Prestwich G D. 3-D culture in synthetic extracellular matrices： new tissue models for drug toxicology and cancer drug discovery[J]. Advances in Enzyme Regulation， 2007， 47（2）：196-207.

[10] Biskup B. Diel Growth cycle of isolated leaf discs analyzed with a novel， high-throughput three-dimensional imaging method is identical to that of intact leaves[J]. Plant Physiology， 2009， 149（3）：1452-1461.

[11] Seano G. Modeling human tumor angiogenesis in a three-dimensional culture system[J]. Blood， 2013， 121（21）：E129-E137.

[12] Luca A C. Impact of the 3D microenvironment on phenotype， gene expression， and egfr inhibition of colorectal cancer cell lines[J].Plos One，2013， 8（3）：201-203.

[13] Wang W. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells[J]. Biomaterials， 2009， 30（14）：2705-2715.

[14] Yoshii Y. The use of nanoimprinted scaffolds as 3D culture models to facilitate spontaneous tumor cell migration and well-regulated spheroid formation[J]. Biomaterials， 2011， 32（26）：6052-6058.

[15] Breslin S， O'Driscoll L. Three-dimensional cell culture： the missing link in drug discovery[J]. Drug Discovery Today， 2013， 18（5-6）：240-249.

[16] Achilli T M， Meyer J， Morgan J R. Advances in the formation， use and understanding of multi-cellular spheroids[J]. Expert Opinion on Biological Therapy， 2012， 12（10）：1347-1360.

[17] Xu X. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer， hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids[J]. Biomaterials， 2012， 33（35）：9049-9060.

[18] Goodwin T J.Reduced shear stress： a major component in the ability of mammalian tissues to form three-dimensional assemblies in simulated microgravity[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 1993， 51（3）：301-311.

[19] Souza G R. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation[J]. Nature Nanotechnology， 2010， 5（4）：291-296.

[20] Pampaloni F， Reynaud E G， Stelzer E H K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2007， 8（10）：839-845.

[21] Lee P J，Hung P J，Lee L P. An artificial liver sinusoid with a microfluidic endothelial-like barrier for primary hepatocyte culture[J]. Biotechnology and Bioengineering， 2007， 97（5）：1340-1346.

[22] Zervantonakis I K. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments[J]. Biomicrofluidics， 2011， 5（1）：25-26.

[23] Kim T， Doh I， Cho Y H. On-chip three-dimensional tumor spheroid formation and pump-less perfusion culture using gravity-driven cell aggregation and balanced droplet dispensing[J]. Biomicrofluidics， 2012， 6（3）：21-22.

[24] Huh D， Hamilton G A， Ingber D E. From 3D cell culture to organs-on-chips[J]. Trends in Cell Biology， 2011， 21（12）：745-754.

[25] Kim H， Phung Y，Ho M. Changes in global gene expression associated with 3D structure of tumors： an ex vivo matrix-free mesothelioma spheroid model[J].Plos One， 2012， 7（6）：78-79.

[26] Huang K Y. Size-dependent localization and penetration of ultrasmall gold nanoparticles in cancer cells， multicellular spheroids， and tumors in vivo[J]. Acs Nano， 2012， 6（5）：4483-4493.

[27] Imura Y， Sato K， Yoshimura E. Micro total bioassay system for ingested substances： assessment of intestinal absorption， hepatic metabolism， and bioactivity[J]. Analytical Chemistry， 2010， 82（24）：9983-9988.

[28] Ma L. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system[J]. Biomaterials， 2012， 33（17）：4353-4361.

[29] Das T. Empirical chemosensitivity testing in a spheroid model of ovarian cancer using a microfluidics-based multiplex platform[J]. Biomicrofluidics， 2013， 7（1）：23-24.

细胞生物学的研究方法篇5

关键词:生物色谱法;中药;分子生物色谱法;仿生物膜色谱法;生物膜色谱法

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0144-04

随着近代科学的发展,在单味中药的化学分离、质量控制、真伪鉴别、化学成分定性定量分析等方面的研究已有一定的基础。色谱是中药化学研究不可或缺的分离分析手段。但中药的常规色谱分离分析模式如气相色谱、液相色谱等都是基于中药成分物理化学水平上分子作用力的差别,只是作为分离的工具,不可避免地存在以下缺陷[1]:(1)在化学成分分离过程中无法给出药理参数的基本信息;(2)一些无药理作用的成分有可能严重地干扰有效成分的分离分析;(3)液相色谱进行中药指纹图谱分析耗时过长;(4)指纹图谱中仍可能有许多没有获得有效分离的中药组分。而将色谱分离与分子生物医学二者紧密结合起来的分子生物技术的新成果――生物色谱法,有可能为中药活性成分的分离分析、结构鉴定、中药的质量控制和中药药理作用机理的研究提供新的技术和手段。本文主要针对目前常见的几种生物色谱法及其在中药领域的应用进展作以综述。

1 生物色谱的种类及其应用

生物色谱法(Biochromatography)于20世纪80年代中后期出现,是由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术,它是采用各种具有生物活性的材料例如酶、细胞膜、仿生物膜、活细胞、细胞壁等做固定相。由于这种具有生物活性的固定相能特异性地结合与人类生命活动有关的各种生物活性物质,所以在医学和药学研究领域中可以利用生物色谱技术,分离和制备各种具有生物效应的物质[2]。目前,生物色谱法主要采用活性生物大分子、活性细胞膜(或仿生物膜)、活细胞等键合在色谱载体上,因此,根据固定相的不同,生物色谱法的相应种类有分子生物色谱法、生物膜色谱法[3]、仿生物膜色谱法、细胞生物色谱法等[4]。

1.1 分子生物色谱法

分子生物色谱法是一种较成熟的生物色谱技术,是目前唯一能对中药活性成分筛选、分离和结构鉴定进行一体化分析的新技术。它是基于生物大分子的特异性相互作用,分离纯化和测定具有活性的化合物和生化参数,即以酶、受体、DNA、血浆中的运输蛋白和其它具有重要生理功能的生物大分子作为分子生物色谱的配基,开展药物活性成分研究。

分子生物色谱技术应用于中药活性成分筛选主要是在两个层面上进行,首先以血液中存在的运输蛋白为靶体进行活性成分的粗筛选和质量控制;然后以特异性靶体筛选具有特定活性的物质。在技术发展上,建立以分子生物色谱为核心、与NMR、MS等可提供结构信息的手段联用的一体化系统,使活性成分筛选、分离以及结构鉴定一体化成为可能,而目前其他筛选方法尚无这一可能性[5-6]。其中以血浆中两种主要的载体蛋白即人血清白蛋白(Human serum albumin,HAS)和α-酸性糖蛋白(alphal-acid glycoprotein,AGP)为固定相较为常用[7]。wang Y等[8]采用综合的二维生物色谱法,即结合使用硅胶键合人血清白蛋白(HSA)柱和反相HPLC柱,用于分析中药龙胆泻肝汤(LXD)中生物活性成分的生物指纹图谱。首先采用人血清白蛋白为固定相的生物色谱来研究LXD中的多组分与血清白蛋白的相互作用,进而采用结合在线和离线硅胶柱分离HAS中活性成分。最终LXD中超过100种的成分被分离和分析,其中19种成分依据保留时间,紫外光谱性质,分子量和质谱图的不同而被鉴别。由此表明此色谱法可用于中药

复方中生物活性成分的指纹图谱的分析。

1.2 生物膜色谱法

生物膜色谱法以人或动物的活性细胞膜为固定相,是研究药物与细胞膜、膜受体、酶相互作用的理想技术。其中的细胞膜色谱法(cell membrane chromatography,CMC),由于细胞膜是生物效应靶点最集中的部位,因此,CMC体系实质上是一种新型的具有生物活性的亲和色谱系统。CMC法中的细胞膜固定相具有细胞膜活性和色谱分离的双重特性,由CMC模型获得的色谱保留参数与药物的药理作用密切相关,对药物异构体有识别能力[9]。

生物膜色谱法一般先通过膜制备,将细胞膜固定于活化的硅胶载体表面,制成细胞膜固定相(cell membrane stationary phase,CMSP),其中CMSP可由各类组织细胞[10]、原代培养细胞、分离细胞或细胞系等获得,受体或受体亚型高表达细胞在CMSP很常用。然后将溶解有化学成分的流动相注入CMSP中,根据待选物在CMSF内的保留特性(容量因子k),即可以估算出该化合物与膜受体的亲和力。在CMSP内可同时进行药物分离和活性筛选,并进行药物鉴定。因此CMC技术有望实现中药的高通量筛选。中药提取物进入CMSP后,具有活性的化学成分或化学成分群(有效部位)被色谱柱保留,且可将他们洗脱下来进行化学分析和鉴定,而无活性部位则流出。利用CMC对复杂体系、混合物,特别是中药提取物的分离和筛选研究具有独特的优势,因此把每个细胞膜色谱柱看成是中药的高通量筛选平台,那么每味中药就可作为一个未知的化合物库,许多各种类型的细胞膜色谱柱组成中药高通量筛选系统[11]。CMC是研究受体与药物相互作用的新型亲和色谱技术,该技术将高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学相结合,利用药物与膜受体间存在的特异性亲和力,成功地将药物体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟[12-14]。

张宇洁等[15]用兔血红细胞膜固定相,以阿霉素为对照药物,筛选长春七中与红细胞膜及膜蛋白有亲和作用的活性成分。实验表明,红细胞膜色谱法筛选结果与药理作用之间存在较好的相关性。因此,可以利用此模型对大量的天然药用植物进行快速筛选,以促进细胞毒性候选药物的开发。朱荃[16]采用红细胞膜固相化当归提取液的成分,得到了洋川芎内酯等化合物,细胞药理学研究证实,洋川芎内酯等化合物具有提高红细胞变形能力,降低红细胞聚集的作用。用血小板细胞膜固相化丹参注射液中的成分,得到了原儿茶醛、绿原酸类等一群化合物,该群化合物可以抗血小板聚集,可以抵抗对于内皮细胞的损伤。结果提示,细胞膜固相色谱是一个快速、简便、高效的中草药药效物质基础的研究技术。樊宏伟等[17]应用血小板细胞膜作为固定相,选择性地结合脉络宁注射液中的活性成分,排除未与血小板靶点结合的非活性成分后,使细胞膜靶点失活,被结合的活性成分从血小板膜上释放出来,样品经固相萃取处理后用HPLC对这些成分进行分析,利用制备色谱得到筛选出的活性成分。结果血小板细胞膜固相色谱法可以进行抗血栓栓塞性疾病血管内给药制剂活性成分的筛选,同时反映了化合物与细胞膜生物靶点即受体、通道、酶等的作用强度。另外,岳宣峰等[18-19]用细胞膜色谱模型筛选了川芎、竹根七等中的活性成分。

1.3 仿生物膜色谱法

仿生物膜色谱法以脂质体、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等为固定相配基,能够模拟生物膜的脂质双层结构,可以用来分离酶、蛋白质,研究药物透过生物膜的过程,预测药物的活性参数,或在仿生物膜中嵌入各种配基以实现特定的色谱目的。脂质体(1iposome)[20]又称为磷脂囊泡(vesicle),是由天然磷脂形成的微球,具有与细胞膜相似的脂质双层结构和生物膜的流动性特征。这种人工模拟的生物膜体系不仅可以精确地模拟生物膜的化学环境,而且其物理性能也可以通过调节温度、pH、离子等得到有效控制。脂质体被视为最接近天然生物膜的简单理想的模型,并以毒性低、制备简单、可使药物包裹入脂质双分子层、可避免药物的降解、可实现药物靶向给药等特点,而被广泛作为药物载体使用。

胡志雄等[21]通过锆基质与磷脂之间强烈的路易斯酸碱作用,制备了锆基质磷脂膜色谱固定相,并使用红外吸收光谱、X射线光电子能谱(XPS)对该色谱固定相进行了表征;使用与体内环境类似的生理缓冲液体系为流动相,评价了该模拟生物膜色谱固定相预测药物膜渗透性的能力,并采用热力学方法对药物一膜之间的相互作用进行了探讨。结果表明药物在锆镁磷脂膜色谱中的保留与表观渗透率在预测药物的膜渗透性、跨膜吸收等方面具有非常好的相关性。Lepont C等[22]运用磷脂膜作为固定性,在反相液相色谱中保留不同的化合物,结果表明,固定化人工膜(immobilized artificial membrane,IAM)柱的保留性能的重现性较差,但是IAM柱和用于胶束电动色谱的固定相的保留特性密切相关,保留在IAM上具有一些类似生物膜吸收的过程,因此提供了一个更合适的用于物理性质评估的方法,有望采用适当的相关模式来评估某些生物在生物膜分配的特性。张然等[23]研究磷脂膜色谱在新药研发早期阶段的介入可以有效地降低候选药物的淘汰率,提高新药的研发效率。

陈丙銮等[24]分别观察不同溶剂提取时提取液在固定化脂质体色谱(Immobilized liposome chromatography,ILC)色谱柱上的保留与分离,同时对在ILC色谱柱上保留的槲皮素及芹菜素进行了定量分析。实验结果表明,从ILC色谱柱保留峰的数目和峰面积两方面观察,槲皮素和芹菜素是二至丸中主要的、可在ILC色谱上保留的成分,固定化脂质体色谱有望成为中药及其复方肠吸收成分的初筛选和定量评价方法之一。董倩倩等[25]运用平衡透析与高效液相色谱-质谱联用技术对丹参水提液中与脂质体模拟生物膜有相互作用成分进行分析、鉴定。结果丹参水提液中8个成分与模拟生物膜相互作用明显,经在线HPLC―MS分析、鉴定,其中5个成分分别为原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A。表明此方法能方便、有效地预测丹参在体内的吸收情况。

1.4 细胞生物色谱法 细胞生物色谱法是将人或动物的活细胞或者植物的细胞或细胞壁作为固定相,利用细胞的特异性结合能力或细胞壁独特的选择性、通透性,达到目标化合物的分离、富集等目的,它是研究药物与活细胞相互作用的理想技术,也是用于大分子化合物分离的新方法。继Zeng等[26]首次将人红细胞固着在凝胶颗粒中,作为生物色谱的固定相,我国学者吴祥瑞等[27]采用肝细胞固相色谱法,应用活细胞选择性地结合中药提取液中的活性成分,旨在直接取用效应器官的细胞对效应成分进行特异性结合,再进行分析,最后得到实验中所用样品。由于肝细胞上有多种受体,能够特异地、有选择性地与活性成分结合,可以满足中药作用多靶点的活性成分的筛选。成功的寻找到茵陈蒿汤中与肝细胞特异性结合的活性成分并分离提取,首先对其保肝效应进行确认,然后再对其作用机理进行探索。进而观察茵陈蒿汤与肝细胞结合成分对H2O2、CCl4诱导的LO2细胞损伤的影响。因此,直接采用细胞如红细胞、血小板、肝细胞等[28]和中药的提取液在适宜培养基中共同孵育一段时间,利用活性细胞膜固相化中药的成分。

2 生物色谱法的特点

2.1 生物色谱法的优点

生物色谱法是基于生物大分子或者细胞等的特异性相互作用,分离纯化和测定具有活性的化合物和生化参数的新兴技术,是一种体外实验模拟体内条件的筛选模型,它为药物筛选和药物设计提供了强有力的工具。该方法与目前的常用的方法相比有许多优点:(1)细胞膜色谱法是一种新型的亲和色谱法,将其用于新药研究中,具有筛选速度快,效率高,可反映药物分子与蛋白受体作用特性的优点;(2)直接与一些药理学参数如活性或结合强度相关,具有一定的药理学意义;(3)快速简单,可将中药的提取液直接进样,无需预处理、纯化等多个分离步骤,因此分析速度快;(4)生物聚合体稳定,排除了主要的实验误差;(5)能很快获得一组有代表性的药物的可比性资料;(6)可获得大量的没有各自异构体的对映体的资料。尤其适合于天然药物效应物质基础的研究[29]。

2.2 生物色谱法尚存在的不足

尽管生物色谱法前景光明,但目前在其推广和应用方面也存在一些困难:(1)固定化脂质体色谱的应用并不广泛,主要原因是柱子制备比较困难、成本高;(2)高效液相色谱柱常用的硅胶基质及其化学键合固定相的pH使用范围较窄(pH 2～8),色谱柱容易被污染而且很难被再生,流动相需要大量有机溶剂,成本高,并污染环境; (3)多数生物色谱的固定相如酶、细胞膜、仿生物膜、活细胞等,目前实现商品化的不多,需要实验室自己制备,对实验室及操作者的专业技术要求较高;(4)生物色谱柱寿命通常比较短,约在几天到十几天之间;(5)生物色谱柱对流动相缓冲溶液的要求比较苛刻,流动相难以进行灵活地调整;(6)由于中药成分的复杂性、作用的多效性,因此,在高通量筛选活性成分时,存在选择何种效应器官以及选择全面与否的问题;(7)细胞膜生物色谱模型虽然在一定程度上能够反映药物成分与细胞膜的作用情况,但毕竟是一个体外过程,尚不能完全模拟体内复杂环境以及机体内其他系统对中药发挥药效作用的影响,与药效成分在体内的作用相比还有一定距离[30]。

3 结 语

中药的效应-物质基础研究一直是中药研究的重点和难点,中药的物质基础和作用机理的澄清是中药走向国际市场的前提,将色谱技术与生物医学结合起来,可望成为极有发展前景的新方法、新技术,将极大地推动中药研究的水平。生物色谱法重复性好、快速简单、直接与一些化学成分的药理学参数如活性或结合强度相关,在中药活性成分筛选、分离和结构鉴定方面已有较广泛的应用。生物色谱技术不仅可以有效地消除无活性成分对分析结果的干扰,而且还可以大大缩小中药活性成分筛选的范围。但是,多数生物色谱的固定相还没有实现商品化,需要有一定条件的实验室自己制备;色谱柱寿命通常比较短等特点,也限制了其推广和应用。随着技术上的问题不断的得到解决及研究的不断深入,生物色谱技术不久的将来在中药领域的研究,以及在研究药动学、药效学、药物毒性及合理开发新药等领域的应用必将有自己的广阔天地。

参考文献

[1] 裴振华,王华陆.中药研究现状与发展趋势[J].黑龙江医学,2004,28(5):343.

[2] 丁岗,董自波,李智立,等.生物色谱法及其在药物研究中的应用[J].中国药科大学学报,2002,33(4):354-357.

[3] 方艺霖,张艺,肖小河,等.细胞膜色谱技术用于中药活性成分筛选的研究进展[J].中草药,2008,39(7):附3-5.

[4] 金念祖,陆晓和.生物色谱法在中药活性成分筛选中的应用[J].中国生化药物杂志,2003,5(24):123-127.

[5] 邹汉法,汪海林.生物色谱技术分离、鉴定和筛选中药活性成分[J].世界科学技术-中药现代化•基础研究,2000,2(2):9-13.

[6] Wang n,ZOU HF,Kong L,et al.Analysis of bioactive compounds in traditionary Chinese medicines by molecularbiOchromatography alphal-acid glycoprotein as stationary phases[J].Basic Chin Physiol Pharmacol,2000,11(2):155-172.

[7] Ascoli GA,Domenici E,Bertucci C.Drug binding to human serum albumin:abridged review ofresultsobtainedwith high performanceliquidchrOmatographyandcircular dichroi sm[J].Chirality,2006,18(9):667-679.

[8] Wang Y,Kong L,Hu L.Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription Longdan Xiegan Decoction by on/off-line comprehensiVe two-dimensional biochromatography[J].Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,860(2):185-194.

[9] 贺浪冲,袁秉祥,扬广德,等.细胞膜色谱法及其在药学研究中的应用[J].中国药理通讯,2003,20(1):22.

[10] 张典,袁秉祥,邓秀玲,等.药物在大鼠主动脉组织及其培养细胞的细胞膜色谱研究[J].西安交通大学学报(医学版),2008,29(3):275-280.

[11] 袁秉祥,林蓉,贺浪冲.细胞膜色谱――中药复杂体系的新药发现[J].中国药理通讯,2008,25(2):32.

[12] He L C,Wang SC,Geng XD.Coating and fusing cell membranes onto a silica surface and their characteristics[J].Chromatographia,2001,54(1):71-76.

[13] He L C,Yang GD,Geng XD.Enzymatic activity and chromatography characteristics of the cell membrane immobilized on silica surface[J].Chin Sci Bull,1999,44(9):826-830.

[14] 陈婷,周玖瑶,徐贝佳.细胞膜色谱法及其在药理学研究中的应用进展[J].中华中医药学刊,2007,25(5):983-985.

[15] 张宇洁,贺浪冲.用细胞膜色谱模型筛选长春七抑制HeLa细胞增殖的活性成分[J].中国药学杂志,2005,40(6):463-465.

[16] 朱荃.细胞膜固相色谱及其在中药效应一物质基础研究中的应用[J].南京中医药大学学报,2006,1(22):8-13.

[17] 樊宏伟,朱荃,洪敏,等.血小板细胞膜固相色谱法在脉络宁注射液效应物质分析中的应用[J].中国药学杂志,2006,1(4):63-66.

[18] 岳宣峰,张延妮,张志琪,等.心肌细胞膜固定相色谱研究中药川芎提取液与受体的作用[J].中国中药杂志,2005,30(2):130-132.

[19] 蒙麦侠,杨智锋,贺浪冲.竹根七中具有血管生成抑制作用有效成分的筛选[J].中国中医药信息杂志,2008,15(1):46-47.

[20] 孙悦.脂质体在分析化学研究中的应用[J].化学分析计量,2008,17(4):80-82.

[21] 胡志雄,张维农,何海波,等,锆镁磷脂膜色谱固定相的制备及其在评价药物一膜相互作用中的应用[J].色谱,2008,26(5):529-533.

[22] Lepont C,Poole CF.Retention characteristics of an immobilized artificial membi,afie column in reversed-phase 1iquid chromatography[J].Chromatogr A,2002,946(1/2):107-124.

[23] 张然,袁从英,王素敏.新技术拟相生物色谱法研究进展[J].药学学报,2008,43(5):443-449.

[24] 陈丙銮,盛亮洪,李萍,等.固定化脂质体色谱研究二至丸及其组成药物的经肠吸收成分[J].中国临床药理学与治疗学,2006,11(7):776-779.

[25] 董倩倩,李睿岩,李萍,丹参与脂质体模拟生物膜相互作用的研究[J].中国药学杂志,2008,42(16):1208-1212.

[26] Zeng CM,Zhang YX,Lu LL,et a1.Immobilization of human red cells in gel particles for chromatographic activity studies of the glucose transporter Glut 1[J].Biochem Biophys Acta,1997,1325(1):91-98.

[27] 吴祥瑞,洪敏一,华永庆,等.茵陈蒿汤与肝细胞结合成分保肝作用研究[J].中药药理与临床,2007,23(5):11-13.

[28] 闵春艳.茵陈蒿汤肝细胞膜固相色谱研究[D].南京中医药大学硕士研究生论文,2005:46.

细胞生物学的研究方法篇6

【关键词】细胞代谢 代谢性疾病 细胞代谢障碍

【中图分类号】G71 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2012）08-0204-01

要认识细胞和疾病的关系，首先要明确细胞是生命活动的基本单位。细胞作为功能与代谢的基本单位，其具有有秩序的、单独的通过自我控制的复杂代谢体系。在生物有机体进行的一切与生命活动相关的各项代谢活动与执行功能过程中，细胞就作为一个有秩序的、各个细胞独立的、自我控制能力很强的的代谢体系参与到有机体生命活动中。而细胞代谢又是细胞正常生长不可缺少的生命活动。因此细胞代谢与各种疾病的关系也是密不可分的。所以要想研究细胞和疾病的关系必须从细胞的生命活动当中去寻找，首先是细胞的新陈代谢，大约平均每过三个月人体细胞的结构就要更新一次，因而细胞能否正常代谢就决定了细胞更新后的结构是否完整。

疾病和细胞的关系还可以从细胞的结构上去研究，近年来的科学研究发现，人体内的细胞外基质的功能对生物学意义不仅表现在物理学性质和作用上，而且肿瘤的转移、人体的发育、细胞的损伤与修复、免疫应答以及在细胞的分化与移行信号的传导等生理过程和炎症等病理过程中具有重要的功能和作用，最近几年来，细胞外基质与各种临床疾病的关系已经成为各种生物学以及疾病研究的重点对象，细胞外基质的研究也作为细胞生物学与生物学研究的热点越来越受到人们的重视。

研究细胞代谢和疾病的关系也不能落下研究细胞的分化，细胞分化异常就会变成癌细胞，因此就会产生癌症这种骇人听闻的疾病，癌症相信大家都知道，我国每年死于癌症的就有200万人。最后，就像生物体一样，细胞也有衰老和死亡，因此细胞的衰老和死亡也是研究细胞代谢和疾病的关系的一个方面内容，细胞的衰老了就会使使细胞代谢活力下降，因此细胞的生存能力下降，很好理解，细胞生存能力下降，各种功能就不会满足生物体的正常生命活动，必然就会导致疾病，细胞的死亡使正常细胞结构消失、功能异常，也必然导致疾病。

代谢是生物体内一切用于维持生物体各项正常生命活动而进行的各种化学反应的总称。正是由于这些化学反应，生物体或者细胞才能够进行正常的繁殖和生存。代谢可以被认为是生物体不断进行物质和能量交换的过程，生物体的正常生命活动离不开细胞代谢，细胞代谢停止了，生物体内不能进行物质和能量的交换，有用的物质吸收不了，有害的物质排不出去，需要能量的地方没法传送能量，那么生物体的生命迹象就会停止，各种生命活动也会消失，就是我们说的死亡。婴幼儿、青少年正处在长身体过程中，所以在建造自身的机体的时候就需要更多的物质来维持，因此就是说年轻的生物体和细胞的新陈代谢旺盛，有用的物质能很快吸收，有害的物质能很快排除，因此就减少了疾病的发生，另外同化作用也占主导位置。这就是为什么年轻人不容易生病身体健康的原因。然而到了老年和晚年，人体机能渐渐开始退化，同化作用与异化作用都有所下降，细胞新陈代谢也就逐渐缓慢，就和年轻人不一样了，免疫力下降各种疾病就会随之而来。只要是正常的生命活动细胞新陈代谢就不会停止。例如动物的冬眠，虽然它们不进水不进食，但是细胞新陈代谢并未停止，只不过变得比平常的时候缓慢。新陈代谢是生命体不断进行自我更新的过程，如果细胞新陈代谢受到抑制，各种危害我们身体健康的不利因素也就随之而来。而其中最常见的就是代谢性疾病。

代谢性疾病即因代谢问题引起的疾病，包括代谢障碍和代谢旺盛等原因，主要包括以下这些疾病：1.糖尿病；2.糖尿病酮症酸中毒；3.高血糖高渗综合征；4.低血糖症；5.痛风；6.蛋白质-能量营养不良症；7.维生素A缺乏病；8.坏血病；9.维生素D缺乏病；10.骨质疏松症。

细胞代谢受到抑制通常也会引起退化性疾病，按照现在的说法，我们所知道的癌症和不育只是所有退化性疾病中的两种。其它的退化性疾病还包括老年痴呆症、糖尿病、心脏病、肥胖症、高血压、关节炎等等。人类只有一种疾病，那就是细胞代谢障碍或故障。细胞故障可以不同形式和不同程度出现，分布在不同部位，表现为不同症状。当所有细胞代谢正常时，人体处于健康状态。细胞出现代谢障碍有两个根本原因：细胞得不到它所需要的东西（营养不良），或者被它所不需要的东西伤害（毒素超载）。

除了环境突变或发生事故，疾病不会突然出现。生病是一个过程，只有当大量机体细胞（组织）出现故障时，才会在机体组织层面出现明显的病症，或有明显的感觉（不舒服）。例如，肥胖是机体细胞的脂代谢障碍，脂肪代谢障碍也叫脂肪重新分布，由于细胞代谢受到阻碍，你身体生产、利用和储存脂肪就会紊乱。而癌症则是机体细胞的氧代谢障碍。其实癌症并不神秘，由细胞中毒，导致“断迅、缺氧和糖化”产生。中毒使细胞通讯失灵，与免疫系统失去联系，变得毫无目的和不受限制。缺氧使细胞原始化，失去分工，开始像原始细胞那样繁殖。糖化提供了细胞在厌氧状态下复制繁殖所需要的营养。癌症病人通常有接触或摄入化学品、便秘、食欲下降和食用糖或淀粉的历史。2型糖尿病是细胞的糖代谢障碍，实际上是大量机体细胞对胰岛素敏感性的下降，其形成过程需要十到二十年的时间，最终才会出现口渴、饥饿、多尿、消瘦和高血糖。同样的道理，心脏病和癌症的形成通常也需要一二十年的时间。

当细胞被各种重金属、农药、药物或化学品入侵时，细胞核和DNA遗传信息可能就会受到污染而破坏，细胞膜的传送物质能力就会受到抑制，细胞间的通讯就会中断，物质无法传送，就会产生各种疾病。如果由于细胞间的通讯中断，自然细胞和免疫系统就不会产生联系，因此细胞处于原始状态的厌氧细胞在糖的无氧酵解中不受限制，可能发生毫无目的分裂和复制，就会产生癌变。

总而言之，细胞作为生物体的不可缺少的进行生命活动的个体，要想研究疾病就离不开对细胞的研究，疾病中的一切问题最后寻找到根一定是要从细胞中寻找原因。而细胞代谢又是研究各类疾病的有力途径。深入研究学习细胞代谢活动就会寻找出一切致病的原因，疾病的过程，治病的方法，防病的措施。所以对细胞代谢的深入研究一定会找到解决各种疑难杂症的方法，这种研究必将造福全人类。

参考文献：

[1]陈蕾，贾伟平，陆俊茜.《中华心血管病杂志》[J]. 2003第31期34—53

[2]仝小林，段军.《中日友好医院学报》[N] 2002第16期

[3]顾东风，Reynolds K， 杨文杰.《中华糖尿病杂志》[J]. 2005第13期13—21

[4]杜月娟，郑国贤.《中国实用医药》[J]. 2007第12期45—53

[5]李兴杰，陈超. 《生物学通报》[N]. 2009第6期

细胞生物学的研究方法篇7

专利数据时间（以公开年分析）：2002―2011

专利总件数：977，其中发明专利948，实用新型专利28件，外观设计专利1件。无锡专利总件数3件，其中发明专利3件，实用新型专利与外观设计专利均无。（限于我国专利审查程序，发明专利从提出申请到公开需要18个月的时间，实用新型专利从提出申请到授权公告需要1年左右时间，因此2011年的申请量数据只供参考）。

1、申请数量和趋势分析

以公开年分析

2002-2010年无锡市干细胞专利申请数为0，只有在2011年申请数为3件。

分析： 近十年来，我国干细胞专利申请量大体上保持持续增长的态势，在2011年出现了较大增长，相较2010年增加了65件。从图中可以看出，自2009年以来，我国干细胞专利申请量有了明显的增长，这主要是因为2009年国家干细胞工程技术研究中心医学转化基地在上海成立，干细胞技术进入了临床应用阶段，我国也把干细胞研究列入了国家863和973计划。在973计划中，干细胞领域是立项最多的一个。从总体趋势来看，我国干细胞专利申请数量虽呈上升趋势，但干细胞产业化发展在我国刚刚起步，干细胞研究的关键技术也只是在最近5年才取得突破，总体水平偏低。而我市干细胞专利申请只有在2011年为3件，之前为一片空白，且这3件专利为一家公司所有。总体来讲，我市干细胞企业规模较小，发展历程短，竞争力相对较弱，干细胞产业在我市几乎没有基础。只有在近两年，我市共引进8家以“530”企业为主的干细胞研发领域的生物公司，相关研究才开始迅速开展起来。因此，要加快发展我市干细胞产业的步伐，加大推进力度。

3、国省分布状况分析

国内干细胞专利申请主要集中在江浙沪一带及北京、天津、广东等经济较发达地区，这些城市在干细胞投入研究方面起步较早，合资企业也相对较多，掌握了主要的技术市场。相比较，一些中部地区相对发展能力不是很强，技术比较薄弱，企业规模较小，发展历程短，竞争力较弱，需要政府进一步加快干细胞相关技术及基因工程药物科研成果向实际生产力转化，逐步推动形成干细胞研究和产业格局。

自2002年至今，无锡市干细胞专利申请量总共只有3件，且都为无锡人寰生物医药科技有限公司所有，占比为100%。

分析：根据我国干细胞专利申请量排名情况来看，干细胞专利技术基本都被大学、科研院所及医院所持有。截止2010年年底，国家干细胞与再生医学产业技术创新战略联盟成立，由国内27家干细胞与再生医学领域的一流科研院所、知名三甲医院、多家211工程重点高校、行业龙头企业等作为发起单位和理事成员单位。“十二五”规划明确将“干细胞研究、发育与生殖研究”列为六个重大科学研究，并在规划中要求有关单位集中优势力量，推进重大科学研究计划实施。政府还建立了科技部国家干细胞工程技术研究中心、发改委细胞产品国家工程研究中心和湖南长沙人类胚胎干细胞国家工程研究中心三大研究机构，推动干细胞的研究。但我国干细胞产业目前只处于研究起步阶段，现阶段我国干细胞产业领域单位数量不多，具有较大规模较强实力主导品牌单位也只有约10多家左右。与美国等发达国家比，我国干细胞产业投资规模较小，多数单位的干细胞产业与临床应用推广尚处于研究起步阶段。

干细胞产业在我市几乎没有基础，只有在近两年引进了8家以“530”企业为主的干细胞研发领域生物公司以后，相关研究才开始发展起来。2009年在马山成立了无锡国际干细胞联合研究中心，此中心致力于各类干细胞的提取、研究、重大疾病干细胞的鉴定、诊断、治疗和新药开发，推动和参与制定干细胞行业标准，对我市的基础和临床医学研究产生巨大影响和推动作用，标志着我市的干细胞研发和产业发展进入一个新的阶段。

4、IPC分类技术构成及趋势分析

国内IPC主要分布在：

C12N：微生物或酶；其组合物；繁殖，保藏或维持微生物；变异或遗传工程；培养基。

A61K：医用、牙科用或梳妆用的配制品。

A61L：材料或物体消毒的一般方法或装置；灭菌、消毒或空气的除臭；绷带、敷料、吸收垫或外科用品的化学方面；绷带、敷料、吸收垫或外科用品的材料。

A01N：人体，动植物体或其局部的保存；杀生剂，例如作为消毒剂，作为农药，作为除莠剂；害虫驱避剂或引诱剂；植物生长调节剂。

C12M：酶学或微生物学装置。

无锡市干细胞专利IPC分类主要分布在：

A61K：医用、牙科用或梳妆用的配制品。

C12N：酶学或微生物学装置。

无锡市干细胞专利申请集中在A61K和C12N上，技术分布情况与全国技术分布情况相一致，但技术发展方向较单一，我市企业大部分只有几十例临床案例，竞争力相对较弱。

二、国外

专利数据时间（以公开年分析）：2002―2011

专利总件数：2317件，包括美国，日本，英国，德国，法国，欧洲， WIPO（世界知识产权组织），瑞士，韩国、俄罗斯。（由于技术条件原因，本次专利检索并不完整，数据仅做参考。）

1、专利区域分布分析（国别）

分析：在本次报告查阅的有关干细胞的专利申请中，美国在该领域的专利申请量占总量的31%，领先于其他国家，其后依次是WIPO26%、日本15%、欧洲13%、韩国10%、德国2%。美国和WIPO合计占比57%，基本控制了整个干细胞发展领域的专利技术。

2、申请数量及趋势

分析：从总量上看，美国、WIPO在干细胞领域的专利申请量远高于其他国家。从趋势上看2007―2009年，干细胞领域专利量呈现震荡起伏态势，发展水平较为平稳。2010年可能受全球金融危机影响，申请量出现下降。1996年多利羊的诞生，引发了世界干细胞研究的热潮，但是由于涉及伦理等诸多因素，美国等西方发达国家限制胚胎干细胞的研究应用，除骨髓干细胞用于治疗白血病的技术被广泛使用外，其它干细胞治疗的临床应用进展缓慢。2009年奥巴马政府宣布对胚胎干细胞研究解禁，国际干细胞研究开始新一轮的发展热潮。基于科技竞争和医疗健康等原因，最近几年干细胞已成为世界各国竞相研究的大热点，全球干细胞市场也随之活跃起来。有统计数据显示，目前全球从事干细胞治疗心脏病研究的就有229家公司左右。虽然美国、日本、德国、韩国、英国等国家的干细胞企业和研究机构纷纷加大投入，试图占领干细胞研究和应用制高点，但实际上这些国家的干细胞产品研究绝大多数仍处于研究阶段，在全球真正上市的干细胞产品很少，全球干细胞市场尚处于初级阶段。尽管现阶段仍然无法实现干细胞产品的真正产业化生产

和销售，但是一些在干细胞领域领先的企业已经研发出多种产品，干细胞领域展现出的光明发展前景也逐渐将许多生物医药企业吸引到干细胞产品研发的行列，而许多以干细胞为主要业务的企业也如雨后春笋般不断涌现，大量的资金正在不断的涌入这个前沿领域中，这些都为干细胞产业化时代的到来带来希望。

3、IPC技术构成分析

分析：国外在干细胞领域技术分布主要集中在C12N、A61K等主要方向，其技术分布情况与国内技术方向相似。

分析总结

根据我国干细胞专利申请量情况来看，干细胞研究的关键技术刚刚起步。我国政府对干细胞技术非常重视，对干细胞的临床应用研究非常宽松。首先，中国的干细胞移植技术从动物实验到批准临床只需要12个月的时间，而在美国，则需要6-8年；其次，在中国，进行干细胞临床试验不仅不会向病人支付任何报酬，而且还要向其收取巨额的手术费用，而这在美国根本不可想象。干细胞生物学研究是我国与西方国家“起跑点”最接近的重大科学领域之一。无锡市在该领域的专利技术只能说还在起步探索阶段。我市干细胞库数量远远不及国内其他发展较早的干细胞库，临床案例也只有几十例，干细胞研究才刚刚开始。政府要进一步加快我市干细胞产业的发展步伐，加大推进力度。

细胞生物学的研究方法篇8

“细胞器―系统内的分工合作”一节是人教版生物必修一第三章第二节的内容。本节课的知识目标为：说出线粒体、叶绿体的结构和功能;得出“结构与功能相适应”以及“细胞器之间既有分工又有合作”的观念。细胞器的内容对于高一学生是非常抽象和难以理解的，在之前的学习过程中学生很少使用显微镜，即使用了显微镜，学生能观察到细胞就已十分不易，要观察到细胞器，如叶绿体和液泡则更加困难。如何让学生在已有的背景知识下，学习并理解分离细胞器所采用的离心技术，如何引导学生形成细胞器之间是协同合作的关系是下面着重探讨的内容。

1 导入细胞器概念的类比

手机作为现代通讯工具给人们的生活带来了无数的便利。手机在最基本的通讯功能的基础上还衍生出了许多其他功能，如视频聊天、导航、浏览新闻、听音乐、看视频、拍照、摄像等。如今手机也已经成为学生群体中必不可少的沟通和交流的媒介。笔者就以学生非常熟悉的手机作为类比对象，导入细胞器一节。在课前，教师引导学生回顾手机的功能，并启发学生思考手机要实现这些功能所需要的零部件，从而顺利启发学生思考：“细胞作为生物体结构和功能的基本单位，细胞能够完成呼吸作用、分裂、分化、分泌蛋白质这些复杂的生命活动，植物细胞还能进行光合作用，那么细胞中是否也存在零部件呢？”这样引出细胞器的概念。手机和组成手机的零部件之间的关系与细胞和细胞器之间的关系非常类似。细胞器作为一个全新的概念，学生无法理解其与细胞之间究竟是何关系。在手机与手机零部件的类比下，学生便可以在第一时间熟悉细胞器原来就是细胞中的有一定结构和功能的基本单位。

2 探究细胞器思路的类比

如果想要研究手机中零部件的结构，只需将手机拆开，用肉眼观察相应的零部件便可以得知;而在细胞中，人们无法再用肉眼去一一观察细胞器，因为细胞太小，需要借助特殊的“眼睛”的帮助――显微镜，从而顺利地引出首先用显微镜看细胞器来观察细胞器结构的思路。随后，便向学生介绍显微镜的发展过程，介绍目前生物科学研究中常用的扫描电子显微镜。之后，继续启发学生思考：如果想要研究这些零部件都有哪些种类和具体的功能，要将不同的零部件区分开，挨个地进行研究，与研究细胞器功能的思路是通的。首先要将不同的细胞器区分开，究竟如何将这些细小的细胞器分开，笔者则用“粉笔盒”的案例做类比。假设细胞就是一个粉笔盒，粉笔盒中已知有物体，因为摇动粉笔盒会发出声响，但并不知道粉笔盒中具体有哪些物品，这些物品分别是怎样的结构，就像学生已知细胞中有细胞器（光学显微镜可以观察到有叶绿体、线粒体），但具体有哪些细胞器，对这些细胞器的结构特点、功能、名称都不知晓。如果想要研究细胞器的具体类别、结构和功能，就要将它们分离，想要研究粉笔盒中具体有什么物品也需要将粉笔盒中导致声响产生的物品进行分离，从而启发学生思考如何分离盒中的物品（提示学生盒子可以打开，但开的方式由学生决定）。学生自然而然就想到粉笔盒中的物品可能有不同的体积，可以利用过滤的想法，在盒子表面打许多等大的孔（由小到大的顺序），再将粉笔盒摇晃，就可以根据体积将粉笔盒中的物体分离开。

接着，继续启发学生若将打孔的方法应用到细胞上会不会有问题，能否顺利进行，学生自然会想到细胞过小，且无法知道最小的细胞器具体有多大，在细胞上打孔难度极大，也不知道孔该打多大。顺着学生的思路，教师继续启发学生可以从描述物体特性的另一个角度“质量”来思考。教师可通过借助“旋转飞椅”（人坐在由链条牵引的椅子上由慢到快被甩到空中旋转的游乐设施）的案例，帮助学生得出离心的技术方法。因为在相同转速下，体重轻的人被甩得更高更远，而体重相对较重的人会被甩得相对较低也离地面更近。教师利用手机、粉笔盒、旋转飞椅三个类比，可顺利地帮助学生理解科学家探究细胞器结构和功能时所采用的思路。

3 “细胞器之间的协调配合”的类比

细胞生物学的研究方法篇9

关键词：血清药理学；肿瘤；细胞凋亡； 三磷酸腺苷酶；葡萄糖-6-磷酸酶

中图分类号：R285.5文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)05-1108-02

Research Application of Blood Serum Pharmacology Method on Induction of Tumor Cell Apoptosisand Lowering of Enzyme Activity

CAI Shuo1，LIU Shan2，ZHANG Lihong1, Jin Chunfeng1, Liu Chunying1

（Liaoning University of TCM,Shenyang 110032,Liaoning China；2.Fourth People's Hospital of Shenyang,Shenyang 110032,Liaoning,China）

Abstract：Objective:To explore the application of blood serum pharmacology method in the research of inducing cell apoptosis and reducing the enzyme activity. Methods:Using Chinese native medicine serology method of treating the liver cancer, stomach cancer, lung cancer, big cancer of theintestines to discuss the effect of inducing tumor cell apoptosis, reducing the enzyme activity of ATP (Mg2+ - ATPase) and the glucose -6-phosphatase (G-6-Pase) of tumor cell. Results:①Four kind of different compound Chinese medicical blood serum all can induce the cell apoptosis of corresponding liver cancer cell lines ,A549 human lung cancer cell lines, CCL229 human colorectal carcinoma cell lines and cell line SGC7901. ②The activity of ATP and Glucose -6- phosphatase in tumor cell is decreased .Conclusion:The research application of blood serum pharmacology method on the induction of tumor cell apoptosis and the lowering of enzyme activity has the stability and the credibility.

Keywords:blood serum pharmacology;tumor;cell apoptosis;Mg2+-ATPase;glucose-6-phosphatase

20世纪80年代中期，日本学者Iwama H等率先提出“血清药理学方法”。此法是先给动物灌胃给中药，一定时间后再采集、分离其血清，并用此含药血清进行体外实验[1]。血清药理学方法已被广泛用于中医药作用机制的研究，研究层面已涉及到细胞增殖、分化、凋亡与细胞周期的调节以及基因表达等方面。本研究采用治疗胃癌、肝癌、肺癌、大肠癌等中药血清学方法，深入探讨其诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞三磷酸腺苷酶（Mg2+―ATPase)与葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)酶活性作用。

1 实验方法

1.1细胞培养主要试剂 抗肝癌、胃癌、肺癌、大肠癌等不同中药复方中的中药，均由辽宁中医药大学第一附属医院提供。

1.2中药制剂制备 将3个不同中药复方组成后传统煎制：中药清水浸泡2h，煮沸后文火煎15min，纱布过滤取汁，药渣加水再煎20min，两次药汁混合，浓缩为100%。

1.3药物血清制备 动物：SD大鼠由辽宁中医药大学实验动物中心提供。30只SD大鼠随即分为3组，即中药组10只，化疗组10只，对照组10只。实验前禁食12h，采用2次给药方法（第1次给药2h后重复等量给药1次），每100g大鼠灌胃中药制剂1mL，2次/日连续灌胃3天。化疗组、对照组生理盐水等量灌胃3天。分别在末次给药后1、2、3h采血，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下，下腔静脉取血，静置4h，4℃，3000r/min 20min离心，分离血清，同种条件药物血清混匀，过滤，56℃30min灭活，-20℃保存，备用。

血清分组：中药血清组（中药组）、化疗血清组（西药顺铂-DDP组）、对照血清组（对照组）。（1）中药血清组：临用前将中药组大鼠血清加入PRMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、20%。（2）化疗血清组：用含10%化疗组大鼠血清PRMI1640培养液，DDP的终浓度为5%、10%、20%。（3）对照血清组：大鼠血清中加入PRMI1640培养液，终浓度为5%、10%、20%。

1.4细胞株 肝癌细胞株、SGC7901胃癌细胞株、细胞株 A549人肺癌细胞株和CCL229人大肠癌细胞株和均由中国医科大学生物教研室卫生部重点实验室提供。

2细胞培养

将细胞从冻存于液氮中的安瓶取出，放入37～40℃水浴中1min内融化，无菌条件下打开安瓶，接种于2只无菌培养瓶中。加入10%小牛血清PRMI1640培养液，在5%CO2，37℃条件下CO2培养箱中培养，倒置显微镜下动态观察细胞形态，24h后见细胞贴壁生长状态良好，弃培养液，分别加入各组血清，继续培养。

3标本制备

3.1细胞凋亡 生长在培养瓶内的贴壁细胞用2.5%戊二醛4℃原位固定2h，用橡皮铲刮下细胞，转至离心管内，低温高速离心机2000r/min，15min，琼脂处理成块，PBS冲洗，1%锷酸（OsO4）后固定1.5h，梯度乙醇、丙酮脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机（LKB-V）切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜（JEM-1200）观察、摄片。

3.2酶细胞化学 取出培养皿中的载片，PBS冲洗，2%多聚甲醛固定30min，8%蔗糖脱水，3次×30min，分别加入Mg2+-ATP酶和G-6-P酶孵育液，37℃孵育45min，双蒸水冲洗，2min×3次，2%硫化铵成色，2min，双蒸水冲洗，2min×3次，梯度乙醇脱水各10min，甘油明胶封片，普通光镜下观察、拍片。

4 结果

4.1 细胞凋亡 ①正常对照组：各组肿瘤细胞株多为长梭形，表面可见较多的微绒毛，线粒体、粗面内质网、高尔基复合体、溶酶体等细胞器丰富、排列规则。②中药组：细胞表为椭圆形、圆形。表面微绒毛明显减少、消失。胞浆浓缩，可见大小不等的空泡，泡内容物电子密度与机制相似。细胞核变小、不规则，染色质浓缩、边集，呈断裂状，部分线粒体肿胀、空泡化。可见到典型的凋亡小体：圆形，可见从凋亡细胞脱落。位于凋亡细胞一侧，表面有完整的细胞膜包裹，小体内可见染色质碎片及破碎的内质网、囊泡化的线粒体等结构。③化疗组：结果与中药组相似，可见典型的凋亡小体。

4.2 酶细胞化学 ①Mg2+-ATP酶：光镜下可见对照组细胞Mg2+-ATP酶主要定位在细胞膜内侧，黑色酶反应颗粒大小均匀，密度大，呈线状规则排列，酶活性强。与正常组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低。提示酶活性明显下降。②G-6-P酶：光镜下可见对照组细胞的G-6-P酶主要定位在细胞质内，酶反应颗粒粗大，排列密集，呈融合状，酶活性强。与对照组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，西药组部分细胞为阴性。提示酶活性明显下降。 采用Tiger图像分析仪测定Mg2+-ATP酶和G-6-P酶阳性细胞平均光密度（AOD）值，与对照组相比，P＜0.01。

5 讨论

中药血清药理学方法是由日本学者于20世纪80年代首先提出来的。是给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的药理学研究方法。利用血清药理学方法，给大鼠灌服中药一定时间后，取出血清进行体外实验。能客观反映中药进入体内之后，经过消化、吸收、代谢等过程后发挥药效作用，中药血清药理学提示：中药复方诱导的肿瘤细胞株凋亡具有可靠性和可信性[2]。

本研究证实，4种不同中药复方的中药血清，均能诱导相应肝癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CCL-229人大肠癌细胞株和SGC-7901胃癌细胞株发生凋亡，见到典型的形态学特征性指标――凋亡小体[3-4]。

Mg2+-ATP酶是质膜标志酶，主要定位于细胞膜内侧，此酶参与质膜上离子的主动转运，,维持细胞内K+和Na+浓度相对稳定状态,保持细胞膜内、外渗透压平衡以及参与保持细胞内外的化学梯度和跨膜电位，维持细胞内高钾低钠状态，从而保证细胞的活性。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，提示酶活性明显下降。G-6-P酶是内质网标志酶，是一种多功能酶,是细胞内糖原异生作用中重要酶之一，被称为“代谢标志酶”之一。此酶在糖代谢、免疫球蛋白合成及其它蛋白质合成、浓缩、加工等方面发挥重要作用。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，有的为阴性。提示酶活性明显下降[5-6]中药血清诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞株酶活性可能是中药复方抗肿瘤的机理之一。笔者同样成功应用本中药血清药理学技术进行了胃癌宁对人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响的研究[7]。

（1）给药方案与采血时间。目前存在多种给药方案。但一般使用灌胃方式，也可通过皮肤、黏膜、呼吸道等途径给药。给药时间最短者为1天，最长者为10天；给药次数也各不相同，有每天2次的，也有每天3次的。尽管已有研究表明，连续用药5天和10天所制备的含药血清的生物学效应是相似的，但无论哪种给药方法都必须使药物浓度达到相对平衡状态。根据目前掌握的大量药物的有效成分的药代动力学数据，本实验采用与多数研究者一致的即时血清在实验前禁食12h，次日采用两次给药方式（一次给药后2h等量给药），连续灌胃3天，日两次；采血时相，分别在末次给药后1、2、3h采血。证明是研究中药复方作用肿瘤细胞株较为可靠的血清药理学方法血清[8-9]。（2）含药血清用量。目前中药含药血清的浓度还没有确切的规定，选用5 、10 和20浓度的含药血清进行实验所得结果的说法不一，进行细胞增殖抑制作用的实验采用高浓度的效果好，而进行细胞增殖促进作用的实验采用低浓度的效果好[10]，本研究采用10的平均浓度进行实验，结果较好。当然，最佳血清浓度是因不同实验而异的，故最好的做法是通过预实验来确定。血清药理学可较好地克服了中药粗制剂直接进入体外实验的缺点，其结果的可信度明显优于中药粗制剂直接用于体外实验，不仅提示中药制剂在胃肠内处理过程中活性成分的转化与改变，而且有利于中药真正有效活性部位、有效成分的发现，将有助于促进中药药理现代化的发展，为新药开发奠定能基础。本研究进一步证实，血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡、降低酶活性等研究中的应用具有稳定性、可信性。血清药理学方法的应用将更多的相关中药方剂引入抗肿瘤细胞凋亡及诱导细胞凋亡方面的研究，筛选有效的中药成分与其有效组方来达到诱导大量肿瘤细胞凋亡，揭示中药的抗癌机理，为中药治疗肿瘤提供科学、客观和现代的手段与方法，是今后研究的重要内容，对人类攻克肿瘤有着重大意义。

参考文献

[1] Iwama H.Effect of shoszikoto,a Japanese and Chinese traditional herbal medical mixture on the mitogenic activity of lipopolysaccharide.A new pharmacology testing method[J].J Ethonopharmacal,1987,211:45.

[2] 米永杰、李健。中药血清药理学研究进展[J].四川解剖学杂志，2006，14（4）：34-35.

[3] 蔡朔，刘芙蓉，邵亚群．胃癌宁诱导人SGC-7901胃癌细胞调亡的实验研究[J].中华现代中西医杂志，2006，4（3）：206.

[4]刘春英， 王哲， 蔡朔，等．肺癌平诱导Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡的形态学研究 [J].中国实验方剂学杂志，2005，11（2）：132-134.

[5] 刘春英， 王哲， 蔡朔，等． 肺癌平药物血清对A549人肺癌细胞株Mg2＋-ATP、G-6-P酶活性的影响[J].2004，11（11）：969-971.

[6] 金春峰，刘春英， 蔡朔，等． 益肺饮对A549人肺癌细胞株酶活性的实验研究[J].中国肿瘤，2004，13（9）：588-590.

[7] 蔡朔，刘芙蓉，刘山．胃癌宁诱导人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响研究[J].中华中西医临床杂志，2007，7（2）：9-12.

[8] 刘成海，刘平，刘成，等． 抗肝纤维化有效中药复方血清药理学方法探讨[J].中国实验方剂学杂志，1998，4(2)：16-17.

细胞生物学的研究方法篇10

细胞生物学是生命科学中的前沿和枢纽学科，生命科学的各个分支学科在细胞层次上进行交汇。细胞生物学同时作为一门重要的基础学科，是本科院校生命科学、医学、农业等专业的重要专业核心主干课程。近年来细胞生物学新的知识内容和研究方法层出不穷，发展迅猛。要使教学内容紧跟细胞生物学发展的前沿；要使学生能了解细胞生物学最新研究成果，培养学生自主获取新知识的能力；传统的教师为主体的课堂教学模式已无法满足要求[1]。在有限的课内教学学时内提高课程教学效果，必须对现有的教学手段和教学方法进行改进，摸索出一种新的课堂教学模式。

传统的教师为主体的教学忽视了学生自主学习、自主探究能力的培养，抑制了学生的研究兴趣与创造性，与对创新人才的强烈需求形成尖锐矛盾[2]。细胞生物学教学根据课程的特点和培养目标，构建课内互动教学结合课外自主学习的“研究型”课堂课教学模式。在研究型教学中，学生是教学过程的主体，学生要在研究中学习和成长，培养学习的主动性和独立性；教师在整个教学过程中起组织者、指导者、帮助者和促进者的作用。课内教学中教师发挥主导作用：对细胞生物学中的经典部分进行讲解；突出学生主体地位：通过案例、专题知识等环节采用启发引导、讨论互动的教学方式，通过科学研究式的学习激发学生学习兴趣，提高教学效果，使学生掌握细胞生物学中的前沿部分。因细胞生物学课内教学学时有限，研究型课堂教学强调课外学生的自主学习。课外自主学习通过教师每次课后推荐的相关文献、视频等资料进行拓展学习，同时结合文献阅读撰写小论文和自主学习小组研讨活动开展，课外学习效果纳入过程性考核成绩。

细胞生物学研究型课堂教学模式从杭州师范大学生命与环境科学学院生物技术专业2009级学生开始，连续实施了四届。为了解学生对细胞生物学研究型课堂教学模式实施的意见和效果评价，以期在今后的实施过程中进一步完善，对2016年6月授课结束的2013级生物科学（非师范）专业学生进行了课程的问卷调查。

一、调查对象与方法

（一）调查对象

杭州师范大学2016年完成学习细胞生物学课程的2013级生物科学（非师范）专业的学生。

（二）调查方法[3-4]

采用问卷调查的方法，共发放调查问卷36份，收回有效问卷34份，有效回收率为94.44%。调查问卷由学生独立填写，当场回收。

二、调查内容

调查内容主要涉及：研究型课堂教学模式对细胞生物学课程内容学习的影响；对本专业学习的影响；对学生综合能力的影响；学生对研究型教学模式适应性评价；学生对研究型教学模式课堂效果的评价和建议。

三、调查结果分析

（一）研究型课堂教学模式对课程内容学习的影响

研究型课堂教学模式对课程内容学习的影响见表1，在被调查的34名学生中，选择研究型课堂教学模式能促进理解掌握每次细胞生物学课堂教学内容的学生为32人，占调查对象的94.12%；31名，占调查对象91.18%的学生认为新的教学模式能更系统地掌握细胞生物学整门课程的知识；85.29%的学生认为新教学模式能帮助了解细胞生物学课程的前沿内容。

（二）研究型课堂教学模式对本专业学习的影响

研究型课堂教学模式对本专业学习的影响见表2，在被调查的34名学生中，选择通过研究型课堂教学模式的学习获得的能力能帮助本专业其他课程学习的学生为25人，占调查对象的73.53%；79.41%的学生认为能激发其学习本专业的兴趣；91.18%的学生认为能拓宽本专业知识面。

（三）研究型课堂教学模式对学生综合能力的影响

研究型课堂教学模式对学生综合能力的影响见表3，在被调查的34名学生中，选择通过研究型课堂教学模式的学习提高了文献检索查阅能力的学生为29人，占调查对象的85.29%，其中20.59%的学生认为有明显提高；58.82%的学生认为能增加解决问题的能力；67.65%的学生认为能增强团队协作意识；64.71%的学生认为能增强与他人交流的能力。

（四）学生对研究型教学模式适应性的情况

学生对研究型教学模式适应性的情况见表4，在被调查的34名学生中，选择对授课教师满意34人，占调查对象的100%；61.76%的学生认为与传统的教学模式相比能适应研究型的教学模式；67.75%的学生课程考核方式合理；76.47%的学生认为新的教学模式占用的课余时间比较合理。

（五）学生对研究型教学模式课堂效果的评价

学生对研究型教学模式课堂效果的评价情况见表5，在被调查的34名学生中，23名学生更喜欢教师采用研究型教学模式进行授课，占调查对象的67.65%；82.35%的学生认为能够提升学习积极性；79.41%的学生认为课程的教学互动和课堂氛围好；91.18%的学生建议学弟学妹们继续采用研究型教学模式。

四、讨论

细胞生物学的发展迅猛，课程内容难以用教材来全部涵盖，也无法仅靠课内有限学时来更好地提高教学效果。因此必须发挥学生的自主性，引导其开展研究性的学习，以获取新的知识[5]。自推动《细胞生物学》课程新教学模式以来，受益学生的实践能力普遍有明显提升，受到实习学校和用人单位的一致好评。学生的科研创新能力明显提高，学生以第一作者发表科研论文4篇，获8项的科研立项，6项的科研竞赛获奖。

通过本次细胞生物学研究型课堂教学模式效果调查结果显示，通过研究型课堂教学，大多数的学生认为能帮助对细胞生物学课程系统性的学习，更好地能了解细胞生物学课程的前沿内容。同时通过新教学模式的学习能增强文献检索查阅能力、解决问题能力；通过新模式中的自主学习小组研讨活动增强了团队协作意识和交流能力。获得的能力能帮助专业其他课程的学习，从而激发学习本专业的兴趣，拓宽专业的知识面。大部分的学生认为能较好地适应新的教学模式。因为新的教学模式除了课内的学习还有较多的课外自主学习，大多数的学生认为占用的课余时间比较合理。91.18%的?W生建议继续推行研究型教学模式。