干细胞培养技术十篇
时间：2023-05-04 13:09:18
干细胞培养技术篇1
关键词：植物；干细胞；培养；生长特性
中图分类号：R282.2／R282.71 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2012)01-0052-04
植物来源的天然产物作为先导化合物和药物的主要来源，曾在制药业的发展中发挥过非常重要的作用。近年其地位日渐衰落，主要是因天然植物生长缓慢、活性成分含量低，致使此类化合物的来源难以保障，难以适应现代制药业工业化大生产的需求。
鉴于天然化合物具有重要的药用潜力和经济价值，随着现代科学的发展，各领域的学者为解决其来源给出了自己的答案，较有成效的研究主要集中在以下几方面：(1)在微生物中表达天然产物的合成途径，采用转基因工程菌发酵方式生产某些活性成分，如紫杉醇等；(2)以容易获得的化工原料或天然前体为基础，半合成某些结构复杂的化合物，例如：青蒿素等；(3)植物组织培养，定向生产目标成分，如紫草素等。然而，由于很多天然产物化学结构非常复杂和独特，涉及的生物合成途径也非常多，例如紫杉醇(20步反应)、喜树碱(11步反应)、长春新碱(18步反应)等化合物的生物合成均涉及一系列繁杂的酶促反应，要化学合成需要多达数十步反应。这样的天然产物在很长一段时间内是难以依靠化学合成或者合成途径表达的方法实现原料供应的。而植物培养技术，以生源植物细胞或组织固有的生物合成途径为基础，利用内源的相关酶系统，结合诱导子和生物反应器技术，定向生产目标成分，经过多年研究，已经有成功工业化的案例(表1)。如日本Mitsui Petrochemical Industries采用人工培养紫草细胞方法获得紫草素，实现了该成分的工业化生产。所得的紫草素不仅用以生产抗炎药，制成唇膏，在本国高科技绿色产品的概念推动下，当年销售量达到200万支，获得了良好的市场效益。美国Phyton Biotech公司利用红豆杉细胞培养技术，结合大量的诱导子实验，创立了紫杉醇高产的方法，其专利中披露的最高产量达902 mg／L。该公司目前已经获得FDA批准，以此专利技术为施贵宝公司供应紫杉醇。
1.植物培养技术面临的挑战
尽管已有许多成功的案例，植物培养技术在适应工业化生产过程中，仍要面临着很多问题需要解决。(1)很多活性成分在生源植物中的分布，呈现组织特异性。某些特定的组织培养物(如：茎、根、芽、毛状根等)，可以表现出与生源植物类似的代谢产物谱，但脱分化细胞中的二次代谢产物丰度非常低，甚至根本没有。例如：喜树碱在脱分化细胞中含量非常低，或者根本检测不到，但在喜树的根培养物中，其含量则与原植物不相上下。与此类似的是，在黄花蒿的脱分化细胞中，也没能检测到其抗疟成分――青蒿素。虽然，培养特定组织容易获得较高产率，但是，该类培养物在常用的生物反应器中难以生长，甚至不能存活，需要开发定制特殊的反应器，难以适应现阶段工业化生产的需要。脱分化细胞在该方面具有明显的优势，能够很好的适应商业化生产的需要。因此，如何提高脱分化细胞中目标成分的含量及产量，已成为目前植物组织培养研究的热点。现阶段采用的方法有：细胞系优选、培养条件优化、诱导子的使用、前体饲喂、阶段培养、灌注培养、细胞固定化等。根据具体情况选择不同的方法，可以获得较理想的结果。(2)植物细胞长期培养时，由于细胞不均一、基因突变、环境因素影响等原因，其生理、生化以及遗传性状逐渐发生变化，成为其商业化的另一大障碍。含量低和易变性作为植物细胞培养商业化的两大阻碍。迄今的研究多集中在前者上，经过多年努力，已建立了一系列卓有成效的实验技术和解决方案。相对而言，控制可变性的研究尚处于较浅水平，鲜有确实可行的方法。近年，在长期培养的细胞系中，随着培养时间延长，代谢产物含量普遍降低，使研究者日益关注植物细胞培养中可变性的机制以及控制方法。由于植物的种间差异和多样性，使此问题异常复杂，传统的研究方法和角度难以对此问题做出全面解答。由韩国和英国学者开发的植物干细胞培养技术，利用干细胞生长和遗传特性方面的优势，为解决上述问题提供了一个全新的方案。
2.植物干细胞培养基本方法
2010年11月，韩国Unhwa公司和英国爱丁堡大学的研究者将以红豆杉干细胞培养为主体的研究成果，以“Cultured cambial meristematic cells as a source of plantnatural products”为题在Nature的子刊Nature Biotechnology上发表。该刊同期还发表了对此成果进行报道评论的综述“Plant natural products from cultured multipotentcells”。以红豆杉体系为代表的植物干细胞培养技术，吸引了全世界的关注。
植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，改进了现有方法，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系。植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。
根据目标干细胞的不同，目前较为成功的植物干细胞培养方法主要有以下几种。
木本植物维管形成层分生(以红豆杉为例)：采取野生红豆杉的新生枝条，表面灭菌后切开；将含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织轻轻地从木质部剥离；将获得的组织在分离培养基上培养30d后，新生的形成层细胞和其他脱分化细胞(愈伤组织)因组织现状的差异自然分离――形成层细胞为均一生长的平板状组织，愈伤组织则为不规则的聚集生长物；将获得形成层细胞转移到生长培养基上培养。目前报道该方法成功的案例仅限于红豆杉属。
草本植物储藏根的维管形成层(以人参为例)：取户外培育、平滑无伤口的人参，表面灭菌；将主根削成薄片，再切成长5～7 mm，宽5～7 mm，高2～5 mm，使每片都含有形成层；将制备好的外植体用蔗糖高渗透液处理，使分化的组织――皮层、韧皮部、木质部、髓部等失去活力，仅形成层能保留生命力；将渗透液处理过的的外植体转移到诱导培养基，培养3-7 d后，外植体的形成层变成淡黄色；再过7～14 d后，淡黄色部分有一圈细胞生长出；将外植体继代到生长培养基，培养10-20 d后，即可分离得形成层细胞，所得细胞继续在同样的培养基上培养。目前，仅有人参属确实报道成功建立了该类干细胞培养体系。
静止中心(以水稻为例)：将稻谷剥皮，表面灭菌，干燥至水分完全去除；将干种子种入培养基，25℃下培养5 d，使其发芽；种子发芽5-6 d后，收集含有静止中心的根组织，去掉根端的根冠，从切口开始截取1 mm长作为外植体；将外植体放入诱导培养基，30 d后观察到细胞被
诱导出：所得静止中心干细胞为白色，均一，且周围环绕着黏性物质(黏原蛋白)，而一般根组织得到的细胞不均一，黄色，无黏性物质，这些差异使干细胞可以和其它细胞自然分离；将分离得到的静止中心干细胞转移到生长培养基。目前，利用该方法可以获得水稻、玉米等植物的干细胞培养体系。
3.植物干细胞培养体系的特性研究
不同来源的植物干细胞培养体系，有着不同的生长特性(表2)，这些特性决定了其各自的用途。这些方法由韩国Unhwa公司开发，现已申请了一系列相关专利。
所有的研究中，考察红豆杉干细胞培养体系的生长特性最为深入和全面。在完成了培养体系的初步建立工作后，研究者首先考察了获得细胞的形态、遗传学特征和基因组学方面的考察，以验证培养的细胞确为维管形成层细胞。另一方面，对培养体系的生长特性进行了研究，主要考察了细胞生长速度、长期培养稳定性(时长22个月)以及对生物反应器的适应性，并与脱分化得到的愈伤组织进行对比。红豆杉干细胞培养体系不仅生长速度快，性状稳定，而且由于细胞具有游离生长、液泡分散的特性，培养体系对各种类型(气升式、搅拌桨式)、各种规格(3L、10L、20L、3吨)的生物反应器均具有良好的适应性，具备了商业化生产的基本条件。为开发培养体系的实用价值，研究者诱导了所得培养体系活性成分，使其中紫杉醇含量提高了数十倍，并进一步进行灌注培养，促使更多的紫杉醇分泌到培养基中[含量268 mg／kg(细胞鲜重)，分泌率74％]。此外，研究者还系列测试了红豆杉干细胞提取物的抗癌活性，在抑制HHC-95肺癌细胞、PC-3前列腺癌等瘤株的实验中，提取物均显示了可与紫杉醇媲美的抗癌效果(该实验所用的培养体系未经诱导，经检测基本不含紫杉醇)。以上工作，从各方面为该技术的商业化提供了有力的技术支持。
对于水稻等干细胞的研究，主要目的是建立植物细胞银行。建立细胞银行可使植物细胞采用类似动物细胞冻存一复苏的培养方法，彻底解决植物细胞培养过程中的变异问题。该策略虽简单可行，但是一般的植物细胞却难以在冻存后顺利复苏，其存活率非常低，且回复生长能力的延迟期漫长。因此，该方面的研究一直停滞不前。如表2所示，以上各种干细胞的一个共同特征就是可在冻存条件下保持良好的生命力，这使植物细胞银行的建立具备了良好的前提。此外，植物干细胞培养体系建立方法的多样性使该技术具有普遍推广的潜力，因而可以预见，植物细胞银行中能够容纳的植物种类将非常丰富。作者相信，随着植物细胞银行的建立，不仅可以为植物细胞培养的稳定性提供一个切实有效的解决方法，而且将在植物种质资源的保存方面发挥关键作用。
目前，人参干细胞的研究成果，主要用于保健品和化妆品的开发，除了相关专利和文章外，已有相关产品面世。相信在植物干细胞这个高科技和全天然概念推动下，该类产品将会很快地在高端市场占有一席之地。
4.植物干细胞培养体系的应用展望
干细胞培养技术篇2
什么是CAL活细胞移植技术？
CAL的英文全称为Cell-assisted lipotransfer，即细胞辅助脂肪移植技术。这个名字的提出者是日本杏林大学整形外科教授、日本东京医科大学整形外科主任吉村浩太郎（KotaroYo-shimura）。他于2008年，成功从自体脂肪中提取出了SVF （Stromal vascular fraction）细胞，并将它混入到将要移植的自体脂肪中，再注入体内，大大提高了脂肪的成活率，而SVF细胞中最有效的成分就是脂肪干细胞。所以CAL活细胞移植就是将未经体外培养的，从新鲜脂肪中提取出的含有脂肪干细胞的细胞群（其中脂肪干细胞占35%左右），注入自体脂肪移植中，增加其干细胞含量的一种技术。
他所做的CAL活细胞移植，在自体脂肪移植的同时提取脂肪干细胞，再移植回体内，未经过体外培养以及任何外界干预，所以是非常安全的。就如同自体成分输血一样，抽出血液，提取某种成分后，就马上输回体内，也是很安全的。由此，我们可以看到这项技术本身是没有问题的，可被国内的某些机构拿来后，就成了商家的噱头，并加入了体外培养的环节，“送至研发中心进行技术处理，对自身活细胞进行细胞活性分析、活细胞比例分析、临床最佳活细胞配比分析”，貌似很先进，其实很危险。
细胞体外培养风险大
人体生长发育依靠的就是细胞的分裂繁殖，为了确保每个细胞分裂良好，人体有一套严密的免疫和防御系统，如果人体内细胞在分裂过程中形成不良细胞，淋巴系统和巨噬细胞就会将它吞噬，不会让它继续生长阻碍身体发展。
经体外培养的细胞，容易受外界环境的影响导致变异或者染色体异常，形成许多不良细胞，当这些不良细胞被注射进人体后，就可能形成肿瘤，危及人的生命安全。而新闻中报道的女孩，正是由于注入了经体外培养的不良细胞而导致两侧形成肿块的。
我国卫生部早就出台《干细胞临床试验研究管理办法》，对干细胞的临床试验都有一整套申报、备案及监管流程，明确禁止经过体外培养的干细胞医疗技术应用于临床治疗，可有些医疗机构却充耳不闻，为赚取高额利润，置消费者健康于不顾。
体外培养干细胞用于临床的要求非常高，需要符合生物药品的一整套技术准入要求，对培养环境、仪器设备、人员、试剂、流程、质量控制等都有严格控制，目前即使在国际上，经政府批准的体外培养干细胞临床试验总共也只有32个，只停留在试验阶段，根本不可能进入临床应用。
脂肪干细胞在自体脂肪移植中的重要作用
整形机构之所以能把CAL活细胞移植作为噱头来吸引客户，就在于脂肪干细胞在自体脂肪移植中确实发挥着异乎寻常的重要作用。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，即ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。
研究发现脂肪干细胞在体外稳定衰亡率低，同时它具有取材容易的优点，所以很适宜自体移植。
原先传统的自体脂肪移植最大的缺陷就是自体脂肪成活率不高，容易被吸收，究其原因，也是因为移植脂肪中的干细胞含量大大降低，只有人体正常含量的一半左右。
脂肪干细胞能促进脂肪中新生血管的形成，为植入的脂肪细胞提供了必要的营养，同时干细胞也可向脂肪细胞分化，所以大大提高了自体脂肪的成活率。
最后，提醒广大求美者，自体脂肪移植是项复杂精细的手术，从吸脂环节开始就要减少损伤，才能最大限度的保存脂肪细胞活性，加入的脂肪干细胞才能促进脂肪细胞成活。在脂肪处理环节，也要尽可能多的增加脂肪干细胞含量，而最重要的是注射环节，必须做到均匀、少量、分层注射，如果注射成团，会导致内结节、肿块形成、钙化等并发症。无论在哪个环节出问题，都会影响手术效果，所以美国整形外科医师协会建议，自体脂肪移植慎用于隆乳，因为手术效果主要取决于医师的技术和经验。
李发成 医学博士、主任医师、教授、硕士生导师，现任中国医学科学院整形外科医院国贸门诊部主任。兼任北京市整形美容业协会常务理事、北京医疗整形美容质量控制和改进中心医疗专家组委员、医疗美容主诊医师培训与考试专家委员会委员。
干细胞培养技术篇3
关键词：人才培养模式；细胞工程技术；教学改革
中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）01-02-152-02
细胞工程是生物制药工业中的关键技术，它是利用动物细胞体外培养和扩增来生产生物产品，或者作为发现和测试新药的工具[1]。就目前而言，高校细胞工程技术教学中还存在着一定的问题，如教学内容陈旧，不适合生物类企业对职员的知识和技能需求；教学方法还停留在高等教育的初级阶段，教学效果不高[2]等。因此，我们必须加快细胞工程技术类型人才培养模式的改革，进行细胞工程技术教学模式和课程的改革与创新，通过有效的教育模式来提高教学质量，让学生既掌握细胞工程关键技术的基本理论和基本方法，又能掌握细胞工程学科技发展中产生的新技术、新方法，提高学生的创新能力。笔者从教学内容与生产、双语教学、生产学习与实验技能几个方面对提高技能型人才培养目标的教学模式进行了探索研究，以期培养学生的学习能力、实践能力、创新能力，全面提高教学的质量和效率。
1 教学内容与生产整合
细胞工程学课程内容是按照细胞的主要结构及其功能、相关技术讲解的，课程包括细胞工程学发展史、细胞工程学概述、细胞培养及生物学特性、细胞融合、干细胞工程学、细胞克隆及克隆动物与转基因动物技术等；考虑到细胞培养技术在科研中普遍应用，目前细胞工程学实验课另外开设了免疫组化、荧光细胞染色与细胞分选、流式细胞仪操作技术、图像处理等课程。
本科学习中，细胞工程学教学中主要以各种细胞培养为主要线索，了解细胞工程技术具有特定的研究方式，使得他们对细胞工程学有一个全面的认识。例如，动物细胞工程技术应用于诊断和治疗疾病的单克隆抗体生产，有几千种单抗用于生化检测，而单抗用于人体疾病治疗是近几年来生物制药的一个重要领域，有几十种单抗药物正处于临床试验中。通过实验，学生理解单克隆抗体生产制备技术，并掌握原代及传代细胞培养技术、培养细胞的观察方法、细胞融合和分选技术等方法和常用设备的使用方法，为以后的生产研究做好准备。又如，动物细胞表达系统表达的蛋白都是胞外分泌的，产物的分离纯化过程非常简单，但是由于细胞大规模培养技术比较复杂，目前仍处于发展完善阶段，因而许多重组蛋白仍选用原核表达系统生产。我们针对这个特点，启发同学设计较好的细胞大规模培养系统，如改装的灌流式培养方式，培养和启迪学生的创新思维。
2 普通教学与双语教学整合
在当前社会高速发展的时代，社会对细胞工程人才提出了更高的要求，尤其是生命科学院校毕业的学生能否跟上时代的步伐，面向世界进行生物学的交流活动，扩大细胞工程技术在世界的影响，这是细胞工程技术发展至关重要的事。
在细胞工程学原版教材的选择上要力求最基础的专业知识内容水平。我们选择的教材是中国海洋大学出版社2011年10月第1版英文教程《CYTOTECHNOLOGY》，该教材的特点是讲授的内容比较全面，语法简单，对专业性的概念、词汇以及分子水平的知识进行了浅显的讲解，比较适合用于高等院校学生进行细胞工程专业外语的学习，避免学生由于英语基础差，导致对抽象晦涩的细胞工程学课程双语学习产生反感情绪，利于完成双语教学工作。
3 生产学习与实验技能整合
学生创新能力和实践能力的缺乏是高等教育教学改革面临的问题[3]。因此，要带领学生参与科学研究与生产实验技能，强化实践教学环节。细胞工程技术实践教学中，联系生物制品企业生产学习很重要，如我们带领学生到福瑞邦制药的厂家参观学习单抗制备，让学生注意在实验操作中可能失败的原因性，出现问题，及时加以纠正，培养学生良好的实践能力。针对细胞工程学的实验教学特点，穿插设计探索性和综合性的实验内容，并让学生自己参与到实验内容的设计，并调动学生的独立思考能力和创新思维能力，培养实验技能和创新思维能力。
实验大纲列出的实验项目较多，可整合为三大部分：（1）细胞培养综合实验。包括培养技术及细胞观察，细胞培养实验还可以将兔角膜上皮、基质及内皮细胞种植于生物材料上进行体外培养，观察培养细胞的生长、排列和细胞的粘附情况等。（2）经典单抗制备综合实验。将单抗制备产生过程中的细胞培养、动物免疫、细胞融合，杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化，抗体检测5个实验内容整合为1个单抗制备设计性实验。教学中不为学生准备传统的实验讲义，只提出实验的任务、要求、进度及安全注意事项等，重点突出学生自行完成相关资料查阅，自拟设计方案，自己安排时间完成实验计划，获得实验结果，撰写实验报告。这个实验计划6个课时，2次课堂实验，分别以实验设计、中期实验讨论与交流、实验结果课件汇报为主要内容。（3）流式细胞仪分选细胞综合实验。包括分选淋巴细胞或是干细胞的筛选，要求学生根据生产实践需要（如奶牛细胞的分选、白细胞计数及分选等）自己选择课题，自己设计实验方法以及最后鉴定。这个实验计划12个课时，4次课堂实验，分别以实验设计、中期实验讨论、实验结果课件汇报为主要内容。所有实验的实验室全天性开放，学生可利用课余时间主动完成各项实验操作，老师指导，确保学生在30d内获得全部实验结果。老师可根据实验结果反馈及时调整教学进程和教学方法。通过学生的反馈，可以反映学生是否理解和掌握本课程的目标，并加强了教师与学生之间的沟通，提高了教学效果。
参考文献
[1]胡显文，肖成祖.细胞工程在生物制药工业中的地位[J].生物技术通讯，2001，12（2）：117-122.
干细胞培养技术篇4
细胞培养基和细胞培养工艺是生物制药和疫苗产业中最关键的部分，我国在此领域人才奇缺，在“”的呼唤下，有着近30年海外背景的罗顺回国创业，为祖国发展贡献自己的智慧。
从国际知名科研工作者，到兼具科研创新、经营管理等多重素质的综合型人才，罗顺实现了角色的成功转型，也在生物制药王国画下壮美的蓝图。
“1号”人才引进回国
美国钢铁大王卡耐基曾说过：将我所有的工厂、设备、市场、资金全部夺去，但是只要保留我的组织人员，四年之后，我仍将是一个钢铁之王。1950年，钱学森决定返回祖国时，主管他研究工作的美国海军次长大为震惊。他认为：钱学森无论在哪里都抵得上五个师。他说，我宁肯枪毙他，也不愿放他回中国。这充分说明了科技人才对一个企业乃至一个国家的重要性。不论在国外还是回国发展，罗顺都是这种不可替代的人才。
罗顺是从华中农业大学毕业后走出国门的，那是1985年，当时算是公派留学。去美国有一个明确的目的，就是希望研究生物化学的一些特性。结合大学学生物化学时研究过酶的一些特性，罗顺开始了对酶的表达情况的研究。
在美国，罗顺一鼓作气，完成俄勒冈州立大学生物化学专业硕士、弗吉尼亚理工大学分子生物学博士学位，并在哈佛大学医学院完成针对癌症的博士后研究。毕业后，因为出色的科研才华受到美国各大知名制药公司的青睐，他先后供职于瑞士制药公司、美国Beckman Coulter公司、美国基因XP生物技术公司、美国细胞培养基公司、美国基因泰克生物制药、美国安进生物制药。在美国待了近30年，罗顺的事业和生活就像他的名字一样，顺风顺水。
2011年的中国生物制药行业，方兴未艾，面临新的发展机遇。2008年陆续回国的同事和朋友都纷纷劝他回国发展生物制药。如果继续留在美国，自己创业，基本只能是个梦想;如果回国，能为国内的生物制药贡献自己的智慧。说干就干，罗顺是一个果敢的人，当下决定回国创业。
在罗顺看来，当时的生物制药作为战略新兴产业，国家对其支持力度很大。中国是一个巨大的医药市场，生物制药是它的核心。并且随着人们对生活品质的提升，越来越关注高质量、健康的生命。尽管近年国家也引进了一批生命科学领域里高水平的专家学者，不过这些人更多是从事基础理论研究，缺少实践者。他认为，要把研究成果转换成生产力，转换成社会价值的东西，你必须要通过产业化。而这正是罗顺回国想实现的。
2011年，时任北京市委书记刘淇亲自批示，将罗顺作为国家第六批第一号人才，引进回国。
回国后，在甘肃做投资的朋友的支持下，罗顺将起点选在甘肃兰州。虽然与科技资源相对丰富的北京失之交臂，可罗顺后来发现，这里非常适合开展培养基的研究。
个中艰辛唯有自知
万事开头难。从未有过经营管理经验的罗顺，碰到了一个接着一个的棘手难题，很多都让他始料不及。
“最大的困难是人才。我带回的是美国技术专家团队，他们中大部分人不会说中文，而且很多是学者型的人才，他们有技术但是遇到问题解决不了，不适应国内的环境。”从论文成果到进入市场成为相对成熟的产品，这中间有一个对企业家和科学家来说是高风险、高投入的关键环节，而要实现这一环节的无缝链接，亟需大批既懂经营也懂科技的科技经营人才。为此，罗顺投入很大的精力来培养本土的团队。
第二个需要面对的问题，就是国内的经济环境、政治环境，以及大家对生物制药行业的误解，大家往往觉得今天投资，明天就能有回报。
“生物制药行业是一个长期投资，大量投资，慢回报的一个行业。所以，不论政府方还是投资方都会提出疑问：他们这么厉害，怎么还没赚到钱？整个社会上的反映也会是，干了两年半，怎么还没有成为世界最大的培养基公司？或者新药怎么还没有研发出来？”这一点让刚回国的罗顺颇感憋屈和无奈，“培养基不是做药的，我们是做原材料的，这是理念上需要纠正的。”
最重要的问题是，国内外都对本土公司的技术不看好，没信心。“很多人觉得，中国公司的技术绝对不如美国的公司，美国的东西一定比中国好。”罗顺说，这种心态似乎形成了一种惯性，植根于每个人的头脑中。“美国人觉得中国制药是劣质、质量不好，原材料质量更不好。我现在做生物科技技术，我也有一个理念，我做的是原材料的事，要做到跟世界一样的水平。”这是罗顺的目标。
从国家部委到地方政府，从投资方到合作方，每个人都在寄希望于罗顺，此时的他，背负多方压力，唯有埋首科研、尽心经营，用事实告诉人们，他的目标达到了。
瞄准生物制药的CPU――细胞培养基
细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境，是生物医学工程中最重要的组成部分。细胞培养基市场主要由美国三大公司――美国英杰（Invitrogen/Gibco）、西格玛SAFC Bio、海克隆（Hyclone/GE Health）垄断。中国细胞培养基市场年需求量大约在600～700吨，由于目前中国并没有能够大规模生产细胞培养基的厂家，而现有的几家小型供应商的产品研发能力不足、生产技术和工艺又不成熟，所以产业化需求难以满足，中国市场上95%的培养基都需要依赖从美国进口，从而导致我国生物制药产业受困于成本高、受制于人的窘境，且如果国内研发、生产能力持续落后，发展缓慢，将长期依赖进口。
最初注意到细胞培养基，是罗顺还在美国生物制药公司的时候。当时，美国几家著名的生物制药公司都与他保持着联系，他们希望罗顺能给他们在这方面提供技术支持，或是担任顾问提供指导。朋友们就纷纷劝他，不如回国，开一个细胞培养基的公司。
“就像计算机的CPU一样，再好的计算机PC设计，如果没有CPU这个核心，生产不出好电脑。”罗顺回国后最成功的是，瞄准了生物制药的CPU――细胞培养基。
细胞培养基对生物制药的产业和行业而言，是一种关键的生产原材料，也是一项关键的生产的技术。罗顺早期的研发工作就是围绕生产的工艺开发进行的，主要是细胞代谢理论的研究、细胞培养基的开发、细胞培养工艺的开发。在对细胞代谢理论进行系统研究的基础上，罗顺建立了一个细胞代谢效率的理论，这个理论就是指导我们怎样给细胞提供最有效的营养，而这个最有效的营养组合就是细胞培养基。由他领导的CHO细胞培养课题组以其在业内一流的药用蛋白产量著称于世，创世界最高产量达每升11克，同时拥有3项专利，罗顺本人获得2010年安进科技创新最高奖。自此，他的科研实力在业界声名鹊起。
“我们把美国一流的细胞培养基技术带回来了，等于是带回来国际一流的新产品开发技术研发平台。短期内，可以研发出将近100种细胞培养基配方，这对中国的生物制药产业的意义是巨大的。”任何一个企业，凭借这项独一无二的工艺，就能涉入更多的生物制药领域，打造起核心竞争力。而对整个产业来讲，更是有着“革命”般的作用，它提高了整个产业的生产效率，发挥了榜样的作用。
打造生物科技的“黄埔军校”
如果说罗顺带回的细胞培养基技术，让我国生物制药行业摆脱了美国培养基公司对中国市场的垄断，而且能提高客户公司的生产的效率和核心竞争力。那他带回的干粉工艺流程，更是填补中国细胞培养基干粉生产的空白。
在罗顺的公司，美国CRB设计团队（曾参与编写美国GMP）首次为中国企业设计、监理、建设，并且这也是国内首家引进针磨技术的企业，生产车间采用国际一流的干粉生产设备。针磨技术解决了国内干粉培养基生产时温度、湿度、粒度稳定性等难题，取代了国内传统的球磨工艺，大大减少了培养基在研磨过程中的损耗，使得公司拥有了符合cGMP标准的工业化大规模细胞培养基生产平台，产能可达300吨/年。
在工艺开发的过程中，罗顺深刻地感受到，科学研究、成果转化和应用，人才不仅是一个非常重要的因素，而且是第一因素。甘肃健顺生物科技有限公司在成立之初就决定要培养年轻的人才队伍，因为这对公司的长期发展至关重要。
在此理念的指引下，依托“无血清细胞培养基工程实验室”，团队培养出了一批中国乃至世界的具有扎实理论基础和实践能力的生物技术人才。同时，与当地大专院校（兰州大学、甘肃农业大学、西北师范大学等）、科研院所联合培养人才，以能力培养为核心，综合素质培养为主线，培养技术型人才和高级经营管理人才，并在科学研究和产学研相结合过程中，掌握国际领先的研发设备，逐步探索出符合公司特色的培养体系。
“我们想打造一个开明、民主、自由的公司文化，也像在美国一样，很多年轻人都直呼我的名字。我们提供单身员工的宿舍，我们有食堂，食堂的伙食非常好。我们与高校联合组织篮球比赛、马拉松，给他们提供放手去做的条件，允许他们出错。”
罗顺对于人才培养可谓费尽心思。公司会对培养对象进行专业辅导培训。如：组织国外专家举办生物医药学科的科学讲座，使培养对象深入了解生物医药产业的先进理念和国际领先的技术水平;每周开设外国专家与新进人才在生物医药领域英语、汉语的专业语言交流提高课程，增强科研合作与交流的能力;鼓励和支持培养对象参加学术交流等活动，了解生物医药领域的一些最新研发动态，拓宽年轻人才的知识结构和研究视野。
在培养过程中发扬“传、帮、带”的精神。通过外国专家亲自到实验室指导实验的方式，培养他们的实验动手能力和独立开展科研的能力。在专家们规范严谨的指导下，一批年轻的科研人员已逐步掌握了试验的方法和操作的要领，并成为了我们科研团队的主力军。
同时，还会有计划地安排年轻科研人员跟随专家团队去境外培训进修，促进团队与境外、国外学者的交流，使年轻科研人才逐渐在国内外科学舞台上崭露头角，并逐步培养和成长为中国生物医药界的新生力量。
“我是希望，能打造出中国生物制药工艺开发――细胞培养基的‘黄埔军校’。”罗顺说，如果公司发展到一定程度，希望能在兰州大学或其他高校建立生物工程专业。他说，在美国，也只有为数不多的几所大学拥有这个专业。他希望能把该领域世界一流专家教授都请来讲授，这样，也能为国内这个领域培养更多人才。
携健顺生物扬帆远行
致力于“无血清个性化化学成分界定细胞培养基”及其工艺的研究开发，同时提供培养基配方委托生产、Clonepix细胞株筛选等技术支持配套服务，2011年3月，甘肃健顺生物科技有限公司（以下简称“健顺生物”）成立，罗顺是公司创始人。
“我们的最终目标就是，降低最高端的生物制药的成本，让更多的老百姓用上生物制药。”罗顺深谙生物科技的这一文化核心和理念，“我们哪怕做非常小的一件事情，也是希望为客户降低成本，用药去治病救人，我们公司的文化是植根于此的。”
目前，健顺生物的产品主要应用于生物制药（治疗性重组蛋白，包括单克隆抗体）、细胞治疗以及人/兽用疫苗的工艺开发与生产。
“健顺生物与美国领先细胞培养基公司一样，拥有世界一流的干粉生产线设备技术、工艺流程，年产量可达300吨，这是国内公司所不具备的。最重要的是，与欧美生物制药公司一样，拥有一流的高等生物细胞培养基配方开发基础理论与技术平台，就连美国三大培养基公司都不具备。”健顺生物独具优势的竞争力让他们初战告捷。
公司成立3年来，在罗顺的带领下，凭借自身全球领先的研发技术水平和过硬的产品质量，目前已产生强大的市场价值，已与兰州、成都、上海、广州、山东、北京、武汉、石家庄、浙江、等十多个省市地区超过35家生物药企建立业务联系，与30多家药企已签订了合作协议，并签订了工艺开发技术项目10多项。同时已与上海、成都等多家大型药企签订了培养基长期供应合同，完成了从一开始的10L、100L的小规模供应到现在10000升以上的批量供应的产业化规模，其中国内创新药开发领军（上市）企业康弘药业等多家知名药企已将我公司细胞培养基列入其新药临床申报，将健顺生物细胞培养基确定为其新药的唯一指定原材料供应商。同时，健顺生物与具有全球竞争创新能力的生物医药公司展开合作，签订了10年的委托供应研发协议。
当然，罗顺对公司未来的定位绝不止于此，在他看来，“这不只是一家以技术服务为主的企业和一支成熟的世界领先的技术团队，更重要的是以技术力量所带来的客观周边效应。公司落户兰州，希望能对甘肃生物制药行业的发展产生积极的影响，使甘肃省的高新技术产业园区在全国乃至全世界立于领先地位。”
为中国生物制药行业提供世界一流的细胞培养基与研发服务！力争在细胞培养基领域成为世界一流的技术与产品供应商！填补中国工业化无血清细胞培养技术和产品的空白！而罗顺作为健顺生物的掌舵人，更是踌躇满志、信心满满，相信梦圆时分已不再遥远。
专家简介：
罗顺，甘肃健顺生物科技有限公司创始人、总裁。
美国弗吉尼亚理工大学分子免疫学博士，美国哈佛大学医学院Dana-Farber癌症研究所博士后，毕业后加入瑞士生物制药公司（Serono），从事生物制药研发工作20多年，先后在Beckman Coulter、JRH Biosciences、Sigma SAFC、基因泰克（Genentech）、安进（Amgen）等公司担任要职，主要负责研发技术部门工作，期间创办了GeneXP Biosciences公司。
干细胞培养技术篇5
多少年来，我们不得不面对这样一个事实：各种各样的牙齿治疗虽然已经被温柔的叫做牙齿美容，可仍然麻烦得让人心有余悸。
想要拥有一口洁白健康的牙齿吗？即使按最流行的治疗方案种上假牙，仍然不是一种理想的解决方案，因为假牙让人很不舒服，就连有"艺术级"水准的钛合金牙也意味着鲜血淋漓而又异常复杂的牙科手术，而且远没有真正的牙齿灵巧方便。
如今，通过生物组织工程学发展的人牙再生技术会在不久的将来轻松解决这些问题。专家预测，如果这项技术能够成功，不管是假牙、牙桥或植牙，都将成为历史名词，未来人们掉牙后能用自己的细胞再生一个和原齿一样的牙齿。而随着技术的成熟，也将会有越来越多的人接受这种牙齿手术。
培育“基因牙” 红透亚欧半边天
一提到生物组织工程学，人们最容易联想到的是像肝脏、肾脏以及心脏之类的重要脏器，而牙齿似乎可另当别论。
然而，有许多研究人员认为，目前生物组织工程学一些最激动人心的进展就是在牙科领域创造的。
进展公报一：和天然牙一样能向大脑传递信息
日本日立公司医学研究小组宣布：它们将继乳牙、恒牙之后，研究开发与正常牙齿功能完全一样的基因牙。他们会先大量培养患者智齿附近的牙齿干细胞，然后制成齿胚，在牙模型里培育成牙齿，最后植入拔牙后留下的牙床空穴。通常的假牙没有咀嚼反应，不向大脑传达刺激信息，而“基因牙”和天然牙一样能向大脑传递信息。
进展公报二：让患病牙齿在原来位置的组织上进行再生
据《新科学家》杂志报导，英国伦敦Paul Sharpe教授利用基因干细胞培育方法让老鼠成功长出了"定制"的牙齿。这项实验证明了牙齿干细胞的存在。Paul Sharpe教授表示将会进一步利用基因疗法使患病或是腐烂的牙齿再生，最终目标是促使口腔内患病牙齿在原来位置的组织上进行再生。
进展公报三：牙科手术中将可以使用在试验室培养出来的牙齿
美国得克萨斯州大学健康科学中心的MaryMacDougall博士在接受BBS采访时表示："科研人员现已利用实验鼠的干细胞培育出鼠牙，这证明可以在培养皿中制造牙齿，不管是门牙还是臼齿，它们可以提供给医生在临床中使用。这一成果如成功运用在人身上，将解决目前牙病患者因戴假牙而产生的各种不适应症问题。”他进一步预测，十年之内在牙科手术中人们将可以使用在试验室培养出来的牙齿。
让“基因皓齿”成形的几个化学信号
“基因牙”的培育运用了生物组织工程学中的定向分化技术，原理是人为干预干细胞或祖细胞(这两种细胞可以分化为体内不同种类的器官组织)的分化方向，使这些细胞不再分化成为完整的个体，而是按照我们的需要分化成单一的组织或器官。
用干细胞分化成牙之所以成为生物组织工程学的一个很诱人的目标，是因为牙并不像肝脏或心脏那样是维持人体存活所必须的脏器，即使培育的牙没有按我们预想的那样在牙床上正常排列也不要紧，牙科大夫只要将它取出来再重头做一次即可。此外，将生物组织工程学处理过的细胞植入牙齿缺损的部位无需太大的手术，只需要我们都熟悉地"张开嘴，啊......"就好了。
但是，实际上要做到这一点却并不那么容易，从细胞发育成牙齿必须依靠一系列复杂且相互联系相互影响的化学过程，这些都是受基因调控的，只有能够掌控让这个化学过程顺利进行的一系列化学信号才是成功的关键。
化学信号一：釉细胞
我们的牙齿是由几种成分组成的，其中包括坚硬的牙本质及其外面的一层薄薄的白色牙釉质。别小看它，这可是我们身体里最坚硬的物质。牙齿的发育要靠牙龈的上皮细胞和其下的间充质细胞之间的相互作用引发，间充质细胞中有可以长出形成牙本质的细胞，称之为成牙质细胞；而上皮细胞中则有长出形成牙釉质的细胞，称之为成釉细胞。
化学信号二：髓室
在每一颗成熟的完整牙齿中，都有一个叫做"髓室"的小腔，其中填塞着从牙龈延伸而来的丰富血管和神经。
化学信号三：干细胞
最近，科学家发现在每一颗牙的髓室中都含有能够转化成牙质细胞的干细胞。研究者从人类牙齿中抽提出牙髓质，用酶将其降解，再将降解产物置于培养皿中进行培养。他们发现许多细胞在这个过程中死亡，但是却有一些细胞存活下来并不断生长分化，它们就是干细胞。在一个髓腔的上百万细胞中，大约只有80个这样的干细胞。科学家将干细胞与牙本质的矿物质部分进行混合，并将它们种植于小鼠的皮下，借此来模拟成牙质细胞在牙龈上皮细胞下的正常生存环境。两个月后，已有一些细胞转化为成牙质细胞，甚至还有一些干细胞形成了富含血管和神经的髓样组织。这证明牙再生在理论上是可能的。
化学信号四：UNX2基因
科学家从一种"锁骨头颅骨发育不良"的奇特遗传病中发现了UNX2基因，他们发现患上这种病的人虽然骨发育都有不同程度的畸形，但却会长出额外的牙齿，而所有这些都源于一个被称为UNX2基因的单点基因突变，说明这一基因在人体生长的早期对骨骼发育起着至关重要的作用。
关于“基因牙”的世界争论
日本：牙齿的再生是可能的
很多理由足以让我们相信，牙齿的再生是可能的。例如，许多低等脊椎动物可以不断地长出新牙，更有甚者，一些种类的鲨鱼一生中可以长出数千颗牙。虽然哺乳动物已失去了这种能力，但是一些患上特殊遗传病的人却能够长出额外的牙来。而且，与牙有类似基本构成物质的骨骼在受伤后可以再生，这证明我们的身体有这种潜能，那为什么牙齿不能做同样的事呢?理论上，我们要做的只是加大机体在这方面的能力。
中国：通过基因技术诱导出类似牙根的组织是一次飞跃
口腔修复治疗涉及到口腔生理、生物力学和美学方面的要求，目前还难以想象基因工程能随心所欲地“建造”人体最精密最坚硬的器官组织。如果能通过基因技术诱导出类似人牙根的组织结构，供口腔修复医师作为基牙进一步完成缺损缺失牙列的修复，对口腔医学来说就是一次飞跃。
美国：通过牙龈注射基因试剂诱导牙齿再生将需要更长时间
虽然科研人员已在老鼠实验中发现了至少25种与牙齿再生有关的不同基因，证明了牙齿干细胞的存在，但毕竟只能确保十年之内在牙科手术中可使用上在试验室中培养的牙齿。要想通过给牙龈注射基因试剂从而诱使人体重新再生牙齿，则将需要更长的时间。
干细胞培养技术篇6
1 传统单纯干性和湿性颗粒脂肪注射移植方法
过去27年里，在湿性肿胀技术和注射器吸脂等基础上[7]，传统单纯自体颗粒脂肪注射移植方法分为（离心法）干性移植法[8-9]（应用离心技术分离浓缩纯化颗粒脂肪）和（静置法）湿性移植法[10-11]（不用离心技术而是采用自然静置悬浮反复漂洗析出水分等杂质纯化颗粒脂肪）；迄今两者仍是临床最常用的操作流程，公认为安全、有效的治疗方法，但有关颗粒脂肪注射移植术后存活率各家报道不一，且争议较大，要真正建立公认的临床规范标准化操作流程，仍需做出更多改进[12-13]，目前，我国自体颗粒脂肪注射填充移植技术已经进入世界先进行列。
2 自体ADSCs和SVF来源
近年研究证实，在人体吸脂颗粒脂肪悬液中获取的多向分化ADSCs是安全理想的自体细胞来源[14]，2007年，朱茗和高建华等[15]实验研究从成人脂肪抽吸物液体部分中分离得到大量可为脂肪组织工程所利用的ADSCs，其细胞量与脂质来源的量基本相同。2009年，Yoshimura等[16-17]实验研究吸脂抽吸物获得大量自体血管基质层片段细胞（stromal vascular fraction，SVF）。2010年，付冰川和高建华[18]等实验研究认为新鲜SVF与培养的ADSCs一样，可提高脂肪移植物存活率，前者操作更方便、省时、安全、高效，后者难以满足临床实际需要；其实，通过吸脂术获得颗粒脂肪内血管间质碎片（SVF）“微粒”含有多种类型多功能干细胞，其中就包括ADSCs，新鲜SVF直接添加到颗粒脂肪移植混合填充物中，不需额外处理，对颗粒脂肪移植混合填充物较少人工处理，更能改善脂肪细胞、ADSCs、SVF活性，额外人工处理纯化方法与脂肪细胞、ADSCs、SVF的细胞数量和活性无关，新鲜ADSCs和SVF可自然混合在颗粒脂肪移植填充物中，直接注射填充移植为脂肪组织工程所利用[19]；目前，虽很难证实新鲜ADSCs和SVF细胞准确数量及对体内移植颗粒脂肪在构建脂肪组织过程中确切辅助作用机制，关键是可避免体外离心浓缩及分离培养ADSCs和SVF过程中可能出现细胞基因变异问题[20]。关于ADSCs的应用，目前仍有许多重要问题有待探索解决，首先ADSCs在无免疫力的移植受体上表现出的肿瘤样无限增生特性，在进入临床实验前仍需寻找并建立合适动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性；其次，在批量提取生产ADSCs过程中，如何保障细胞质量均一稳定仍然有待深入研究。
3 离心法与静置法对ADSCs和SVF的影响
对于吸脂抽吸物是否需要离心，迄今仍有很大争议，一些学者一直倡导采用自然静置悬浮漂洗或不漂洗法，另外一些学者则主张离心分离浓缩纯化法；目前临床还无公认合理的离心速度，Kurita 等[22]认为过快离心速度反而会破坏ADSCs完整性[21]；杨东运等认为低速离心并不能显著提高面部自体颗粒脂肪移植存活率；雷华等[23]认为大于等于600rpm均会损伤颗粒脂肪活性，建议颗粒脂肪移植慎用离心法，宜采用静置法，以最大程度保护颗粒脂肪免受损伤。2011年，Botti等[24]经长期临床验证认为注射移植的颗粒脂肪细胞其吸收、存活情况与脂肪离心分离浓缩纯化技术无关。研究表明，颗粒脂肪离心分离浓缩纯化方法与细胞数量和活性无关，注射器法吸脂吸出的颗粒脂肪不必进行离心和漂洗，宜采取自然静置悬浮法析出无用水分和杂质，最大程度保护颗粒脂肪混合填充物免受损伤[25]。
4 ADSCs和SVF体外提取分离培养过程及存在问题
ADSCs和SVF体外分离、提取、培养、制作、注射为一体的处理过程均需在高标准无菌手术室和净化室采用专用设备完成[26]。操作复杂繁琐成本高，ADSCs诱导液常含有与肿瘤发生转移有关的生长因子，且价格昂贵不易推广普及[27]。将离心浓缩纯化后颗粒脂肪与体外分离、培养的ADSCs和SVF细胞混合填充物复合同步移植，该项技术尚不成熟，目前仍处于进一步研究阶段。关于ADSCs和SVF的临床应用，目前仍有许多重要问题有待探索解决，《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（简称新版药品GMP） 认为干细胞治疗需要严格按照药物研发的一般流程，包括研发筛选、临床前研究、临床阶段、新药批准上市几个主要阶段[28]，当前FDA和SFDA还未批准分离培养的ADSCs和SVF用于任何临床领域。目前为止，干性CAL技术主要是在体外细胞培养皿及试管中或动物身上进行实验研究，须经由严谨人体试验证实，不但要有稳定成活率和肯定疗效，而且还要有标准统一的质量控制和临床治疗规范化管理，只能允许有限的人体可忍受，不影响健康的副作用和无严重并发症发生，不改变受植区组织结构、不干扰受植区成像、不影响受植区恶性肿瘤筛查、不干扰受植区恶性肿瘤诊断，在这些条件完全具备后方可临床推广应用。干性CAL目前在临床治疗上并没有太大实际价值，进入临床应用前仍需慎之又慎，切勿盲目过早开展临床应用。进入临床试验前仍需寻找并建立合适动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性，特别是目前还无法保证经离心后体外分离培养的ADSCs和SVF是否出现细胞基因变异瘤化问题；有研究显示，长时间培养的ADSCs可使免疫缺陷小鼠发生肿瘤[29-30]。目前尚无一安全稳定并行之有效的培养、诱导方式，以及在批量提取生产ADSCs和SVF过程中，如何保障细胞质量均一稳定性，有待进一步研究。
5 干性CAL和湿性CAL主要区别及临床效果
主要区别在于干性CAL是应用离心技术分离浓缩纯化自体颗粒脂肪及体外分离、培养ADSCs和SVF，手术需二次完成，难以满足临床需要，还没有经过严格循证医学的临床对照研究检验，另外还有一些伦理道德方面问题需探讨。刘晓燕等[31]临床应用ADSCs（干性CAL）治疗面部老化症和面部凹陷症，局部症状明显改善，但长期效果尚待进一步观察。湿性CAL是不用离心技术去除吸脂抽吸物液体和脂质中大量ADSCs和SVF，不体外分离培养ADSCs和SVF（注射器内自然静置悬浮不漂洗法），新鲜ADSCs和SVF自然混合在颗粒脂肪填充物中直接注射移植，手术可一期完成，操作简易、快速、安全、经济、并发症少；湿性CAL是未离心分离培养的新鲜ADSCs和SVF“微粒”与颗粒脂肪混合填充物复合同步移植，临床技术基本成熟，规避了许多体外培养细胞移植伦理道德方面问题，经过了严格循证医学的临床对照研究和检验，有26年传统单纯自体颗粒脂肪（干性/湿性）注射移植经验可借鉴[32]。
2011年，鲁峰[33]采用新鲜获得SVF，不体外分离、培养ADSCs和SVF，一次完成临床手术，治疗11例，认为新鲜干细胞辅助能提高游离移植脂肪组织存活率，是一种安全有效的治疗软组织缺损方法。除此之外，干性CAL和湿性CAL在抽取颗粒脂肪和注射移植过程中均符合“三低三多” 颗粒脂肪注射移植原则和“3L3M”技术规则[34]。如果干性CAL效果并不优于湿性CAL，那我们一定更愿意选择操作简便、效果安全可靠的湿性CAL方法，湿性CAL初步解决了制约单次多量颗粒脂肪注射移植术后存活率的重要难题，公认的标准化湿性CAL操作流程应该是：①吸脂术：采用手工注射器注射肿胀液（尽量避免压力过高过快）和注射器吸脂法；②制备新鲜湿性颗粒脂肪及干细胞“微粒”混合填充物：20ml螺口专用一次性注射器和1.5～2mm无创吸脂针吸脂，每次吸满一支注射器毕，将注射器直立自然静置悬浮后只排出注射器内颗粒脂肪下层少许水分（若水分很少，亦可不排出），不拨除注射器芯，将吸脂抽吸物由注射器桶后口倾倒入生理盐水盆中悬浮漂洗颗粒脂肪抽吸物，不排出静置后注射器内颗粒脂肪上层脂质（油脂）部分，不离心浓缩纯化分离颗粒脂肪和干细胞“微粒”，不排出注射器内自然静置后混合填充物微粒间液体部分（因其内富含未经分离新鲜ADSCs和SVF），直接注射填充移植用；③湿性CAL隆乳和隆臀及隆乳假体取出后即刻注射隆乳术：注射移植前受区先局部肿胀浸润麻醉（0.125%盐酸利多卡因含1：1000000肾上腺素溶液） 使各层次组织液压膨胀和疏松无创分离，并根据注射肿胀液体积量计算出湿性填充物微粒注射需要量，实际注射量要比受区注射需要量再增加30%～50%体积，注射填充过枉矫正；单点微量（0.5～1ml）、多点、多隧道（在形成隧道退针同时注射，将颗粒脂肪和干细胞“微粒”定位于受植床内）、多平面注射，隆乳注射量为120～180ml/侧，隆臀220～360ml/侧，局部肌肉内可分多层注射以保证良好血运和尽量减少损伤；④体表局部凹陷及面部多量自体颗粒脂肪注射填充移植：可根据受区具体情况个性化处理后，多量自体颗粒脂肪注射方法同上，局部凹陷重点是采用肌肉内分多层注射以保证良好血运和尽量减少损伤，湿性CAL美容性丰面，重点是采用全面部深层肌肉内多层次注射移植，注射量为100～160ml/例。因矫枉注射填充，受区术后早期有明显肿胀，术后48h内可间断冰敷， 72h后可局部热敷理疗，1周内均恢复自然；湿性CAL均采用单次注射填充移植完成， 无需重复注射移植即可达到较为满意的治疗效果；截止目前，这是含有自体新鲜ADSCs和SVF辅助多量颗粒脂肪注射填充移植操作最简单、颗粒脂肪和干细胞“微粒”损伤最轻、受区血运条件最佳、安全合理的临床标准规范操作流程之一，从注射肿胀液到颗粒脂肪抽吸毕，颗粒脂肪注射填充物加工完成，注射到受区至术毕，这段规范公认的标准化操作流程时间，在操作医生安全可控范围内，操作时间越短，颗粒脂肪填充物所含脂肪细胞、ADSCs、SVF等活性越高；反之操作时间越长，细胞活性会随时间延长而越来越低[35]。
6 现代影像学技术在CAL中的作用
随着现代影像学技术（MRI[36]、螺旋CT、多层螺旋CT血管造影、MDCTA三维重建技术[37]、最新三维扫描技术测量隆乳术后体积变化术[38]）的发展，现今可有效、客观、精确、测量、评定、验证CAL术后效果及干性CAL和湿性CAL术后区别，湿性CAL术后18个月MRI成像观察隆乳后部分个例仍显示有脂肪组织有效增殖，MRI检查很容易分辨出坏死脂肪，发生率不足1%，术后不改变乳腺组织结构，不干扰乳腺成像，不影响乳腺恶性肿瘤筛查，不干扰乳腺癌诊断[39]；MRI对湿性CAL隆臀术不同注射层面颗粒脂肪移植后的寿命可进行定量分析，同时对脂肪坏死钙化的鉴别诊断能力明显提高[40]。临床上Rubin等[41]使用精确成像工具验证干性CAL注射移植隆乳术具有较低并发症发生率，术后6个月仍有有效组织存活，且未出现肿块及其他结构改变。
7 CAL技术与受区血运的关系
ADSCs体外培养过程中，有学者发现该细胞群具有稳定的倍增效应和低衰老性，可向多种细胞类型分化，能分泌血管内皮生长因子等多种细胞因子[42]。李劼等[43]自人体吸脂术中脂质部分分离培养ADSCs，在体内ADSCs能够分化为血管内皮细胞并促进游离移植脂肪组织再血管化，提高脂肪组织存活率并减轻纤维化，ADSCs辅助颗粒脂肪移植（干性CAL）可能是一种较为理想的细胞疗法。目前学者们对干性CAL和湿性CAL持有不同观点，但为获得预期移植效果，保证良好血运和尽量减少损伤，却已形成共识，因血运不良及损伤程度均对移植效果有直接影响。自体颗粒脂肪注射移植后，血运重建是脂肪组织再生基础，脂肪细胞存活率及存活时间影响因素很多，其中最大限度减低颗粒脂肪损伤，受区尽早及时建立有效血运循环是关键[44]。注射至肌内不同层次，每层注射较少颗粒脂肪，可保证每个颗粒脂肪都有血供包围营养，更易存活，现已逐渐成为主流颗粒脂肪注射移植方法[45]。近年许多实验研究在移植颗粒脂肪中加入各种生长因子，以促进移植颗粒脂肪组织内血管增生和脂肪细胞分化[46]。ADSCs和SVF均能自身分泌血管内皮生长因子等多种内源性细胞生长因子，直接参与增强注射移植颗粒脂肪血管化过程并减低纤维化[47]。2011年，黎洪棉等[48]实验研究结论：ADSCs与外源性血管内皮生长因子共同参与新生脂肪组织的血管化过程，血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素；血运重建是移植脂肪组织再生基础，颗粒脂肪注射移植后，尽量减少损伤和保证良好血运是多量颗粒脂肪注射移植成活的核心因素。扁平、容积小、皮肤紧的，很难容纳多量颗粒脂肪，预扩张技术采用体外扩张器（BRAVA增大系统辅助自体脂肪移植隆乳）可暂时增大容积，弥补空间的不足，在注射移植颗粒脂肪隆乳前即极大改善了受区血，使隆乳颗粒脂肪能获得足够血运，远期美容效果明显提高[50]。湿性CAL颗粒脂肪注射移植前，受区先局部肿胀浸润，使各层次组织液压膨胀和疏松无创分离，即在受区局部肿胀浸润呈现一个“生理湿性内环境”，使注射移植混合填充物微粒易自行弥散开，不易形成脂肪结节，又对体表软组织凹陷及扁平小等受区部位起到一定的术中即时预扩张作用[51]。
8 小结和展望
由于不同条件、不同操作者及不同受术者的不确定性因素差异，CAL效果都会有不尽相同。湿性CAL的有效性和安全性仍需大样本临床人体应用进一步远期观察，以确定其长期安全、高效[52-53]。ADSCs和SVF临床应用前瞻性研究，定会创造整形外科新未来，也会有助于整形美容外科临床治疗方法改进提高[54]。湿性CAL应是现阶段多量自体颗粒脂肪注射移植临床医学美容和整形治疗方面的首选技术[55]，目前自体ADSCs分离、提取、培养技术在国际上还没有正式开展临床应用，设备价格昂贵是其没有开展的主要障碍之一。我们仍需不断研究，以确定CAL对颗粒脂肪注射填充移植成活率的影响机理，现今我国在世界CAL研究领域里处于领先水平，相信CAL技术在整形美容外科范畴具有更广阔的应用前景。
[参考文献]
[1]Illouz YG. Present results of fat iujection[J]. Aesth Plast Surg，1988，12（3）：175-181.
[2]Zuk PA ，Zhu M， Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell，2002，13：4279-4295.
[3]Matsumoto D，Sato K，Ganda K，et al. Cell-assisted lipotransfer： supportive use of human adipose-derived cells for soft tissue augmentation with lipoinjection [J].Tissue Eng，2006，12（12）：3375-3382.
[4]Yoshimura K，Shigeura T，Matsumoto D，et al.Characterization of freshly isolated cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates[J].J Cell Physiol，2006，208（1）：64-76.
[5]刘乃军，管延萍，王艳，等.湿性脂肪干细胞辅助自体脂肪移植术[J].中国美容医学，2011，20（7）：1178-1180.
[6]刘乃军，王艳.湿性脂肪干细胞辅助自体脂肪移植临床应用体会[G].第十届上海国际整形美容外科会议论文集，中国：上海，2011.
[7]王阳.注射器法脂肪抽吸术.戚可名 主编.女性美容整形外科学[M].北京：人民军医出版社，2001：647-671.
[8]Colemxn SR. Hand rejuvenation with structural fat grafting[J].Plast Reconstr Surg，2002，110（7）：1731-1744.
[9]李青峰.自体脂肪移植技术的临床应用[J].中华整形外科杂志，2009，25（6）：401-402.
[10]Latoni JD，Marshall DM，Wolfe SA，et al.Overgrowth of fat auto transplanted of correction of localized Steroid induced atrophy [J].Plast Reconstr Surg，2000，106（7）：1566-1569.
[11]刘乃军.自体脂肪颗粒注射填充移植临床技术探究[J].中国美容医学，2008，17（10）：1519-1521.
[12]李青峰.自体脂肪注射移植临床原则与问题[J].中国美容整形外科杂志，2010，21（9）：513-514.
[13]刘乃军，李斌.自体脂肪填充术的应用体会 [J].中国美容整形外科杂志，2009，20（2）：106-107.
[14]Locke M， Windsort J，Dunbar PE. Human adipose-de-rived stem cells： isolation， characterization and application in surgery[J]. Avz J Surg，2009，79（1）：235-244.
[15]朱茗，高建华，鲁峰.从脂肪抽出物的脂类和液体部分提取脂肪来源干细胞的细胞生物学研究[J].中华整形外科杂志，2008，24（2）：138-144.
[16]Yoshimura K，Suga H，Eto H.Adipase-derived stem/progenitor cells： roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation [J].Regen Med，2009，4（2）：265-273.
[17]Gimble JM，Guilak F，Bunnell BA.Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissues-derived cells[J].Stem Cell Res Ther，2010，1（2）：19.
[18]付冰川，高建华，鲁峰，等.新鲜分离的脂肪SVF细胞促进脂肪移植存活的实验研究[J].中华整形外科杂志，2010，26（4）：289-294.
[19]Brown SA，Levi B，Lequeux C，et al.Basic science review on adipose tissue for clinicians[J].Plast Reconstr Surg，2010，126（6）：1936-1946.
[20]刘乃军，王艳.湿性脂肪干细胞辅助自体脂肪移植矫治内陷[G].第十届上海国际整形美容外科会议论文集，中国：上海，2011.
[21]Kurita M，Matsumoto D.Influeces of centrifubation on cells and tissues in liposuction aspirates： optimized centrifugation for liposuction and cell isolation[J].Plast Reconstr Surg，2008，121（3）：1033-1041.
[22]杨东运，陈亮，黄书鹏，等.低速离心对面部自体颗粒脂肪移植存活率影响的临床研究[G].第八届中国医师协会美容与整形医师大会论文集，中国：东莞，2011.
[23]雷华，李青峰.离心对脂肪颗粒活性影响的研究[J].中国美容医学，2005，14（1）：21-24.
[24]Botti G，Pascali M.A Clinical Trial in Facial Fat Grafting： Filtered and Washed versus Centrifuged Fat[J]. Plast Reconstr Surg，2011，127（6）：2464-2473.
[25] 刘乃军，王艳.湿性脂肪干细胞辅助多量颗粒脂肪移植面部年轻化治疗[G].第十一届上海国际整形美容外科会议论文集，中国：上海，2012.
[26]高景恒，袁继龙，王志军，等.CAL技术的研究与应用进展[J].中国美容整形外科杂志，2009，20（7）：442-444.
[27]张倩，刘晓燕.脂肪来源干细胞的研究进展[J].中国美容整形外科杂志，2010，21（9）：565-567.
[28]国家食品药品监督管理局.《药品生产质量管理规范（2010年修订）》生物制品（简称新版药品GMP）[M].2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：71-77.
[29]Rubio D，Garcix-castro J，Martin MC，et al. Spontaneous humanstem cell transformation[J].Cancer Res，2005.65（8）：3035-3039.
[30]刘乃军，管延萍，王艳.假体取出即刻湿性脂肪干细胞辅助自体脂肪隆乳术 [G].第八届中国医师协会美容与整形医师大会论文集，中国：东莞，2011.
[31]刘晓燕，陶凯，梁久龙，等.脂肪源性干细胞在面部整形美容中的应用：15例临床报告[J].中国美容整形外科杂志，2010，21（11）：647-649.
[32]刘乃军，管延萍，王艳，等.湿性脂肪干细胞辅助自体多量颗粒脂肪移植术[G].第八届中国医师协会美容与整形医师大会论文集，中国：东莞，2011.
[33]鲁峰.干细胞辅助疗法在游离脂肪移植术中的应用[G].第八届中国医师协会美容与整形医师大会论文集，中国：东莞，2011.
[34]谢芸，郑丹宁，刘凯，等.自体脂肪移植综合技术在面部轮廓整形中的应用[J].中华整形外科杂志，2010，26（3）：178-181.
[35]刘乃军，王艳.湿性脂肪干细胞辅助自体脂肪移植术临床研究 [G].第十一届上海国际整形美容外科会议论文集，中国：上海，2012.
[36]林涛，谢毓芝，余强，等.隆乳术后的MRI表现[J].中华放射学杂志，2006，40：357-359.
[37]贾懿，刘伟，曾昂，等.MDCTA血管三维重建技术在术前组织瓣营养血管评估中的应用[J].中华整形外科杂志，2008，24（4）：275-278.
[38]刘春军，栾杰，吉恺，等.三维扫描技术测量隆乳术后体积变化的研究[J].中国美容医学，2011，20（9）：1401-1403.
[39]刘乃军，王艳.湿性脂肪干细胞辅助自体颗粒脂肪移植术后影像学观察[G].第十一届上海国际整形美容外科会议论文集，中国：上海，2012.
[40] 刘乃军，王艳.湿性脂肪干细胞辅助自体脂肪移植注射隆臀术[G].第八届中国医师协会美容与整形医师大会论文集，2011，9（16-18）：中国·东莞.468-470.
[41]Rubin JP.Discussion：breast augmentation using preexpansion and autologous fat transplantation： a clinical radiographic study[J].Plast Reconstr Surg，2011，127（6）：2451-2452.
[42]Miranville A，Heeschen C，Sengenes C.Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissuederived stem cells[J].Circulation，2004，110（3）：349-355.
[43]李劼，高建华，鲁峰，等.脂肪组织来源干细胞提高游离脂肪组织存活率的研究[J].中华整形外科杂志，2009，25（2）：129-133.
[44]刘乃军，王艳.湿性脂肪干细胞辅助自体颗粒脂肪移植术与受区血运关系 [G].第十一届上海国际整形美容外科会议论文集，中国：上海，2012.
[45]Roberts TL，Delapena JA，Toledo LS，et al.Panel discussion：cosmetic surgery of the buttocks region[J]. Aesthetic Surg J，2003，23（5）：381-387.
[46]Levi B，James AW，Wan DC，et al.Regulation of human adipose-derived stromal cell osteogenic differentiation by insulin-like growth factor-1 and platelet-derived growth factor-alpha[J]. Plast Reconstr Surg， 2010，126（1）：41-52.
[47]Rehman I，Traktuev D. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cell[J]. Circulation， 2004，109（10）：1292-1298.
[48]黎洪棉，高建华，吴涛，等.脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子及纤维蛋白胶复合物体内构建血管化组织工程脂肪 [J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（40）：7480-7484.
[49]刘乃军，王艳.湿性CAL联合整形美容手术方法临床效果研究[G].第十一届上海国际整形美容外科会议论文集，中国：上海，2012.
[50]Adams WP JR. Discussion：breast augmentation using preexpansion and autologous fat transplantation： a clinical radiographic study[J].Plast Reconstr Surg，2011，127（6）：2453-2454.
[51]刘乃军，王艳.湿性CAL治疗外伤或感染及先天体表软组织缺损凹陷 [G].第十一届上海国际整形美容外科会议论文集，中国：上海，2012.
[52]刘乃军，管延萍，黄金井.脂肪来源干细胞在临床脂肪雕塑术中的指导意义[J].中国美容医学，2009，18（7）：1034-1036.
[53]刘乃军，李健宁.现代整形外科学原则的探讨[J].中国美容整形外科杂志，2008，19（1）：74-76.
[54]Rod J. rohrich.魏峰，高景恒，张晨译.脂肪来源干细胞：整形外科科研与临床的新视野[J].中国美容整形外科杂志，2011，22（7）：S48.
干细胞培养技术篇7
[关键词]间充质干细胞；细胞膜片；成骨分化
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）10-0-0
组织工程技术的出现和兴起标志着再造时代的来临，传统的基于细胞的骨组织工程，是利用大量的种子细胞种植在支架材料上，通过活性因子等诱导细胞分化成骨[1]。但研究发现该方法存在一些缺点，如细胞利用率低、附着效率差； 细胞在支架材料上分布不均；常用的蛋白酶消化收集细胞的方法，会改变细胞的表型和生化成分。并且，培养过程中细胞分泌的细胞外基质及形成的细胞间连接蛋白也常被破坏[2]。目前这些问题一直未能圆满解决，已成为限制骨组织工程技术应用于临床的瓶颈。
1993年日本学者Okano等[3]首先报道将聚N-异丙基丙烯酰胺应用到细胞培养上，创新性地发明了细胞膜片技术。应用特殊的外源性温敏聚合物材料提取完整的细胞聚集体，用于组织工程构建。该技术借助细胞间的连接以片状形式脱附，保留了基质中细胞与细胞间连接、细胞表面蛋白等，细胞生物学行为和功能得以维持[4]。在本实验中，笔者探讨体外构建骨髓间充质细胞膜片的培养方法并予以改进，试图进一步缩短膜片培养时间，同时增加膜片厚度，以利于构建组织工程骨。
1 材料
1.1 实验动物：3月龄成年新西兰大白兔，体重2.5～3.0kg，由乌鲁木齐总医院实验动物中心提供。
1.2 实验仪器设备：倒置相差显微镜及照相系统（Olympas，日本）；酶联免疫检测仪（BIO-RAD680， 美国）；JEM-2000EX透射电镜 （JEOM Ltd，日本）；S-3400N 扫描电镜 （Hitachi，日本）；X-射线能谱分析仪（Oxford，Link ISIS，英国）。
2 方法
2.1 兔骨髓间充质干细胞膜片体外构建：按以往所报道的实验方法分离培养MSCs[5]。将第2代MSCs，按密度1×106/cm2接种到直径10cm的培养皿，使用含成骨诱导剂的DMEM/F12培养液（含10%胎牛血清、地塞米松10nM、β-甘油磷酸钠10mM、抗坏血酸 50mg/L）， 置于37℃，5%CO2培养箱孵育，隔日换培养液1次。连续培养直至皿底形成半透明乳白色薄膜样物。
2.2 组织学检查：4%多聚甲醛固定膜片，分别行HE和茜素红组织学染色。光镜下观察膜片显微结构。
2.3 超微结构观察：同时选取部分膜片，以3% 戊二醛固定，分别行透射电镜观察及扫描电镜观察标本表面的微细形貌。并选择矿化结节中心点检测，通过X-射线能谱分析仪了解矿化结节表面的元素组成。
2.4 碱性磷酸酶活性定量测定：细胞膜片加入裂解液（0.2% TritonX-100），充分裂解后离心，取上清与磷酸硝基苯基磷酸盐37℃反应30 min，酶联检测仪（405 nm波长）测光吸收值，行ALP活性定量检测。
3 结果
3.1 膜片大体观察：MSCs高密度接种后体外培养5天左右，形成薄膜样物质，并逐渐增厚，12～14天，所获膜片具备一定的弹性和较好的机械性能，呈现半透明乳白色（如图1）。小心用细胞刮刀沿培养皿底刮擦，将膜状物与皿底分离，可用眼科镊将其完整夹持起来，进行卷曲或折叠等操作。
3.2显微结构观察：MSCs增殖旺盛，3天后呈复层生长，逐渐由梭形变为胞体较小的立方形，并出现多角形成骨样细胞，胞质颜色变深。继续诱导后，胞外基质分泌逐渐增多，钙盐不断沉积，14天左右形成不透光矿化结节，见图2。
3.3 组织学观察：HE染色显示，膜片是由12～15层细胞及细胞外基质组成的聚集体（图3A）。茜素红染色见细胞外基质中沉积有多个大小不等的钙化结节（图3B），表明膜片具有成骨能力。
3.4 超微结构观察：TEM观察膜片两面均有细胞，排列成多层结构。高倍镜下可见粗面内质网及胶原纤维丰富（图4），说明合成和分泌蛋白质功能旺盛。细胞外基质内大量针状钙盐结晶沉积，部分为局灶性的。SEM见成骨诱导分化的膜片中细胞被自己所分泌的细胞外基质包埋，基质中见大量矿化结节聚集（图5）。矿化结节X射线能谱分析结果显示有钙、磷、碳、氧、钠、镁六种元素构成，钙、磷两种元素的重量构成分别为（10.09 ± 0.01）% 和（4.53 ± 0.01）%，比值为2.23（图6A）。
3.5 碱性磷酸酶活性定量检测：结果表明，膜片成骨诱导分化后ALP活性随着时间延长而稳步增加，至第14天ALP值达到峰值， 见图6B。
4 讨论
目前利用细胞膜片技术，已成功构建出角膜、皮肤、肝脏、心肌、血管等多种软组织[6]。细胞膜片技术的优点在于：①种子细胞利用效率高，体外扩增的细胞几乎可全部被用于组织构建；②细胞与细胞外基质复合体可直接用于组织构建，通过叠层实现三维构建，可避免使用外源性支架材料伴随的一些反应，更具有良好的生物相容性；③保留了细胞-细胞间、细胞-基质间连接和细胞表面蛋白等。
近期国内也有将骨髓间充质干细胞细胞膜片应用于骨组织工程的研究报道[7-8]，但该技术需要特殊的温度敏感性培养皿和提取设备，通过温度变化，20min左右细胞与细胞外基质一起脱落形成完整的细胞片层。马东洋[9]等实验所构建的骨髓间充质干细胞膜片，采用DMEM培养基，膜片厚度仅100 μm 左右。Sonja[10]研究发现，选择恰当的培养基对于细胞生长和增殖非常重要，并证实了选用DMEM/F12培养基，MSCs增殖率最高。本实验，改进了以往细胞膜片的体外构建方法，选择DMEM/F12培养基促进MSCs增殖，同时利用抗坏血酸促进MSCs扩增和分泌大量胞外基质，缩短了以往的培养时间， 4～5天即可形成薄层膜片，经过12～14天左右的连续诱导培养，HE染色显示膜片的多层结构厚度增加到200μm以上，膜片相应的弹性和机械性能也随之增加，更便于操作。用两把镊子就可将细胞膜片完整提起来，仅仅需要几秒钟，不必借助特殊的材料或设备，简捷的可操作性，更利于膜片的进一步塑形和三维构建。
实验证实，经上述条件培养液孵育的细胞膜片具有成骨分化的潜能。经定量分析膜片中的细胞具有较高的ALP活性。此外，茜素红染色表明膜片基质中有大量大小不等的钙化结节形成，证实了MSCs向成骨细胞分化后期的表型特征。同时扫描电镜、透射电镜下都观察到矿化的细胞外基质。尤其是，对膜片中的矿化结节进行X射线能谱分析结果显示有钙、磷、碳、氧、钠、镁六种元素构成，钙、磷两种元素的重量构成分别为（10.09±0.01）% 和（4.53±0.01）%，比值为2.23，接近于天然骨。细胞膜片工程研究将为骨组织再生重建开辟广阔的前景。
[参考文献]
[1]Fujioka N， Morimoto Y， Takeuchi K， et al. Difference in infrared spectra from cultured cells dependent on cell-harvesting method[J].Appl Spectrosc， 2003， 57（2）： 241-243.
[2]Hutmacher DW， Schantz JT， Lam CX， et al. State of the art and future directions of scaffold-based bone engineering from a biomaterials perspective[J]. J Tissue Eng Regen Med， 2007， 1（4）：245-260.
[3]Okano T， Yamada N， Sakai H， et al. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly （N-isopropylacrylamide）[J].J Biomed Mater Res，1993，27（10）：1243-1251.
[4]Han D， Sun X， Zhang X， et al. Ectopic osteogenesis by ex vivo gene therapy using beta tricalcium phosphate as a carrier[J]. Connect Tissue Res， 2008，49（5）：343-350.
[5]张蓉，沈开金，刘彦普.兔骨髓间充质干细胞的体外培养及多向诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（45）：8382-8385.
[6]Yang J，Yamato M， Shimizu T， et al. Reconstruction of functional tissues with cell sheet engineering[J]. Biomaterials，2007， 28（34）：5033-5043.
[7]高振华，李宁毅，刘凤芝，等.骨髓基质干细胞片层的制备及其在组织工程骨中应用的初步研究[J]. 中华老年口腔医学杂志，2010， 7（4） ：235-238.
[8]陈涛，王艳辉，卜令学，等. 应用细胞片层技术构建功能性组织工程骨的动物实验研究[J]. 华西口腔医学杂志，2011，29（4）：442-445.
[9]马东洋，马敬，姜东红，等.骨髓间充质干细胞膜片复合磷酸三钙陶瓷构建工程化骨组织的体内成骨研究[J]. 中国美容医学， 2011，20（3）：408-410.
干细胞培养技术篇8
【摘要】 目的 筛选NS基因特异性siRNA阳性细胞克隆，研究NS基因特异性RNA干扰对Eca109细胞株体外增殖能力的影响。方法 用脂质体法将NS特异性siRNA表达载体转染Eca109细胞，Zeocin抗生素压力筛选后用PCR方法鉴定阳性克隆；MTT法检测各组细胞的生长增殖情况，RTPCR方法检测NS基因表达量的变化情况。结果 与对照组比较，silencer组肿瘤细胞趋于分化，细胞增殖抑制率超过80%(P
【关键词】 Nucleostemin（NS）;RNA干扰；食管癌；基因表达；细胞增殖
Abstract：Objective To screen NS gene specific positive cell clones，and investigate the effect of human esophagus cancer Eca109 cells proliferation in vitro by NS gene specific RNA interference.Methods The NSsiRNA expression vector was transfected into human esophagus cancer Eca109 cells using LIPOFECTAMINETM2000 Reagent， and positive clones were examined by PCR after stable transfectans screening with Zeocin; detected the cell proliferation by MTT assay and the levels of NS gene expression by RTPCR.Results Compared with the two control groups， the silencer group cells were nearer differetiation，the proliferation inhibitory rate was higher than 80%(P
Key words：Nucleostemin（NS）; RNA interference; Esophagus cancer； Gene expression; Cell proliferation
0 引言
NS基因是美国国立卫生研究院的学者Mckay and Tsai 2002年新发现的一种蛋白质核因子［1］，该基因在干细胞及人类的数种肿瘤细胞中表达丰度很高，但在分化的成体组织中，该基因却不表达。二位学者提出干细胞与癌细胞均由相同的蛋白质－NS来决定其细胞自我复制的能力，NS可能是干细胞和肿瘤细胞通过G2/S检验点的特异性调控因子。本文将以人食管癌Eca109细胞株为实验材料探讨NS基因特异性RNA干扰对食管癌Eca109细胞株体外增殖能力的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
人食管癌Eca109细胞购于上海细胞所； 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶为Gibco公司；PCDNA4/CNSsilencer质粒 [2]；MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：Invitrogen公司;RNA、DNA试剂盒;RTPCR试剂盒：TaKaRa公司;引物合成：上海申能生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及NS基因转染
人食管癌Eca109细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2潮湿空气的CO2培养箱内培养。脂质体法将PCDNA4/CNSsilencer质粒及空载体PCDNA4/Cvector质粒转染 Eca109细胞，分别命名为silencer组、vector组，未转染的Eca109细胞记为normal组。转染细胞进行Zeocin抗生素筛选；阳性细胞克隆继续在含Zeocin抗生素的培养基中进行扩大培养。
1.2.2 阳性细胞克隆的鉴定
提取克隆细胞基因组DNA，以Zeocin基因为目的基因，通过PCR方法进行细胞克隆外源基因整合阳性鉴定，同时以normal组肿瘤细胞作对照。其引物序列为：上游引物5′atggccaagttgaccagtgc；下游引物为5′tcagtcctgctcctcggcca。 PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后 94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循环，最后72℃延伸10min；PCR产物大小约370bp。
1.2.3 生长曲线的绘制 [3]
将三组细胞传到24孔板上（1×104细胞/孔），每组18复孔，分别于24h、48h、72h、96h、120h、144h用计数板进行活细胞计数，绘出各组细胞的生长曲线。
1.2.4 细胞的形态学观察
倒置显微镜下观察各组细胞形态变化情况。
1.2.5 MTT比色法测定细胞增殖抑制率 [3]
在96孔培养板上接种三组细胞，每组24复孔（1×103细胞/孔），分别于24h、48h、72h三个时间段进行MTT测定，以培养液做空白对照并调零，用酶标仪测定490nm处的吸光度值（OD值），每次每组测定8复孔。
细胞增殖抑制率＝1-细胞存活率
即细胞增殖抑制率＝（1-silencer组OD值 / Normal组OD值）×100%
1.2.6 各组肿瘤细胞NS基因表达水平检测
提取肿瘤细胞总RNA，用RTPCR方法验证各组肿瘤细胞NS基因表达情况。参照genebank中NS和GAPDH的基因序列及参考文献 [4]设计引物如下:NS基因上游P1：5′atgaaaaggcctaagttaaagaaagc，下游P2：5′gctctccaaattctcctttggta；GAPDH上游为P3：5′ggtggacctgacctgccgtctaga，下游P4：5′ttactccttggaggccatgtggg；扩增产物长度分别为570bp和280bp，在同一体系内反应，PCR反应条件为94℃预变性5min， 94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循环，最后72℃延伸10min。
1.2.7 统计学分析
实验数据以±s表示，统计学处理采用SPSS 11.5 软件，进行t检验。
2 结果
2.1 PCR法鉴定阳性细胞克隆
抗Zeocin的细胞克隆部分PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1；silencer组与vector组皆检测到Zeocin基因条带，而normal组无，即细胞克隆外源基因整合阳性。
2.2 细胞生长曲线的绘制
各时间段silencer组细胞数目低于对照vector组（P
2.3 各组细胞的形态学变化
silencer组细胞与对照vector组和normal组相比体积变小并趋向于均一，多数细胞由梭形趋向变圆，核质比变小，瘤巨细胞减少，细胞趋于分化。
2.4 MTT比色法测定细胞增殖能力
细胞培养24h后，silencer组细胞增殖抑制率分别为normal组（P
2.5 各组肿瘤细胞NS基因表达水平
silencer组肿瘤细胞NS基因表达水平明显低于对照vector组和normal组，见图4。
3 讨论
NS基因是一种p53结合蛋白，主要存在于核仁中，在核质中也有低量表达；在干细胞处于早期多潜能状态时该基因的表达丰度很高，而在分化开始时，这个基因的表达却突然几乎完全消失 [1]。本室与中科院遗传发育研究所合作证实了多种肿瘤组织中都有NS基因的表达 [5，6]，运用siRNA真核表达载体，使宫颈癌Hella细胞的增殖被抑制，细胞内NS基因的表达量下降 [7，8]。
本实验将PCDNA4/CNSsilence载体转染人食管癌Eca109细胞，同步转染PCDNA4/Cvector空载体作对照。经过Zeocin抗生素压力筛选获得阳性细胞克隆，并通过PCR方法验证克隆细胞外源基因整合阳性。与对照组vector和normal组比较，silencer组细胞的肿瘤生物学行为发生了显著的变化，细胞增殖明显变慢，趋向于分化； MTT法进行细胞增殖抑制率测定显示silencer组细胞的增殖速率明显低于两对照组；细胞增殖抑制率大于80%；各组细胞RTPCR产物电泳结果显示silencer组肿瘤细胞中NS基因表达量明显下降。
实验结果表明，我们构建的针对NS基因的特异性siRNA的表达载体PCDNA4/CNSsilencer是成功并有效用的，将其转染入人食管癌细胞后，通过RNA干扰机制使部分NS基因沉默，从而产生了抑制Eca109细胞分裂、增殖的效应。同时提示调节NS基因活性可能对肿瘤有防治作用， NS基因能够预测肿瘤的发展趋势，有可能成为一种新的肿瘤标记物。但是NS蛋白活动的精确分子机制尚不完全清楚，这仍然需要大量的实验工作去证实。运用RNA干扰技术对NS基因进行深入研究可能会揭示或部分揭示干细胞和肿瘤细胞增殖之迷，为肿瘤的早期诊断、基因治疗和预后及以干细胞为基础的组织工程等提供理论依据和工作基础。
参考文献
［1］Tsai RY，Mckay RD.A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells [J].Genes & Dev，2002，16(23):29913003.
[2] 蔡子微，刘思金，劳为德，等 . NS特异性siRNA真核表达载体的构建 [J]. 牡丹江医学院学报，2003，24（3）:14.
[3] 薛庆善. 体外培养的原理与技术 [M]. 北京：科学技术出版社，2001.340343.
[4] 刘思金，薛延，劳为德，等.人类骨桥蛋白（hOPN）在细胞增殖中的功能研究 [J]. 高技术通讯，2003，3（2）：2528.
[5] 刘思金，蔡子微，胡国法，等. NS基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚胎肾细胞NS基因的表达 [J].牡丹江医学院学报，2003， 24（2）：57.
[6] Liu SJ，Cai ZW，Lao WD，et al.Role of nucleostemin in growth regulation of gastric cancer，liver cancer and other malignancies [J].World Journal of gastroenterology，2004，10(9):12461249.
干细胞培养技术篇9
论文关键词：生物技术；伦理问题；思考
21世纪是生命科学的世纪，生物技术的发展对人类和社会的影响深远。而生物技术引发的伦理问题，已成为世界的焦点议题。如何合理的应用生物技术造福人类和社会，是众多学者和科学家急需解决的问题。
一、现代生物技术研究的新进展
进入21世纪，生物技术正处于发展成熟阶段，生物技术的应用已经渗透到我们生活中许多与生物无关的角落。生物技术的发展至今已经揭示了许多生命现象的本质及其规律，但生命现象极其复杂，目前仍有许多课题有待深入研究和探索。目前在克隆、胚胎干细胞、转基因食品、人类基因组计划、组织工程等研究和实际应用等领域取得了成果。
（一）克隆技术。克隆原意是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因都是相同的。克隆技术首先用于动物，动物克隆就是通过无性繁殖方式，由动物细胞产生的遗传形状相同的动物个体。克隆羊多莉是首例克隆成功的动物。动物克隆为我们进一步揭示生命的奥妙及人类的自我认识展现了全新的视野。
（二）胚胎干细胞。干细胞是生物体在生长发育过程中起“主干”作用的高度未分化细胞，它具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞分为三大类：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞之所以全能，是指它可以分化成人体全部细胞类型，进而构建心、肝、肾、肺等多种组织和器官，最终发育成一个完整的个体。全能干细胞再进一步分裂、分化中又形成了各种多能干细胞。多能干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，但是却失去了发育成完整个体的能力。
（三）转基因食品。转基因食品是利用生物技术将某些生物的基因转移到其他物种中去，从而改造生物的遗传物质，使其在性质、消费品质等方面向人类所需要的目标转变。以转基因生物为直接食品或以这种生物为原料，加工出来的食品都被称为转基因食品。转基因食品在欧美应进入人们的日常生活中。有资料表明，在欧洲，玉米钻心虫每年要毁坏4000万吨玉米，占世界玉米总产量的7%，但是如果把分离出来的抗钻心虫基因植入玉米中去，就可培育出抗虫害的玉米，这种玉米就是转基因食品。
二、现代技术发展引发的伦理问题
（一）关于克隆人的争议。从“多莉”羊的克隆成功，待几年来其他克隆动物的尝试，克隆技术正不断发展。目前科学界把对人体的克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆。科学界和伦理界对治疗性克隆普遍支持。但生殖性克隆，即克隆完整的人则遭到很大的抵制。克隆人给伦理道德方面带来了巨大的冲击，对现有的社会关系、家庭结构造成了巨大的冲击。另外，克隆人的身份难以认定，使人伦关系发生模糊、混乱乃至颠倒，进而冲击传统的家庭观以及权利与义务观。
（二）胚盘干细胞研究中的生命伦理问题。由于胚盘干细胞的制备是离不开人类卵子、胚盘以及克隆技术的，而卵子与胚盘在一些不同的国家和宗教界被视为是生命的起源，与活着的婴儿没有什么不同，所以在许多国家是被严格禁止的。坚持认为可以用人类胚胎做实验的人认为：1、早期胚胎仅是一团细胞，尚难称其为人的一条生命，从胚泡内细胞培养成人的胚胎干细胞，并没有杀死细胞，只是改变细胞的命运；2、培养胚盘干细胞是用于治疗现在还无法治愈的组织坏死性疾病，让病人恢复健康，完全是合乎人类伦理道德。
（三）转基因食品的潜在危险。对转基因食品发展有两种态度：支持者极力宣传其带给人类充足的粮食和新型抗病虫策略；反对者则强调人为地用基因技术改变神武，会给人体健康和环境带来危害。基因表达调控是个复杂的生命现象。目前，人类对基因的活动实施了解还不够透彻，还没有十足的把握控制基因中组后的结果。1993年英国的一份报告列出了一些人们对于转基因食品应用的来努力方面的主要担忧：1、人类基因转入食品动物，如将人类基因因子与凝血的蛋白质的基因转入绵羊中；2、某些宗教团体禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中，这可能触怒犹太人和穆斯林，列入将猪的基因转入绵羊；3、动物基因转入植物中，可能会引起一些素食者的特别关注。
三、现代生物技术发展存在的伦理问题对策
现代生物技术的飞速发展，引发诸多伦理问题，发人深思。为了促进生物技术的和谐发展，应采取相应对策和措施。科学预言，21世纪是生物技术发展的黄金时期，全国普及大众伦理学知识尤为重要，设置伦理学咨询机构，利用各种媒体宣传伦理学知识，增强大众的伦理学意识，提高全民族的整体伦理水平。同时，我们还应改变传统伦理观念，发展中国特色的生命伦理学。总体上，生命伦理学应和国际生命伦理学保持一致，但又要保持中国的特色。另外，培养生命伦理专业人才，解决人才匮乏的局面。生命伦理学的发展任道重远，生命伦理学人才匮乏问题需要解决，设置生命伦理学专业，加快专业人才培养规模势在必行，特别应注重研究生、博士生的培养。
干细胞培养技术篇10
【关键词】雨生红球藻；虾青素；大规模培养；提取
虾青素是近年来走入国际研发领域的类胡萝卜素。它广泛存在于自然界中，也是海洋动物体内最主要的类胡萝卜素之一。研究表明，虾青素具有强大的清除氧自由基的能力，其抗氧化性是类胡萝卜素的10倍，是维生素E的550倍，被誉为“超级抗氧”[1-2]。鉴于虾青素的抗氧化功能，且对人体的绝对安全性，在国外已被广泛应用于医药，食品，保健及水产养殖业中[3-4]。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）在特定的条件下可积累本身干重的1%以上的虾青素，是天然虾青素“浓缩品”和最好的生物来源[5-6]。
雨生红球藻是一种淡水单细胞微藻，属绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。其具有特殊的生物学性质，即在弱光及营养丰富的条件下，以游动的绿色营养细胞存在，而在不利于其生长的条件下，以不动厚壁孢子存在，同时在体内积累大量的虾青素[7-8]。鉴于雨生红球藻此生长特点，目前国际上成功的生产模式都采用了两阶段生产方式，即先采用封闭式光生物反应器培养系统实现细胞的高密度营养生长、克服污染问题，再采用流行的开放池系统在胁迫条件下使细胞积累虾青素[9]。本项目旨在利用雨生红球藻的培养及虾青素的提取实验中获得的方法，结合现实生产条件，将技术应用到生产实际中，进一步的推广雨生红球藻的大规模培养和虾青素的提取技术。
1 雨生红球藻的大规模培养
目前雨生红球藻的培养主要分为两个阶段：细胞生长繁殖阶段和虾青素的积累阶段。
1.1 细胞生长繁殖阶段
雨生红球藻的生长繁殖阶段采用逐级扩大培养的方式。各级培养所需淡水取自程海湖，营养液配制与补充均采用MAV母液。
1.1.1 一级培养
利用5000ml三角瓶室内密封恒温培养。三角烧瓶使用之前用草酸清洗并用清水冲洗三遍，每瓶加入培养所用淡水，加热煮沸消毒后用牛皮纸和橡皮筋密封并冷却至室温。加入适量营养盐母液后，藻液按1：3的比例接入，接种细胞密度为1000～6000个/毫升，密封培养。光照强度控制在4000～5000lx，每天摇瓶3～4次以保证充足的二氧化碳溶解量，室内温度控制在25～27℃。每天取样计数，监测藻细胞的浓度。待细胞处于指数生长期时，取一部分藻液继续用于一级培养，以保证藻种的规模；一部分用于二级培养，以逐级扩大生产规模。
1.1.2 二级培养
利用50L白色塑料桶密封充气培养。充气系统包括鼓风机，主充气管，支充气管和气石，支充气管和气石需加热煮沸消毒后才可使用。白桶使用之前用消毒水清洗并用清水冲洗干净，加入淡水45L后再加入消毒片消毒。消毒6h后加入适量硫代硫酸钠中和漂白精，待完全中和后加入营养盐母液并接入一级培养至指数生长期的藻种，接种比例根据藻液的浓度确定，并将已加热消毒后的支充气管和气石安装好进行充气，用尼龙塑料和橡皮筋密封。培养过程中光照控制在4000―5000lx。每天计数监测藻细胞密度，待藻细胞进入到指数生长期时，培养至细胞密度为10万～25万个/毫升，扩大至三级培养。
1.1.3 三级培养
利用100～200 m2水泥池搅拌培养。消毒池和搅拌车用消毒水清洗干净后，加入培养所需淡水，高度控制在30～40cm。按照比例均匀加入漂白粉原池消毒过夜。消毒6h后加入适量硫代硫酸钠中和漂白粉，待完全中和后加入营养盐母液并接入藻种，搅拌培养，光照控制在5000～6000 lx。每天计数监测藻细胞密度，培养至雨生红球藻细胞密度达到6万～12万个/毫升，到达适宜密度时用于下一步生产流程。
关于雨生红球藻的大规模培养技术，已取得了一项专利：大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置和简易方法（专利号：ZL200610154678），并有一项专利已受理：一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法（申请号：200910099708.6）。
1.2 虾青素的积累阶段
虾青素的积累阶段需要建特殊的收集池。收集池面积大至和三级培养池相同，约100～200m2，池底要铺表面光滑的瓷砖，并要有一定的坡度，以便冲洗收集。
待三级培养的雨生红球藻到达一定的浓度，将上层活力较好的藻细胞液转移到收集池。三级培养池底层的藻液含有较多的死细胞和杂质，将其丢弃。转移至收集池的雨生红球藻，光照强度控制在10000lx以上，利用搅拌车进行搅拌并加入一定浓度的氯化钠，进行其虾青素的积累过程。待到藻细胞完全变为孢子，上层水体已基本无颜色，便可进行下一步生产程序。
2 雨生红球藻的收集
经过虾青素的积累阶段之后，藻细胞已完全转化为红色孢子，沉入池底，上层藻液已无藻细胞，水色变清。此时将上层清水排至污水处理厂，之后通过较大的水容器连接收集池的排水口和高速连续离心机，进行雨生红尘球藻的收集。收集过程中，用水泵将收集池底的雨生红球藻冲至排水口的水容器，同时利用高速连续离心机对冲出的含雨生红球藻的水体进行离心，完成雨生红球藻的收集过程。
3 虾青素的提取
经过离心收集后的雨生红球藻藻粉，首先进行喷雾干燥，之后利用超声波技术对雨生红球藻进行破壁处理，之后利用虾青素的脂溶性特性，对处理后的藻液进行油溶萃取，萃取后的脂溶液进行离心处理，收集上清液，得到虾青素，虾青素累积可达1.0%以上。在雨生红球藻的收集，虾青素的提取技术方面从扩红球藻的食品加工方面，已取得一项专利：一种红球藻、菊署的食品及其制备方案（专利号：ZL200910099707.7）。
雨生红球藻中虾青素的含量很高，是天然虾青素的最好生物来源，如何大规模的培养雨生红球藻以及从中高效率的提取虾青素已成为生产天然虾青素的重要途径。相比于国外先进的生产技术，我国雨生红球藻的培养及虾青素提取技术尚处于实验起步阶段，本文创新了雨生红球藻的培养及虾青素的提取实验中获得的方法，为国内首次报道，再结合生产实际条件，运用适宜的生产设备，将该技术措施应用到生产实践中，将进一步的推广雨生红球藻的大规模培养和虾青素的提取技术，获得了适应范围广，生长速度快，虾青素累积可达1.6%以上的技术指标，将产生良好的示范效应，推动我国微藻养殖与加工及市场开发相衔接的新型产业链发展。
【参考文献】
[1]李晓梦，齐安翔，蔡明刚，等.雨生红球藻室外大体积培养与虾青素积累初步研究[J].厦门大学学报，2006，5：245-249.
[2]庄惠如，陈必链，王明兹，等.雨生红球藻混合营养与异养研究[R].微生物学通报，2000，27：198-201.
[3]蔡明刚，王杉霖，李文权，等.天然虾青素在水产养殖中的应用研究进展[R].台湾海峡，2003，22：377-385.
[4]CrungM D，S ouzaF M L ，B orowitzkaM ，et a l.Algalca rotenoidsH .S econdaryc arotenoids2 .H aematococcuspl uvialisa planosproesasa so astaxanthine sters[J].JA pplph ycol，19，92（4）：165-171.
[5]庄惠如，卢海声，陈必链，等.雨生红球藻营养细胞的虾青索累积[J].水生生物学报，2001，25（4）：376-378.
[6]魏东，减晓南.大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状[J].中国海洋药物，2001（5）：4-8.
[7]殷明焱.雨生红球藻细胞周期及调控研究[J].中科院海洋研究所，1998.