细胞遗传学技术在急性白血病的应用

急性白血病（acuteleukemia，AL）是造血干细胞恶性克隆性疾病，为发病率占首位的小儿临床恶性血液肿瘤疾病。AL可以分为两大类：急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblasticleukemia，ALL）和急性髓细胞白血病（acutemyeloidleukemia，AML）。主要临床症状为贫血、出血、器官浸润和感染等，严重威胁患儿生命安全[1]。国际上一般通过MICM[综合形态学（morphology）、免疫学（immunology）、细胞遗传学（cytogenetics）、分子生物学（moleculebiology）]分型对初诊恶性血液病患者进行准确诊断与规范治疗，以提高患者生存率[2-4]。因此，及时、有效的诊断对于AL患儿的预后和治疗具有十分重要的意义。本研究采用常规染色体核型分析和荧光原位杂交技术对140例AL患儿进行检测，探讨联合检测对提高白血病染色体异常检出率的价值。

1材料和方法

1.1样本收集选取2017年1月—2018年12月上海市儿童医院140例AL患儿，其中ALL患儿99例、AML患儿41例。诊断和分型均符合中华医学会儿科学分会血液学组2014年制订的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》[5]。抽取患儿3～5mL骨髓，进行常规细胞遗传学（染色体核型分析）和荧光原位杂交检测。1.2试剂与仪器ChangMediumMF/BMC细胞培养试剂（美国irvinescientific公司）、Sigma-AlorichGs500染液（美国Sigma-Alorich公司）、VysisFISH探针（美国Abbott公司）、CX41、BX51、BX61显微镜（日本Olympus公司）、CDS5细胞生成干燥箱（美国Thermotron公司），Thermobrite杂交仪（美国Leica公司）。1.3方法1.3.1染色体核型分析采用直接法和24h法制备染色体标本，根据人类细胞基因组学国际命名体系2016分析二倍体核型20个中期分裂相。1.3.2荧光原位杂交检测探针分别为ETV6/RUNX1、BCR/ABL1、MLL、PBX1/TCF3、PML/RARα、ETO/AML1、CBFβ、MYC、CCND1/IGH、IGH/BCL2，在荧光显微镜下通过DAPI、CY3.5、FITC与三色融合滤光片观察样本的信号，计数300个细胞，如遇信号异常，则加数至500个或更多。

2结果

2.1染色体核型分析结果99例ALL患儿中，20.2%（20/99）染色体核型正常；45.5%（45/99）核型异常，所有核型异常中，单纯数目异常占15.6%（7/45），结构异常占53.3%（24/45），数目及结构均异常占31.1%（14/45）；不完全计数占24.2%（24/99），未见分裂相占10.1%（10/99）。19.5%（8/41）的AML患儿核型正常，核型异常占75.6%（31/41）；结构异常占64.5%（20/41），数目与结构均异常占35.5%（11/41），不完全计数4.9%（2/41）。ALL患儿染色体特异性异常包括der（19）t（1：19）12.5%（3/24）、t（9：22）16.3%（4/24）、t（8：14）8.3%（2/24）、t/del（11）（q23）20.8%（5/24）；高超二倍体占35.6%（16/45），中位染色体数为56（正常为52～67），主要是获得三倍体，其中100%获得X染色体，以下依次为获得21号（93.8%）、18号（68.8%）、6号（62.5%）、14和4号（各56.3%）、8号和10号（各31.3%）、17号（31.3%）。AML患儿染色体特异性异常包括t（15：17）及17号染色体数目异常占25.8%（8/31）。产生ETO-AML1融合蛋白的t（8：21）占16.1%（5/31）（高于文献[6]中12.0%～15.0%的发生率）、t/del（11）（q23）占22.6%（7/31）、inv（16）占9.7%（3/31）。此外，数目与结构均异常占35.5%（11/31），累及染色体X、8、7、21。2.2荧光原位杂交检测结果ALL患儿荧光原位杂交检测异常率为80.7%（113/140）（1例患儿多种探针异常只计数1次）。28例染色体核型正常患儿中，荧光原位杂交检测异常11例（39.3%）；76例核型异常患儿中，荧光原位杂交检测结果正常11例（14.5%）。ALL患儿中出现几种探针同时异常的现象，AML患儿则未发现这一现象。荧光原位杂交检测共检出异常信号151例次，其中ALL124例次，AML27例次。2.2.1ALL患儿荧光原位杂交检测异常特征ALL患儿荧光原位杂交检测异常率为86.9%（86/99）。异常信号共124次，ETV6/RUNX11异常信号占50.0%（62/124），PBX1/TCF3异常信号占23.4%（29/124），BCR/ABL1异常信号占14.5%（18/124），MLL检测t/del（11）（q23）占9.7%（12/124），MYC/IGH占1.6%（2/124），MYC占0.8%（1/124）。2.2.2AML患儿荧光原位杂交检测异常特征AML患儿荧光原位杂交检测异常率为65.9%（27/41），低于ALL患儿，其中ETO/AML1占29.6%（8/27）、PML/RARα占29.6%（8/27）、CBFβ/inv（16）占22.2%（6/27），MLL探针检测t/del（11）（q23）占18.5%（5/27）。2.32种方法联合检测结果染色体核型分析、荧光原位杂交和联合检测结果见表1、表2。

3讨论

本研究140例AL患儿中，ALL占70.7%，与文献报道的儿童AL主要以ALL为主的结论一致[7]。染色体核型分析结果显示，核型异常占54.3%（76/140），其中不完全计数占18.6%（26/140），未见分裂相占7.1%（10/140）；结构异常多见。荧光原位杂交检出80.7%（113/140）的AL患儿信号异常，高于染色体核型分析的异常检出率。2种技术联合检测异常率为88.6%（124/140）。根据染色体异常的出现频率，发现ALL主要涉及21、1、6、X、14号染色体，AML主要涉及17、8、6、9、11号染色体，两者并无相关性。ALL-B患儿中常见t（12：21）（p13：q22）易位形成ETV6/RUNX1基因改变，因片段小，染色体异常核型分析难以检测到该异常。本研究在染色体核型正常的20例患儿中发现信号异常16例（80%）；染色体不完全计数的22例患儿中，异常19例（83.4%）；9例染色体无分裂相患儿中，异常5例（55.6%），高于文献[8-10]中20%～25%的检出率。染色体亚二倍体是白血病预后不良的标志之一，而高超二倍体则提示预后较好。本研究ALL患儿中有2例存在染色体亚二倍体，16例存在高超二倍体；AML患儿中有5例存在亚二倍体，未发现高超二倍体。高超二倍体的染色体检查显带常不理想，因此需要通过分子检测才可以获得更准确的结果[11]。染色体结构畸变与特定的FAB亚型及预后密切相关的异常被定义为特异性异常。有80%～90%的AML患儿有特异性的染色体畸变，所以染色体特异性异常具有诊断意义[12]。本研究有8例作为AML-M3特异性标志的t（15：17）和PML/RARa融合基因异常，提示预后良好，对此类患儿采用全反式维A酸治疗有效。本研究中，患儿特异性BCR/ABL1融合基因异常信号占14.5%（18/124），高于文献中ALL患儿2%～5%的检出率[13]。染色体核型分析和荧光原位杂交对AL的诊断、鉴别诊断和分型、预后、治疗方案的选择有着重要作用。虽然染色体核型分析在AL诊断中最为常用，但患儿骨髓取样困难，或有骨髓干抽，细胞培养后中期分裂相少或制片质量差等情况，易导致核型分析失败。荧光原位杂交仅用少量骨髓样本即可培养中期细胞，或无需培养的间期细胞，2～3d即可报告结果。染色体核型分析对复杂核型的检出率高于荧光原位杂交，荧光原位杂交虽对探针种类具有依赖性，且覆盖区域受限，但探针特异性高、假阳性少，能提高畸变类型诊断的准确率[14]。本研究染色体核型分析异常率为54.3%，荧光原位杂交异常率为80.7%，2种方法联用异常率为88.6%。综上所述，细胞遗传学检测技术已成为白血病的分子检测方法之一，两者联合可以提高异常检出率，提供必不可少的诊断依据，在指导临床治疗与预后判断中具有重要作用。

作者：孙恒娟 杜成坎 蒋慧 邵静波 李红 张泓 单位：上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院检验科 上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院血液科