单细胞研究十篇
时间：2023-12-06 17:52:46
单细胞研究篇1
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis , SCGE),是由Ostling 建立经Singh 等改进的一种检测有核细胞DNA 损伤的技术。其原理是包埋在琼脂糖凝胶中的细胞经裂解和解螺旋,使断裂的DNA 碎片进入凝胶,在电场作用下,带负电荷的DNA 断片向阳极迁移,形成彗星影像。由于该方法具有敏感、简便、快速、稳定、低耗等优点,广泛应用于遗传毒理、环境监测和细胞凋亡等的研究。闫海张崇华
1. 实验方法及操作要点
1．1 分离制备细胞悬液:单细胞凝胶电泳既可用于体外培养的细胞株，有可用于体内脏器细胞。体外培养的细胞株先用胰酶消化,吹打成单细胞悬液。体内脏器细胞则处死动物,取出脏器,于Hanks′液中制备成单个细胞悬液。细胞浓度是关键，如果细胞浓度过低或过高都很难完成100个彗星计数分析。样品应置4℃环境下避光进行,以抑制或降低核酸内切酶等活性,阻止DNA损伤的修复,从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1 h内达到90%的修复, 3 h达到97% ,因此,应严格控制细胞在分析过程中的温度。
1．2 胶板制备:取30～50μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。取120～150μl 0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上,再于其上加盖玻片, 4℃冷凝10 min。取下盖片,取70～100μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与70～100μl细胞悬液(105个细胞/ml)混匀,立即铺片,加上盖玻片, 4℃冷凝10 min。去掉盖玻片, 取70 ～100μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片,加盖玻片, 4℃冷凝。该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板,应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1 层放置于4℃制备时间约20 min,如时间过短或过长,均可造成实验失败;第2层凝胶是1%低凝点(24-26) ℃琼脂糖液,放置的温度为30℃～37℃,温度过高引起细胞损伤,此过程要快,以免引起细胞DNA的修复加速［1］。
1．3 细胞裂解与电泳:将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,裂解1 h。取出胶板,放入电泳槽中,浸泡在4℃电泳液中解旋30 min。电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DNA 迁移长度,造成假阳性或假阴性。建议采用稳压25 V 或稳流300 mA ,电泳30 min。电泳进行中应持续监测,吸出或加入电泳液,调节液面高度,保持电压与电流的恒定。
1．4 中和与染色:电泳结束,将胶板浸泡于中和液中中和两次,每次15 min, ,取出胶板,暗处染色20 min。
2. 镜检和图像分析
随着SCGE技术的发展,图像分析软件的出现使一些无法用肉眼测量的指标如,尾矩、尾部DNA 含量等得到检测，结果也更精确，拓展了检测范围。目前,除了昂贵的商业软件（英国的KOMET 与德国的KS400）外,也出现了一些免费的分析软件。国外常见的免费软件有Sicion Image 和CASP ,有数据表明这2 个软件分析指标有很好的相关性［2］。Helma 等所设计的软件(Sicion Image) 能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部DNA 含量、尾矩等多项参数,而且该软件可根据需要进行修改,并具有操作简便、快捷的优点［3］ 。Konca 等在Helma的基础上研制了另一软件(CASP) ,该软件可在多种硬件及软件平台上运行,所测量的彗星参数中增加了Olive 尾矩,而且用户界面更方便［4］ 。在锁定要分析的细胞后能同时自动分析13 项指标,克服由于主观因素而产生的误差,简化了操作并与SPSS 统计软件有很好的兼容性。除了国外免费的分析软件外,国内朱正良等研制的彗星图像分析软件( IMI) 也具备了上述软件的优点,而且在中文界面下使用起来更舒适便捷［5］ 。Bocker 等研制的分析系统能自动识别细胞,并自动对彗星进行分类并定量,大大提高了彗星图像的分析速度,15 分钟内能分析100个彗星图像［6］，减少人为因素的干扰 。
3. 应用
SCGE 是检测DNA 损伤快速、简便、敏感、经济的方法。该方法不受染色体的大小和数目的影响。与其它检测方法相比，SCGE 技术具有所需细胞数目少，实验耗时短、耗费低、应用简便、灵活性高以及可用于分析非增殖型细胞等优点。一些国外研究表明， SCGE是目前短期遗传毒性检测中最灵敏的方法，具有广阔的应用前景。
参考文献
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单细胞研究篇2
关键词：传染性单核细胞增多症 护理 研究
传染性单核细胞增多症是EB病毒感染所引发的一种传染性疾病，多骤然起病，且病程为自限性，患者可出现以发热、咽峡炎及淋巴结肿大为主的典型三联征，也会伴随肝脾肿大，外周及异型淋巴细胞水平上升，绝大多数情况下有着良好的预后，但不排除引发噬血综合征等严重并发症的可能性[1]。经口密切接触是该病的主要传播途径，如亲吻、共用餐具或咀嚼食物喂食婴儿、飞沫传播等，在进行对症治疗的同时，结合相应的护理，能够控制病情，降低并发症发生风险，利于改善患者预后。基于此，本研究就传染性单核细胞增多症患者的护理研究进展进行综述，以期为同行业学者提供借鉴。
1 发病机制
目前，传染性单核细胞增多症的发病机制尚未完全明确，由于B淋巴细胞EB病毒表面有EB病毒受体，所以当口腔内存在EB病毒时，咽扁桃体中的B淋巴细胞和口腔上皮细胞最先被感染，EB病毒会在细胞中大量增殖并产生破坏作用，引发扁桃体炎及咽炎，临床表现为淋巴结局部受累并出现肿胀。EB病毒也会在腮腺及其他唾液腺上皮细胞中大量繁殖，会长时间或间断性排放到唾液中，然后流入血液，经由病毒血症或者被感染的B淋巴细胞大范围播散，最终损害整个淋巴系统[2]。在B淋巴细胞被感染后，其表面抗原出现变化，引发T淋巴细胞产生强烈的免疫应答效应，继而转变为细胞毒性T细胞，在消灭被感染的B淋巴细胞的同时，会对众多组织器官造成损害。
2 临床症状及诊断标准
2.1 临床症状
(1）典型表现：潜伏期5～15 d不等，多为10 d，起病急缓不一；近半数有前驱症状，发病时主要有发热、淋巴结肿大、咽峡炎、肝脾大、皮疹及神经系统症状。（2）慢性活动性EB病毒感染表现：部分患者会出现蚊虫叮咬过敏情况，表现为蚊虫叮咬后局部皮肤出现红斑、水疱及溃烂，同时伴有高热，偶可出现腹泻及视网膜炎[3]。
2.2 诊断标准
(1）持续6个月以上的相关临床症状及血清学表现：从EB病毒原发感染开始症状一直持续；EB病毒抗体滴度异常（衣壳抗原-免疫球蛋白G≥1:5 120),EA抗体≥1:640或EB病毒核抗原<1:2。（2）主要脏器受损的组织学标志：淋巴结炎、噬血现象、脑脊髓炎、持续性肝炎、脾大、间质性肺炎、骨髓增生不良、视网膜炎。（3)EB病毒检测阳性：受损组织中EB病毒的DNA、RNA或抗原检测阳性；外周中EB病毒DNA检测阳性；满足上述每一项中至少1条并排除任何免疫缺陷（包括人类免疫缺陷病毒感染）即可诊断[3]。
3 护理
3.1 心理护理
传染性单核细胞增多症患者的病情较为复杂，且表现为持续不退的高热、咽峡炎所致的疼痛及进食困难，尤其是青少年及儿童的机体耐受力较弱，不适感更为明显，此时会出现较为严重的焦躁及恐惧心理，且该病复发率较高，会增加家属的思想负担，导致其出现焦虑及担忧的不良情绪。陈佳佳[4]的研究指出，考虑到年幼患儿的心理应激能力及承受能力均不及成年人，于进行相关的心理培训后疏导患儿及家属的各种焦虑及急躁情绪，可增强患儿对治疗的安全感，提升治疗配合度。总之，针对年龄较大的患者，应给予详细的解释、耐心进行安慰和鼓励，并辅助科学的心理干预措施来缓解患者的不良情绪；针对年纪较小的患者，应用和善、关切的态度，以语言或肢体动作实现与患者的有效交流，强化医护工作者和患者间的信任感；针对患者家属，除了必要的关心及安慰外，还应向其说明病情的预后情况、诊疗及护理措施，让其可以理解、支持并配合医护工作者的治疗及护理计划。
3.2 健康宣教
患者及家属对传染性单核细胞增多症缺乏基本的病理知识了解，在面对骤然发生的疾病时，往往会不知所措，导致治疗及护理配合度降低，且其对疾病发展过程及各个发展时期的病情变化缺乏认知，缺少基础的预防与防治知识，导致不能在发病前期配合医师进行有效的治疗，且不能实现对并发症的有效预防，不利于改善预后。徐雪芳和郑德颖[5]对传染性单核细胞增多症患儿实施健康宣教，干预后患儿及家属均对该病有了较为客观及科学的了解，心理负担得到了减轻，不良情绪得到了缓解，治疗及护理配合度、满意度均得到了提升，住院时间比同类患儿缩短了2～5 d，效果较好。因此，对传染性单核细胞增多症患者实施健康宣教非常必要，在住院期间集中开展的宣教措施为：介绍传染性单核细胞增多症的致病原因、临床表现、服药方案、不良反应表现，提升服药依从性；以手册或影像资料等形式发放宣教内容；建立病友微信、QQ群，在患者居家期通过家属及时了解其康复情况，对护理中可能出现的呼吸、神经系统不适等问题进行答疑解惑，通过后台最新护理、康复视频教程等，让家属学习并掌握；强调及时复诊的重要性，若患者出现不适，则立即咨询并入院会诊，提供及时、长效的信息支持。
3.3 高热护理
传染性单核细胞增多症患者会长时间处于高热状态，一般持续2～3周，护理人员应观察、记录并分析患者的体温及走势，事先准备好退热降温药物、退热贴、医疗工具和相关器械，密切监测患者的体温，若超过39℃，则给予药物或物理退热处理；此外，要保持床单清洁干燥，及时更换汗湿的床单和衣服，并注意保暖，避免着凉。李香玉等[6]的研究指出，因乙醇会增加肝脏负担，所以应尽量少使用乙醇进行擦浴。在高热较为严重时可遵医嘱给予退热剂，也可以辅助使用退热走珠器（武汉天天健康生物工程有限公司，YZB/鄂汉0067-2011），且密切关注患者的体温及病情变化。
3.4 并发症护理
传染性单核细胞增多症会累及多个系统，如会引起头痛、颈强直、癫、昏迷等神经系统症状，引起咳嗽、病毒性肺炎、肺部受累等呼吸系统损伤，还可伴随心悸、脾破裂、溶血性贫血、血小板减少、心肌炎、肝肾功能受损等并发症[7]。因此，应密切观察传染性单核细胞增多症患者的面色、皮肤、脉搏、呼吸、血压、消化道等变化，询问其生理及心理感受，尽早发现并发症，及时采取对症治疗措施。针对肝肾功能受损患者，应观测其是否出现乏力、恶心呕吐、皮肤黄染，尽早检查肝功能并采取保肝降酶治疗，且要求患者充分休息，不再使用有损肝脏的药物；针对咳嗽患者，应给予止咳药缓解症状，并要求保持正常的病房温湿度及通风；针对心悸患者，应给予心肌营养类药物，并嘱咐其绝对卧床休息，避免剧烈运动，且使用电子听诊器[上海富林医疗设备有限公司，YZB苏（镇）0067-2013]测定其心率；针对肾功能损害患者，应控制其饮水量，并热敷腰部及眼部，减少运动量；针对溶血性贫血患者，应在常规治疗的基础上加强保暖，保证绝对的卧床休息，并密切观察其血常规、尿常规、肝功能情况。
3.5 用药及治疗护理
临床上针对传染性单核细胞增多症患者无特效的治疗方法，主要采取对症治疗。由于轻微的腹部创伤即可能导致脾破裂，故有脾肿大的患者2～3周内应避免进行与腹部接触的运动。抗菌药物对本病无效，仅在继发细菌感染时应用；抗病毒治疗可用阿昔洛韦、更昔洛韦及伐昔洛韦等药物，但疗效尚存争议；静脉注射丙种球蛋白可改善临床症状，缩短病程，早期给药效果更好[8]，且应选取较大血管进行输注，时间在1 h以上，避免出现药物渗流及外溅，如果出现渗流或外溅，应迅速用清水进行完全冲洗，必要时使用红外线照射药物溅落致肿胀部位；α-干扰素亦有一定的治疗作用，重型患者短时间应用肾上腺皮质激素可明显减轻症状[9]；当发生脾破裂时，应立即输血并进行手术治疗。此外，对患儿家属进行用药指导，准确测定用药时间及用量，严格遵医嘱说明服用，严禁自行增加或减少药物用量或服用其他药物。
3.6 饮食护理
传染性单核细胞增多症患者代谢能力较强，尤其是患儿，故要制定科学的饮食方案，充分保证患者的营养水平。郭晓君等[10]的研究建议要确保饮食营养均衡，搭配合理，并叮嘱其少食多餐，以高钙、高维生素、高蛋白、高碳水化合物、低脂肪的流质或半流质的清淡食物为主，忌辛辣油腻食物。孔祥珍[11]的研究指出，传染性单核细胞增多症会减弱患儿的消化功能，应在进行饮食护理的同时使用0.9%氯化钠注射液漱口，并采取相应的口腔护理，保证口腔清洁、湿润、无异味；逐渐增加粗纤维食物，预防便秘，严禁暴饮暴食，降低心脏负荷。针对成人患者，应在以上基础上避免食用鱼类、虾类等易过敏食物及接触巧克力、浓茶、烟酒、咖啡等刺激神经中枢系统的食物[12]。
3.7 气道护理
传染性单核细胞增多症患者气道分泌物较多，在日常治疗护理期间，应协助患者取半卧位姿势，头偏向一侧，鼓励并帮助患者咳嗽、吐痰；同时，应对病房环境进行湿化处理，保证室内湿度维持在50%～60%，防止患者出现分泌物黏稠的情况，若患者病情严重，则应进行雾化、吸氧处理，改善其通气及换气障碍；另外，应嘱咐患者家属多供给患者水分，确保其口咽黏膜处于湿润状态，利于痰液排出。陈恕青[13]的研究指出，适当的湿化气道可稀释痰液，便于咳出，可以以常规超声雾化形式吸入，且根据患儿的实际情况调节雾化量，采用渐进增加雾化量的方式来达到雾化吸入的效果；此外，将痰液维持在糊状，以利于排出，减弱排痰湿的疲乏症状。何春梅等[14]的研究指出，给予传染性单核细胞增多症患儿气道护理后，可提升有效排痰率，且利于患儿的治疗及预后改善。
3.8 隔离护理
病房要正常进行开窗通风，保证空气流通，控制室内温度在适宜的范围内；医护工作者在接触患者前要严格做好手消毒工作，避免患者间密切亲密，防止出现交叉感染。陈雪林[15]的研究指出，给予传染性单核细胞增多症患儿隔离护理并配合心理干预、专项护理，可预防并发症发生，改善临床症状，提升护理满意度。
4 小结
传染性单核细胞增多症可发生在任何年龄段，其中在学龄前最为常发，应加强对患者的心理护理、健康宣教、高热护理、并发症护理、用药及治疗护理、饮食护理、气道护理、隔离护理等，配合相应的对症治疗，以期达到控制病情、减少并发症发生的效果。需要注意的是，该病不仅在住院治疗期间要实施护理，在出院之后也要相对应的实施院外延续护理，以期更好地改善预后。
参考文献
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单细胞研究篇3
【摘要】 本研究确定人急性单核细胞白血病细胞系SHI1在裸鼠体内的高致瘤性，并对其成瘤机制进行初步探讨。将SHI1细胞接种至裸鼠皮下，观察肿瘤生长情况；取肿瘤组织行病理检测、R显带核型分析；RTPCR检测MLLAF6融合基因和VEGF基因的转录；明胶酶谱法检测培养上清中基质金属蛋白酶9（MMP9）和MMP2的表达；体外穿膜实验观察迁移能力。结果表明： 注射SHI1细胞的16只裸小鼠均于皮下出现肿块；瘤体由白血病细胞组成；注射的裸鼠中有MLL/AF6融合基因和VEGF基因的转录；在无血清培养上清中MMP9和MMP2的表达明显高于对照细胞；SHI1细胞有较强的迁移能力，MMP2的阻断抗体可显著抑制其体外迁移能力。结论：SHI1在裸鼠体内有极高的成瘤率，其机制可能与p53基因的异常、高水平VEGF基因的转录、金属蛋白酶的高表达和较强的体内浸润能力有关。
【关键词】 急性单核细胞白血病
High Tumorigenicity of Human Acute Monocytic Leukemic Cell Line SHI1 in Nude Mice and Its Mechanism
Abstract
This study was purposed to explore the tumorigenicity of a novel human monocytic leukemic cell line SHI1 in nude mice and its mechinism. The tumorigenicity in mice was evaluated in sixteen nude mice subcutaneously injected with the SHI1 cell line. The tumor specimen was studied by the conventional pathologic examination. The mononuclear cells (MNC) of the tumor was assayed by RHG banding，
the transcription of MLLAF6 fusion gene and the VEGF gene was detected by RTPCR. Gelatin zymography method was used to study the expression of MMP9 and MMP2 in the supernatant of the SHI1 cell line. Matrigel invasion assay was employed for the study of migration of the SHI1 cell in vitro. The results showed that the tumor masses were found in all sixteen mude mice after subcutaneous injection of SHI1 cells， the tumor mass was mainly composed of leukemia cells， the transcription of MLLAF6 fusion gene and VEGF gene was proved by RTPCR analysis， the expressions of MMP2 and MMP9 in the serumfree culture supernatant of the SHI1 cell line were significantly higher than those in U937， K562， and NB4 cell lines. The SHI1 cell line exhibited significantly higher in vitro invasiveness than other leukemia cell lines， the blocking antibody of MMP2 could inhibit the migration of the SHI1 cell line significantly. It is concluded that the SHI1 cell line presents higher tumorigenicity in nude mice than other leukemia cell line and the mechanism is associated with p53 gene alteration， high transcription level of VEGF gene， high expression level of MMP， and significantly higher invasiveness.
Key words
acute monocytic leukemia; SHI1 cell line; t(6;11)(q27;q23); tumorigenicity; p53 gene
由于动物模型相对于体外实验而言更接近于人体内的真实情况，建立疾病的动物模型对于深入研究疾病的发生机制和治疗方法有着极其重要的意义。白血病的研究同样也离不开白血病的动物模型。然而大多数白血病细胞系在裸鼠体内的致瘤率非常低，如K562细胞系经体内筛选后所得的亚克隆K562/n才具有较高的致瘤率［1］，HL60和其它常用白血病细胞系的致瘤率也较低。近年本实验室建立了国内第1个以t(6;11)(q27;q23)和p53基因异常为特征的人单核细胞白血病细胞系［2］， 命名为SHI1。我们对SHI1细胞系的致瘤特性及其机制进行了研究。
中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(4)人单核细胞白血病细胞系SHI1在裸鼠体内的高致瘤性及其机制的初步研究材料和方法
裸鼠饲养
取4周龄NC裸鼠4只和BALB/c裸鼠12只，饲育于NASA1000级净化室内，饲料、饮水和笼具等均灭菌后使用，工作人员按无菌规则操作。
SHI1细胞的接种
白血病细胞系SHI1由本所建立，收集对数生长期SHI1细胞，调整细胞浓度为2×108/ml，给每只裸鼠于右侧背部皮下注射100 μl，每日观察注射部位肿瘤生长情况。
肿瘤组织的病理检测
分离裸鼠实体肿瘤组织，常规固定，石蜡包埋、切片，HE染色。光学显微镜下观察、采集图像。
肿瘤组织中单个核细胞（MNC）的分离
无菌条件下分离裸鼠实体肿瘤组织，眼科剪剪碎，碾磨后经100目和200目滤网过滤，将所得细胞悬液收集至无菌离心管，加入适量RPMI 1640培养液， 378×g离心5分钟，弃上清，再加入适量RPMI 1640培养液，吹打、混匀后378×g离心5分钟，弃上清，调整浓度，备用。
核型分析
将由裸鼠肿瘤组织中分离的MNC以1×106/ml的浓度接种于含15％胎牛血清的IMDM培养液中，加入秋水仙酰胺，使终浓度为0.05 μg/ml，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱培养1小时后收获，染色体标本制备和R显带按本室常规方法［3］。核型分析根据《国际人类细胞遗传学命名体制（ISCN）1995》。
MLLAF6融合基因的RTPCR检测
引物序列和PCR反应条件参照文献［4］。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，扫描并分析结果。用于扩增VEGF基因的引物序列分别为: 5′GGG CCTCCGAAACCATGAACTT3′和5′CGCATCAG GGGCACACAG 3′；扩增产物为259 bp。反应体积为50 ml，其中包括: PCR缓冲液，MgCl2 1.5-2.0 mmol/L， dNTPs 0.2 mmol/L， 引物各12.5 pmol， Taq聚合酶1.5 U，逆转录产物4 m·综述·
Mer功能研究进展
范磊，阮长耿
苏州大学附属第一医院江苏血液研究所， 苏州 215006
摘要
Mer是Axl受体酪氨酸激酶家族中的一员，其受体Gas6和Mer结合后可以激活Mer的酪氨酸激酶活性，并激活下游信号传导途径，在细胞炎症、凋亡、血液肿瘤发生发展以及血栓于止血等方面发挥作用。本文主要就近年来Mer的功能研究进展以及Mer的抗血栓和抗血液肿瘤潜在治疗前景进行综述。
关键词
Mer；受体酪氨酸激酶；Gas6；血栓；异位表达
Advance of Study on Mer Function——Review
FAN Lei， RUAN ChangGeng
Jiangsu Institute of Hematology， The First Affiliated Hospital of Suzhou University， Suzhou 215006， China
Abstract
Mer is one member of Axl receptor tyrosine kinase family， and its ligand Gas6 can stimulate activity of Mer receptor tyrosine kinase after binding it， and then activate the downstream signal transduction pathway， Mer participates in cell inflammation， apoptosis， tumorigenesis， thrombosis and hemostasis. Rencet advances of study on Mer function were reviewed， and its potential prospects of antithrombosis and antitumor were discussed in this article.
Key words
Mer; receptor tyrosine kinase; Gas6; thrombosis; ectopic expression
J Exp Hematol 2007; 15(4):892-895
Mer（cMer Nyk Eyk）属于受体酪氨酸家族。此家族还包括Axl和Tyro3两个受体酪氨酸激酶，它们有着共同的配体—Gas6［1］。人类的Mer基因是1994年由Graham［2］首先从人类B淋巴母细胞λgt11的cDNA文库中克隆得到，随后小鼠的Mer基因于1995年同样由 Graham成功克隆，并发现和人类的Mer基因具有88％的同源性［3］。Mer基因的命名主要是基于开始发现其在人单核细胞（monocytes）、上皮组织（epithelial tissue）和生殖系统组织（reproductive tissue）中表达较高。
Mer的生物学性状及其配体
Mer是Axl受体酪氨酸激酶家族的中一员，定位于2q14.1，基因全长为130 755 bp，包括19个外显子。Mer的mRNA共有3 632个 bp，一共编码由999个氨基酸组成的18-20 kD的蛋白［1］。Mer的基因结构和其家族其他两个成员类似，胞外区包括两个IgG样区，两个纤维连接蛋白样区，其中IgG样区为Mer和其配体Gas6结合区域，而纤维连接蛋白样区也在和生长阻滞特异基因6（growth arrestspecific gene 6，Gas6)结合过程中起调节作用［4］。胞内区为酪氨酸激酶样区，具有激酶的活性，并且具有该家族特有的KWIAIES序列。
Mer的配体Gas6是1993年由Manfioletti首先克隆，并发现其氨基酸序列和蛋白S具有44％的同源性［5］。Gas6是1个VitK依赖、由678个氨基酸组成的75 kD的分泌型蛋白，其结构由Gla区、4个EGF样区和2个LaminG样区组成，其中LaminG样区为与其受体结合区域，而Gla和EGF样区也认为参与调节Gas6及其受体的结合过程［6］。
Mer作为受体酪氨酸家族一员广泛表达于多种组织器官和体细胞，在外周血细胞中Mer主要表达于正常的单核细胞和血小板膜上，而不表达于正常的T、B淋巴细胞和粒细胞；组织器官中Mer在睾丸、卵巢、前列腺、肺和肾脏组织是高表达的，而在脾脏、胎盘、胸腺，小肠、大肠和肝脏表达较低，而在心脏、脑组织和骨骼肌则没有表达［1］。Graham等［1］和Dirks等［7］分别发现在多种恶性血液细胞株中Mer以及Gas6的异常表达升高，提示Mer可能参与恶性血液病的发生发展过程。
Mer的生物学功能
细胞炎症和凋亡是体内两个重要的生理病理过程。近年来有多篇文章报道Mer与此有关。1999年Todd等［8］将LPS注入Mer-/-小鼠体内，结果发现Mer-/-小鼠有88.2％死于LPS引起的内毒素血症，而对照组只有6.7％的小鼠死亡，同时该小组检测到Mer-/-小鼠体内巨噬细胞分泌的TNFα量明显高于对照组，并且利用TNFα的单克隆抗体可以明显抑制LPS导致的内毒素性休克，提示Mer通过调节巨噬细胞分泌的TNFα来参与LPS导致的内毒素性休克。同时我们也发现在利用LPS、TNFα和IL1β刺激后，人皮肤微血管内皮细胞无论在mRNA水平还是蛋白水平，Mer的表达量都是明显上升的，这一结果也可以从一个侧面证明Mer参与了细胞的炎症反应。
Mer功能研究进展对于凋亡方面的作用，Mer和Axl家族其他成员作用有一定的差别。2002年Guttridge等［9］将构建的EGFR/Mer嵌合蛋白质粒转染到IL3依赖的32D细胞株，并表达此嵌合蛋白，通过利用EGF刺激此嵌合蛋白可以发现Mer导致细胞骨架的结构改变并且抵抗由于IL3撤离导致的凋亡，但并不刺激细胞的增殖，这和其他成员的作用是不同的。然而，将构建的Fms/Mer转染到NIT3T3细胞中则发现Mer具有细胞增殖作用的［10］。同时也应该注意到真正的全长Mer蛋白和EGFR/Mer嵌合蛋白是存在差别的。研究发现，EGFR/Axl可以抵抗32D细胞的凋亡同时刺激细胞增殖，但是利用Gas6刺激转染全长Axl的细胞时此作用并不明显，因此利用全长Mer蛋白进行功能研究也是必需的［11］。
2001年首次发现Gas6和血小板功能相关，利用Gas6敲除（knockout）小鼠发现，被敲除Gas6基因的小鼠可以幸免于尾静脉注射胶原和肾上腺素导致的致死性血栓［12］。2004年Chen等［13］利用Mer敲除小鼠对Mer参与血小板功能做了较为全面的评价，他们应用RTPCR和Western blot证明Mer表达于人和小鼠的血小板膜上，而同家族的Axl和Sky则没有此作用，Mer-/-小鼠的PRP对于低浓度聚集诱导剂诱导的血小板聚集反应较弱，而且敲除Mer基因后同样可以保护小鼠不死于尾静脉注射胶原和肾上腺素导致的肺栓塞。而与此同时Mer-/-小鼠的血小板和野生型小鼠一样可以结合正常数量的可溶性纤维蛋白原，没有自发性出血，并且各种凝血指标以及外周血细胞参数等没有显著的变化。2005年Goul等［14］利用流式细胞术发现Mer、Axl和Sky均表达于人的血小板上，这和Chen等的结论是矛盾的。利用针对拮抗Mer和Sky的单克隆抗体可以有效地抑制体外ADP、PAR1和SFLLRN诱导的血小板聚集达80％之多，而抗Axl的抗体反而促进血小板聚集。由此看来，Gas6/Mer很可能在血栓形成过程中起到信号放大的作用，因为Gas6/Mer本身并不能引起血小板聚集而只是放大聚集诱导剂的作用。目前关于Mer及其家族成员和配体参与血小板黏附和释放功能的研究尚少，并且对于Mer在血栓中的作用研究也只局限于表象，对其内在的机理和相关的信号通路目前也只推测可能通过αⅡbβⅢa参与了血小板活化过程中“自外而内”的信号通路，但并没有相关的深入报道。
Mer在正常的T、B淋巴细胞和粒细胞是不表达的，但是在某些恶性血液病细胞株，如Jurkat、PEER、K562和Raji中有Mer的异常表达［1］，这个现象提示Mer很可能和某些恶性血液疾病有关。
2002年Hogerkorp等［15］利用高通量基因芯片技术发现Mer在外套细胞淋巴瘤中异常表达，并提示可能和此类疾病发生发展有关。2006年Graham等［16］利用流式细胞术和Western blot技术检测了16例儿童急性T淋巴细胞白血病患者，发现其中8例患者骨髓中异常表达Mer，并且高表达组患者白血病细胞表型多为CD3-，CD4-和CD8-，提示表型为幼稚型，而低表达组则多为CD4和CD8单阳性组，较为成熟。2006年Keating等［17］利用转基因技术将Mer异常表达于小鼠的淋巴细胞和胸腺组织，结果发现Mer转基因小鼠脾脏明显增大，并且在12月龄出现体重下降、活动减少和肝脾肿大等症状，24月龄经流式细胞仪检测有55％的Mer转基因小鼠证实罹患淋巴细胞白血病或者淋巴瘤，而野生型组这个比例只有12％。同时体外地塞米松诱导凋亡实验也证实转染Mer的淋巴细胞较野生型的淋巴细胞具有生长优势，提示Mer的抗凋亡效应可能起到作用并促进某些恶性血液病细胞的生长和防止药物诱导的凋亡。
对于实体肿瘤中Mer的表达情况的报道较少，目前研究也主要局限于在某些恶性细胞株中的表达情况。1994年Graham等［2］利用RTPCR的方法证实了Mer在肺癌细胞株A549、上皮瘤细胞株A431中表达较高，而在部分乳腺癌、胶质瘤和膀胱癌细胞株中有低水平表达。2004年Wu等［18］以转染了FMS/Mer嵌合蛋白的前列腺癌细胞株为模型，利用微阵列技术发现特异性的激活Mer活性可以使部分趋化因子表达上调，其中以IL8的上调最为明显，而后者被认为与多种肿瘤发生、转移和血管新生有关。
Mer作用的信号传导通路
目前关于Mer具体的分子信号传导途径的研究还不十分完善。PLCγ，PI3K，Src，Grb2，Raf1以及ERK等下游分子的磷酸化作用可能与Mer的信号传导有关。位于激活Mer分子酪氨酸激酶区域的的Y749，Y753和Y754氨基酸被认为是Mer自动磷酸化的位点，并且Mer分子的完全活化需要三者共同的磷酸化作用［19］。Y749，Y753和Y754三种位点同样存在于同家族的Axl和Sky分子中，提示这可能是该酪氨酸激酶家族激活的重要保守区域。Todt等［20］利用单克隆抗体技术证明，Mer可以激活下游的PLCγ分子，并且与巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的过程有关。小鼠Mer酪氨酸激酶区域的嵌合蛋白可以持续激活下游的ERK分子并导致Ba/F3前B淋巴白血病细胞的增殖；实验显示，小鼠Mer的Y867位氨基酸（相当于人类Mer分子的Y872位）可以结合Grb2分子，从而依次激活下游的PI3K以及NFκB分子，而PI3K/NFκB信号途径被认为是与很多细胞的凋亡和分化等重要生理过程有关［21］。另外有报道证实，人类Mer分子的Y872位氨基酸是多个下游分子的结合位点，其中可能包括PLCγ，PI3K，cSrc，Grb2和Lck［22］。Besser等［23］利用点突变技术证明，Mer介导的细胞转化作用是通过激活下游的STAT分子信号途径实现的。虽然有报道Mer氨基酸第933位的LQ突变会明显激活下游的STAT3分子并增加Mer的细胞转化效率，但是还是认为人类的Mer分子主要激活的下游的STAT1分子。除了PI3K/NFκB分子信号途径，Mer也可以通过其他信号通路起作用，利用基因芯片技术筛选的Mer可以强烈地诱导IL8生成，并导致细胞分化，同时也证实Mer介导的IL8上调是通过ERK分子信号途径而不是PI3K/NFκB途径实现的。
针对Gas6/Mer途径的抗血小板药物临床应用前景Mer或者Gas6基因敲除小鼠都显示血小板聚集和血栓形成能力下降，同时没有自发性出血、各种凝血指标和外周血细胞参数正常等现象，因此有人推测Gas6/Mer信号途径可能在血小板聚集中起到信号放大和加速的作用，而其本身并不引起血小板聚集。体外实验也表明，针对Mer的单克隆抗体可以抑制多种低浓度诱导剂引发的血小板聚集。目前传统的抗血小板药物多为抑制血小板“自内而外”的信号传导，比如阿司匹林可以抑制环氧化酶进而抑制血栓恶烷A2的合成；氯吡格雷则通过拮抗P2Y12受体发挥作用。目前抗血小板药物在抑制血小板聚集的同时存在较大的出血风险，因此针对Gas6/Mer等调节途径的新一代抗血小板药物有望成为治疗的新靶点，此类药物的特点就是可逆性抑制血小板聚集而没有明显的出血等副作用，这点已经在基因敲除的小鼠模型中得到证实。
Mer在8例儿童急性T淋巴细胞白血病中的异常表达表明，Mer的抗凋亡作用可能参与某些恶性血液病的发生发展并抵抗药物诱导的凋亡。目前已有多种酪氨酸激酶被报道参与白血病的发生，如由于染色体异位产生的ABL基因就是典型代表，其他还有ARG、FLT3、CFMS、JAK2和CKIT等。目前针对ABL和FLT3的特异性抑制剂已经应用于临床并成为白血病靶向治疗的典范，而Mer在急性T淋巴细胞白血病中的异位表达也提示其可能成为治疗恶性血液病的新药物。
结束语
Mer作为一种新型的酪氨酸激酶在1994年被首次克隆后其功能被日益完善，多篇研究报道其参与炎症、凋亡、血栓、止血等多种生理过程，并且Mer在急性T淋巴白血病细胞以及部分恶性肿瘤白血病细胞株中的异常表达也提示其可能在肿瘤发生发展等重要病理过程中扮演重要的角色，因此针对Gas6/Mer信号转导途径的特异性靶向治疗，可能成为研制相关疾病新一代的药物的线索。
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单细胞研究篇4
【关键词】 红细胞凝集素 分离纯化 凝血 性质研究
Purification and Partial Characterization of Erythrohemagglutinin from Phaseolus Vulgaris
HE Tao1，ZHANG Tao2*，WU Chang-ying1，WANG Liang1，SHAN Xiao-xue1，LUO Qin1
(School of Preclinical Medicine，Chengdu Medical College，1.2006s Biotechnology，2.Biotechnology laboratory，Chengdu，610083，China)
Abstract：Objective To study a new method for Erythrohemagglutinin（PHA-E）production from Phaseolus vulgaris.Methods PHA-E was purified from the excellent seeds of Phaseolus vulgaris by extraction，ion exchange chromatography and final gel filtration chromatography.The purity，the molecular weight and the isoelectric point of purified PHA-E were determined by electrophoresis.The ability and the influencing factor of agglutination were determined by 2% erythrocytes of human.Conclusion The purified PHA-E was single PAGE outline and had apparent subunit molecular weights of 32 kD by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.Isoelectric point of the PHA-E was 6.5.PHA-E can promote agglutination of human erythrocytes at 4 μg/ml，but its activity was not inhibited by any monosaccharide.EDTA can inhibit the ability of agglutination，and Zn2+ can accelerate it.The sugar content of PHA-E was 8.1%.
Key words:erythrohemagglutinin；separation and purification；haemagglutination；characterization
植物凝集素(Phytohemagglutinin PHA)是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质［1］。植物凝集素具有刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂［2］，促进免疫反应，使细胞凝聚，肿瘤细胞失活，以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性。文献［3］报道PHA是由E、L两种亚基组成的四聚体蛋白质的混合物，按其亚基组成可分为L4、L3E、L2E2、LE3、E4具有相同物化性质和不同生物学活性的同工凝集素。其中PHA-E含有4个相同的E亚基，具有最强的红细胞凝集功能，没有白细胞凝集能力。由于凝集素单体较混合物PHA对于糖链具有更加特异的识别能力，可以作为分子探针，研究特异细胞膜受体的分布等，在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用，在医学、农业上呈现出巨大的应用前景。关于红细胞凝集素单体的分离纯化国内还未见报道，本研究改进和优化前人的提取和纯化方法，简化操作程序，从红芸豆中得到了凝血活力较高的电泳纯红细胞凝集素单体。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
UV1102紫外－可见分光光度计（上海天美科技有限公司），蛋白质纯化系统（上海琪特仪器分析有限公司），高速冷冻离心机（Eppendorf公司），MINI-PROTEIN Ⅳ电泳系统（Bio-Rad公司）。
红芸豆（购自甘肃兰州），低分子量蛋白标准（上海东风生物技术有限公司），蛋白质等电点标准（Pharmacia公司），两性电解质（pH 3～9，Pharmacia公司），PHA-E（Sigma公司），DEAE-Sepharose FF、CM-Sepharose FF、Sephadex G100（Pharmarica公司），乙酰氨基葡萄糖（Sigma公司），人红细胞悬液由本实验室自制，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 PHA-E提取过程
1.2.1 PHA-E粗提液制备 将红芸豆粉碎，取100 g粉末，加入1000 ml的NaAc-HAc缓冲液(pH 5.2，20 mmol/L，0.14 mol/L NaCl)，分四次磁力搅拌浸取。合并浸取液，后用两层纱布过滤。收集滤液，调pH 5.2，在4℃下10 000rpm离心10min，取上清液，即得PHA-E粗提液。
1.2.2 CM-Sepharose层析 取CM-Sepharose装柱(2.6 cm×20cm)，用NaAc-HAc缓冲液（pH 5.2，20 mmol/L）平衡，将收集的PHA-E粗提液上柱。用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 6.0，20 mmol/L）冲洗至没有蛋白质流出，再用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 7.2，20 mmol/L）洗脱，收集蛋白质峰，调pH 7.2.
1.2.3 DEAE-Sepharose层析 取DEAE-Sepharose装柱(2.6 cm×25 cm)，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)平衡，将1.2.2收集得到的蛋白质峰上柱吸附，用缓冲液冲洗至基线平衡。用含0～0.4 mol/L NaCl的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)进行梯度洗脱，流速为5 ml/min，收集活性峰，装入透析带中，4℃冰箱中PEG浓缩。
1.2.4 Sephadex G100层析 取1.2.3中的PEG浓缩液，上已经平衡好的Sephadex G100层析柱(2.6 cm×100 cm)，上样量为5 ml，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)）进行洗脱，流速为2 ml/min，收集活性峰，用纯水透析除盐后，冻干，即得PHA-E单体。
1.3 分析方法及性质研究
1.3.1 凝血活力测定 按照文献方法［4］在微量V型血凝板上进行，用生理盐水倍比稀释凝集素，每孔含稀释液40 μl，加入2%人红细胞悬液40 μl，振荡混合，在25℃下放置2 h，肉眼观察结果，凝集活力以50%人红细胞凝集所需凝集素的μg数表示。
1.3.2 PHA-E凝血活力影响因素测定 依上法，参考文献［5，6］，PHA-E倍比稀释后，每空加入20 μl，同时加入20 μl EDTA、二价金属离子或单糖等待测物质溶液，37℃下孵育1 h，用上述凝血活力测定方法进行评价。
1.3.3 蛋白质含量测定 以牛血清白蛋白为标准，采用考马斯亮蓝G250测定方法［7］。
1.3.4 蛋白质亚基分子量测定 参照文献［8］进行，使用不连续电泳（SDS-PAGE），凝胶浓度为12.5%，pH 8.3.考马斯亮蓝R-250染色。
1.3.5 蛋白质等电点的测定 参照文献［8］进行，将样品和pH 3～10等电点标准在pH 3～9胶上进行电泳，经考马斯亮蓝R-250染色后，量取标准蛋白带和样品的泳动距离，测定样品的等电点。
1.3.6 PHA-E纯度测定 参照文献［8］进行，使用不变性电泳PAGE，用PHA-E标准品做对照，测定其纯度。
1.3.7 糖含量测定 参考文献方法［9］，以苯酚－硫酸法测定，以葡萄糖为参照物做标准曲线，求得值以0.9的系数修正。
2 结果与分析
2.1 PHA-E的提取
文献［3］报道，PHA-E分子量为128 kD，等电点为pI 6.5.通过粗提取和CM-Sepharose层析，有效的除去了核酸和多数杂蛋白，将PHA-E主要集中在pH 7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中。洗脱液上DEAE-Sepharose柱后，梯度洗脱获得2个峰（见图1），其中蛋白质峰A具有较强凝血活力。收集峰A，浓缩后进行分子筛层析，得到两个峰（见图2），其中峰b具有凝血活力。收集峰b，透析脱盐，冻干后得到白色粉末，即为PHA-E纯品。
2.2 凝血活力测定
纯化得到的PHA-E产品，在微量V型血凝板上进行凝血活力测定。无凝集时红细胞沉于“V”图1 DEAE-Sepharose层析图
Fig.1 Ion exchange chromatography of PHA-E on DEAE-Sepharose
图2 Sephadex G100层析图
Fig.2 Gel filtration of PHA-E on Sephadex G100
型孔底部，呈一小圆点；凝集时红细胞相互聚集形成一片网络状，红细胞不下沉。不同的凝集程度用数字表示如下：O(不凝集)：红细胞全部沉积于“V”型孔底部，呈边缘清晰的小圆点；1(少许凝集)：沉积范围比半凝集大，未遍及全孔；2(半凝集)：部分沉积中部，周围有浑浊带，约占孔面积的50%；3(大部分凝集)：少许沉积于孔中心，沉积点边缘模糊；4(全凝集)：红细胞相互聚集形成一片网络，红细胞不下沉。凝集效价的判定以“2”作为终点。实验中PHA-E起始浓度为200 μg/ml，倍比稀释得到200 μg/ml～0.75 μg/ml浓度范围（1～9号孔）的样品，以生理盐水作为空白（10号孔），PHA-E标准品为对照（起始浓度为200 μg/ml，凝血活力为8 μg/ml），测得PHA-E的凝血活力为4 μg/ml.实验结果见图3和表1.表1 红细胞凝集结果示意图
2.3 凝血影响因素
结果见表2，葡萄糖、半乳糖不影响PHA-E凝血活性，EDTA抑制其凝血，Zn2+促进凝血。其他二价金属离子对PHA-E凝血活力未见明显影响。表2 EDTA、二价阳离子和单糖对PHA-E凝血活力的影响
2.4 电泳性质测定
所得产品PHA-E在12.5%凝胶浓度的SDS-PAGE上表现为单带，分子量为32 kD电泳位置与标准品PHA-E一致(见图4)。在PAGE上表现为单带，位置与标准品一致，结果见图5。在IEF上表现为两条带，主带位置为pI 6.5，与标准品位置一致(见图6)。以上电泳分析证明，分离得到的产品PHA-E纯度达到电泳纯，电泳性质与标准品一致。
3 讨论
植物血细胞凝集素PHA是由五种四聚体糖蛋白组成的混合物，组成的蛋白质等电点在5.4～6.5之间。其中PHA-E的等电点最低，为pI 6.5。目前文献报道主要是通过亲和层析［10，11］、盐析和离子交换树脂结合［12］来进行凝集素的纯化。亲和层析提取PHA，然后再纯化得到各个单体，操作步骤虽然简单，但是亲和介质价格昂贵且重复使用率低，产品质量虽然很好，但是成本较高。普通生产采用离子交换树脂法，成本较低，但是在前处理阶段却需要盐析使蛋白质沉淀，而后透析脱盐，处理量大，步骤繁琐。
本研究采用直接在阳离子交换层析柱上进行pH梯度的洗脱，在阴离子交换柱上进行盐浓度的洗脱。通过离子交换树脂的富集浓缩，达到了盐析法的效果，且纯化效果更好。离子交换层析处理上没有体积限制，也较传统方法更具备优势。产品经PAGE考马斯亮蓝R-250染色后得到单一的带，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示一条分子量为32 kD的带，IEF电泳经考马斯亮蓝R-250染色后得到样品等电点为6.5，说明分离得到的红芸豆凝集素具有较高的纯度且与标准品吻合。PHA-E样品在血凝活性检测中，能使5O%人红细胞凝集的最低浓度约为4 μg/ml.
PHA-E具备单一的凝血活性，能特异性的识别特殊糖链，因而在免疫诊断方面较PHA更具优势，纯化的红细胞凝集素可作为糖专一性探针，研究癌变细胞膜糖链结构和细胞变异的工具。
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单细胞研究篇5
【关键词】长春瑞滨软胶囊；晚期非小细胞肺癌；老年人
肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，近年其发病率在我国持续上升，随着生活水平的提高，我国老龄化问题日趋严重，而在老年人中肺癌的发病率较高，且就诊时多为晚期，因一般情况差、基础疾病及并发症较多、或病人及家属对放化疗毒副作用恐惧等原因，绝大部分高龄非小细胞肺癌患者得不到规范的抗肿瘤治疗。因此探讨适合高龄患者的安全有效的化疗方案非常必要。长春瑞滨是一种半合成的长春花生物碱，是一种周期特异性抗癌药，主要通过与微管蛋白结合，使细胞在有丝分裂过程中形成障碍。长春瑞滨软胶囊为口服剂型，给药方便，较易为老年患者接受。
我科2010年9月――2012年9月采用长春瑞滨单药口服治疗70岁以上晚期高龄非小细胞肺癌25例，对症支持治疗15例，进行随机对照临床研究，现总结分析如下。
1资料与方法
1.1临床资料全组40例，男30例，女10例。年龄70-85岁，平均年龄75岁。病理类型：鳞癌27例，腺癌13例，均为初治。按国际肺癌TNM分期标准，治疗组25例，Ⅲb期10例，Ⅳ期15例。对照组15例，Ⅲb期6例，Ⅳ期9例。治疗组患者Karnof-sky≥60，无明显心、肺、肝、肾功能失代偿，脑转移患者不入组，预计生存期3个月以上，患者及家属已签署化疗知情同意书。
1.2方法两组患者均无手术指征，并拒绝静脉化疗及放疗，均给予最佳对症支持治疗。治疗组25例给予长春瑞滨软胶囊（江苏恒瑞医药有限公司生产，商品名：盖诺）口服化疗，前三周期用药量为60mg/m2，d1，8，15，28天重复，未出现Ⅲ、Ⅳ°骨髓抑制患者第四周期开始剂量增至80mg/m2。每次服药前复查血常规及肝肾功能，并给予辅助护肝、护胃、止吐药物，出现骨髓抑制的患者给予重组人粒细胞集落刺激因子及重组人白介素-11维持血象。未接受长春瑞滨口服化疗的15例患者为对照组。除死亡病例外，两组患者均完成规定治疗。
1.3评价标准
1.3.1疗效评价按WHO实体瘤疗评定标准，分为：完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD）。CR+PR为总有效率（RR），CR+PR+SD为临床受益率。
1.3.2不良反应的评价按WTO标准分为0-Ⅳ度，以Ⅲ度或Ⅳ度为严重不良反应。
1.4统计学处理应用SPSS16.0统计软件，计数资料采用χ2，p
2结果
2.1近期疗效两组均无CR患者。治疗组的有效率为24%，临床受益率为72%。其中部分缓解（PR）6例，稳定（SD）12例，进展（PD）7例，中位生存期7.5月，1年生存率为35.4%。对照组的有效率为6.67%，临床受益率为40%。其中PR1例，SD5例，PD9例，中位生存期4.5月，1年生存率17.5%，见表1。两组结果，无论有效率、临床受益率、中位生存期还是1年生存率，疗效比较差异均有显著意义（p0.05）。
3讨论
老年人生理功能减弱，免疫机制降低，比年轻人对化疗药物更易受伤害[1]。因此选择高效低毒抗癌药物已成为治疗老年非小细胞肺癌患者的关键。
长春瑞滨是天然植物长春花碱中分离得到的半合成衍生物，对微管蛋白有高度的亲和力，阻止微管蛋白聚合物形成微管，又可诱导微管的解聚，使纺锤体不能形成，细胞分裂停止于有丝分裂中期，是抗有丝分裂的细胞周期特异性药物。该药抗肿瘤活性高，抗瘤谱广，入血后在肝脏浓度最高，其次为肺，肺中含量比其他长春碱类药物高，是目前治疗非小细胞肺癌的有效药物之一。但在用药过程中，静脉注射长春瑞滨后局部静脉炎发生率可达57.6%，而影响进一步用药[2]。长春瑞滨软胶囊则解决了静脉炎的问题。长春瑞滨联合顺铂方案是目前治疗晚期NSCLC的一线方案之一，正广泛应用于临床治疗。顺铂一直被认为是最有效的、最具活性的药物[3]，但由于其较强烈的恶心呕吐反应和肾脏、神经等毒性而限制了一进步的临床应用[4]。尤其是晚期高龄非小细胞肺癌患者，往往合并慢阻肺、冠心病、高血压、糖尿病等慢性疾病，老年人各种生理机能衰退，肝肾功能以及骨髓再生能力及储备能力减弱[5-6]，导致机体对药物耐受性差，联合化疗可能出现严重的毒性反应或诱导并发症的发作及加重。所以对晚期高龄非小细胞肺癌患者，我们强调个体化治疗，本临床研究应用长春瑞滨软胶囊单药治疗70岁以上老年人晚期NSCLC，与对照组相比，无论有效率、临床受益率、中位生存期还是1年生存率，疗效比较差异均有显著意义（p均0.05）。毒副作用主要为白细胞减少症、血小板减少症、贫血、消化道反应、周围神经毒性反应。治疗组25例患者均未出现Ⅲ-Ⅳ度血液学毒性反应及非血液学毒性反应，经积极对症支持治疗均恢复正常，结果表明长春瑞滨软胶囊单药治疗70岁以上老年人晚期NSCLC有确切的疗效，治疗毒副作用少，患者生活质量较好。
长春瑞滨软胶囊单药方案，毒副反应更少见，治疗耐受良好，且经济性高，较易为老年患者接受，比较适合晚期高龄NSCLC患者。
参考文献
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单细胞研究篇6
[关键词] 系统性红斑狼疮；B淋巴细胞活化因子；B淋巴细胞活化因子受体；实时荧光定量反转录-聚合酶链反应
[中图分类号] R593.24 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0043-03
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及多脏器的自身免疫性疾病，存在B淋巴细胞过度活化。B淋巴细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）是近年发现的肿瘤坏死因子（TNF）家族的新成员，主要作用是调节B淋巴细胞的功能。新近发现的BAFF第三种受体BAFF-R，是BAFF的特异性受体，两者结合后，参与调节B细胞内稳态失调。本课题研究SLE患者治疗前后BAFF与BAFF-R的表达，探讨BAFF与BAFF-R在SLE发病机制中的作用和意义，为SLE的病情发生、发展及治疗后评估提供新的思路和评价指标。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2010年1～10月山西医科大学第二医院和二医院风湿科住院SLE患者14例，均符合美国风湿病协会1997年修订的SLE诊断标准；其中，男性1例，女性13例，年龄18～44岁，平均（32.05±12.42）岁。有慢性感染病史、恶性肿瘤、高血压、糖尿病及严重的心脑血管疾病者除外。治疗采用醋酸泼尼松（1～2 mg/kg），环磷酰胺（800～1000 mg，3～4周应用1次）。正常对照组10例，年龄20～41岁，平均（28.76±7.29）岁。所有入组患者SLEDAI评分均大于10分，经治疗后14例患者均病情稳定（以SLEDAI评分低于10分为病情稳定）。
在治疗前、治疗后12周观察SLEDAI评分变化，实时荧光定量RT-PCR检测外周血单个核淋巴细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs） BAFF和BAFF-R mRNA表达水平。
1.2 主要试剂与仪器
B320A型医用低速离心机（白洋离心机厂），人淋巴细胞分离液（中国医学科学院生物工程科学研究所），Trizol（TaKaRa公司），氯仿（北京化工厂），异丙醇（北京化工厂），反转录试剂盒（TaKaRa公司），PCR试剂盒（TaKaRa公司）。
1.3 方法
1.3.1 PBMC的提取：抽取SLE患者及健康对照组静脉血各10 ml，加淋巴细胞分离液，密度梯度离心法常规分离PBMC，细胞计数至少达到5.0×106个/ml。
1.3.2 RNA的提取：细胞中加入750 μl RNAiso plus，室温静置5 min，12 000 r/min离心5 min，上清移至新的离心管，加入1/5RNAiso plus体积量的氯仿，室温静置5 min，12 000 r/min离心15 min，上清移至新的离心管，加入等体积量的异丙醇，室温静置10 min，12 000 r/min离心10 min，向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，弃上清保留沉淀，溶于20 μl DEPC处理水中。
1.3.3 根据Genbank人BAFF mRNA序列（AF132600），利用PCGENE软件设计引物（表1）。
1.3.4 反转录反应：加入5×PrimeScriptBRBuffer 4 μl，PrimeScriptBRRT Enzyme MixⅠ1 μl，Oligo Dt Primer 1 μl，Random 6 mers 1 μl，Total RNA 5 μl，DEPC处理水8 μl。37℃15 min，85℃ 5 s。加入总RNA的提取与cDNA 的合成，PCR扩增依据试剂盒说明进行。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5 统计分析软件包处理数据，所有正态分布数据以x±s表示，非正态分布数据以四分位间距表示，组间均数比较采用t检验/单因素方差分析或秩和检验，以P
2 结果
14例SLE 患者治疗前、治疗后12周PBMC BAFF mRNA表达水平与正常对照组相比明显升高（P
14例SLE 患者治疗前、治疗后12周PBMC BAFF-R mRNA表达水平与正常对照组相比明显升高（P
3 讨论
SLE是以B淋巴细胞异常增殖为主的一组自身免疫性疾病，异常B细胞在SLE发病中起到主要作用[1]。BAFF是肿瘤坏死因子家族新成员，是B淋巴细胞生长、发育和分化中重要的免疫调控因子。BAFF是近年来各国学者研究的热点。病理状态下，BAFF过度表达可能参与了自身反应性B细胞的产生和自身免疫耐受的失衡，导致自身免疫病的发生[2]。BAFF-R是BAFF的特异性受体，BAFF主要通过与BAFF-R的结合对B细胞的发育、功能及内稳态失调发挥重要调节作用[3]。然而过量的BAFF又会导致B淋巴细胞过度活化而引起某些自身免疫性疾病（如SLE）。
本研究中治疗前SLE患者BAFF mRNA水平较正常对照显著升高，治疗后BAFF mRNA水平较治疗前显著下降，这与以往报道相似[2-4]，提示BAFF可能参与了SLE的发病，可能BAFF与疾病活动相关。国内研究发现，SLE患者PBMCs中BAFF的表达与SLE的活动性指标呈正相关，与高免疫球蛋白IgG、IgM血症呈正相关，与补体C3、C4水平呈负相关[5]。说明BAFF是SLE发病的重要调控因子，其在PBMCs中表达的升高在一定程度上反映了SLE病情的活动。
BAFF有三种受体，BAFF-R是BAFF的特异性受体[6]。为此本实验同时检测了SLE患者外周血单个核细胞中BAFF及其受体BAFF-R的表达，以进一步探讨BAFF及BAFF-R在SLE中的变化和意义。本研究中BAFF与BAFF-R结果一致，治疗前SLE患者BAFF-R mRNA表达水平与正常对照组相比明显升高，病情稳定后显著下降，提示BAFF-R可能参与发病，并且也可能与病情活动有关。
而BAFF/BAFF-R途径可能是参与SLE 发病机制的主要途径，BAFF、BAFF-R可以作为疾病活动性指标。治疗后BAFF/BAFF-R表达水平明显下降，如果设法阻断BAFF/BAFF- R的生物活性，可能起到治疗SLE的作用[7]。国内丁涵露等[8]研究发现在BXSB狼疮鼠腹腔注射B淋巴细胞因子融合蛋白5周后发现，外周血BAFF水平下降，抗dsDNA抗体有部分下降，尿蛋白减少，肾脏病理损伤减轻，提示抑制体内BAFF水平可能对治疗SLE有效。因此抗BAFF、BAFF-R抗体和用它们的受体融合蛋白封闭BAFF、BAFF-R，使B淋巴细胞活化受抑，能为SLE提供新型药物。
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单细胞研究篇7
[关键词] 单侧输尿管部分梗阻；输尿管平滑肌；M3受体
[中图分类号] R693.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（b）-0034-03
已有研究显示，在单侧输尿管梗阻（PUUO）的动物模型中，8周时PUUO大鼠的输尿管肌条的收缩功能[1]和输尿管平滑肌细胞中的α1-肾上腺素能受体[2]以及Ca2+浓度均强于或者高于同期对照组，而16周时PUUO大鼠的相应指标均是减弱或者降低的。所以本研究采用国内学术界认可的输尿管梗阻动物模型制作方法，于不同实验时间点分离大鼠输尿管检测输尿管平滑肌M3受体蛋白的表达水平，为上尿路动力学研究同临床工作相结合做好铺垫。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组[3-4]
将80只190～230 g雄性Wistar大鼠随机分成4组：8周PUUO组、8周对照组、16周PUUO组和16周对照组，每组各20只。
1.2 大鼠输尿管梗阻模型的建立
两PUUO组大鼠用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉后仰卧位固定，腹部备皮后用络合碘消毒左侧腹部，行长3～5 cm的纵形切口。游离左侧输尿管，将腰大肌腹侧纵行切开1～2 cm，将左侧输尿管上1/2包埋于腰大肌切口中，用丝线缝合，注意切口不能过紧，造成部分输尿管梗阻模型。两对照组只将左侧输尿管游离，给与相同的刺激和生理环境。术毕在29℃恒温箱内使动物复苏，复苏后放回笼中，排便后在标准饮食和恒温照明条件下饲养，温度（21±2）℃，湿度（55±2）%[3]。
1.3 肾盂压力检测
参照文献[4]的方法进行模型验证。
1.4 主要试剂与仪器
高保真即用PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），Goat Anti-Mouse IgG（广州康世德生物有限公司），Western Blotting Kit兔IgG（广州康世德生物有限公司）。PE2400PCR扩增仪（Perkin-Emer公司），旭日EF-750生物电泳分析系统（广州旭日科技有限公司）。
1.5 实验方法
1.5.1 RT-PCR检测输尿管平滑肌M3受体mRNA表达水平
1.5.1.1 检材取样与RT-PCR 造模成功后，提取输尿管平滑肌细胞M3受体mRNA，取2 μg mRNA加入cDNA合成试剂盒配置成混悬液进行反转录。取总RNA模板2 μg、引物Oligo（dT）18（0.5 μg/μL）1 μL，用Px2′NTase-free水定容至12 μL，充分混合均匀，70℃恒温水浴5 min后加入5×Reaction Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor（20 U/μL）1 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）2 μL充分混匀，37℃恒温水浴5 min后加入1 μL M-MuLvRT（20 U/μL），使终体积为20 μL。37℃水浴保温60 min，70℃水浴加热10 min后结束反应，将所得cDNA于-20℃冻存。各引物序列参照Gen Bank中的序列，应用ABI primer express 3.0软件进行引物设计。
1.5.1.2 PCR扩增反应及电泳 按照高保真即用PCR扩增试剂盒说明书进行PCR扩增反应。抽取每种扩增产物15 μL，进行琼脂糖凝胶电泳分析，分别用DNA marker来判断扩增片段的大小，用溴化乙锭染色来观察所得扩增产物的量与片段大小。PCR扩增产物在100 V恒压1.6%的琼脂糖凝胶中电泳约90 min后，电泳的条带结果输入生物凝胶电泳图像分析系统进行图像分析，根据所得灰度值将参照引物的浓度与M3受体mRNA对比得出具体数值。
1.5.2 Western- blotting法检测输尿管平滑肌中M3受体蛋白水平
取梗阻以上肿胀的输尿管组织100 mg，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加入蛋白裂解液1 mL，冰上研磨5～10 min，重复3次。取匀浆1 000 mL，4℃下12 000 r/min离心5 min，取上清液加入等体积的2×SDS buffer，加热至100℃，5～10 min，迅速冰浴，取上层清液，置于-20℃保存备用。制备10 mm厚的SDS胶，包含0.1%十二烷基磺酸钠，其中分离胶含12%聚丙烯酰胺，积层胶含5%聚丙烯酰胺。计算出含25 μg蛋白的溶液体积后，蛋白样品电泳进行分离，浓缩胶电压80 V，30～60 min；分离胶电压120 V，2～3 h。然后经200 mA恒流电转膜至PVDF膜，用5%牛奶封闭液室温封闭PVDF膜3 h，与特异性M3受体抗体：Rabbit Anti CHRM3（广州康世德）1∶1 000稀释，4℃过夜。TBST洗涤，3×5 min，及相应二抗∶Western-blotting Kit兔IgG（广州康世德）1∶5 000稀释，室温反应2 h，以β-actin肌动蛋白作为内参对照。将PVDF膜置二氨基联苯胺（DAB）显色试剂中进行显色，并用生物凝胶电泳图像分析系统（旭日EF-750），对Western- blotting印迹条带进行图像采集照相和数据分析，测定其灰度值，并计算目的条带面积和灰度的乘积值与β-actin内参蛋白条带面积和灰度的乘积值的比值用于定量比较。
1.6 统计学方法
采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
成模的40只大鼠通过验模后，8周PUUO组和8周对照组分别有17只和19只完成实验，16周PUUO组和16周对照组分别有14只和16只完成实验。
2.1 各组输尿管平滑肌中M3受体mRNA表达结果
RT-PCR结果显示M3受体mRNA的表达，8周PUUO组高于8周对照组（55.16±3.94）vs（36.48±3.87），16周PUUO组低于16周对照组（19.37±3.70）vs（37.39±3.65），8周PUUO组高于16周PUUO组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。
2.2 各组输尿管平滑肌中M3受体蛋白表达结果
Western-blotting结果显示M3受体蛋白的表达，8周PUUO组高于8周对照组（27.13±1.77）vs（21.36±2.69）（P < 0.05），16周PUUO组低于16周对照组（19.41±1.37）vs（23.43±1.58），差异均有统计学意义（均P < 0.05），8周对照组与16周对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。
3 讨论
泌尿系统是完整、统一的整体，在解剖结构上是具有连续性的管道，具有贮存、转运和排泄尿液的功能，而尿路梗阻是临床上常见的一种病变，不论其发生在泌尿系统的任何部位和任何性质，梗阻部位近端的尿路均会随病程的进展出现尿流储运异常，进而逐渐影响肾脏功能[5]。
近些年来，许多学者致力于上尿路梗阻后其受累器官肾脏发生改变的研究[6-7]，并且已经取得了一定的进展。而本研究则将尿路梗阻后最先发生变化的输尿管作为研究对象，观察病变早期受累组织输尿管的生理、生化的改变，揭示其相关机制所发生的变化。本研究已在前期证实了PUUO模型中病变输尿管的平滑肌收缩功能和平滑肌细胞中α1-肾上腺素能受体以及Ca2+浓度在不同梗阻时间点发生的相应变化，所以本研究期望通过分子水平的进一步探讨来阐明PUUO后输尿管发生的变化。
M3受体是人体平滑肌细胞中一种重要的G蛋白偶联受体，虽然在上段输尿管平滑肌细胞膜上分布不是最多的受体，但是它的兴奋可以加强输尿管平滑肌的收缩力，加快收缩频率。M3受体与配体结合后，即可通过一系列的生化反应增加细胞质内的Ca2+，使得平滑肌收缩。所以，M3受体在输尿管平滑肌的收缩中扮演着重要的角色，尤其是在输尿管发生梗阻后的整个病理变化过程中起着举足轻重的作用。
本研究在前期的系列研究中已经发现，在PUUO动物模型中8周实验组大鼠的输尿管平滑肌的收缩功能和输尿管平滑肌细胞中的α1-肾上腺素能受体以及Ca2+浓度均强于或者高于同期对照组，而16周实验组的相应指标均是减弱或者降低的。通过本实验，笔者发现在输尿管梗阻的动物模型中8周实验组病变输尿管平滑肌中M3受体mRNA及其受体的表达水平高于同期对照组（P ﹤ 0.05），16周实验组病变输尿管平滑肌M3受体mRNA及其受体的表达水平低于同期对照组（P ﹤ 0.05），而两同期对照组病变输尿管平滑肌中M3受体mRNA及其受体的表达水平差异无统计学意义（P ﹥ 0.05）。也就是说，8周实验组大鼠病变输尿管平滑肌中M3受体mRNA的表达及其受体的合成是上调的，而16周实验组大鼠病变输尿管平滑肌中M3受体mRNA的表达及其受体的合成则是下调的。由此，通过本实验在分子水平上可以证明大鼠发生尿路梗阻后8周处于代偿期而16周处于失代偿期，这也为发生尿路梗阻后输尿管产生的一系列病理、生化改变提供了实验依据。
在临床中，引起尿路梗阻的疾病有多种，临床表现各有不同，例如输尿管结石引起的肾绞痛可能是输尿管平滑肌处于代偿期而收缩功能增强所致[8]，所以笔者一般是应用M3受体的阻滞剂对其干预来降低输尿管平滑肌的兴奋从而解除痉挛，缓解患者的症状。而有的疾病例如肾盂输尿管连接部狭窄，由于早期无症状，当发现尿路梗阻时已经产生肾积水，输尿管平滑肌可能处于失代偿期，而无法促进梗阻部位以上尿液的排泄。因此根据本研究得出的结论，可以考虑通过选择合适的时间点使用相应的药物干预其发展的过程来缓解输尿管在发生梗阻的代偿期或者失代偿的前期产生的各种症状，达到解除患者痛苦，减轻或者延缓尿路梗阻对受累器官肾脏的损害。但是如何选择合适的时间点进行干预，选择何种方法干预，干预的结果又如何，还有待以后继续研究和探讨，以便得出进一步的结果。
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单细胞研究篇8
那么，有没有可能制造出单倍体胚胎干细胞呢？科学家们想出了非常巧妙的办法。他们把注射到去除了细胞核的卵母细胞中，或者把原核期受精卵的雌原核去除，再把这样的细胞体外培养到囊胚期，由此能获得“孤雄单倍体胚胎干细胞”。类似地，去除原核期受精卵的雄原核，或者孤雌激活卵母细胞，再将细胞体外培养至囊胚，则能获得“孤雌单倍体胚胎干细胞”。经检测验证，这些单倍体干细胞既保持了普通胚胎干细胞的特点，又同或卵细胞一样只有一套染色体，而不是像普通二倍体胚胎干细胞那样有两套。
获得基因修饰动物
为了检测单倍体胚胎干细胞的功能，科学家们将孤雄单倍体干细胞注射到卵母细胞中，惊奇地发现，它能够成功替代完成使卵受精的使命，所得胚胎能正常发育至成年并具有生育能力。进一步，科学家们对这种孤雄单倍体胚胎干细胞进行了特定的基因修饰，并注射进卵母细胞得到后代，这样出生的小鼠直接携带了这种修饰后的基因序列，从而方便地获得了基因修饰动物。利用单倍体胚胎干细胞获得基因修饰动物，为一些其胚胎干细胞不能嵌合到生殖系的物种，例如非人灵长类等，提供了新型的获得基因修饰动物模型的方法。
进行同性生殖
由于在哺乳动物中进化出了基因组印记调控，哺乳动物无法实现同性生殖。而利用单倍体胚胎干细胞技术，小鼠的同性生殖已经成为了现实。科学家们利用新型的基因编辑技术CRISPR-Cas9系统改变了孤雌单倍体干细胞中称为H19和Gtl2的两个非常重要的印记基因区域，将原本的雌性印记逆转为了雄性印记。然后将这种逆转后的孤雌单倍体干细胞替代，注射进卵母细胞，获得了遗传物质来自于两个雌性亲本的后代小鼠。这一技术将加速人们对于基因组印记机制的研究，也会给生殖方式带来新的认知。
研究物种间杂交
物种之间存在生殖隔离，一直以来，科学家都想获得分别来源于两个物种全套遗传物质的稳定细胞系。而最近，科学家利用单倍体干细胞技术，将这一想法变为现实。他们将大鼠和小鼠的单倍体胚胎干细胞进行细胞融合，创造出了大小鼠异种杂合二倍体胚胎干细胞，这种细胞含有一套大鼠染色体和一套小鼠染色体。他们通过测序方法统计出大部分基因的表达量是小鼠和大鼠各贡献一半。这一研究建立了新型的哺乳动物胚胎干细胞，为研究物种间性状差异，物种间基因、RNA和蛋白质之间相互作用提供了非常好的工具。
单细胞研究篇9
概述来源于人类恶性绒毛膜癌的3种滋养层细胞系(BeWo,Jar和JEG)表达了侵袭子宫的滋养层细胞的很多生物化学和形态学特征,因此这些细胞系被用来作为模拟胎盘屏障的模型[6]。其中,BeWo细胞系是最早建立的滋养层细胞系,已经被证明是研究药物和营养物质通过滋养层跨细胞转运最有意义的模型,因为其能在相对较短的时间内通过传代维持并生长为与胎盘滋养层相似的融合的细胞单层,可以表达与典型的滋养层相同的激素分泌特性以及体现妊娠晚期滋养层的很多特性[7],还与胎盘屏障存在相似的转运体,在顶侧和基底侧存在ATP-结合盒(ATP-bindingcassette,ABC)转运体和可溶性载体(solutecarrier,SLC)两大家族中多种转运蛋白的表达[8]。模型的制作方法及鉴定BeWo细胞多用含胎牛血清(FBS,10%)、L-谷氨酸盐(1%)、青霉素(1×104U/mL)、链霉素(100mg/L)的DMEM/F-12培养液培养(37℃、5%CO2),传代后将其接种于Transwell小室(TranswellInsert)或Millicell小室(MillicellInsert,孔径0.4μm)的碳酸酯膜上,待细胞生长为具有屏障性质的融合层即可使用。跨BeWo细胞的转运实验一般在Transwell小室或水平扩散池(side-by-sidediffusioncell)中进行。在细胞层的顶侧加入含有待测药物的Hank′s平衡盐溶液,在基底侧加入空白Hank′s平衡盐溶液(或相反操作),培养过程中定时从基底侧(或顶侧)取样,测定两侧药物含量,计算出药物的表观通透系数(Papp)[9]。BeWo细胞单层的完整性和功能性可通过以下指标评价[7,10]:①细胞形态学观察。电子显微镜或透射电镜观察单层细胞融合性和细胞间紧密连接,在细胞培育4~6d时,切除碳酸酯膜,透射电镜观察横纵切面,可见细胞呈现连续单层,此时的细胞单层即可进行跨膜转运实验。②BeWo细胞单层的跨膜电阻(transepithelialelectricalresistance,TEER)。在细胞培育4~6d,TEER约达60Ω?cm2时,细胞单层即可进行跨膜转运实验。③漏出标记物被动扩散的跨膜通量。通常用甘露醇、葡聚糖T70、荧光素等荧光或放射性标记物,考察一定时间内BeWo细胞单层对低分子和高分子漏出标记物的透过情况。模型的应用及评价到目前为止,BeWo细胞系已经成功用于研究多种营养物质和化合物的不对称的跨细胞转运,包括氨基酸、葡萄糖、胆固醇、叶酸、脂肪酸、转铁蛋白、血清素、胆碱和免疫球蛋白等。近年来,利用该模型研究了多种营养物质、药物、有毒物质等的跨胎盘转运[11-13]。BeWo细胞是目前研究滋养层转运和药物代谢的有效模型,不足之处在于BeWo细胞不能自发分化为合体滋养层,不能模拟人胎盘屏障结构在妊娠期呈现的动态变化过程。而且体外培养胎盘合体滋养层细胞需要的费用较高,实验周期长,对实验室的设备和条件要求也较高。
胎盘组织模型
概述胎盘组织培养操作简便、快捷,对实验室的设备和条件要求不高,易于开展,且妊娠各期胎盘组织均可获得并进行培养。体外培养的胎盘组织可以用来研究母体胎儿许多方面的相互关系,如转运、酶功能、营养物质和异生物质代谢[14]。目前可用于研究药物胎盘代谢和转运的胎盘组织模型有绒毛模型和质膜囊泡模型两种。模型的制作方法及鉴定胎盘绒毛组织从胎盘分离后被剪切为2mm大小的碎片,于含有药物或营养物质的培养基中孵化(通常进行放射性标记),以进行这些药物胎盘摄取的评价。培养一段时间后,组织碎片在蒸馏水中移除、洗涤和裂解,以释放放射性底物,使用闪烁计数法分析结果。胎盘绒毛模型可在体外维持组织结构完整性至少达3h,通过检测微绒毛边缘膜、合胞体和质膜的完整性,胎盘催乳素和雌二醇的分泌率,以及乳酸脱氢酶的释放水平来评价绒毛的完整性和功能性[15-17]。模型的应用及评价合体滋养层细胞形成了胎盘绒毛的最外层,因此,胎盘绒毛常用于药物或营养物质的摄取和转运体功能研究。例如,研究氨基酸和葡萄糖的摄取,胎盘的葡萄糖和氨基酸转运载体的激素调节,检测P-糖蛋白(P-gp)的表达和活性[15-16,18]。近年来,胎盘绒毛模型常被用来研究胎盘转运体功能的表达[19-20]。合体滋养层细胞与滋养层细胞培养相比,其优势在于转运载体的表达在整个研究过程不易改变,且极性和细胞间的连接与体内更加相似,优于培养滋养层细胞系或离体的细胞滋养层细胞。胎盘绒毛模型已经成功应用于妊娠早期及足月胎盘的氨基酸的摄取研究,提示该模型可应用于整个妊娠过程中胎盘摄取的相关研究[17]。胎盘绒毛模型可用于物质在合体滋养层摄取的研究,但不能用于跨细胞转运的研究。而且绒毛碎片由多种细胞组成,运用该模型得到的结果不能完全反映滋养层细胞的摄取。模型的制作方法及鉴定质膜囊泡来源于人足月胎盘上从合体滋养层细胞剥脱的表面微绒毛,将脐带、胎膜和蜕膜从胎盘去除,于母体面切取组织,搅动切碎物使微绒毛膜疏松,用两层棉制纱布过滤,滤液通过差速离心、洗涤进一步纯化获得微绒毛备用。通过监测标志性酶的活性来鉴别膜完整性和方向性:以具有活性的标志性酶含量代表顶膜囊泡的特性,如碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶;在洗涤剂存在与否的条件下,通过检测核苷酸焦磷酸酶的活性判断囊泡的方向性或两面性[21]。模型的应用及评价质膜囊泡可以从滋养层的刷状缘膜和基底面分离,可以分别研究其功能,进而研究各自不同的转运蛋白。例如,Ushigome等[22]研究P-gp的生理表达功能,证明了使用P-gp抑制剂、维拉帕米、环孢素A、孕激素或C129抗P-gp的单克隆抗体可以抑制胎盘膜囊对地高辛和长春碱的吸收。近年来,胎盘微绒毛膜多被用来研究P-gp的调节转运、阳离子化合物的转运机制、药物与营养物质转运的相互作用,以及病理条件的胎盘上氨基酸转运的差异[23-24]。质膜囊泡制备是另一种研究胎盘转运的可行的体外模型,这一模型对于研究药物或化学物质透过质膜的转运机制是很有意义的,但是其主要缺点是膜转运蛋白活性的研究需要在不存在调节因子的条件下完成,因此不能完全反映在体情况[25]。
单细胞研究篇10
随着高新技术的发展和人们对生物医学认识的不断提高和更新，近年来医学基础研究呈现出飞跃式发展。人们利用不断发展开发的新技术，对人类各种疾病的发生发展进行了深入的研究和探讨。以下就泌尿系肿瘤基础研究的热点及我国存在的问题做一简要介绍。
1 干细胞的研究
1.1 骨髓间充质干细胞的研究 骨髓间充质(mesenchymal stem cells， MSC)是骨髓间质细胞的前体细胞，它与骨髓微环境密切相关。人们已在体外成功分离出MSC，并能诱导分化为骨、软骨、神经细胞等多种其他组织细胞。近年来，MSC在组织工程重建尿路和泌尿系统器官方面的研究层出不穷，主要在先天性畸形、外伤、肿瘤和手术造成的组织缺损等，如尿道、输尿管、睾丸、膀胱等器官的组织工程重建均有研究报道。研究表明MSC可定向分化为膀胱上皮细胞、肌细胞以及新生器官必须的血管内皮细胞和神经细胞。体外实验证明MSC可分化为睾丸生精细胞和具有雄激素分泌功能的细胞。这为泌尿系肿瘤手术切除后组织和器官缺损的替代和功能恢复开拓新的领域。
1.2 肿瘤干细胞的研究 近年来，成体干细胞成为医学界倍受关注的课题之一。人们对干细胞的认识由造血干细胞的研究开始，后发展到对组织成体干细胞的研究。最近有人提出干细胞与肿瘤发生有关，认为肿瘤细胞中存在少数干细胞样肿瘤细胞，这可能是肿瘤细胞的启始细胞。由此提出了肿瘤干细胞(cancer/tumor stem cells)的新概念。也有人将其称为肿瘤启始细胞(tumor initiating cells)。这使人们对干细胞的认识更加深入一步。肿瘤干细胞的研究最早由Bonnet等在1997年研究急性粒细胞白血病发现白血病干细胞，随后涌现出大量的实体瘤干细胞研究。
肿瘤的发生与成体干细胞密切相关，许多肿瘤常起源于干细胞的突变或分化停止。人们同样发现肿瘤细胞与干细胞有着惊人的相似性，二者均具备很强的自我更新能力。Mary Hendrix 发现转移的肿瘤细胞在很多方面与干细胞相似，除了表面分子标志相似外，还具有干细胞的多能性。随着肿瘤干细胞被人们逐渐认识后，大量的实体肿瘤干细胞的研究相继问世，包括乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤等研究。最近，国内有膀胱癌、前列腺癌肿瘤干细胞研究的课题在进行中。肿瘤干细胞的研究将可能进一步揭示肿瘤的生物学行为，可以更好地指导肿瘤治疗，选择性的杀伤肿瘤干细胞从而切断肿瘤的起源，可能在预防肿瘤复发和转移方面有重要的意义，也可以通过检测肿瘤干细胞的特殊或特异的分子标记物早期诊断肿瘤，评价治疗效果和评估预后。
2 细胞凋亡与肿瘤
大量的研究充分证明了肿瘤发生发展与细胞凋亡状态密切相关。细胞的程序死亡(凋亡)受到抑制时细胞大量增殖，使肿瘤发生、发展、复发，也可使肿瘤产生化疗耐药。细胞凋亡有两个主要的调节通路：一是bcl2/bax等凋亡相关蛋白的调节使细胞色素C释放，然后活化凋亡效应蛋白caspase9、caspase3、PARP，最终使DNA断裂细胞凋亡；另一个是Fas与细胞表面的FasL作用，激活了caspase8、caspase3、PPAR等使细胞发生凋亡。在细胞凋亡的过程中这些效应蛋白caspases起着关键作用。而这些凋亡效应蛋白受一组凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis， IAPs)的调控。LIVIN和XIAP基因是新近发现的凋亡抑制蛋白家族新成员，可抑制凋亡效应蛋白caspase3，7，9等的活化，使细胞逃避凋亡。近几年国内外研究发现LIVIN和XIAP在膀胱癌组织中高表达，提示可能与膀胱癌发生、发展和复发相关。将XIAP基因转入膀胱癌细胞T24可使细胞凋亡受到抑制，细胞增殖活性增强。这些研究均表明凋亡抑制蛋白与移行细胞癌的发生和复发有着不可分割的联系。
大多数化疗药物是通过使细胞凋亡而发挥抗癌作用的。XIAP高表达的膀胱癌显示了对化疗药物的耐药性，是因为XIAP使肿瘤细胞凋亡受到抑制而产生抗药作用。在肾癌的研究中发现MDR1、GSTπ、topoⅡ等基因高表达是肾癌显示了强的抗化疗作用。针对泌尿系肿瘤化疗耐药的研究结果，大量的逆转耐药的研究也在展开，通过各种分子生物学手段阻断不同耐药基因或凋亡抑制蛋白的表达，在体外实验和动物实验中获得了明显的逆转耐药的作用。但是MDR (multidrug resistance)机制是一个极其复杂的过程，它通过不同的传导通路中多个基因的相互作用。因此，单一机制的研究远不能解决肿瘤耐药的问题，肿瘤耐药研究的展望包括：①多因素耐药的相互作用机制；②细胞凋亡和凋亡抑制与化疗耐药机制的研究。
细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、复发和化疗耐药密切相关，深入研究细胞凋亡将可能阐明肿瘤发生、发展和耐药机制，也将是解决临床实际问题的基础。
3 血管生成与肿瘤
新生血管的形成是肿瘤生长的基本条件。早在1863年，Virchow就注意到肿瘤组织中血管绝对数急剧增加，1945年Algire提出了肿瘤新生血管 (neovascularization)的新概念。研究提示肿瘤生长分为两个时期：①血管形成前期，癌细胞的营养供应主要依靠周围组织的弥散作用；②血管期，当癌组织＞2-3mm或癌细胞数＞107时，肿瘤内出现新生血管。肿瘤细胞分泌多种促血管生成因子(VEGF，TGF，PDGF等)，它们促进内皮细胞迁移并形成新生血管。肿瘤血管为肿瘤细胞提供营养，同时为肿瘤转移提供了途径。肿瘤血管形成机制及通过阻断肿瘤血管进行防癌、治癌在几乎所有肿瘤研究中均有大量报道，包括肾癌、膀胱癌、前列腺癌等，其中对肾癌的研究具有突破性进展。VEGF在肿瘤血管形成中起到关键作用，人们针对VEGF传导通路已经研制出多个分子靶向治疗药物，包括单靶点药物和多靶点药物，其中多靶点药物Sorafinib和Sunitinib于2005年和2006年先后被美国FDA批准治疗晚期肾癌。这些药物显示了较好的临床治疗效果。在研究中人们先后发现了多个肿瘤血管生成的抑制因子，包括血管生成抑制素(angiostatin， AS)和内皮抑素(endostatin， ES)等，AS可作用于血管内皮细胞使其发生凋亡，ES可抑制内皮细胞迁移并促进其凋亡。
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4肿瘤标记物的研究
肿瘤标记物是在某一肿瘤特异性表达或分泌(或释放)，在其他肿瘤组织或正常组织不表达或低表达(低分泌或释放)的分子，即分子标记物(molecular marker)或生物标记物(biomarker)。根据其临床功能可将肿瘤生物标记物分为：①肿瘤诊断，用于肿瘤早期诊断或治疗后的随访，肿瘤复发的早期诊断；②预后判断，用于判断肿瘤手术或治疗后无疾病生存或无进展生存；③化疗、放疗敏感性判断。肿瘤生物标记物的取材包括组织、血液、尿液、腹水和其他体液。泌尿系肿瘤生物标记物以膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌等的研究最为广泛和深入。
PSA是近20余年来前列腺癌诊断中的主要肿瘤标记物，用于前列腺癌的筛查、诊断、预后判断和随访。但由于PSA的特异性和敏感性较低，因此人们不断寻找更具有特异性和敏感性的标记物。PCA3是前列腺癌特异表达的基因，检测血PCA3mRNA特异性高于血PSA。最近研究发现检测尿PCA3/PSA mRNA(前列腺按摩后第一次尿)的特异性和敏感性明显高于血PSA，其诊断前列腺癌的特异性为76%-82%，敏感性为50%-63%，而同一组患者血PSA特异性仅为22%-42%(2006年AUA资料)。早期前列腺癌抗原(early prostate cancer antigen， EPCA)在前列腺癌特异表达，其前列腺癌诊断敏感性达80%，特异性84%。EPCA有EPCA 2.19和EPCA 2.22两个亚型。EPCA 2.19的界值为0.5ng/mL时，前列腺癌诊断敏感性为93%，特异性100%；EPCA 2.22的界值为30ng/mL时，前列腺癌诊断敏感性为96%，特异性100%。同一组患者PSA的特异性仅为37%。EPCA 2.22有助于区分局限性和非局限性前列腺癌。RM2抗原表达于前列腺癌细胞和间质，前列腺癌时有大量的RM2释放入血，因此检测血RM2有助于前列腺癌的诊断，尤其是PSA
膀胱癌的诊断和随访多年来依靠尿细胞学。尿细胞学的特异性很高(96%-100%)，但敏感性较低(38%-54%)。近年来人们从尿中找到了许多尿路上皮癌的生物标记物，如BTA在膀胱癌诊断特异性为92%，敏感性100%；NMP22的特异性77%-87%，敏感性为85%-91%；Telomerase的特异性95%，敏感性80%。此外，还有ImmunoCyt/uCyt+、soluble Fas、Survivin、MMP2、MMP9、Cox2、CD24等对尿路上皮癌的诊断均有一定特异性和敏感性。其中BTA、NMP22和ImmunoCyt/uCyt+已被FDA批准作为尿路上皮癌的临床应用。研究发现膀胱癌组织中高表达XIAP、MDR1等与化疗耐药密切相关，这对于判断膀胱癌化疗耐药或逆转耐药的研究奠定了基础。对于尿路上皮癌，这些生物标记物取代尿细胞学而应用于临床，仍有待于提高它们的特异性或寻找更具有尿路上皮癌特异性的生物标记物。
5 我国在泌尿系肿瘤基础研究中存在的问题
医学基础研究在中国与美国和欧洲相比有着一定的差距，包括在泌尿系肿瘤的基础研究。归纳起来，在我国基础研究还存在以下几个问题：
5.1 缺乏系统性和连续性 医学基础研究是根据某种生物现象或临床出现的问题进行探索，研究其发生的原因和过程，并解决问题，即所谓“还原因果”。解决某个生物现象或临床问题需要连续不断的系统性研究，单纯追求时髦或盲炒热点，“打一枪换一个地方”不仅不能“还原因果”，解决实际问题，反而造成极大的浪费。因此，一个好的实验室或一个好的课题组的研究方向应该高度集中，研究内容具有系统性和连续性。
5.2 缺乏创新性 科学技术的发展日新月异，许多创新性的研究不断涌现。但是，通过国内许多申请的科研项目和发表的大量文章来看，存在着对创新性的认识偏差：①认为别人没有做过的科研工作就是创新性的工作。创新性的科学研究应该是不仅具有新颖性(即他人没有做过的工作)，更重要的是具有突破性的思想和工作；②移植工作。认为在其他肿瘤中研究过，但在某一肿瘤中没人做过。这种情况如果对某一肿瘤具有独特的相关性，可能会得到突破性结果，但绝大多数情况属于重复工作。
5.3 重复工作 设计一个科研项目需要充分了解国内国际在该领域的研究现状，设计出具有创新性课题，避免重复工作。在中国因条件限制医学基础研究多年来落后于美国和欧洲，多数情况下属于追随科学。另外，因急于发表文章，急于求成或为发表文章而做科研，极易造成重复研究。在中国许多实验室虽然资金投入和设备条件不及欧美国家，但在中国具有大量的研究资源和人种地区的特点。从追随科学到自创科学是我们努力的方向。
5.4 研究方法单一 表现在通过单一研究方法(如免疫组化或原位杂交等)所得结果得出某一结论，这种情况往往是不完全或偏差的结果，也不符合科学的严谨性。研究和解释某一现象，如某一基因表达高或低，或表达改变导致下游传导通路改变和最终的生物现象的改变，应该在不同的分子水平如DNA、RNA、蛋白等水平分别研究，通过多种途径和方法证明这一现象。
5.5 单纯追求新方法和技术 目前存在某种偏差的认识，认为应用了新技术和方法(如siRNA、蛋白组分析、干细胞技术等)就能申请到科研项目和在好的杂志发表文章。方法和技术是为科学研究服务的工具，人们不断地研究开发新技术和新方法目的是为了更好地服务于科学研究。利用新技术和方法能更好的得到我们想要的研究结果是最终目的。