基因工程载体的种类范文

导语：如何才能写好一篇基因工程载体的种类，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

学生做好这一模块的题目，就需要从四个方面入手。即如何切入，何为重点，何为难点，如何改进。

关键词：基因工程；复习；切入点；重难点；改进和调整

中图分类号：G633.91 文献标识码：A 文章编号：1992-7711（2016）08-0005

在过去三年的江苏高考卷中连续出现了三道基因工程方面的题目，而且分值较高。这就不禁让笔者有理由推测明年的高考卷中势必还会出现这种类型的题目，所以笔者在复习这一模块时，特别总结了相关注意事项，并思考如何才能让学生理清思路、游刃有余地把这一模块的题做好。过去三年出的三道题目很类似，都是提供几种限制酶识别序列及切割位点图和转基因操作流程图，考查的重点问题都是限制酶对质粒和目的基因的识别与切割，以及切割后的重组问题，即目的基因的获取和表达、载体的构建。那么，我们的学生要想做好这种题目，还需要形成哪些方面的认识呢？笔者认为在复习时应该从以下四个方面入手：

一、以肺炎双球菌转化实验为复习的切入点

复习前先带学生重新认知该实验的过程，复习巩固生物之间的自然的基因转接过程。从学习角度分析，借助学生所熟知的原型，可以启发、引导以实现温故而知新。这个实验是一个很好的认知原型，让学生能够感悟到大自然的鬼斧神工造就了自然发生的重组DNA，那我们人为地也可以改变，即我们的基因工程。基因工程的操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取，基因的表达与载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中，获取目的基因和基因表达与载体的构建是整个工程的核心技术。这一技术涉及许多知识点，如DNA的结构、DNA的复制、限制酶和DNA连接酶及DNA作用与特性、基因的表达、载体的结构组成和作用等。因此，命题者可以从多个角度考查学生对这一系列知识的整体掌握程度及相关的能力。前几年的题目都分别考查了不同的限制酶切割目的基因和质粒后可得到重组质粒的种类、目的基因导入质粒后对质粒结构和功能的影响、DNA水解酶、毒素蛋白与受体细胞中受体间的特异性结合、转基因植物栽培中降低害虫种群抗性基因频率增长速率的措施等问题。基因工程内容重要，基础性知识要求较高，涉及的知识和技术多，同一个问题还可以从不同的角度设置问题，笔者认为，教师在教学中、学生在学习中仍然要格外重视这部分内容。

二、基因工程是现代生物技术的核心内容

高中生物选修内容包括选修一《生物技术实践》、选修二《生物科学与社会》、选修三《现代生物科技专题》。其中，选修三选择了现代生物技术中深刻影响着人类社会的生活、生产和发展的四大工程：基因工程、细胞工程、胚胎工程、生态工程。由于基因工程是现代生物技术的核心内容，所以显得尤为重要。因此，我们在给学生复习的时候要特别重视基因工程的复习，但在复习方法上要侧重理论与原理，注重理解和应用，注重与必修内容、社会热点、生物科技发展的最新成果的联系，注重这些技术在农业、工业以及在医疗卫生事业上的应用，努力用已学的原理和技术去分析理解并解决其中的一些实际问题。复习的深度不宜过深，在操作技术上至少要求一般性了解，不宜过细。另外，微观的技术要注意采用模拟操作的方法加强理解，宏观的技术要尽可能走进工厂或研究所参观学习，加强直观理解，实在没有条件的学校，要想办法找一些视频或录像反复地观看。只有做到理解，才能达到真正掌握和应用。笔者认为，学生之所以一直感到这部分内容难，主要原因就在于他们缺乏这一学习过程，而是局限于看书和记忆。所以，我们在复习这部分内容时一定要将这个过程给他们补上。

三、对双基的掌握和分析、解决问题的能力是复习的重难点

近几年的生物高考命题指导思想都强调以能力测试为指导，重点考查对基础知识和基本技能的整体掌握程度，力求引导中学全面实施素质教育。这一指导思想通过近几年的高考实践已经得到充分的证明，也就是要求学生全面掌握《生物课程标准》和考试大纲规定的基础知识和基本技能。这种整体掌握不但体现在必修和选修上，还体现在要求考生能在相对简单的情境中综合运用进行分析、判断、推理和评价。这一指导思想表现在试题上为：知识覆盖率高，注重基础知识和基本技能，重点内容、主干知识的考查出现频率高且相对稳定，试题的学科内、专题内和专题间综合性强。那么，像基因工程这么重要的知识在近三年高考题中连续出现的现象就不足为奇了。事实上像遗传规律的应用、人类遗传系谱图的分析、免疫、生态等内容也是连年考，但设置的问题和考查的角度不完全相同。这一指导思想要求我们学生既应踏踏实实地、全面系统地、重点突出地掌握基础知识和基本技能，也要能从不同的角度去理解知识，要能挖掘知识之间的区别和联系，并在不同的情境中运用知识。

篇2

叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年baur和correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣[1]。1988年boynton等首次用野生型叶绿体dna转化了单细胞生物衣藻突变体(atpb基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生[2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。

1叶绿体基因工程概述

1.1叶绿体简介

叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状dna。叶绿体dna分子一般长120~160kb。叶绿体dna有ira和irb 2个反向重复序列(分别位于a链和b链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。

1.2叶绿体基因组转化优点

叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数[3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。

1.3叶绿体转化的主要过程

叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物[4]。

1.4叶绿体转化的主要方法

依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株[5]。二是农杆菌t-dna介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是peg处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的peg浓度下与植物原生质体共培养。

2叶绿体基因工程的应用

2.1提高植物光合效率

植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于rubisco酶的丰富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量[6]。很多科学家正试图通过提高rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破,证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。

2.2合成有机物质

由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点,已被越来越多的人关注,并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如,有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。聚3-羟基丁酸酯及其他类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质,是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。具有生物可降解性,如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。其通过构建了含phbb、phm、phbc和aada基因表达盒的叶绿体整合及表达载体,通过基因枪轰击法转化烟草。northem点杂交、rt-pcr分析结果表明,叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因。

2.3生产疫苗

人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达,表达效率取决于外源基因的整合位点,增强转录和翻译的调控元件以及外

源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如,范国昌等将甲型肝炎病毒vp3p1区和丙型肝炎病毒c区融合,并导入到衣藻叶绿体基因组中,融合蛋白得到高效表达,且具有双抗原活性。而霍乱病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已经在叶绿体中转化成功,预示着转基因植物疫苗的可商业化前景。tregoning等将tetc基因在烟草叶绿体基因组进行表达,为了增加mrna的稳定性及在烟草叶片内表达的可行性,他们将基因进行了密码子优化,分别表达了未经改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表达量分别为总可溶蛋白的25%和10%。

2.4在植物抗性方面的研究

在抗虫性方面,kota和cosa分别于1999年、2001年将btcryzaaz基因转入烟草叶绿体,前者可100%杀死4 000多倍抗性的抗性虫,后者报道bt表达量达46.1%。在抗逆性方面,人们通过编码sod、apx等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中,提高了植物的耐氧化能力,从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力。

2.5叶绿体基因组在系统发育学上的应用

叶绿体在系统发育学上的优点:一是叶绿体基因组是仅次于核基因组的第二大基因组,为比较研究提供了一个较大的数据基础;二是叶绿体dna的核酸置换率适中,在应用上很有价值。然而,用叶绿体dna研究系统发育也存在着明显的不足:一是叶绿体基因组是母性遗传的,因此并不能单靠叶绿体基因组来解释居群间的杂交现象;二是虽然有越来越多的叶绿体dna被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系,但只有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信息、传统的形态及生理特征结合起来获得更多的信息,才能更接近系统发育的本来面目。

2.6叶绿体基因在消除环境忧虑问题上的前景

当今最为普遍的问题就是外源基因从转基因作物到杂草的逃逸,这一逃逸主要是通过花粉的扩散,产生超级杂草或产生和其他作物之间的基因污染,对环境极为不利。叶绿体基因工程产生的基因逃逸现象的风险远远低于核转化作物,因为大多数作物中的质体dna都是母系遗传,这样就可以避免作物和作物、作物和杂草之间的杂交,消除人们对基因污染的忧虑。 　3叶绿体基因工程存在的问题

3.1叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题

由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体,每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前,目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。

3.2植物的种类有待扩展

可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。

4展望

虽然在叶绿体基因工程领域人们已经取得了一定的进展,但对于改变叶绿体基因工程中所存在的缺点,科学界仍然要有大量的工作需要进行。为此,寻找更多更加合适的方法来改进叶绿体基因工程,使其优点更加明显,必将在未来生物技术领域带来又一场革命,为人类造福。

5参考文献

[1] 刘良式.植物分子遗传学[m].北京:科学出版社,1997.

[2] boynton j e,gillham n w,harris e h,et al.chloroplast transfo-rmation in chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles[j].science,1988,240(4858):1534-1538.

[3] 李宏韬,赵淑青,赵彦修,等.叶绿体基因工程简介[j].遗传,2003,25(4):495-498.

[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.

[5] 沈桂芳,倪丕冲.植物叶绿体基因工程[j].高科技与产业化,1999(1):26-28.

篇3

关键词：植物疫苗；基因工程；表达系统；安全性

1 植物疫苗的免疫原理

植物疫苗可诱导粘膜免疫反应，小肠淋巴组织的粘膜上有一种特殊的细胞叫做膜细胞（M 细胞）。粘膜免疫应答就是由M 细胞识别抗原开始的。M细胞识别抗原并将其传递给巨噬细胞，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞，再将抗原展示给辅T细胞，辅T细胞识别外源蛋白质片段后就会刺激B细胞制造和释放能中和抗原的抗体，当疾病因子出现时，记忆辅T细胞刺激胞毒T 细胞攻击受感染的细胞，同时它迅速刺激记忆B 细胞分泌中和抗体消灭入侵的病原体。总的来说，转基因植物疫苗可以诱导相应的血清型的IgA 和IgG 反应。

2 植物疫苗的特点

2.1 安全性高

植物是人类食物来源之一，除个别人群对某些特定的植物过敏外，其安全性高。用动物细胞生产疫苗，可能有动物病毒的污染，对人类存在潜在危害。而植物病毒不会感染人类，比较安全，同时也可避免微生物生产疫苗带来的有害产物。

2.2 成本低

植物种植系统简单易行，植物细胞培养条件简单，便于进行遗传操作，可通过大面积栽培获得廉价的疫苗，且不需要技术、设备和种植条件等巨大投资。农作物可以当地生产，还易于储藏和运输，而且经过长期种植，植物栽培、收获、贮藏、加工程序已经形成工业化。与植物生物反应器相比，原核生物反应器与动物生物反应器生产时需要昂贵的技术设备、大量的人力物力。

2.3 植物具有完整的真核表达系统

具有与动物相同的真核加工修饰系统。可以对重组蛋白进行糖基化、磷酸化、酰胺化、亚基正确装配等。微生物系统不能对真核生物蛋白进行正确的翻译后加工。

2.4 转基因植物中的外源基因可重组

通过植物杂交的方法进行基因重组，进而在植物体内积累多种病原体的抗原基因，生产出方便高效的多联疫苗。

3 植物基因工程疫苗外源基因的表达系统

3.1 瞬时表达系统

主要采用植物病毒作为载体，而外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒感染植株，从而将外源基因导入植物细胞内，采用这种转化方式，外源基因并不整合至植物基因组中，只是利用寄主细胞在细胞质中进行复制，以高拷贝的形式游离于植物中，并进行高效的表达，因此可在短时间内在植物细胞内积累大量的外源蛋白。采用农杆菌介导的转化，外源基因蛋白的产量一般要低于细胞内可溶性蛋白总量的1%；而采用这种瞬时表达系统,外源基因蛋白总量会远大于1%。

3.2 稳定整合系统

3.2.1 土壤农杆菌介导的遗传转化。目前根癌农杆菌主要用于双子叶植物的遗传转化，其转化植物的机制已从分子水平上基本得到解释。而发根农杆菌，由于对Ri 质粒了解得还不充分，所以对这种转化系统的研究主要集中在以生产次生代谢产物为目的的根组织培养和根的发育。采用农杆菌介导的植物转化最常采用共培养法，即使用农杆菌菌液与叶盘、愈伤组织、悬浮培养细胞、茎段、下胚轴段、子叶切片等部分进行共培养，从而达到转化的目的。

3.2.2 外源DNA 直接导入法。主要包括基因枪法、电激发、PEG诱导法、激光穿孔法、脂质体法、超声波法，其中最常用的是基因枪法。它是将带有外源基因的质粒用亚精胺包裹为直径1μm 左右的金弹或钨弹，再用高压氦气、火药爆炸力、高压放电气体作为动力加速子弹，使它们穿过植物细胞壁和细胞膜，将外源基因带入具有再生能力的植物组织，这样可以在很大程度上缩短再生的时间，从而避免体细胞变异的发生。

4 以植物为载体的免疫技术

4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保护作用

由于植物疫苗一般是通过食用来被人体利用。所以如何避免消化酶的影响来保护抗原就是一个重要的研究课题。目前，避免消化酶的影响来保护抗原可分为2类方法：①用沙门氏菌和弧状霍乱杆菌作为载体；②用保护性的包被对抗原进行包装。

用减毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系统摄取所表达的抗原。但是基于减毒菌株的方法具有潜在安全缺陷，而后者可通过生物降解的多聚物、脂质体、蛋白质体或者表达抗原的转基因植物来实现。许多研究表明，植物材料可潜在地保护所选定的抗原。特别在种子中，植物可为亚单位疫苗提供一个富含蛋白酶抑制物的糖类聚合物基质环境。其它的抗原包装方法需要烦琐的处理步骤；而通过植物种子来进行生物包装不需要任何额外的代价，就可以为这些抗原提供保护。在有关转基因马铃薯的研究中，从轮状病毒和产肠毒素大肠杆菌中所选的抗原分别与霍乱毒素的B和A2亚单位融合，抗原的免疫反应显示出对Th1的偏爱性，并可诱导白细胞介素2和干扰素γ，CD4 + 水平也相应增加。Th1的偏爱性很可能是抗原或者载体的选择结果。在佐剂的帮助下，亚单位疫苗的释放能增加免疫反应量。霍乱毒素和大肠杆菌的热不稳定毒素，它们与抗原共表达，有利于诱导保护性的免疫产生，改变口服免疫低效率递呈。另外，有人证实了转基因植物疫苗的粘膜传输中所诱发的免疫应答所具有的黏膜佐剂的特征，这给口服免疫可不需佐剂提供了依据，同时也提高了其安全性。

在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候选的亚单位疫苗也具有较好的保护作用。马铃薯块茎或谷物种子中表达的热不稳定毒素的B 亚基和马铃薯中表达的霍乱毒素B 亚基用于小鼠口服免疫，可以保护老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物种子表达的传播性肠炎病毒的S2糖蛋白，对乳猪能够起到很好的保护作用。目前，通过植物递送系统来生产B 型肝炎的疫苗也逐渐成熟。

4.2 提高抗原在植物中的表达水平

利用植物进行疫苗开发，首要的问题是，植物能否表达相关的蛋白？目前为止，许多亚单位候选抗原在转基因植物中成功表达，这些抗原主要包括感染人类、家畜、野生动物的细菌和病毒抗原。表达水平很大程度上取决于表达的蛋白和用于表达的植物种类，同时，构建的表达系统也影响抗原的表达水平，比如用于表达的细胞器基因组(核和质粒)、启动子的强度和组织专一性、非翻译前导序列和信号序列的选择和表达蛋白的靶细胞器的定位等均对表达产生影响。一般而言，利用上述策略可以实现抗原高水平表达。然而，很难对表达系统进行比较，因为特定抗原对植物表达系统的选择很重要，在不同的系统中其表达效果是不一样的。近来，研究人员利用内质网滞留信号可提高外源基因的表达量，Mason等利用一个核表达系统，把蛋白定位于内质网滞留信号之后，热不稳定毒素B亚单位在马玲薯块茎中表达量可达总可溶性蛋白质的0.2% ；在谷物种子中的表达量约占总可溶蛋白的4%或12% ，这些都依赖于所用的调节序列。另外，霍乱毒素（B）亚单位在利用内质网滞留信号时在烟草叶片中的表达量约占总可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更难于在转基因植物中表达，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表达量远不及可溶性蛋白，这就需要优化表达系统以提高表达水平。

目前，转基因马玲薯表达B型肝炎的表面抗原水平已由马玲薯大约1mg/g增加到马玲薯大约16mg/g抗原，这样可以大大减少口服剂量。目前许多研究表明，所欲表达的抗原在植物中能够表达并装配成四级结构。糖基化修饰的蛋白也可在植物中进行糖基化，尽管糖基化模式很可能存在着差别。在植物系统中表达的热不稳定蛋白毒素的B亚单位和霍乱毒素的B亚单位，均有GM1受体结合活性，B型肝炎表面抗原和诺沃克病毒衣壳蛋白可形成类病毒颗粒，类病毒颗粒的形成，可认为有利于诱导免疫反应。

5 植物基因工程疫苗研究进展

5.1 反转录病毒载体

反转录病毒作为载体是在进行动物基因工程中发现的，许多研究人员认为它同样适于植物基因工程，但目前研究的不多。

5.2 单链RNA植物病毒

单链RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作为mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花叶病毒(ALMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、烟草花叶病毒(TMV)等。它们作为外源基因载体主要通过以下步骤感染植物：病毒RNA 首先反转录为一条单链cDNA，在DNA聚合酶作用下形成双链DNA，将其克隆入细菌质粒中，将外源基因插入质粒的cDNA中，最后通过体外转录，用带有外源基因的RNA病毒感染植物，将其转入植物细胞。

5.3单链DNA植物病毒载体

在单链DNA 植物病毒载体中，研究最多的是Geminiviruses(简称GeNV) ，又叫做双粒病毒或双联体病毒。它一般含有2个成对并存的病毒颗粒，大小约为18～20nm，遗传物质是单链DNA ,每2个颗粒中包含1～2个、2. 5～3.0 kb的环状DNA分子。该病毒寄主广泛，单子叶植物和双子叶植物均可被感染，但感染部位仅限于植物的维管组织，且其传播媒介主要是昆虫，不能通过机械接种。

5.4 双链DNA植物病毒载体

双链DNA植物病毒载体中最典型的是花椰菜花叶病毒，它的基因组长约8kb，主要感染花椰菜、油菜、拟南芥等，主要寄主是芸苔属植物，目前尚未发现可感染豆科和单子叶植物。

6 植物疫苗的安全性

6.1 对环境的影响

由于在植物疫苗中包含了病原体的DN段，因而花粉和种子的散播造成的基因逃逸可能给人类带来新的病原、毒素、过敏原等，因此对可能引起的基因渐渗现象必须做出充分的安全性评价,并规范植物疫苗的利用和管理，同时寻求技术方法。如可恢复阻塞(RBF)技术，它能使自然界中因渐渗而携带RBF 的杂种或近缘系植物死亡或不育或利用叶绿体转化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，这样就可避免花粉传播而带来的潜在威胁，转基因植物疫苗有着传统疫苗无法比拟的优越性，已经成为一个研究热点了。未来的研究应着眼于生产出作为医药商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。转基因植物疫苗应用最大的限制就是表达量低。现在的研究表明：可以通过叶绿体转化、植物育种和利用食品加工技术来提高表达水平，而且研究还指出，运用携带蛋白和辅助蛋白可以增加抗原被免疫系统识别的能力。这些研究都使我们越来越接近生产出廉价“安全口服的商品植物疫苗”，这样的疫苗将可以帮助人们预防疾病的传播。

6.2对人类和动物的影响

抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用的标记基因。长期食用这类转基因疫苗是否会对人体或动物造成抗生素医疗无效。转基因植物中的新基因会不会传递给人畜肠道的正常微生物，引起菌群和数量的变化或插入并表达，从而危害人畜健康？这些问题目前都无法解答，仍需大量学者继续研究论证。

7 展望

利用植物来表达和递送疫苗技术的发展给免疫研究注入了新的内容。以往的研究中,在植物中表达了包括过滤性病毒、细菌、肠道和非肠道的病原体等各种不同的抗原，并做了相应免疫学研究。但植物疫苗面临的最大问题是抗原蛋白在植物细胞表达量不高，低剂量抗原蛋白往往不能激发足够的免疫反应，这不能仅靠增加植物组织摄取量得以解决，因为低剂量的重复免疫可能会导致机体的免疫耐受，导致机体对此抗原免疫反应保持“低调”，即使以后增加抗原蛋白的剂量也不能改变。另外，机体每天对植物组织的摄取量是一定的，不可能无限增加。因此，未来研究的重点之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表达量。随着生物技术的发展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗递送系统将更具吸引力，并呈现出广阔的应用前景。

参考文献

1 余祖华，王红宁.用植物生物反应器研制基因工程疫苗的进展[J].生

物技术，2004（8）

篇4

1、基因工程中重组DNA分子的筛选

基因工程的第一步是提取目的基因，第二步是将目的基因与运载体结合，即把用同一种限制性核酸内切酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DN段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状的DNA。这些环状的DNA有的是由一个DN段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DN段形成的，共有三种，即目的基因―载体连接物、载体―载体连接物 、目的基因―目的基因连接物。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化。常用的方法有抗药性标记选择法（插入失活法），即将目的基因插入带ampR和tctR基因载体的tctR基因（或ampR基因）中，则tctR基因（或ampR基因）失活，再在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。

[例1]：(2008海南高考题) 右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。

（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DN段之间连接形成的产物有__________、__________、__________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行__________。

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________________。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是______________________________。

（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时 。

[解析]：考查基因工程重组DNA的构建与筛选，以及基因结构与表达调控。

(1)考虑载体的自连接、目的基因的自连接及载体和目的基因的相互连接。

(2)载体―载体连接物含有ampR(青霉素抗性基因)和tctR(四环素抗性基因)，其宿主细胞接种到含四环素、青霉素的培养基中均能生长。由于目的基因插入tctR四环素抗性基因位置，使得该四环素抗性基因完整性破坏而不能表达，但因含有tctR(四环素抗性基因)，所以将相应宿主细胞接种到含四环素的培养基中不能生长，接种到含青霉素的培养基中能生长。

(3)目的基因表达时,RNA聚合酶识别和结合位点是启动子，作为转录起始信号，其合成产物是mRNA。

(4)质粒包括EcoRI、BamHI酶切位点，目的基因的两端分别有EcoRI、BamHI酶切位点,若用该两种酶同时处理质粒、目的基因会得到相同黏性末端，其目的基因――载体连接物就只能有一种。当然还有若干载体――载体连接物、目的基因-目的基因连接物。

[答案]：

（1）目的基因―载体连接物 载体―载体连接物 目的基因―目的基因连接物 分离纯化 （2）载体-―载体连接物；目的基因-―载体连接物、载体―载体连接物 （3）启动子 mRNA （4）EcoRI和BamHI

[例2]：科学家利用基因工程成功地将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内生产出人的胰岛素。在该过程中采用质粒作为运载体，已知质粒上含有抗氨苄青霉素（简称氨苄）和抗四环素的基因（位于不同区段），目的基因与质粒的结合位点刚好位于抗氨苄青霉素基因结构内，且受体大肠杆菌体内不含质粒，也不含质粒上的抗药基因。导入完成后，在得到的大肠杆菌中，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒，只有少数导入的是重组质粒。某科研机构想从培养基上筛选出含重组质粒的大肠杆菌（即“目的菌种”），他们设计了如下实验方案：

第一步：将得到的大肠杆菌接种在含的培养基上，筛选出含有质粒的大肠杆菌。

第二步：为选出“目的菌种”，将第一步筛选出的大肠杆菌中选用“印影法”分离。

①采用涂布平板法，将第一步筛选的大肠杆菌以合适的稀释度涂布_______________________上，经培养后形成单菌落，如图1B所示。

②通过一消毒的“印章”（如图1A所示），将培养基上的菌落分别按原位印迹到图1所示的非选择培养基__________和选择培养基__________上（顺序不能颠倒，C培养基成分与B相同，D上含有氨苄青霉素，含重组质粒的大肠杆菌不能生长）。

③培养后对照观察C、D培养基上的单菌落。

④在C培养基上挑取D培养基上不生菌落的位置上的单菌落，从而获得含重组质粒的大肠杆菌，即“目的菌种”。

⑤实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的的目的是____________________

[答案]：四环素 到含普通质粒的大肠杆菌和含重组质粒的大肠杆菌都能生长的培养基 C D防止污染环境

2、细胞工程中杂种细胞的筛选

2.1植物体细胞杂交中融合体的类型和杂种细胞的筛选

植物体细胞杂交中融合体的类型有以下三种：①未融合细胞：再生植株与亲本相同；②自体融合：融合结果得到“同核体”； ③异体融合：融合结果得到“异核体”。例如，在一定的技术手段（物理法、化学法）协助下进行植物A、B细胞的人工诱导融合，先进行膜的融合，再进行核的融合，最后形成杂种细胞，杂种细胞有三种：AA型、BB型、AB型，只有AB型才是我们所需要的杂种细胞，所以需要进行筛选，再通过植物组织培养技术，培育成杂种植株。杂种细胞的筛选方法有以下几种：①利用双亲细胞形态和色泽上的差异识别杂种细胞，这是最简单的选择方法。②遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常的等位基因，纠正另一亲本的缺陷，从而使杂种细胞表现出正常功能的原理选择杂种细胞；③抗性互补筛选法：利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异来选择杂种细胞；④生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如，常用IOA（核失活―碘乙酰胺）处理与培养基相结合进行选择：A亲本用IOA处理，使细胞质不活化，这样A原生质体不能分裂；使用的培养基是不利于B亲本再生的培养基，这样B原生质体也不能再生，最后能再生的只能是A + B 体细胞杂种；⑤物理特性筛选法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种细胞；

[例3]：（2001上海高考题）现有甲、乙两个烟草品种(2N=48)，其基因型分别为aaBB和AAbb，这两对基因位于非同源染色体上，且在光照强度大于800勒克斯时，都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果。取甲乙两品种的花粉分别按图示操作培养成植株，将它们的叶肉细胞制成原生质体，并将两者相混，使之融合，诱导产生细胞团。然后，放到大于800勒克斯光照下培养，结果有的细胞团不能分化，有的能分化发育成植株。

（1）在大于800勒克斯光照下培养，有_______种细胞团不能分化。

（2）能分化的细胞团是由__________的原生质体融合来的(这里只考虑2个原生质体的相互融合)。

（3）由该细胞团分化发育成的植株，其染色体数是_______，基因型是_________。

（4）该植株自交后代中，在大于800勒克斯光照下，出现不能生长的植株的概率是_________

[解析]：根据题意，基因型aaBB和AAbb的个体在光照强度大于800勒克斯时都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果，我们可推测出：能生长的植株一定同时含A、B基因。本题可用遗传互补筛选法解题，见右图所示。甲品种aaBB产生的花粉aB，花药离体培养成的植株为aB，乙品种AAbb产生的花粉Ab，花药离体培养成的植株为Ab，它们的叶肉细胞制成原生质体，将两者相混融合，诱导产生细胞团有aaBB、AAbb 、AaBb，只有AaBb在光照强度大于800勒克斯下能生长。AaBb的个体自交后代中出现不能生长的植株的基因型aa___或___bb的个体，能生长的植株基因型是AABB、AaBb、AABb、AaBB，由于AaBb的个体能产生四种配子其比例相等，其后代产生AABB的比例为1/4×1/4=1/16、AaBb为l/2×1/2=1/4、AABb为l/4×1/2=1/8、AaBB为l/2×1/4=1/8，这些个体之和为9/16，其余为能生长的个体，其比例为7/16。

[答案]：（1）2 （2）甲乙两品种 （3）48 AaBb （4）7/16

2.2单克隆抗体的制备中杂交瘤细胞的筛选

2.2.1杂交瘤细胞的第一次筛选

B淋巴细胞与骨髓细胞的融合随机性很大，因此，细胞融合过程中将会形成多种细胞的混合体，包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、B―B融合细胞、骨髓瘤―骨髓瘤融合细胞、B―骨髓瘤融合细胞（即杂交瘤细胞）和细胞多聚体（容易死亡，无需筛选）。在细胞混合体中，只有B淋巴细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞才有意义，所以必须从不同种类的细胞中筛选出杂交瘤细胞。目前常采用HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞，其原理是：DNA的合成有D和S两种途径。B淋巴细胞具有D和S两种DNA合成途径，但一般不分裂增殖；骨髓瘤细胞只有一种DNA合成途径，即D途径，可无限增殖；杂交瘤细胞具有D和S两种DNA合成途径，它利用其中任何一个途径都可无限增殖。由于HAT选择培养基是在普通培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质配制而成，由于氨基喋呤可阻断D途径，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，而且B淋巴细胞一般不增殖，淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。所以多种不同形式细胞的混合体在HAT选择培养液中，只有杂交瘤细胞能存活下来并不断增殖。

2.2.2杂交瘤细胞的第二次筛选

由于实验小鼠在注射目标抗原前，其体内已存在大量的病原体，因此小鼠体内会存在大量的针对不同种类抗原的免疫B淋巴细胞。所以在细胞融合时产生的杂交瘤细胞的种类也很多，但是只有与目标抗原有特异性的免疫B淋巴细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞才是所需要的。第二次筛选的常用方法：①放射性免疫测定：用于可溶性抗原细胞的单克隆抗体的检测；②酶联免疫吸附试验：用于可溶性抗原、细胞和病毒等的单克隆抗体的检测；③免疫荧光试验：用于细胞表面抗原的单克隆抗体的检测。利用上述方法选出针对目标抗原的抗体的阳性杂交瘤细胞。

[例4]：1975年科学家首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。请观察下图，回答问题：

（1）1984年以来，科学家针对如右图所示的单克隆抗体来自_________，应用于人体，会作为__________产生___________，加速排斥反应，以及完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效治疗的浓度等问题，制备出可用于肿瘤治疗的相对分子质量小的单克隆抗体。

（2）制备单克隆抗体的B淋巴细胞一般从 _______（器官）中采集。从下表看，用于筛选杂交瘤细胞的是特定的__________培养基。

篇5

【摘要】

目的: 制备和鉴定抗His标签单克隆抗体（mAb）， 初步建立检测和纯化带His标签融合蛋白的方法。方法: 用碳化二亚胺法合成His-tag完全抗原， 免疫BALB/c小鼠， 采用杂交瘤技术进行细胞融合， 通过有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水， 用辛酸-硫酸铵法纯化， 并对纯化的mAb进行特异性鉴定。结果: His-tag完全抗原偶联成功， 经细胞融合、 筛选及克隆化， 成功获得1株分泌His标签mAb的杂交瘤细胞株。制备腹水测得腹水效价高于 1∶106， 且此株mAb与其他融合蛋白标签无交叉反应， 并在含His标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论: 成功制备了1株His标签mAb， 为带His标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。

【关键词】 His标签 单克隆抗体 蛋白印迹

His-tag是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽，专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化， His-tag 融合标签与其他标签相比有很多明显优势， 是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种［1］。利用 His标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。目前商品化His-tag的单克隆抗体(mAb)种类不多， 且价格也十分昂贵。因此， 研制出 His-tag的mAb， 在融合蛋白质的研究中具有非常广泛的应用前景。

1 材料和方法

1.1 材料 His六肽为西安蓝晶生物科技有限公司合成; 卵清白蛋白 (OVA)、 牛血清白蛋白（BSA）、 兔抗小鼠 IgA、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3和IgM抗体均购自Sigma公司; HRP标记的羊抗鼠 IgG由河南省生物工程技术研究中心提供; MULTISKAN MK3酶标仪购自Thermo公司; 3326型CO2培养箱购自Forma公司; 硝酸纤维素膜（NC膜）购自Amersham公司; SDS-PAGE电泳仪购自BIO-RAD公司; BALB/c纯系雄性小鼠（鼠龄6～8周， 体质量18～22 g）购自中国医学科学院动物研究所。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成 （1）免疫原的合成: 称取4.4 mg His-tag和5 mg OVA溶于1 mL PB（0.05 mol/L， pH7.0）中， 充分溶解后， 将200 μL含有2.2 mg EDC的PB溶液逐滴加入， 边滴入边混匀， 摇床100 r/min反应4 h， 4℃静置过夜， 用 0.01 mol/L， pH7.0 PBS透析 72 h， 存储于-20℃备用。（2）包被抗原的合成: 合成方法同免疫抗原的合成，载体蛋白为 BSA。

1.2.2 杂交瘤细胞株的建立 按本室常规方法免疫BALB/c小鼠（20～30 μg /只）， 末次免疫后免疫小鼠血清效价达到 1∶10 000以上， 进行细胞融合， 并以间接ELISA法筛选分泌抗 His-tag的阳性克隆。克隆化及腹水制备， 均按实验室常规方法进行。

1.2.3 mAb特性鉴定 （1）效价测定: 以 BSA-His-tag（100 ng/孔）包被 ELISA 板， 腹水从 1∶10 00 开始作10倍稀释。用间接 ELISA法进行测定。（2）mAb特异性鉴定: 用于抗体交叉反应性研究的为常用蛋白标签， c-myc、 多聚精氨酸、 FLAG、 钙调蛋白结合多肽、 β-actin、 谷胱甘肽S转移酶 (GST)、 葡萄球菌蛋白A(SPA)、 麦芽糖结合蛋白、 硫氧化还原蛋白及 Ig的 Fc段， 用间接 ELISA法测定。（3）抗体蛋白纯度测定: 　抗体纯度测定采用 SDS-PAGE凝胶电泳分析。（4）Ig类和亚类的鉴定: mAb类型及亚类鉴定采用双向琼脂扩散试验［2］和用兔抗小鼠 IgA、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3和 IgM酶标抗体的间接 ELISA试验检测。

1.2.4 mAb在检测带His-tag的融合蛋白中的初步应用 （1）酶标抗体的制备及活性测定: 酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法［3］。酶标抗体活性测定方法: 将包被抗原用包被液稀释成100 ng/孔包被96孔酶标板， 4℃过夜， 洗涤后分别加入梯度稀释的酶标抗体， 37℃温育 30 min， 洗涤; 加底物显色 20 min， 加终止液终止反应， 用酶标仪测吸光值。取A值为1.0左右时所对应的酶标抗体稀释倍数为其效价。（2）融合蛋白的检测: 采用蛋白印迹法对本基因工程实验室所纯化的带His-tag的基因工程蛋白进行检测［4］。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞株的建立及mAb的特性鉴定 获得1株高亲和力、 高特异性杂交瘤细胞， 命名为 3A-3。此株细胞经过多次传代、 3次冻存及复苏， 杂交瘤细胞分泌抗体稳定。此株mAb经检测， 腹水效价达到 2×10-6 ; mAb经双向琼脂扩散试验和间接ELISA法检测为: IgG1; 各种融合蛋白标签与His-tag mAb均无交叉反应性; SDS-PAGE电泳结果显示: 抗体纯度≥90%。

2.2 酶标抗体活性测定结果 由酶标仪（双波长450 nm和630 nm）检测A值， 测得酶标抗体活性达106。

2.3 带His-tag的融合蛋白检测结果 Western blot结果显示， 制备的mAb与带His-tag的融合蛋白有较强的特异性反应（图1）。

图1 带His-tag的融合蛋白检测结果（略）

A， C: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;

B， D: Western blot检测结果.

图1B和图1D分别是图1A和图1C的对应。其中11是不带His-tag的阴性对照， 其余所用的12种蛋白均为本实验室纯化的带His-tag的基因工程蛋白。其中1、 10中His6-tag与 RGS—相连， 位于基因工程蛋白N端， 2、 4、 5、 6、 8、 12、 13中His-tag位于基因工程蛋白内部， 3、 7、 9中His-tag位于基因工程蛋白C端。结果表明， 此株mAb与河南省生物工程技术研究中心基因工程实验室所有带His-tag的基因工程蛋白反应均呈阳性， 与不带His-tag的基因工程蛋白无反应， 故此株mAb可以用于检测带His-tag的基因工程融合蛋白。

3 讨论

融合标签根据其相对分子质量(Mr)大小可以分为两大类: 大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段（His-tag等）。虽然有些作用机制尚不明确， 但已证实融合标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、 控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、 使体内生物事件可视化、 提高重组蛋白质的产量、 增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等［5］。标签融合蛋白所具有的上述优越性， 使之成为后基因组时代的重要研究工具， 而抗标签蛋白的mAb也将成为研究相应融合蛋白的主要方法之一。 His6-tag由于其Mr小， 单独不具备免疫原性， 故需将其连接到蛋白质大分子上， 从而借助大分子的T细胞表位， 刺激机体产生特异性抗体免疫应答。本试验采用碳化二亚胺法制备出了人工抗原。从免疫效果来看， 该方法合成的His6全抗原免疫原性较好， 能使机体产生较强的免疫应答， 小鼠抗血清效价（ELISA）达到106以上。应用淋巴细胞杂交瘤技术获得的此株抗His6-tag的mAb， 经鉴定具有效价高、 特异性强、 亲和力高等特点。在含His6-tag融合蛋白的鉴定中， His6-tag的mAb与N端、 内部、 C端带His6-tag的基因工程蛋白均能发生反应， 取得预期效果。此将为后基因组时代大量涌现的新分子的结构和功能研究提供重要的工具， 有很高的实用价值。

目前纯化带His-tag的基因工程蛋白多采用固定化金属螯合层析， 利用过渡态金属离子与组氨酸侧链之间的相互作用进而分离目的蛋白。虽然用此法纯化His6-tag融合蛋白与其他标签融合蛋白相比有很多明显优势， 但此法也有其缺点: 在金属离子存在的情况下， 多聚组氨酸倾向于形成一种hem-like的结构， 这是一种疏水性的结构， 因而与某些蛋白质融合后， 有被埋藏在融合靶蛋白质内部的可能性［5］; 用咪唑洗脱会导致蛋白质的聚集。另外， 带His-tag的基因工程蛋白的纯化率还有一定上升空间， 能否通过His亲和层析柱在尽量低损失的情况下来有效填补空缺， 仍需要进一步的实验摸索。

参考文献

［1］ Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and bio-chemical fundamentals to commercial systems［J ］. Appl Microbiol Bio-technol， 2003， 60: 523-533.

［2］ 余冰宾. 生物化学实验指导［M］. 北京: 清华大学出版社， 2004: 123-124.

［3］ 杨利国， 魏平华， 郭爱珍， 等. 酶免疫测定技术［M］. 南京: 南京大学出版社，1998: 189-210.

篇6

抗菌肽(antimicrobialpeptides)是具有抗菌活性短肽的总称。1975年瑞典科学家G.Boman等人[2]等从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽,并将其命名为cecropin。此后,许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代,有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来,在继续对大型经济昆虫进行研究的同时,又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物,抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点。研究的内容包括:抗菌肽的分离与纯化,氨基酸序列的分析,蛋白质构型与功能的关系,抗菌肽的作用机理[3,4],应用基因工程克隆与表达抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等,其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受重视[5,6]。目前已发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于生物界,包括细菌、动植物和人类。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成,在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用,更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有广谱杀菌作用,大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用,有些则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用。对某些真菌、原生动物,尤其对耐药性细菌有杀灭作用,并能选择杀伤肿瘤细胞,抑制乙型肝炎病毒的复制。

1.抗菌肽的分类

迄今为止从不同生物体内诱导的抗菌肽已不下200种,仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。根据抗菌肽的结构,可将其分为5类:(1)单链无半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由无规则卷曲连接的两段а-螺旋组成的肽。该类包括天蚕素Cecropins,Magainins等。Magainins最初是从非洲爪蟾的皮肤中发现的,它是爪蟾的皮肤在一定的环境压力下分泌出的抗感染和促进伤口愈合的成分,由两个紧密相连的肽链组成,每一个肽链有23个氨基酸,低浓度便可抑制许多细菌和真菌生长[7]。(2)富含某些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)残基的抗菌肽。如从猪肠内分离的抗菌肽PR39中Pro含量占49%[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly[8]。(3)含一个二硫键的抗菌肽,该二硫键的位置通常在肽链C端。如爪蟾皮肤细胞中产生的Brevinins[9]。(4)有两个或两个以上二硫键,具有β折叠结构的抗菌肽。如绿蝇防御素(Phormindefensin),分子内有6个Cys形成3个分子内二硫键,肽链C末段是带有拟β转角的反向平行的β片层[10]。实验证明,分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要。(5)由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。

2.抗菌肽的作用及机理

2.1抗菌肽的抗菌作用及其机理抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道,造成细菌细胞膜结构破坏,引起胞内水溶性物质大量渗出,而最终导致细菌死亡。抗菌肽分子首先结合在质膜上,接着其分子中的疏水段和两亲性α-螺旋也插入到质膜中,最终通过膜内分子间的相互位移,抗菌肽分子聚集形成离子性通道,使细菌失去了膜势而死亡[10-14]。但是,Gazit[15]等得出的实验结果表明,抗菌肽只是结合到了单位膜的表面上,并未插入膜中,更未形成通道。然而,抗菌肽的作用靶部位是细菌细胞质膜,以及抗菌肽的作用结果是导致细菌细胞质膜通透性增大等基本内容是确切无疑的,这也正是抗菌肽与青霉素等传统抗生素对细菌作用机制不同的本质所在。2.2抗菌肽的抗病毒作用及其机理研究发现烟芽夜蛾幼虾的血淋巴对6种DNA、RNA病毒有明显的抑制作用,使病毒感染力迅速降低,而且这种抗病毒活性具有广谱性。Mariam[16]试验表明来源于爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins类抗菌肽具有抗疱疹病毒-HSV的作用,还发现人的嗜中性粒细胞防御素(HNP-1)对一种疱疹病毒有抑制作用。此外,蜂毒素和天蚕素也可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达,从而抑制减少HIV-1的增殖。这表明抗菌肽对于当今人类的顽症———艾滋病也有抑制作用。

2.3抗菌肽的抗寄生虫作用及其机理抗菌肽可以有效地杀灭产生人类及动物寄生虫病的寄生虫,如疟疾、Chagas氏病、莱什曼病等。目前发现一种合成的天蚕素-蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫有损伤作用,起作用的靶目标是细胞质膜,它可以快速降低H-OH+的通透性,破坏膜电势,质膜形态也受到损坏。Shahabuddin[17]研究发现昆虫抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的不同时期有不同的作用,主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显的损伤。

2.4抗菌肽对肿瘤细胞作用及其机理国内外已对抗菌肽杀伤肿瘤细胞的作用进行了广泛研究,发现抗菌肽对体外培养的癌细胞的作用主要是使癌细胞膜上形成孔洞,内容物外泄,线粒体出现空泡化,嵴脱落。核膜界限模糊不清,有的核膜破损,核染色体DNA断裂,并抑制染色体DNA的合成,细胞骨架也受到一定程度的损伤[18,19]。通过对荷瘤小鼠的研究证明,抗菌肽能显著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的积累;对S180肉瘤和U14宫颈癌的抑瘤率亦达30%-50%[20]。抗菌肽还可以调动机体的免疫机能,从体液免疫方面来抵抗癌瘤的入侵。

3.抗菌肽基因的融合表达

抗菌肽的天然产量低,合成或从机体中提取步骤复杂、产率低、价格相当昂贵,利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。抗菌肽所携带的碱性氨基酸使其对蛋白酶非常敏感,必须采用融合表达策略以抵消其碱性并降低其对宿主细胞的毒性。

谢维等合成了家蚕抗菌肽CMIV基因,并将其克隆到金黄色葡萄球菌A蛋白和IgG亲合的结构域ZZ的融合表达载体中,得到Pezz318-CMIVV质粒,以此质粒转化E.coliHB101,得到ZZ-CMIV融合表达的蛋白,用CBr切割后,得到CMIV肽。李秀兰等[21]对天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改动,根据E.coli偏爱的密码子人工合成了肽基因片断,重组到测序载体,再将此片断重组到表达载体Pet28上进行表达,融合蛋白经CNBr裂解后,具有与天然抗菌肽相同的生物活性。吴映雅等将柞蚕抗菌肽D基因连接在牛成纤维细胞生长因子cDNA的上游,在酵母中成功地得到了表达,表达产物具有抗菌活性和牛成纤维细胞生长因子的抗原性。Kevin等[22]HNP(humanneutrophilpeptide1)和CEME(syntheticcecropin/melittinhybrid)分别与GST(glutathione-S-transferase)、ORRF、IgG结合序列及SPA(staphylococcalproteinA)在E.coli或S.aureus中融合表达,结果在S.aureus中虽实现了与SPA的融合分泌表达,但表达产量较低;Zhang等[23]选择RepA蛋白的序列作为抗菌肽的融合表达伴侣,并插入Histag等序列作为纯化亲和位点,实现了在E.coli中的融合表达。ChristsnenB等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一个供体抗菌肽的活性都高。

4.抗菌肽转基因研究

王志兴等把大麦α-淀粉酶的信号肽序列和抗菌肽CecropinB基因或HhivaA基因构成嵌合基因,并把此基因导入马铃薯,结果加信号肽序列的CecropinB转基因植株发青枯病延迟,病情指数降低。Yarus等[24]用显微注射法将牛气管抗菌肽基因转入小鼠,转基因鼠在牛气管抗菌肽基因控制序列的驱动下成功的表达了牛气管抗菌肽,在鼠乳中的牛气管抗菌肽对大肠杆菌具有抗菌活性。Reed等研究了以IL-2启动子/增强子控制转基因鼠中抗菌肽的合成及随后对布氏杆菌的抑制作用。Reed[25]构建了这样一个DN断:Shivala片断,SV40多腺苷酸化/剪切信号肽基因片断,此片断加到鼠IL-2基因5’侧-593─+110区域。在受精卵精前核时将此融合基因注入受精卵(微注射法),得到26系小鼠。RT-PCR检测:有两系转基因鼠,当其脾淋巴细胞置于3.25mg/kg的conA(刀豆蛋白,一种抗原诱导物)时,可以诱导产生成熟的ShivalamRNA。用一定量的布氏杆菌接种时,有两系小鼠遭到攻击。四星期后,在转基因鼠脾脏组织布氏杆菌比非转基因鼠少得多(P<0.05)。DavidWinder等[26]把编码Ceropin或Melittin的基因放置在MLV(鼠白血病病毒)的启动子下,转染到EJ细胞(人膀胱癌细胞),然后把这些细胞注入到裸鼠内,发现这些肿瘤细胞停止生长或生长减弱DavidWinder等用PCR扩增,Prepromelittin(PPM前蜂毒素原),Premelittin(PM前蜂毒素)和Prececroppin(PC前抗菌肽)三种核酸片断,均置于MLV启动子下构建融合基因转染进EJ细胞。三种类型的EJ细胞分别注入裸鼠后,测定50d后的肿瘤生长情况,无抗菌肽基因片断的EJ细胞(对照组)致瘤率为70%,带Cecropin基因片断的EJ细胞致瘤率只有39%,PPM为50%,PM为65%,其抑制肿瘤的效果明显。

5.抗菌肽的应用前景

目前,大部分植物抗菌肽是从植物种子中分离获得的,它们可以保护植物组织和种子不受真菌病原菌的侵害,但是植物抗菌肽对大部分细菌无抑制活性。因此,依靠基因工程的方法用其它真核生物的抗菌肽基因来转化农作物,培育抗病新品种是当前国内外研究的一个热点。

动物抗菌肽和干扰素、补体一样是机体非特异性天然防御系统的重要组成部分。机体受损伤或病原微生物入侵时,能迅速产生抗菌肽来杀伤入侵者,它对正常真核细胞几乎没有作用。另外,因为抗菌肽的合成速度非常快(假定核糖体上肽键合成速率不变,抗菌肽的产生比IgM要快100多倍),［27］而且小肽的扩散比大的蛋白质和免疫细胞更加迅速,作用更显灵活,所以Boman曾指出,抗菌肽是机体的一种理想的一线防御物。与普通抗生素相比,抗菌肽的“抗菌谱”更广,除了抗细菌外,有的抗菌肽还能作用于真菌、原虫、有包膜的病毒及癌细胞(对癌细胞的选择性作用可能与其细胞骨架的改变有关),同时能加速免疫和伤口愈合过程。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒、抗感染等方面具有良好的应用前景。更为重要的是,由于抗生素的滥用导致菌株产生了抗性,人们需要寻找新的抗菌药剂。抗菌肽这种从生物体中获得的物质恰巧具有独特的抗菌机理,不是像一般的抗生素那样通过阻断生物大分子的生物合成来发挥作用,因而极有希望开发成为一类新型的广谱高效抗菌药物。

随着研究工作的进一步深入,可以预见,抗菌肽及其基因工程在医药、卫生、食品工业及农业等方面将会发挥更为重要的作用。另外,有些抗菌肽分子中含有D-氨基酸,这也为研究D-氨基酸如何在核糖体上合成多肽提供了一个理想的模式体系。

6.研究展望及存在问题

抗菌肽是哺乳动物防御系统的一个重要组成部分,具有热稳定、水溶性好、广谱杀菌甚至有的能杀真菌、原虫等优点,而且许多抗菌肽在100℃加热10min条件下仍能保持一定活力,且对较大的离子强度和较低或较高的pH都有较强的抗性,而对真核细胞几乎无作用,仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,并且与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机制完全不同,病源菌不易对其产生耐药性,由此显示了它具有独特的研究和应用价值。近20年来,人们对昆虫抗菌肽已进行了比较系统的理论和应用研究,但有关畜禽抗菌肽基因工程应用研究方面的报道较少。从哺乳动物抗菌肽特有的性质,显示了它具有以下几个方面在畜牧生产上的研究和应用前景。研究展望及存在问题

6.1药用前景随着传统抗生素的广泛及长期的应用,许多病源菌对它们产生了耐药性,而具有广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具明显优势。随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深化,设计一种高效的、有利于人类健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。

6.2转基因研究及应用仔猪腹泻、奶牛炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等一直是棘手的疾病,不利于畜牧业的发展。借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程,如转基因蚊子、转基因马铃薯、转基因水稻等,把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达,从而产生抗病新品种,不失为一条发展畜牧生产的新思路,前景深远。

6.3抗菌肽基因表达调控及抗菌肽添加剂研究研究表明,［28］抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生物平衡,并易在动物体内残留,严重影响了畜产品的品质和人类的健康。用基因工程方法生产环保型抗菌肽添加剂,或者,通过日粮因素调控抗菌肽基因的表达而达到畜产品无抗素化值得进一步研究。

然而,由于抗菌肽分子小,分离提纯存在一定的困难,故天然资源有限。化学合成和基因工程法获得抗菌肽是主要手段,但化学合成抗菌肽成本高,而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因,则可能对宿主有害而不能获取表达产物。所以,对抗菌肽的结构、构效关系及作用机理还需进一步研究。7.结束语

抗菌肽是生物体对外界病原物质侵染而产生的一系列免疫应答反应产物,它的出现为人们寻找理想的抗菌药物提供新的领域,尤其是当今许多抗生素产生了耐药性,因此抗菌肽具有巨大的应用潜力。基因工程技术的发展,极大的促进了抗菌肽的研究和开发,通过抗菌肽基因的克隆与表达而大量生产成为可能。虽然抗菌肽目前还不能直接应用于养殖业,但抗菌肽独特的作用机理不易产生耐药性的特性将吸引科研工作的不断深入,可以相信抗菌肽将在动物养殖和提高畜产品品质方面发挥重要作用。

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篇7

关键词：高中生物;知识;链接

在教学中，依照章节的次序，让学生学习、归纳生物学基本事实，让生物学原理与概念有机结合，从中探寻知识的规律组成，发现当前生物应用技术与生物科学理论的建构模式，掌握生物学发展动向，帮助学生梳理各个知识点，强化理解能力，稳固而扎实地获取知识。将高中生物知识的各个环节通过一定教学方法来完成链接，让系统化、层次分明的知识网络形成于学生的头脑，提高学生的逻辑思维以及对知识按照先后顺序进行统一的能力。

1.创建知识链接

1.1形成章节内的知识链。知识链是指将生物学核心概念、基本原理、基本事实及运动过程等用文字箭号的形式串联起来，用来表现生命结构的特征及生命运动的特点，或人们利用生物学的原理来解决实际问题的过程。这种归纳方式简单明了，脉络清晰，是生物学教学中常用的一种手段。如在学习基因工程、动物细胞工程、胚胎工程等生物技术过程中，可引导学生尝试形成以下有关的知识链，例如基因工程部分，基因获取目的、基因构建的表达方式与载体、基因导入受体细胞、基因鉴定及检测，最后进入转基因部分;动物细胞核移植的知识链接创建，从动物体细胞过渡到MⅡ卵母细胞，分析细胞重组与胚胎、细胞代孕、动物的克隆技术等;胚胎移植部分，早期胚胎代孕母体子代;胚胎分割：早期胚胎二、四、八等份胚胎代孕母体子代;胚胎干细胞分离和培养：早期胚胎胚胎干细胞组织器官某器官缺陷的个体。用知识链形式归纳，可以将复杂的操作过程简约化，有利于学生的理解和记忆。

1.2寻找知识联系的“节点”。要建立起不同知识链之间的联系，关键是寻找知识链之间的联系的“节点”。所谓节点，就是指联系两条或几条知识链之间的关键概念、过程或原理，通过节点，可以梳理几条知识链之间的关系，就像交通要道的十字路口，方便地从一条知识链到达另一条知识链。上述的基因工程、细胞工程、胚胎工程中的几条知识链之间如何进行链接？可以通过引导学生探究如下问题来寻找链接的“节点”：⑴利用基因工程技术获得转基因哺乳动物常用的受体细胞是什么？受体细胞怎样对目的基因进行操作才能够发育形成转基因动物？⑵应用动物细胞核移植技术最终完成动物克隆时，完成重组的早期胚胎培养场所是怎样的形式？继续的发育场所是什么？⑶胚胎分割在什么时期进行操作的？分割后的早期胚胎如何处理才能得到遗传性状完全相同哺乳动物？⑷提取胚胎干细胞一般在什么时期？它有什么意义？通过探究可以发现，培育转基因动物和克隆动物，受体细胞或重组细胞都是在体外培养成早期胚胎，然后再移植到代孕母体内发育的。而胚胎分割和胚胎干细胞其实都是在早期胚胎水平上的操作的。这样就可以将“早期胚胎”作为一个节点，把几条知识链联系起来，达到链接的目的。

1.3链接不同的知识链。知识链接就是将不同的知识联系起来，这种链接可以是章节内的，也可以是跨章节的。通过寻找知识联系的节点，建立起不同知识链的沟通。有时几条知识链之间的节点并不特别明显，这就需要分析，仔细研究它们的关系，找出最关键的联系节点。找到“早期胚胎”这样一个关键的节点后，可以引导学生进行这样的链接：⑴进行胚胎移植的早期胚胎可能有哪些来源？⑵早期胚胎有几种去向？就可以从早期胚胎的来源和去向这两个方面来联系：哺乳动物早期胚胎可以通过正常的体内受精作用或体外受精收集到，也可通过基因工程或细胞工程获得的改造后细胞在体外培养而成。早期胚胎移植到母体内，由代孕的母体生出子代个体，就是说，通过基因工程和核移植培养的早期胚胎，只有通过胚胎移植过程，才能发育成所期望的哺乳动物。胚胎分割和胚胎干细胞分离和培养都是在移植前对早期胚胎的处理，以获得更多的遗传性状相同的子代，或定向分化成组织器官，后者用以对有缺陷的动物进行器官移植。如下图所示。

2.知识链接的几种类型

2.1直链式链接。几条知识链通过关键的节点链接后，仍然为直链的链接方式。直链式链接结构简单，知识梳理清晰，特别适宜进行一章或一节内的知识联系，在一章或一节的复结中常使用。例如植物和动物的内在相关能量转变过程为光能、电能以及ATP等物质的活跃，化学能在ATP等物质中的活跃，光合作用的暗反应以及大部分有机物含有的稳定化学能ATP中的活跃化学能（动植物的呼吸作用）;ATP中的活跃化学能机械能、光能、电能、化学能（动植物细胞中能量的利用）。通过链接完成生物体之间能量转变的过程，例如光能、电能以及ATP等物质内含有的活跃化学能;大部分有机物内含有的稳定化学能、活跃于ATP物质中的化学能、机械能、光能、电能以及化学能等。

2.2放射式链接。若干条知识链之间不形成紧密的联系，每条知识链只表现生命活动的某一方面，几条知识链由一个关键的节点链接后，形成放射式链接结构，就可以说明完整的生命活动过程，这种形式特别适宜建立不同章节之间的联系，在总复习课中经常使用。如血糖的调节过程，体温调节过程，水和无机盐调节过程，PH调节过程，免疫调节等几条知识链，可以通过“内环境稳态”这一节点联系起来，因为这些调节过程都是维持内环境稳定的重要方面，只有多种调节过程维持正常，才能表现内环境的稳定。如下图所示。

2.3网络式链接。不同的知识链，由关键的节点链接，各条知识链之间的关系错综复杂，不止在一个知识点处有关联，于是就形成了复杂的网络式结构，这种链接适宜跨模块或跨章复习时的归纳总结。如上述基因工程、动物细胞的核移植、胚胎工程之间的知识联系就是这种链接。

2.4体验式链接。体验式链接亦可称为体验式教学，它强调利用课堂体验来提高学生对于学习的主动性，以兴趣培养为前提，巩固生物知识的链接基础。体验式链接的内涵在于，教师充分向学生展示日常生活中可以见到的生物学相关知识，理解生物学与日常生活之间的关联，利用体验式教学来为知识链接注入活力，创造轻松愉快的生物课堂。体验式链接能够有效利用到学生原有的生物知识结构，通过实验和体验来将知识结构横向拓宽，为链接下一部分的知识打下基础。另外，体验式链接能够为学生带来一些反思，快速找到当前生物知识尚且存在的不足，通过对学生的引导，端正学习态度与学习的方式方法，创造一些可以利用到生物知识经验的教学场景，进而提高生物课堂的整体性与关联性，让知识链接得以事半功倍。

篇8

[关键词] 生物技术 畜牧兽医 应用

[中图分类号] S8-1 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2014）01-0242-01

随着DNA重组技术等生物技术的快速发展，生物技术产品被广泛应用于饲料工业、畜禽疾病控制、动物生产等领域，并在其中发挥着巨大的作用，有效的提高了畜禽的生产能力、饲料的产量和质量，减少了畜禽疾病的发生率和死亡率，改善了环境污染。生物技术在畜牧兽医领域中的应用主要有以下几个方面。

一、生物技术在动物育种中的应用

动物育种中广泛应用的生物技术主要有转基因技术、动物克隆技术、DNA重组技术以及胚胎工程技术等等。运用现代生物技术进行分子育种可以有效的改善传统育种方式中的培育周期长等问题，大大的加快了育种的进展，提高了育种的质量。比如，利用生物技术可以把特种功能的基因簇或者是单个基因插入某个生物品种的基因组中，并成功表达，再运用相关的生物技术进行诊断和检测，选择出能够达到预期标准的小组，不仅可以有效的提高育种的准确性，加快育种的速度，还能提高畜牧品种的生产能力和经济性状。

二、生物技术在操纵动物生产中的应用

生物技术操纵动物生产主要表现在运用相关生物技术对动物原有的内在和环境系统进行目的性的干预，使动物机体所达到的新的代谢平衡向人类期望的方向移动。比如，通过生物技术人工合成的生长激素，可以达到和动物天然的生长激素相同的作用，可以有效的促进动物的生长，降低动物的采食量，并且对动物及人类健康都不会产生不良影响，有效的促进了畜牧业的发展。

三、生物技术在防治与诊断动物疫病中的应用

在防治动物疫病方面，运用生物技术培育的基因工程兽用疫苗与常规疫苗的生产相比生产周期更短，疫苗的种类更多，效果更强大，并且降低了由于残毒和污染而造成的生物污染的机率。常见的有预防禽痘病毒的活病毒载体重组疫苗、基因缺失疫苗、核酸疫苗等等。在畜禽疾病诊断方面，随着生物技术发展而产生的限制酶分析法、免疫印迹法、核酸探针法以及聚合酶链反应法等多种分子生物学的诊断方法都是畜禽疾病有效的诊断方法。

四、总结

生物技术是一门神奇而复杂的综合性技术，生物技术应用在畜牧兽医领域中，不论是在动物育种、动物生产、动物疫病的防治与诊断，还是在新生物制品和制剂的研制上，都发挥着重要的作用，生物技术为畜牧兽医领域的发展有着巨大的推动作用。

参考文献

篇9

关键词：鸡柔嫩艾美耳球虫；疫苗；基因重组苗

中图分类号： S859.797 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2013）-08-82-2

鸡球虫病是由属于顶复门、孢子虫纲、真球虫目、艾美耳科、艾美耳属的原虫寄生于鸡肠道引起的疾病，由于其造成雏鸡大量死亡，耐过的鸡只因为消化功能障碍，饲料转化率下降，生长发育缓慢而出现生产性能下降问题，给养鸡业造成巨大损失。感染鸡的球虫主要有柔嫩艾美耳球虫（E.tenella），堆型艾美耳球虫（E.acervulina），早熟艾美耳球虫（E.praecox），巨型艾美耳球虫（E.maxima），布氏艾美耳球虫（E.brunetti），毒害艾美耳球虫（E.necatrix）以及和缓艾美耳球虫（E.mitis）[1]。其中，柔嫩艾美耳球虫虫株是该属球虫中毒力最强、危害性最大的虫种，并且与其他球虫株之间几乎无交叉反应，给养鸡业带来极大的危害，据Allen报道全世界每年因此病造成经济损失超过80亿[2]。

1 重组表达亚单位疫苗

基因重组表达亚单位疫苗是利用DNA重组技术，将编码E.tenella保护性抗原基因导入受体细菌或者细胞，使其在受体中高效表达，分泌保护性抗原肽链，然后提取保护性抗原肽链，加入佐剂即成。基因重组表达亚单位疫苗的候选基因有5401、SO7、3-1E、 MZ5-7和表面抗原SAG5、SAG10、SAG13、SAG 14等。

H. D. Danforth[3]等于1989年开启了对鸡球虫基因重组表达亚单位疫苗的篇章，他们把柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原5401导入到大肠杆菌中与β-galactosidase 融合表达，添加弗氏完全佐剂配制疫苗，经该重组疫苗皮下免疫一次的鸡在攻毒后的损害评分明显低于对照组，增重效率则明显高于对照组。Du Aifang [4]等，使用编码艾美耳球虫5401抗原转入到致弱沙门氏菌中制备的重组疫苗，试验表明最多有55%的保护力。

SO7是位于子孢子折光体上的一种抗原。M. S. Crane[5]等的研究发现重组表达的E. tenella SO7抗原免疫鸡只，不但能保护受到同源株攻毒的鸡，同样也能保护受到E. acervulina， E. maxima 和 E. necatrix攻毒的鸡。Christian Klotz[6]等， 用SO7抗原与两种不同的真核表达载体构成的重组疫苗，做免疫保护性试验，均能够减少排卵量，具有部分保护力，而且对其他球虫也有一定的交叉保护，说明SO7抗原可以作为候选疫苗。

麦博等[7]将E.tenella表面抗原SAG10做原核表达后将重组蛋白以lOOug/只肌肉注射免疫雏鸡，攻虫后观察免疫效果，免疫组抗球虫指数为152.13。说明重组表达的EtSAGl0可诱导雏鸡产生一定的抗球虫免疫保护。E.tenella表面抗原SAG13和SAG14[8]，SAG2和SAG7[9] SAG5[10]做原核表达，将可溶性蛋白免疫雏鸡，攻毒后检测其重组蛋白的免疫保护效果，结果表明，这些重组表达蛋白均有一定的抗球虫保护力。

Millter[11]等于1989年用抗Etenella子抱子28KD的单抗Mabl209从cDNA文库中筛选出GX3262基因，表达的融合蛋白分子量为115kDa，试验表明用该重组抗原免疫幼龄肉鸡对感染艾美耳球虫卵囊产生明显的部分保护作用。

B. M. Subramanian[12]等的研究发现一个来自于E. tenella 微线体的能激发宿主鸡的体液和细胞免疫反应的抗原EtMIC1，重组表达的EtMIC1能提供受试鸡部分的免疫保护。

Ralf.Hosse[13]等首次克隆表达出柔嫩艾美耳球虫的89kDa亲环蛋白 EtCTP89，在E.tenella整个生活史中表达，其从CsA到Cyps具有紧密联系，研究表明亲环蛋白A具有抗球虫作用。Nishinaka S[14]等从母系的无胸苷激酶活性的R27H1和 R27H4与鸡的B细胞系MuH1 和MuH4融合制备单克隆抗体，研究表明能产生IgG。Clarke Lorraine E等克隆EtHL6抗原，该抗原能在Eimeria tenella的子孢子和第二代裂殖子阶段表达，结果表明具有一定的保护作用。

2 重组DNA疫苗

重组DNA疫苗是将一种或者几种抗原基因重组到表达载体，直接或经包装注入体内表达出相应抗原，诱导机体产生免疫应答。

X. Ding [15]等用E. tenella微线体抗原基因EtMIC-2构建的DNA疫苗载体进行卵内鸡胚免疫，结果表明其能提高雏鸡攻毒后10天和17天的抗体水平，同时排卵量下降，增重提高。

3-lE是E.tenella子抱子与裂殖生殖阶段的表面抗原，氨基酸序列全长1086bp，含有一个由170个氨基酸组成的开放阅读框架。Song [16]克隆3-lE基因构建 pMPI3-3-lE重组质粒 ，插入到pBK-CMV载体中 ，以不同的免疫剂量和免疫方式免疫1日龄雏鸡 ，14日龄时功毒， 10d后，检测机体的抗体，结果表明不管何种接种方式 ，均能检测到最高的循环抗体水平。说明3-lE基因能够促进机体免疫系统产生免疫保护作用。D. Ma [17]用共表达3-1E和IL-15的DNA疫苗载体免疫试验鸡的结果表明其免疫保护效果（用ACI评价）比仅表达3-1E抗原的DNA疫苗的保护效果更好。Geriletu [18]用共表达E.tenella抗原基因MZ5-7和IL-17的DNA疫苗载体免疫试验鸡，7天后鸡脾细胞的IL-2和IFN-γ表达量上升，攻毒后免疫组的抗球虫指数也明显高于对照组，而且共表达IL-17的DNA疫苗比仅表达MZ5-7抗原的DNA疫苗的保护效果更好。徐守振[19]增出有3-l E抗原基因和鸡IFN基因融合克隆到真核表达载体 proVAX中构建双价融合表达质粒 proIE。将proIE于14、21日龄免疫AA肉鸡，28日龄观察免疫保护效果。结果显示， proIE双价融合DNA疫苗具有增强免疫保护作用，可显著降低粪便中的卵囊排出量（P

TA4 是柔嫩艾美耳球虫通过二硫键连接5kDa和17kDa两条多肤形成的子孢子的一种表面糖蛋白。S. Q. Wu[20]的研究发现表达E.tenella抗原基因TA4的DNA疫苗pcDNA3.1-TA4和pcDNA3.1-Et1A-TA4经肌肉免疫能提供试验鸡部分免疫保护效果，抗球虫指数（ACI）达到160。Xu Qianming [21]用嵌合有艾美耳球虫TA4和IL-2基因的联合表达疫苗诱导鸡体对球虫病的免疫力，结果表明TA4基因是有效的疫苗表达抗原，该抗原和细胞因子联合表达能增强DNA疫苗的免疫力，是一个不错的方法。

λMZ5-7是在第二代裂殖子阶段表达的一种分泌性蛋白（MZP）。秦睿玲[22]将λMZ5-7连接到pVAX载体构建重组质粒pVAX-Mzp5-7，用该重组质粒肌肉注射机体内表达，免疫试验表明该质粒对鸡柔嫩艾美球虫的攻击有较好的免疫保护作用。

L Yang [23]克隆广东株Eimeria tenella的子孢子折光体抗原Etp28基因与AcMNPV-OCC（-））构建重组表达体GST-6xHis-Etp28免疫鸡只，实验表明具有部分保护作用，可以作为候选疫苗。Yang Guilian [24]，用重组鸡痘病毒表达艾美耳球虫菱形基因能够诱导免疫反应，证明有部分保护作用。D.G..J. Breed[25]， 筛选出4段不同的基因片段用于免疫鸡只，都能诱导出强烈的T细胞反应，其中有一段分子量是26到30kDa的基因片段，试验表明能够极大的减少盲肠病变。Alireza Talebi[26]，用编码抗原的基因合成多肽疫苗用于预防鸡只，分别用Eimeria acervulina 和Eimeria tenella 功毒，结果是能产生很高水平的抗体，细胞内反应具有部分交叉免疫保护作用。

3 展望

从80年代开始研究鸡球虫基因工程疫苗至今，取得了很大的成果。艾美耳球虫重组疫苗研究表明以这些抗原基因制备的亚单位疫苗和DNA疫苗对鸡球虫攻毒具有一定的免疫保护作用，但所有这些研究中的重组疫苗都还达不理想的保护效果，离临床应用还有较大距离。艾美尔球虫的基因工程重组疫苗研究之所以至今未有突破性进展，我们分析主要有三方面的原因：其一，目前对艾美尔球虫重组疫苗的研究大都是基于偶然发现的一些单个抗原基因进行的一些试验性免疫效果研究，缺乏对艾美耳球虫所有抗原的系统化研究基础。其二，由于球虫的生活史比较复杂，球虫发育的每一阶段都具有免疫原性，对球虫感染诱发保护性免疫起关键作用的可能不只一种抗原，可能需要多种抗原的共同作用才能诱发保护性免疫反应。其三，对球虫感染宿主的机制现在仍然不清楚，这也是制约柔嫩艾美耳球虫疫苗研究的一大难题。随着分子生物技术的不断发展和对球虫基因的研究不断深入，最终能研究出高效的基因重组疫苗。

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篇10

小小杆菌　偏食何道

根癌农杆菌生活在土壤――特别是耕种过的田地里，因为经过耕种的土壤疏松，适宜根癌农杆菌生长。根癌农杆菌的身体为棒状，有两三个微米长，靠几根鞭毛运动，鞭毛一般生在侧边。用显微镜放大到1000倍时，人们就能把它看得很清楚了。

根癌农杆菌虽小，也有细胞壁，按以前的生物两界分类法，它当然属于植物界，就是说，它曾被当作是一种低等植物。

在许多双子叶植物靠近地面的根茎交界处，根癌农杆菌能诱发一种帽状肿瘤，人们称之为冠瘿瘤病。这种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积发生，造成很大的危害。在其他地方，甚至城市园林绿化中，也有不少植物患上此病。

人们发现，根癌农杆菌所产生的冠瘿瘤病，与豆科植物根部的固氮根瘤细菌所产生的根瘤相似；然而，事实上，两者的作用方式并不一样。

豆科植物的固氮根瘤菌会钻到植物细胞内部，与植物细胞共生，根瘤细菌为豆科植物提供氮肥，植物细胞则供给根瘤细胞其他各种营养。

根癌农杆菌虽然也能诱发植物肿瘤，细菌却并不侵入到植物细胞里面去。

这到底是怎么一回事呢?

原来，根癌农杆菌是一群特别偏食的家伙，最爱吃一类叫冠瘿碱(氨基酸衍生物)的物质。对于根癌农杆菌来说，这种物质既是丰富的碳源，又含足够的氮元素，能够很好地满足它们的生活所需。

可是，到哪里去找冠瘿碱呢?一般情况下，正常生长的植物体内是没有冠瘿碱的。不过，这一点也难不倒根癌农杆菌。

农杆菌的细胞内除含通常的染色体外，还含有一种Ti质粒。质粒是许多原核生物细胞内具有的一类小型的环状DNA，虽然它们对原核细胞本身并非是必需的，却常常具有特殊的功能。农杆菌细胞内的Ti质粒上面就有一段能够专门指导合成冠瘿碱的基因。T是英文tumor(肿瘤)的缩写，i是induce(诱发)的意思。Ti质粒就是诱发肿瘤的质粒。

可以说，Ti质粒就是农杆菌获取美食的魔圈法宝。

设备简陋　草船借箭

由于根癌农杆菌属于原核生物，细胞内“设备”简陋落后，缺乏叶绿体、线粒体等各种细胞器，甚至连像样的细胞核都没有，根本合成不了冠瘿碱这种特殊的食物。

怎么办呢?农杆菌并不发愁，因为它会“草船借箭”：通常，受伤的植物组织会产生酚类化合物。不远处，一头牛刚好蹭破一棵小树的树皮，还有害虫咬破了一棵幼苗的表皮细胞。万事俱备，正好东风吹来，一股一股的乙酰丁香酚的气息飘来。“哇，好香啊!一定是那里的植物细胞有隙可乘，让我们快快行动起来吧!”农杆菌们兴奋起来。

靠它们的鞭毛，没几个小时，根癌农杆菌们就在植物伤口的若干位点上附着了。附着好之后，它们立刻拿出内部的魔圈法宝――Ti质粒挨近一个个植物细胞。Ti质粒上的VirA，VirG基因首先活跃起来，接着激活了Vir区各个基因的表达，一些基因开始转录翻译生成一些酶，这些酶帮助从质粒环上复制出单链的T-DNA，这里的T是Transfer(转移)的意思，T-DNA链就是待转移的DNA链；T-DNA链又与virE2蛋白结合形成T复合物；T复合物由细菌细胞中分泌出来进入植物细胞，接着又被摄入细胞核：奇妙的是，T-DNA一旦进入植物细胞核，就很容易地被整合进植物染色体基因组中去了；然后，借用植物细胞内的各种细胞器，包括内质网、高尔基体等等先进设施，植物细胞基因组上这段T-DNA基因开始表达产生冠瘿碱，同时还生成许多植物激素。植物细胞在这些激素的作用下被追加速分裂生长，结果形成了肿瘤，即冠瘿瘤。

由于每一个植物肿瘤细胞中也都含有指导冠瘿碱合成的那段基因，于是合成了更多的冠瘿碱。这时，根癌农杆菌可以在植物细胞外面守株待兔等着吃源源不断的可口美餐了。

有趣的是，根癌农杆菌还有一个同属兄弟，名叫发根农杆菌。它这兄弟也喜欢嗜食冠瘿碱类物质，只是它们使用的方法不同。发根农杆菌不是在植物根茎部诱发肿瘤，而是在土壤深处的根部诱发毛状根。

发根农杆菌细胞内的Ri质粒(Root Inducing plasmid)一样能向植物细胞中转移基因，诱发的植物毛状根细胞内同样能大量合成冠瘿碱，满足自己的需要。

基因载体　屡立奇功

在许多植物基因工程中，都需要利用基因载体来转移目的基因。基因载体的种类很多，比如向大肠杆菌、酵母菌内转移基因，人们一般利用噬菌体；向高等植物转移基因，最好的载体就是农杆菌了，包括根癌农杆菌和发根农杆菌。

人们把农杆菌Ti质粒(或Ri质粒)上指导合成冠瘿碱的那段基因替换成我们要转移的目的基因，比如某种抗虫基因，同时把诱导植物肿瘤(毛状根)的基因去掉，这样转基因植物就能表现出我们要求的性状，而不会产生冠瘿瘤(或毛状根)了。

过去，棉花遭受棉铃虫的危害，损失严重。苏云金杆菌的体内有一种杀虫蛋白基因Bt，其合成的杀虫结晶蛋白会让蚕食植物的害虫得厌食症而死。这是多好的杀虫基因啊，要是能转到农作物中就好了。可是，在过去，人们不能把它的杀虫基因转到植物细胞里面。后来，科学家想到了农杆菌。切掉“魔圈”上的冠瘿碱合成酶基因和植物激素合成基因，换上苏云金杆菌的杀虫基因，就能让农杆菌协助人类把杀虫基因转到棉花小苗中去了。等到棉花结铃，棉铃蛾飞来产下棉铃虫卵。新一代棉铃虫孵化出来后，开始吃含有杀虫基因的棉花叶片和棉铃，结果肚子疼起来了，然后滚落在地死掉了。

“锄禾日当午，汗滴禾下土。”农民伯伯种地，最辛苦的事情莫过于为庄稼除草了。要是能发明一种除草剂，喷洒到地里，既能清除杂草又不伤害庄稼，那该有多好啊。这不，科学家发现，一种土壤潮湿霉菌体内有抗草丁膦这类除草剂的基因bar。科学家就找来农杆菌，请它帮助把土壤潮湿霉菌的基因bar转到烟草体内。农杆菌也很快地把抗除草剂的基因转到了烟草体内。

此外，人们在一种突变的鼠伤寒沙门菌体内发现了抗另一类除草剂草甘膦的基因aroA，农杆菌也可以帮助人类把基因转移到作物中去。

自从种植了含有抗除草剂基因的庄稼，农民再也不用辛苦地除草了。