干细胞范文10篇

干细胞范文篇1

关键词:干细胞;药学教育;人才培养

干细胞是一类可自我更新、多向分化的细胞群体，根据分化潜能大小可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，根据发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞治疗是干细胞研究的重要分支，正逐渐发展为生命科学、临床医学、药学等多学科交叉融合的转化应用型新兴学科［1］。随着干细胞基础研究的不断深入，干细胞治疗已在多种疾病中展现出很好的治疗前景，被认为是继药物治疗、手术治疗后的第三种治疗途径［2］。目前，世界上大多数国家和地区都对干细胞产业表现出很大兴趣并积极出台相关政策扶持，预计2020年全球干细胞治疗相关市场市值将达4000亿美元，我国在该领域的市值也将达到500亿美元［1］。因此，发展干细胞治疗及其相关技术对医药发展和人类健康有着划时代意义。目前大多数国家将干细胞治疗相关产品按照药品进行监管，为干细胞治疗这一新兴产业的发展指明了方向［3］。药品是要求极其严格的特殊商品，从业人员都是经过严格的、系统的、规范化培训的药学专业人员。干细胞药物作为医药史上最为复杂的产品，其研发、生产是一项复杂的系统工程，从业人员除了需要干细胞的专业知识，更需要药学专业知识。因此，在药学高等教育中开设干细胞药学课程，在药学生中普及干细胞药物的相关知识，可从根本上吸引更多的药学生从事干细胞药物的研发、生产工作，这必将促进干细胞药物产业的发展。干细胞药学的基本内容涵盖干细胞的基础理论、行业指南、政策法规、临床医学和药学等相关知识，是多学科相融合的一门新兴交叉学科。要创建这一课程，就要求相关研究人员探索出与其相适应的课程体系和教学模式［4］。本教研组联合其他多个学科的优秀人才，结合自身多年从事该领域的经验，探索出了与干细胞药学课程相适应的培养目标、教学内容与教学方式，建立了一套相对完整的干细胞药学教学体系。本文主要阐述在药学本科教学中开设干细胞药学的必要性以及开设该课程的具体思路与方法，让学生充分了解该领域的基础知识和产业发展情况，最终实现干细胞药学专门人才的储备，为行业发展助力。

1.开设干细胞药学课程的必要性

1.1干细胞药学的发展需要药学专家的参与。目前全球已获批了14种干细胞药物，我国国家药品监督管理局已临床默示许可4种干细胞药物，可预计未来几年全球将有更多干细胞药物获准上市。现有从事干细胞产业的人员主要是干细胞相关领域的科研人员，其普遍缺乏系统的药学专业知识，生产的干细胞治疗产品质量参差不齐，药理、药效学相关研究也不够系统和深入，这些方面的欠缺严重制约了干细胞药物治疗相关产业的规范发展。干细胞药学研究涉及药学领域的方方面面，缺乏既懂干细胞又懂药学知识的复合型人才，是干细胞药学发展的主要限制因素。干细胞药物的研发生产、质量控制、注册申报、审查批准等均应严格按照药物的报批流程进行，干细胞药物的药效、药理、毒理、药代等方面的研究也需要药学专家的高度参与。1.2干细胞药学的发展为传统制药行业注入新活力。近几年来，制药行业中传统的化学药物增速放缓，而生物制药却呈飞速上升趋势。干细胞药物作为一种新兴的生物制品药物，其原料来源于人体组织，具有安全性高、副作用小的优点，对运用传统治疗手段治疗效果不好或无效的多种疑难病症有着较好的疗效。如多发性硬化、阿尔兹海默病、脊髓损伤、黄斑病变、小儿脑瘫等［5］。干细胞药物产业是生物制药领域最有发展前景的产业之一，相信会给制药行业带来革命性变革。而现有的药学专业人员对干细胞相关知识了解不多，对干细胞产业的兴趣不足，这使得药学专业人员对干细胞治疗领域的研究参与度不高，这在一定程度上限制了传统制药行业在干细胞药物领域的新发展。究其根源，可能与药学专业高等教育课程中涉及干细胞内容偏少有一定关系。因此，对部分药学专业人才，特别是从事生物制药相关专业的人员普及干细胞药学的相关知识，将极大地促进传统制药行业在生物制品药物领域的发展。1.3药学专业设立干细胞药学课程十分必要。现阶段药学及相关专业的培养方案中主要的基础课程和专业课程包括有机化学、分析化学、生物化学、微生物学、药剂学、药理学、药物分析学、药物化学等，部分医学院校还会开设一些生理学、免疫学、细胞生物学等课程，这些构成药学专业高等教育的常规课程体系［6-7］。目前的课程设置缺乏干细胞药学相关知识的介绍，因此，笔者建议在药学本科教育中也设立干细胞药学选修课程，希望以此可以弥补这方面的教学空白，一方面丰富学生的知识体系，另一方面为学生提供新的药学研究视角。干细胞药物既具有传统药物的特征，又具有自身独特的特点，该领域还有很多问题没有得到很好解决，其需要研究人员运用创造性思维打破常规去解决，所以干细胞药学课程将是培养学生独立思考、分析问题、解决问题的有效工具。该课程的开设能促进干细胞药学基础知识的普及，为该类药物的发展奠定人才知识储备基础。

2.干细胞药学课程的培养目标

干细胞药物涉及生命科学、临床医学、药学等多学科的相互交叉和融合，我国干细胞药物的发展亟须相关复合型人才，因此，笔者建议在药学高等教育中开设干细胞药学课程。该课程可作为一门选修课，在药学、生物制药、药物分析、药剂学等专业的高年级学生中开设，其培养目标包括:掌握干细胞的基本理论知识和技术;掌握干细胞与药物的区别与联系;了解干细胞最新研究进展及转化应用前景;了解国家对干细胞药品的监管政策;将干细胞与药学知识融会贯通，培养创新思维，提高学生分析问题和解决问题的能力，激活学生的积极性与创造性，为以后从事干细胞药物产业奠定知识基础与能力基础［8］。

3.干细胞药学的教学内容与教学方式

3.1教学内容。干细胞药学课程作为一门新课程，涵盖了干细胞和药学等多个学科的知识，课程内容应立足未来、立足应用、立足特色。根据设定的课程目标，本教研组召集了相关高等学校、干细胞科研机构、临床试验基地、药品监管部门和医院等单位中从事干细胞药学相关教学工作、基础研究、药学研究和临床试验研究的人员经过多次讨论，结合笔者对本课程的思考和理解，构建了本门课程的教学内容。课程以自编教材为主，分为基础知识、药学评价和前沿进展三个单元，主要内容包括:干细胞的分类及生物学特性与功能;干细胞的最新研究进展及临床转化应用情况;干细胞药物生产工艺的质量控制;干细胞药物的药代动力学、药效学和安全性评价方法;国家关于干细胞药物的监管政策;干细胞药物研究中的伦理学;干细胞药物面临的挑战和机遇等。3.2教学方式。干细胞药学课程综合性强，一方面要求授课教师具备全面的干细胞药学相关知识，另一方面要求课堂授课方式要具有一定的灵活性。针对不同的教学内容，教师应结合最新的文献及实例，综合运用多种教学方法和手段，使学生掌握基本知识和理论，提高学生学习的兴趣和积极性，实现综合素质的提升［8］。针对基础知识模块，以教师讲授为主，但要摒弃传统的填鸭式教学，采用以问题为导向(Problem-BasedLearning，PBL)的教学方法，将教学讲解与学生阅读和讨论相互结合，这有助于培养学生主动学习的兴趣和能力［9-10］。针对药学评价模块，建议采用案例教学方式，针对干细胞药物的质量控制、药理药效学评价等方面举出实例，将知识具体化［11］。高年级的药学专业学生，已经具备了基本的药学专业知识，课堂上教师要求学生结合已学的药学基础，将干细胞药物与传统化学药物、生物制品进行对比，思考干细胞药物和传统药物在质量控制、药品监管层面有哪些相同和不同。针对前沿进展模块，一部分课程内容可以采用讲座的模式讲授，学校可邀请一些专家教授和骨干教师，结合自己的科研项目讲授干细胞药物研究的最新进展，对该领域感兴趣的学生可以加入教师的课题研究中;另一部分课程内容可以通过翻转课堂的形式，教师把课堂让位于学生，使学生由被动的接受者变为主动的参与者［12］。

4.展望

随着干细胞技术的迅速发展，干细胞药物的发展空间也越来越广阔，其已成为当今生物制药领域研发的热点。干细胞药物作为医药史上最为复杂的制剂，与传统的化学药物、蛋白类药物有着明显差异，其研发、生产、管理和监督均需要专门的干细胞药学人才。在药学高等教育中开设干细胞药学课程可为干细胞药学产业发展提供复合型的药学人才储备，推动干细胞产业发展。高等学校积极布局干细胞药学这一领域，可从根本上加快我国干细胞药物产业的发展，有可能助力我国在这一领域实现弯道超车。

参考文献

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干细胞范文篇2

【关键词】细胞因子骨髓基质干细胞软骨细胞软骨缺损

Abstract：［Objective］Toretrievalabestcellfactorwhichcaninducebonemarrowstromalcells(bMSCs)intochondrocyteinvitroandtoexploreaneffectiveplantorepairrabbit''''schondrocytedefect.［Method］IsolatedbMSCswereculturedinvitro.rhFibroblastGrowthFactor1(rhFGF-1)、rhTransformingGrowthFactor-β1(rhTGF-β1)、rhInsulinlikeGrowthFactor-Ⅰ(rhTGF-Ⅰ)wereutilizated.TheproliferationofcellswasdetectedbyMTTassay,andthemacroscopichistology,HEstainingandimmunohistochemicalexaminationswereperformedtoseekthebestcellfactor.Invivo,toinvestigatetherepairofthearticularcartilage,bMSCscombinedwithfibringlueandrhTGF-β1、rhIGF-Iwascomparedwithcontrolgroup.［Result］ThecellsinducedbyrhTGF-β1andrhIGF-Iweresimilartochondrocytesinmorphology,andimmunohistochemicalexaminationsshowedthecellspossessedphenotypeofchondrocytes.RhTGF-β1andrhIGF-Icoulddifferentiatebonemarrowstromalcellsintocartilagecellsinvivo,andrepairthearticularcartilagedefect.Thecontrolgroupcouldnotrepairthearticularcartilagedefectefficiently.［Conclusion］rhTGF-β1andrhIGF-IarebestgroupwhichstimulatebMSCstodifferenateintocartilagecells.BMSCscombinedwithfibringlueandrhTGF-β1、rhIGF-Icanrepairthearticularcartilagedefect.

Keywords：cellfactor;bonemarrowstromalcells;chondrocyte;cartilagedefect

作者简介：童培建(1961-)，男，杭州人，教授，主任医师，在读博士研究生，研究方向：关节外科，(电话)0571-87070956骨髓基质干细胞（BMSCs）中含有少量的多功能基质干细胞，能向成骨系细胞、成软骨系细胞分化［1］，为骨、软骨组织的损伤提供了潜在的修复可能。临床软骨缺损自行修复的效果较差，可能跟软骨损伤局部BMSCs的含量少有关。因此作者通过对BMSCs在体外扩增培养、应用不同的细胞因子进行诱导，从中寻找体外促进骨髓基质干细胞增殖分化的最佳条件，并将细胞因子与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物，植入缺损处，探讨体内修复家兔软骨缺损的效果。

1材料与方法

1.1骨髓基质干细胞的取材与培养

取新生红皮胎兔2只（24h内），置入浓度为75％的酒精中浸泡消毒5min，在超净工作台中，无菌分离四肢长骨骨干，剔除软组织，在10％的DMEM培养液中剖开骨干，反复吹打髓腔。将细胞悬液移入离心管中，加入Hank''''s液至10ml，平衡，1500r／min离心10min，弃上清，加入10％DMEM，反复抽吸吹打均匀，计数，按1×107接种于25ml培养瓶中，37℃5％饱和湿度培养箱中常规培养。5d后首次全量换液，以后每3d换液1次，待细胞融合至80％时，0.25％胰蛋白酶常规消化，按1:3比例传代培养。逐日倒置显微镜观察培养细胞的生长情况。

1.2体外实验分组

实验分组如下：rhFGF-1组（简称F组）；rhIGF-Ⅰ组（简称I组）；rhTGF-β1组（简称T组）；rhFGF-1rhIGF-I组（简称FI组）；rhFGF-1rhTGF-β1组（简称FT组）；rhIGF-IrhTGF-β1组（简称IT组）；rhFGF-1rhIGF-IrhTGF-β1组（简称FIT组）；对照组（不加任何试剂）。其中rhFGF-1浓度为10μg/L;rhIGF-I浓度为10μg/L;rhTGF-β1I浓度为5μg/L。

1.3MTT比色法测定

取第2代骨髓基质干细胞以1×104/ml接种到96孔培养板上，共4块，常规培养24h。待细胞完全贴壁后，弃上清液，将每块孔板随机分组，每组8孔，按实验分组添加相应的细胞因子，分别于第1、3、6、9d各取孔板1块，进行MTT检测：即每孔加50mg/ml的MTT液20μl,常规培养4h，弃废液，0.1%PBS液清洗1次，加入二甲亚砜，每孔150μl，静置20min后，用酶标仪测定波长为490nm的吸光度值。

1.4体外细胞形态学观察

将细胞进行HE、Ⅱ胶原免疫组化测定（ABC法），倒置显微镜下观察。

1.5纤维蛋白凝胶复合体的制备

传代培养的骨髓基质干细胞经0.1%胰蛋白酶＋0.02鞹A消化后，1000r/min离心10min浓集，进行细胞计数。制成单细胞悬液，与纤维蛋白原溶液混匀。使纤维蛋白原和骨髓基质干细胞的终浓度分别为2.5g/L和5×106/ml，每毫升再加入rhTGF-β15ng/5μl和rhIGF-I50ng/50μl。然后加入凝血酶20U/ml。制成凝胶备用（2h内使用）。

1.6体内实验分组

32只家兔，雌雄不限，随机分为4组。无菌条件下后肢右股骨髁滑车关节面钻孔，直径3.5mm、深3.0mm，达软骨下骨。干细胞复合体组：缺损中直接种植纤维蛋白凝胶复合体；单纯凝胶复合体组：缺损植入未加细胞因子的凝胶复合体；骨髓基质干细胞注射组：缺损单纯注射浓度为5×106/ml骨髓基质干细胞悬液0.5ml；空白组：缺损不作处理。不固定术肢，自由活动。分别于4、8、12周处死取材。标本10％福尔马林固定。行HE、Masson三色、甲苯胺蓝染色检查。第12周标本行透射电镜检查。

1.7体内组织形态学评分

参照O''''Driscoll，KeeleyandSalter组织形态学评分标准。对实验组和对照组修复组织形态学进行半定量评分（表2）。

1.8统计学处理

实验数据用±s表示，显著性检验采用t检验。P＜0.05为差异有显著性。使用SPSS11.5统计软件进行数据统计处理。

2结果

2.1体外细胞形态学观察

贴壁细胞呈梭形、纺锤形、多角形等，有不规则的生长突生出，细胞基质折光性强；4～5d后细胞形成集落状，形态比较单一，基本上呈梭形或多角形；7～8d后形成单层。

首次传代的细胞呈圆形，24h后恢复梭形，折光性好，细胞呈均匀生长，形态更加单一，基本呈梭形。8d后可铺满瓶底，形成单层结构，排列呈有规律的方向性（图1）。经生长因子诱导的细胞，对照组、T组生长速度有所减慢，10d左右形成单层结构；IT组形态由梭形变为以扇贝形或多角形为主，细胞核深染（图2）；F组生长加快，在5d形成单层，形态以长梭形为主（图3）。免疫组化染色显示：细胞基质呈棕黄色，染色较均匀，证明Ⅱ胶原存在［2］，部分细胞不着色(图4)。细胞经苏木素复染后可见细胞核深染，免疫组化染色后的细胞形态在镜下成圆形、椭圆形或多角形，不同于前2代的细胞形态(图5)。免疫组化染色（随机镜野）阳性率面积接近50%（图4、6）。图1p1代4×10图2HE（IT组）10×40图3HE（F组）10×20图4免疫组化（IT组）10×20图5免疫组化（IT组）10×40图6免疫组化（IT组）10×20

2.2诱导细胞增殖测定(MTT)

第1、3dMSCs细胞处于增殖静止期；细胞在第3d开始进入对数增殖期，细胞增殖迅速，以F组增殖最为显著，第6d达到高峰；第9d多数实验组进入增殖平台期，增殖速度相对减缓，而IT组仍保持增殖的趋势（见表1）。MTT测定3d时各组细胞均有不同程度的增殖；6d时F组、I组、FI组、FT组细胞增殖较快，与对照组相比，P<0.01，其它组细胞增殖速度不明显；9d时，F组、FT组、FIT组与对照组相比有统计学意义（P<0.01）；FI组P<0.05。表1生长因子在不同时间对MSCs的增殖活性的影响注：*与对照组比较P＜0.05；**与对照组比较P<0.01；

2.3修复软骨的大体观察

术后4周，干细胞复合体实验组标本可见缺损处由白色、半透明类软骨样组织所填充，与正常软骨组织界限清楚，表面不光滑。术后8周，缺损处修复组织变成乳白色，半透明光滑组织，与周围软骨组织边界开始变模糊。术后12周，缺损修复组织与周围正常软骨组织已基本难区分，表面平坦（图7）。单纯凝胶复合体组12周缺损呈乳白色，表面平坦，边界模糊。骨髓基质干细胞注射组12周缺损处凹陷，肉芽组织生长（图8）。空白组12周缺损处肉芽组织填充表面仍稍凹陷，与周围正常软骨组织界限仍清楚。

2.4修复软骨HE染色

第12周干细胞复合体实验组的修复软骨与正常软骨整合良好，各层结构清晰，新生软骨细胞数量明显增多，排列已经类似正常软骨，潮线明显，表面未见裂缝（图9）。空白组修复组织内见少量的细胞，细胞形态异常，纤维组织填充。单纯复合体组见细胞数量增多，形态正常，与周围组织整合良好。

2.5修复软骨Masson三色

干细胞复合体实验组12周，软骨细胞数量多，排列较前规则，软骨表面光滑，与周围组织整合良好，可见亮绿色胶原纤维，修复的软骨与软骨下骨质紧密结合。

2.6修复软骨甲苯胺蓝染色

干细胞复合体实验组12周时，甲苯胺蓝染色与正常软骨接近，修复的组织呈现出均匀的异染性着色，软骨深层染色浓，细胞形态大。单纯凝胶复合体组，基质染色浅，细胞陷凹少。骨髓基质干细胞注射组，细胞较少，基质呈浅蓝色（图10）。空白组，细胞少，基质染色颜色浅蓝色。

2.7修复软骨电镜检查

干细胞复合体实验组软骨细胞具有典型的褶皱状小突起，细胞周围还可见到许多长纤毛，并延伸到细胞外基质中。高倍电镜显示干细胞复合体实验组的修复软骨细胞细胞核增大，核内常染色体增多。细胞质内可见粗面内质网排列整齐、紧密，膜表面附有大量的核糖体颗粒。胞质内细胞器数量增加。软骨细胞周围的外基质中可见胶原纤维成束状紧密排列，可见到周期性横纹（图11）。单纯凝胶复合体组修复的软骨细胞结构正常，但细胞表面未见纤毛。高倍镜下软骨细胞胞质内粗面内质网数量少，排列较稀疏，高尔基体数量也减少。细胞核较干细胞复合体实验组明显小。细胞周围胶原纤维排列紊乱，稀疏。骨髓基质干细胞注射组电镜下观察基本类似于空白组。大多为凋亡软骨细胞，细胞水肿胀大，细胞核固缩，细胞质内见不到细胞器（图12）。偶尔可见未坏死的软骨细胞，但细胞形态小，成梭形。细胞周围纤维束排列稀疏。

2.8修复软骨的组织形态学评分及统计分析(表2)表2修复后软骨组织形态学分值注：*与干细胞复合体实验组比较P＜0.05，△与空白组比较P＞0.05，▲与空白组比较P＜0.05图7术后12周，干细胞复合体组缺损修复组织大体照片图8术后12周，单纯骨髓基质干细胞组缺损修复组织大体照片图9第12周干细胞复合体实验组的修复软骨与正常软骨整合良好，新生软骨细胞数量明显增多，排列已经类似正常软骨。HE100×图10第12周单纯骨髓基质干细胞组的修复软骨细胞较少，基质呈浅蓝色。甲苯胺蓝100×图11干细胞复合实验组12周，软骨细胞周围的外基质中可见胶原纤维成束状紧密排列。12500×图12空白组12周，大多为凋亡软骨细胞，细胞水肿胀大，细胞核固缩，细胞质内细胞器很少。1650×

3讨论

许多证据表明［3］，MSCs可以在不同理化环境的细胞因子的诱导下，定向的向成骨细胞或成软骨细胞系方向分化，并最终形成骨或软骨组织。在细胞生存微环境中，生长因子对细胞增殖、分化、发育和成熟过程起重要的调控作用。

bFGF对MSCs的作用还不是很明确，但主要认为促增殖作用。另外，bFGF能促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原，对维持软骨细胞正常表型的表达具有重要的作用。IGF1能刺激细胞分裂增殖，而且增强细胞蛋白多糖(PG)及Ⅱ型胶原的合成［4］。TGFβ是一种多功能性的细胞因子,可以显著提高软骨细胞表型的表达,促进软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成与分泌。TGF-β诱导MSCs后经连续培养，可以在体外形成软骨结节，经证明具有软骨的组织结构［5］。

本实验中作者发现，细胞因子单独应用时，bFGF-1的促增殖作用最显著，倍增时间最短；其次分别是IGF1和TGFβ，这与以往的实验研究相符［6］。然而，当联合应用细胞因子时，发现bFGF1与其它因子组合的增殖作用部分受到抑制，不如单独应用bFGF-1作用显著。同时作者发现，IGF1和TGFβ联合应用时，细胞的对数增殖期最长，诱导细胞呈持续的增殖状态，这可能是IGF1和TGFβ联合应用，使各自的半衰期延长，能够更持久的调节细胞的生物学行为，使之保持生物学活性。IGF1和TGFβ联合应用时，部分集落的骨髓基质干细胞呈大而圆形或多角形，通常认为，圆形、多角形的细胞体外能够保持合成软骨特异性Ⅱ型胶原及蛋白多糖的功能。免疫组化染色阳性面积较其它组大；而对照组与其它实验组细胞集落多数呈长梭形，以往认为这是软骨细胞去分化的表现（dedifferentiation）。Ⅱ型胶原蛋白是软骨细胞所特有的胶原类型，是软骨细胞重要的表型蛋白，免疫组化结果揭示MSCs经IGF1和TGFβ联合诱导可以向软骨细胞方向增殖分化。实验研究结果表明，IGF1和TGFβ联合应用是诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化的最佳组合，能促进Ⅱ型胶原合成和表达。在体内作者采用TGFβ及IGFⅠ作为骨髓基质干细胞向软骨细胞转化的诱导因子，以纤维蛋白凝胶作为前者的载体。纤维蛋白凝胶可通过释放β转化因子和血小板衍生生长因子等来促进细胞黏附、增殖并分泌基质，起到骨髓基质干细胞的支架作用，能很好地包埋骨髓基质干细胞和软骨细胞。此外，IGFⅠ在体内可以通过与软骨细胞膜上的受体结合以旁分泌和自分泌的方式起作用。因此IGFⅠ可以不进入血液，而在局部与细胞发生作用。

实验表明在体内联合应用IGF1和TGFβ，能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞的分化。在12周时修复组织为透明软骨，病理切片提示修复组织与正常软骨组织结构类似，并且与周围组织整合良好。电镜观察也发现，联合应用TGFβ及IGF1修复组织的软骨细胞形态正常，细胞活跃，基质内纤维组织结构符合软骨特性。软骨修复是一个复杂的过程，有多种细胞因子参与。缺少细胞因子的单纯凝胶组和骨髓基质干细胞注射组均不能达到较好的软骨修复效果。因此，TGFβ及IGF1联合可作为组织工程学修复软骨的首选细胞因子。

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干细胞范文篇3

【关键词】造血干细胞移植；淋巴瘤；淋巴细胞白血病

EffectofHematopoieticStemCellTransplantationinMalignantHematologicDiseaseofLymphaticSystem

AbstractThestudywasaimedtoinvestigatetheeffectofhematopoieticstemcellstransplantation(HSCT)intreatmentforhematologicmaglignaciesoflymphaticsystem.Throughobserving8patientswithnon-Hodgkin′slymphoma(NHL)and3patientswithlymphoblasticleukemia,whoreceivedautoorallo-HSCTafterchemotheraphy,thehematopoieticreconstitution,complicationandsurviraltimewereevaluated.Theresultsshowedthat11patients(7patientsafterauto-PBSCT,4patientsafterallo-PBSCT)allachievedhematopoieticreconstitutionandcompleteremission(CR).Withinthreeyearsfollowing-up,5patientswithNHLweresurvival,butonecaseofNHLdiedatthe2monthsafterauto-PBSCT,onepatientsuicided.From4casesreceivedallo-PBSCT,onepatiantwithNHL(NKcell)wasdiedat79dayslater,onepatientwithchroniclymphoblasticleukemiawassurviving,another2casesofacutelymphoblasticleukemiaweredeadat17monthsand54daysrespectivelyafterallo-PBSCT.InconclusionHSCTisaneffectivetreatmentforhematologicmaglignanciesoflymphaticsystem,butthereplasewouldoccurinsomepatientsreceivedauto-PBSCT.Theothersbyallo-PBSCTmightdieofseverecomplicationoftransplantation.

Keywordshematopoieticstemcellstransplantation;lymphoma;lymphoblasticleukemia

造血干细胞移植（HSCT）已被公认为是治疗恶性血液病的有效方法，特别是对急慢性白血病及中高度恶性、初治耐药、易于复发等预后不良淋巴瘤效果尤为突出［1］。外周血造血干细胞移植（PBHSCT）是HSCT中的一种类型，因其采集方法简便，移植后造血重建迅速，痛苦相对较少,易于被患者个人或供者接受，而广泛应用于临床治疗。本研究在已有的造血干细胞移植研究基础上［2-7］，重点探讨HSCT治疗淋巴系统恶性血液病的效果。

材料和方法

病种和移植类型

11例移植患者中，男6例，女5例，年龄15-56岁（中位年龄35岁），其中非霍奇金淋巴瘤8例（弥漫性大B细胞型5例，B细胞源性2例，NK细胞型1例），急性淋巴细胞白血病2例，慢性淋巴细胞白血病1例。移植类型：自体外周血干细胞移植7例，异基因HLA单倍相合亲缘移植4例（其中2例为非清髓移植，2例为清髓移植）（表1）。Table1.Informationof11patientswithmalignanthematologicdiseaseoflymphaticsystemafterHSCT（略）

干细胞的采集、动员、保存

对所有异基因造血干细胞供者均予粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员外周血干细胞，10μg/（kg·d）分2次皮下注射共5天，所有自体造血干细胞移植患者先予环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）联合G-CSF动员外周血干细胞，再用CS-3000plus(Baxter公司产品)分离外周血干细胞，每次循环血量10L左右，如1次采集干细胞数量不足，可于第2日重复采集直至CD34细胞数量超过3×106/kg，将采集到的外周血造血干细胞放置液氮中保存。

预处理方案及干细胞回输

自体造血干细胞移植（auto-HSCT)中，有6例采用CBV方案(CTX/VP-16/CCNU)，1例选用MA方案（MIT/Ara-C）进行移植术前预处理。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT)中，2例非清髓干细胞移植者，1例采用环磷酰胺阿糖胞苷全身照射（CTX/Ara-C/TBI），1例采用氟达拉滨(fludarabine，FAMP)环磷酰胺进行预处理；2例清髓干细胞移植者，1例采用CTXTBI，1例采用CTX/VP-16/TBI进行术前预处理。所有患者在预处理结束后均予以输注含CD34细胞数平均为5.5×106/kg的未去T细胞的移植物，移植后即开始使用G-CSF（300μg/d），直至WBC＞3×109/L后停用。

结果

造血重建

11例患者中性粒细胞（ANC）＞0.5×109/L平均天数为11（8-18）天，血小板（Plt）＞20×109/L平均天数为12（8-23）天（表2）。Table2.Hematopoieticreconstitution,complicationandprognosisof11patientswithmalignanthematologicdiseaseoflymphaticsystemafterHSCT（略）

并发症

自体造血干细胞移植中，3例患者在骨髓抑制期间出现肛周、口咽部、颈静脉置管处感染，1例在造血功能恢复前因血小板低出现泌尿系出血。异基因造血干细胞移植中，1例出现移植物抗宿主病（GVHD）及肝静脉闭塞病（veno-occlusivediseease，VOD），1例出现移植物抗宿主病及出血性膀胱炎（hemorrhagiccystitis，HC）、间质性肺炎。

近期疗效

8例非霍奇金淋巴瘤患者中，5例为弥漫大B细胞型，2例为B细胞源性，1例为NK/T细胞型，移植前5例CR，3例PR，按文献［8］标准，外周血干细胞移植术后8例均为CR；3例淋巴细胞白血病患者中1例为CLLA期，2例为ALL，其中有1例多次复发，移植术后3例均达到CR。

生存期

随访3年，自体移植7例患者中，除1例自杀身亡，1例术后再次复发出现肝脏、中枢神经系统广泛浸润，于移植术后2月死亡外，其余5例均无病生存。异基因移植4例患者中，除1例CLL患者无病生存外，其余3例分别于移植后54天、2个月、17个月死亡。

讨论

上述7例auto-HSCT患者均为非霍奇金淋巴瘤弥漫大B细胞型或B细胞型，已有报道明确表明，放（化）疗大约可使30%的NHL病人长期存活，但对于中、高度恶性NHL病人的长期生存改善不明显，auto-PBSCT已成为中、高度恶性非霍奇金淋巴瘤病人治疗的标准方案之一［9］。对于初治未达到CR的侵袭性NHL病人，常规挽救治疗的效果比较差，长期无病生存率很低，而auto-PBSCT却能获得较高的CR率和PR率，5年生存率达37%［10］。我院所采用auto-PBSCT治疗的7例患者中，有3例为初治未达到CR的淋巴瘤，5例为中度恶性淋巴瘤，经过auto-PBSCT后7例均达到CR标准，其中1例弥漫大B细胞型患者移植前经CHOP方案、proMACE-cytoBOM方案、MACOP-B方案多次化疗后均不能缓解，行auto-PBSCT治疗后复查各项指标提示达到CR标准,但2月后再次复发，出现肝脏及中枢神经系统广泛侵润最终导致死亡。因此可以说，自体干细胞移植无供受者之间的免疫排斥，合并症少，造血重建快，既使出现骨髓抑制引发的感染、出血、贫血症状，予以细胞因子刺激造血，同时加强抗感染、输红细胞悬液、血小板及对症处理后也可迅速恢复，确实是治疗中高度恶性、初治耐药难治性恶性淋巴瘤的有效方法，但同时也要看到因为自体干细胞移植缺乏GVL效应，易于在移植之后再次复发，降低了auto-PBSCT对该类疾病的总体有效率。鉴于auto-HSCT治疗NHL有一定的复发率，且国际上也存在采用异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗侵袭性淋巴瘤的病例，遂予例8患者进行了非清髓allo-HSCT治疗，移植过程中患者造血重建恢复迅速，也未出现严重GVHD及其他相关移植并发症，可能与术中有效使用环孢素（CsA）、骁悉（MMF）进行移植物抗宿主病预防有关，但移植后患者再次复发，较术前有明显进展，出现颅内及脾脏多处浸润。有研究表明，对侵袭性淋巴瘤的治疗，可考虑采用allo-HSCT取代auto-HSCT,但采用allo-HSCT仍有25%复发率，且移植相关死亡率较高，使其总体生存率（OS）仅有18%-35%［11，12］，近年来有报道显示采用allo-HSCT治疗恶性淋巴瘤OS可升至76%［13］，所以allo-HSCT对NHL具有治愈潜能，但因其高移植相关死亡率，同时也存在移植后复发可能，因此需有选择地对该类患者进行allo-HSCT。目前，allo-HSCT在治疗急性白血病方面已得到公认。在上述11例患者中，有2例ALL患者进行了清髓allo-HSCT，分别采用CTXTBI、CTXVP16TBI作为预处理方案。例6患者造血重建略有延迟，例7造血重建迅速，分别出现Ⅱ度aGVHD和Ⅲ度aGVHD,移植后2例患者均完全缓解，但例7因同时存在出血性膀胱炎及巨细胞病毒感染导致的间质性肺炎于移植后第54天死亡，例6因广泛性cGVHD在移植17个月后死亡。虽然allo-HSCT治疗急性白血病效果已得到肯定，但上述2例患者无病生存时间较短可能与预处理强度、配型为单倍相合及严重移植相关并发症有关。此外，allo-HSCT在CLL中的应用也逐渐被重视起来。Pavletic等［14］报道了用allo-HSCT治疗23例CLL的情况，结果显示在这些移植后患者中完全缓解率达到87%，5年的无病生存率仅为65%，复发率为5%。虽然本研究中仅有1例为采用非清髓allo-HSCT治疗的CLL患者，但其移植后亦达到完全缓解并且无病生存。综上所述，虽然自体造血干细胞移植患者尚存在复发的可能，异基因造血干细胞移植患者有一定的移植相关死亡率，但造血干细胞移植仍然是治疗恶性淋巴系统血液疾病的一个有效方法，值得在临床工作中推广。

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干细胞范文篇4

【关键词】骨髓干细胞

骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。

1骨髓基质细胞的生物学特性

1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等[1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞[3，4]。

1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化[3]。

2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞

最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用[5]。

3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理

3.1供体与受体

MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等[6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠[7]。Zhao等[8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。

3.2MSCs在脑内有迁移能力

Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞[9]。

3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植

脑立体定向移植：根据缺血损伤的部位采用脑立体定向术，将一定体积适当数量的MSCs直接注射到缺血损伤部位。该方法的缺点是：(1)对脑组织产生一定程度的损伤；(2)移植物的数量受一定程度的限制；(3)不便多次多靶点注射[10]。颈内动脉注射移植：可将MSCs直接经缺血侧颈内动脉注入，该方法与立体定向法相比有以下优点：(1)移植的MSCs可广泛分布于缺血半暗带区；(2)创伤较小；(3)可允许较多数量、较大体积的移植物输入；(4)有更多的BrdU阳性细胞在缺血区存活，缺点是：需要一定的技术条件，经静脉注射移植简便、安全、快捷、有效，一次可输入较多数量的MSCs，而且进入脑内的MSCs分布在缺血坏死灶及其周边区较大的范围内。经静脉或动脉注射较脑局部注射优越，因MSCs随血液循环分布更广，除大部分集聚于靶点梗死区周边的半暗带区外，对侧镜区也有少量分布。移植后MSCs存活和分化需要各种细胞因子的营养、微环境的平衡及一定的血液供应，因此，最适合注射部位应在梗死区周边的半暗带区。

3.4移植的时间

动物研究从脑梗死模型建立后1天到1月移植均有，有关不同移植时间对神经的增生、细胞分化、整合及神经功能恢复的影响的研究还较少。急性期时兴奋毒性神经基质、自由基等的释放对新生组织造成损害。考虑到脑梗死的自然恢复过程，有些学者在脑梗死后数月进行移植，疤痕组织的形成可能会影响移植物的生长。

3.5MSCs可参与正常的基质代谢，修复细胞外基质，促进神经元细胞的增殖、分化和迁移，参与中枢神经系统损伤的修复。

由于严重缺血或细胞因子的刺激，基质祖细胞可以沿内皮祖细胞伸展并聚集，因而有助于血管新生和(或)损伤愈合，Chen等发现，MSCs移植后14d，BrdU标记的MSCs可能与内皮祖细胞一样发挥作用，促进缺血组织的血管再生和损伤神经组织的修复。

3.6移植的细胞数

既往研究脑局部注射移植的细胞总数为2.25×105(分为3个点注射)，静脉或动脉注射移植的细胞数为2～6×106时，神经功能缺失症状均有恢复[8]，而静脉移植的细胞数为1×106时，神经功能恢复不明显。MSCs浓度太低，达不到治疗效果，浓度太高易致静脉栓塞。3.7移植后的表达率

对供体来源的MSCs用BrdU标记，双染后免疫荧光显微镜或共聚焦显微镜下计算BrdU和NeuN或GFAP均为阳性的细胞以判断移植后的表达情况。表达率与移植的方式有关[5]，有报道一些神经营养因子可以提高诱导分化后的表达率，在脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)及碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)存在的情况下，NeuN的表达率达到2%，GFAP达8%。

3.8MSCs治疗脑梗塞

研究表明部分MSCs可通过正常的血脑屏障迁移到脑内广泛的区域，局灶性脑缺血时，由于血脑屏障的破坏，可能有助于MSCs选择性迁入缺血脑区，此外，缺血脑组织的炎症等缺血相关信号也可能诱导和促进MSCs的迁移，由于脑缺血后局部微血管表达的粘附因子的引导，经静脉或颈内动脉输入体内的MSCs可以分化为类似神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的细胞，这些细胞主要分布在缺血区，显然脑内的特有微环境，尤其是缺血损伤信号诱导了MSCs的迁移、分化，缺血微环境似乎有利于MSCs的存活、增殖，脑缺血可以诱导脑内尤其是缺血周边区内胶质细胞系源性神经营养因子(glialcelllinederivedneurotrophicfactor，GDNF)、神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、转化生长因子1(transforminggrowthfactor1，TGF1)等神经营养因子的表达，MCAO后，BrdU阳性的MSCs高度集中在缺血周边区，该区表达的神经营养因子可能对随后移植的MSCs的存活、分化或迁移有重要作用[10]。

4展望

MSCs的移植，尤其是自体MSCs移植克服了诸如伦理免疫排斥等问题，因此有更好的应用前景，MSCs极易在脑内存活、分化及整合，移植后并不产生炎症和免疫排斥反应，所以MSCs移植治疗局灶性脑缺血是切实可行的，但是下列问题需要进一步解决：(1)经静脉或颈动脉注射的MSCs迁移入脑内的机制，以提高MSCs进入脑内的数量；(2)MSCs在脑内迁移、分化和存活的机制及影响因素；(3)MSCs在脑内分化的神经元、胶质细胞能否取代已死亡的神经元和胶质细胞，分化的神经元能否与宿主神经元形成功能性突触联系和神经环路，它们在脑缺血损伤恢复中的地位；(4)MSCs在脑内可否产生有关神经营养因子、细胞因子及细胞外基质并参与神经功能重建；(5)将携带有关神经营养因子或细胞因子基因的载体转染MSCs，使其在缺血脑内表达神经营养因子等，从而达到治疗局灶性脑缺血的目的；(6)高效诱导MSCs体外分化的最佳方法及分化的神经元的移植对局灶性脑缺血的作用；(7)MSCs和基因治疗骨髓基质细胞移植入脑几天内发生凋亡，那么如何提高其存活率将成为一个主要问题。Bcl-2基因是细胞凋亡的重要抑制基因，近年发现它在脑缺血中表达并在其中起重要作用，Shimizu等研究发现，缺血诱发的bcl-2蛋白可增强脑对后继缺血的耐受性，具有神经保护作用，减少缺血神经细胞凋亡。因此可尝试利用Bcl-2基因抗骨髓基质细胞凋亡观察是否增强MSCs治疗脑梗死的效果。

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干细胞范文篇5

【关键词】异基因外周血造血干细胞移植迟发性非感染性肺部并发症移植物抗宿主病

LateonsetNoninfectiousPulmonaryComplicationsafterAllogeneicPeripheralBloodStemCellTransplantation

AbstractTheaimofstudywastoexploretheincidence,riskfactors,outcomeandefficacioustreatmentoflateonsetnoninfectiouspulmonarycomplications(LNIPC)afterallogeneicperipheralbloodstemcelltransplantation(alloPBSCT).SeventypatientsreceivedalloPBSCTwereanalyzedretrospectively.Theresultsshowedthat9outof63patientssurvivingmorethan3monthsoccurredlateonsetnoninfectiouspulmonarycomplications(14.3%).Fiveoutofthe9patientsdevelopedsecondarypulmonaryinfections.In4patients,LNIPCcauseddeathdirectly.Advancedstageofdiseaseattransplantationandextensivechronicgraftversushostdisease(GVHD)happenedinassociationwithLNIPC.However,othertransplantationrelatedfactorsincludingageattransplantation,genderofpatient,conditioningregimen,HLAmatchingandGVHDprophylaxiswerenotsignificantlycorrelatedwiththeincidenceofLNIPC.Itisconcludedthatperformingpulmonaryfunctiontest(PFT)andthoraciccomputertomographyshouldbetakenroutinelyaftertransplantation.MostpatientswhogetcorrectandearlydiagnosisforLNIPCwillshowapositiveresponsetoprednisonewithorwithoutCsA.

Keywordsallogeneicperipheralbloodstemcelltransplantation；lateonsetnoninfectiouspulmonarycomplications；graftversushostdisease

迟发性非感染性肺部合并症（lateonsetnoninfectiouspulmonarycomplications,LNIPC）是造血干细胞移植晚期主要的合并症之一，文献报道其发病率为3%-23.7%［1-3］。迄今为止，这方面的报道多限于异基因骨髓移植（alloBMT），而异基因外周血干细胞移植（alloPBSCT）后LNIPC发生情况的报道尚不多。为此，我们对2000年1月到2004年12月间在我院进行alloPBSCT后患者发生的迟发性非感染性肺部合并症进行总结分析。

材料和方法

病例

2000年1月到2004年12月70例患者接受了alloPBSCT，7例死于移植早期并发症，其余63例存活超过3个月者入选本研究。患者中男性53例，女性10例，中位年龄31（13-46）岁。63例中急性髓系白血病（AML）20例，急性淋巴细胞白血病（ALL）17例，慢性粒细胞白血病（CML）20例，非霍奇金淋巴瘤（NHL）4例，骨髓增生异常综合征难治性贫血（MDSRA）1例，多发性骨髓瘤（MM）1例。移植时疾病状况：缓解状态41例（65%），包括：AMLCR113例，ALLCR113例，CML慢性期13例，NHLCR2例；未缓解或部分缓解22例（35%），包括AML，难治性或未缓解或≥CR27例，ALL髓外未缓解或CR24例，CML加速期5例，急变期1例，不典型慢粒1例,NHLPR或NR2例，MDSRA1例，MMⅢ期，PR1例。供者情况：HLA完全相合同胞供者51例（81％），HLA完全相合非亲缘供者7例（11％），单倍相合亲缘供者5例（8％）。

预处理方案

52例患者采用改良的CY/TBI方案，其中4例非亲缘供者和单倍相合亲缘供者移植在原方案基础上加用ATG（3mg/kg×4天）；10例患者采用改良的BU/CY，其中8例非亲缘供者或单倍相合亲缘供者移植在原方案基础上加用ATG（3mg/kg×4天）；1例MM患者采用马利兰（4mg/kg×2天）氟达拉宾（30mg/m2×4天）CTX（30mg/kg×2天）。

移植物抗宿主病（GVHD）的预防

60例采用环孢菌素A(CsA)骁悉（MMF）短疗程MTX，3例采用CSA骁悉（MMF），其中有6例非亲缘供者移植和单倍相合亲缘供者移植加用了CD25单克隆抗体。

造血干／祖细胞的输注

输注的单个核细胞（MNC）数为（6.38±1.02）×108／kg，多数病例在输注后3天开始给予GCSF皮下注射，以加速造血重建。

LNIPC的诊断及治疗

迟发性非感染性肺部合并症的诊断依据为：移植3个月后经标准的细菌、病毒及其他致病微生物的培养与检测无感染证据，但临床出现咳嗽、气喘、呼吸困难等非特异性的临床表现，CT检查发现边界清楚的密度增高影、不规则的片状实变影和毛玻璃样改变，或双肺弥漫性浸润性阴影，特别是肺功能检测（PET）的明显异常(主要表现为第1秒用力呼气量／用力肺活量（FEV1/FVC）<70%)。治疗采用强的松1-2mg/（kg·day）或甲基强的松龙2mg／（kg·day）复合或不复合CsA。

合并肺感染的诊断及治疗

肺感染主要依据患者的发热、咳嗽、咳痰、肺部啰音等临床表现及影象学检查，特别是病原学检查结果确立临床诊断。对于格兰阳性菌感染，按经验性治疗给予万古霉素头孢他啶或马斯平或碳青霉烯类，格兰阴性菌经验性治疗选用氨基糖甙类头孢他定啶或马斯平或碳青霉烯类，用药48小时无好转，则根据病原学检查结果更换或加用其他抗生素；肺结核采用异烟肼利福平乙胺丁醇吡嗪酰胺利复星5联治疗；真菌感染轻者给予氟康唑口服或静脉滴注，重者给予两性霉素B静脉滴注，自小剂量开始，逐渐增加到15-25mg/day，疗程4-6周；CMV所致间质性肺炎（CMVIP）给予更昔洛韦5mg/kg，12小时1次，疗程3-6周。

统计方法

所有数据用Stata5.0统计软件进行处理，应用χ2检验分析各因素与LNIPC的关系，设P<0.05为具有统计学显著差异。

结果

移植结果

63例患者的中位随访时间为328（157-1668）天，其中10例（14％）发生Ⅲ-Ⅳ度急性GVHD，6例（8.6％）发生广泛性慢性GVHD，9例（12.9%）发生LNIPC。4例发生LNIPC者未合并感染，经治疗全部存活；5例合并感染者，4例死亡，病死率为6.4%(4/63)。

LNIPC

4例患者依照临床表现、胸部CT、肺功能、血气分析等检查诊断为LNIPC，经激素复合或不复合CsA治疗均获治愈。

LNIPC叠加感染性合并症

共5例，均有慢性广泛性GVHD。1例慢性髓系白血病加速期患者，移植后经肺功能及CT检查诊断为LNIPC，3年后出现发热、咳嗽，痰培养发现白色念珠菌，口服氟康唑治愈。另1例慢性髓系白血病加速期患者，诊断LNIPC后出现曲霉菌肺炎，移植后128天死于呼吸、循环功能衰竭；1例不典型慢性髓性白血病患者发生，LNIPC后合并CMV曲霉菌混合感染经治疗无效于移植后156天死亡；1例急性淋巴细胞白血病患者合并白色念珠菌＋粪肠球菌混合感染（全身败血症的一部分），移植后191天死亡（附图）；再有1例慢性髓系白血病加速期患者，移植后出现超急性GVHD,移植后43天出现急性粟粒型肺结核，经抗痨治疗治愈；后期出现慢性广泛性GVHD及LNIPC，移植后2年因混合性肺炎（细菌＋真菌）而死亡。

危险因素分析

以χ2检验分析各因素与LNIPC的关系发现，移植时疾病处于晚期及慢性广泛性GVHD是发生LNIPC的危险因素(P<0.05)（附表）。病人的性别、年龄、预处理方案的选择、HLA相合程度、输注的MNC数、急性GVHD的发生及程度等均与该并发症的发生无相关关系。

讨论

近年来随着造血干细胞移植技术的不断提高，与移植后的长期存活及患者的生活质量密切相关的移植晚期并发症越来越引起临床医生的重视。移植后肺部合并症的发生率高达40％-60％［4］，是alloHSCT的主要并发症，其中迟发性非感染性肺部并发症（LNIPC）的概念由Palmas等［2］在1998首次提出，为移植晚期主要合并症之一，多危及生命，降低生活质量。患者往往由该病直接或间接继发感染而死于进行性的呼吸衰竭。迄今为止，该病的病因尚不明确，多认为与慢性GVHD的发生及GVHD的预防等有关［1,2］。Duncker等［3］指出，该种肺损伤与介导慢性GVHD的异体活性T细胞相关，用免疫抑制剂治疗有效。Cooke等［5］进一步在小鼠模型中证实了这一观点。有关LNIPC的病理分型尚无统一标准，综合相关文献主要为如下3类［2,6,7］：①闭塞性细支气管炎（bronchiolitisobliterans，BO），表现为终末性、呼吸性细支气管内多发性肉芽组织栓塞，诊断主要依靠PFT,最大通气量<预计值的80%、第1秒用力呼气量占用力肺活量的比值（FEV1／FVC）<70%可确立诊断；②闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎（bronchiolitisobliteranswithorganizingpneumonia,BOOP）；③间质性肺炎（IP）（也有作者称此阶段为特发性肺炎）。后两种病理类型的诊断需依靠支气管肺泡灌洗、经支气管肺活检等活体组织检查来实现。

不同研究单位得出的与该并发症相关的危险因素包括:慢性GVHD,慢性髓系白血病,包含马利兰的预处理方案,MTX和激素的GVHD预防方案,CsA的减量方式等,其中对慢性GVHD与LNIPC关系的看法最为一致［1-3,8］。更有作者［1］进一步指出，慢性GVHD中尤以唾液腺受累者更易发生LNIPC，而非以皮肤和肝脏病变为主要表现者，并推测其可能机制为供者的T淋巴细胞攻击受者的腺体，导致气道干燥，免疫球蛋白分泌减少所致。

对LNIPC的治疗主要采用免疫抑制剂，但对BO效果欠佳；导致患者死亡的原因多为进行性的呼吸衰竭。比较发生LNIPC和未发生LNIPC者的生存情况，并未发现显著差异，由于前者往往存在慢性GVHD，而慢性GVHD又与较强的GVL（移植物抗白血病效应）相关，故复发率有所降低［1］。

本研究中LNIPC的发生率为12.9%,与文献报道的3%-23.7%一致。移植前疾病未完全缓解状态及慢性广泛性GVHD是其发生的主要危险因素。4例发生LNIPC而未合并感染者，经治疗全部存活；5例合并感染者，4例死亡，病死率为（4/5）。我们的经验显示，较早诊断且未并发感染者，经激素复合或不复合CsA治疗，多数患者能治愈；就诊时即出现较重的呼吸道症状、血气分析示血氧饱和度下降、PFT明显异常、影象学检查呈肺间质弥漫性改变者易继发肺部感染，即使治疗后得到暂时缓解也会再次复发，我们的5例患者中就有4例死亡。通过肺组织活检获得病理学结果被认为是诊断LNIPC的金标准，但因其创伤性缘故，该项检查应用受到一定程度的限制，在这种情况下，PFT及CT等影像学检查对该病的诊断尤为重要。我们认为，移植后需定期进行CT、PFT检查，一旦出现异常即早期进行支气管镜肺泡灌洗、在支气管镜或CT引导下进行肺组织病理类型等检查，及时治疗，这对改善患者预后有重要意义。该类患者一旦得到及时救治，往往因为相关的GVL作用而生存期延长。

【参考文献】

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干细胞范文篇6

【关键词】神经干细胞；2型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力

绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一种新的报告基因，由于其表达产物GFP可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如β2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在GFP的基础上进行F64L和S65T的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），EGFP增强了GFP的荧光性能，更容易观察、检测［1］。2型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体DNA介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体［2］。随着神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）的分离、培养、纯化及生物学功能研究深入［3～5］，寻找NSCs基因修饰载体及标记分子，已成为研究NSCs在体内、外分化调控和细胞工程基因治疗中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。

1材料与方法

1.1病毒载体rAAV-2/EGFP购于863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为5×1011v.g/ml。

1.2神经干细胞分离、培养、鉴定［6］按参考文献进行，体外分离胚胎大鼠大脑额叶皮质、悬浮培养，经Nestine鉴定为神经干细胞（见图1），作为实验细胞株。

1.3主要试剂、仪器DMEM/F12培养液、胎牛血清（HyClone公司产品）；表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）（SIGMA公司产品）；兔抗巢蛋白Nestin抗体、罗丹明标记山羊抗兔二抗（北京中杉金桥公司产品）。相差倒置显微镜（Cannon）、倒置荧光显微镜（Nikon）、细胞计数板、CO2培养箱、超净台、流式细胞仪（BD）。

1.4rAAV-2/EGFP体外转染神经干细胞

1.4.1分组取生长良好的NSCs，机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制备成单细胞悬液，以1×105个细胞/孔接种于4块6孔培养板中，分别按感染复数（MOI）（v.g/cell）=0、1×104、1×105、1×106转染，设四组，其中MOI=0作为未转染对照组。

1.4.2转染转染时先按MOI值计算所需加入rAAV-2/EGFP病毒载体的体积数，在试管中将所需加入rAAV-2/EGFP病毒载体与DMEM/F12培养液混合形成转染液，将每组对应孔中加入相应的2ml转染液，MOI=0作为未转染对照组，同样操作但不转染rAAV-2/EGFP，37℃，5%CO2培养箱培养2h后，1000r/min离心5min，如此DMEM/F12清洗细胞2次，弃病毒残液，补充完全细胞培养液（DMEM/F12加2%B27，20ng/ml的EGF、bFGF）5ml，37℃，5%CO2培养箱培养，常规换液、传代。在倒置荧光显微镜下观察、记录rAAV-2/EGFP转染NSCs后EGFP的表达情况。

1.5rAAV-2/EGFP体外转染对神经干细胞存活、增殖、分化的影响rAAV-2/EGFP转染NSCs后，各组分别在7、14、21天细胞传代时台盼兰拒染法检测细胞活力、细胞计数计算增殖倍数。0.2%台盼兰溶液与细胞悬液混匀，死细胞着色，而活细胞不着色，计数活细胞数及死细胞数。细胞活力为活细胞数/（活细胞数＋死细胞数）。EGFP表达稳定时，10％胎牛血清诱导各组NSCs克隆球分化，观察分化情况。

1.6流式细胞仪检测基因转染率和表达效率［7］rAAV-2/EGFP转染NSCs后，各组在各相应的时间点细胞机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制成单细胞悬液，上流式细胞仪（BD），以未转染组为对照，激发光为488nm、吸收光为530nm，进行数据获取与分析；分析结果用转染率和荧光指数（fluorescentindex，FI）表示。转染率即EGFP阳性细胞的阳性率，荧光指数主要反映了目的基因的表达效率。

每一样品收集1×104个细胞，根据细胞大小设定一个单细胞区域，该区域的细胞用于荧光分析。以未转染组的细胞作为阴性对照，设定GFP阳性细胞区（M1区）使阴性对照M1区细胞数不超过0.1%，流式细胞仪分析结果用转染率和荧光指数FI表示。转染率即为GFP阳性细胞阳性率，FI主要反映了目的基因的表达效率，分别用下列公式计算：转染率=样品M1区细胞百分率－阴性对照M1区细胞百分率；FI=样品M1区细胞百分率样品×M1区平均荧光强度－阴性对照M1区细胞百分率×阴性对照M1区平均荧光强度。在上述两个公式中，减数很小，一般情况下可忽略不计。

1.7统计学处理各组数据均用x±s表示，组间比较用单因素方差分析，实验数据用统计软件SPSS11.0进行统计学处理。

2结果

2.1rAAV-2介导的EGFP基因在NSCs中的表达rAAV-2/EGFP转染NSCs，10天后EGFP开始表达，倒置荧光显微镜下可见各转染组神经球受蓝色光激发产生的呈团块状的绿色荧光，但较弱且强度不一，总体上感染复数越大荧光越强；随后表达显著增加，21天时达高峰，这时荧光较强（见图2），表明细胞球中多数细胞被转染并成功表达EGFP，细胞继续传代培养，仍可见大量荧光。

2．2rAAV-2对神经干细胞活力、增殖、分化的影响不同MOI的rAAV-2转染组和未转染对照组的NSCs在倒置显微镜下观察，均生长良好，细胞透光性好，形态完整，细胞碎片少，NSCs形成克隆球速度相当，细胞稳定性好，可连续传代，各组细胞在7、14、21天台盼兰拒染法检测细胞活力差异均无显著性（P＞0.05）（见表1）。同时各组细胞在7，14，21天细胞计数从而计算增殖倍数，转染组与未转染对照组在相应时间点差异亦无显著性（P＞0.05），并在培养过程中呈指数生长趋势（见表2）。表1rAAV-2转染对NSCs活力的影响注：均为同一时间点转染组和未转染组对照比较，组间比较P＞0.05，差异无显著性表2rAAV-2转染对NSCs增殖倍数的影响注:均为同一时间点转染组和未转染对照组比较，组间比较P＞0.05，差异无显著性。

EGFP表达稳定时，10％胎牛血清诱导各组分化后，各组均可见神经干细胞克隆球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中6h左右细胞克隆球贴壁，12h后即发现有突起从团块边缘长出，24h后见有少数细胞从克隆球的边缘向外迁移，分化为有突起的细胞，有的细胞迁移速度较快，以后分化的细胞逐渐增多，从克隆球周围迁移出，呈放射状排列，随着时间的推移，突起不断增粗与延长并互相连接成网状，1周以后，各组NSCs克隆球几乎完全分化，形成大量胞体呈圆形或椭圆形、具有1～2细长突起的神经元样细胞和胞体较大、形态不规则、具有多个粗突起的星形胶质样细胞。MAP-2、GFAP免疫荧光分别鉴定分化细胞，荧光显微镜下各组均可见MAP-2阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。rAAV-2转染的神经干细胞不仅可以分化为神经元和胶质细胞，细胞形态保持正常，且转染不影响神经元和胶质细胞的分化比例。各组MAP-2、GFAP阳性细胞比例见表3，差异均无显著性（P值均＞0.05）。表3不同MOI转染组和未转染对照组MAP-2、GFAP阳性细胞的比较注：组间比较P>0.05，差异无显著性

2.3rAAV-2对神经干细胞的转染效率EGFPEGFP开始表达后，于14、21、28天流式细胞仪检测各MOI的rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率（见表4）：可见21天为其表达高峰，此时MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%（见图3），荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06。表4不同MOI的rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率

3讨论

近年来，神经干细胞的研究发展迅速，但仍存在许多问题，如细胞移植时常常不能区别供体细胞与宿主细胞，不能较精确地观察植入细胞的存活及生长分化情况，也就难以对脑内移植的功效作出一个客观评价。随着基因工程技术的发展，人们可根据不同的科研及治疗目的，对神经干细胞进行不同的遗传学修饰，以期制成基因工程细胞，这些细胞极具科研和应用价值，受到广泛关注。病毒载体和非病毒载体是目前基因修饰中常用的两大类载体。非病毒载体有脂质体、质粒、分子偶联载体等，基因转移效率低。病毒载体应用最广泛，约占85%，其中腺相关病毒、逆（反）转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒是基因治疗中最常用的4种病毒载体，病毒载体安全性问题至关重要［8］。各种病毒载体都有自己的优点和不足，但是逆（反）转录病毒是随机整合入宿主DNA、可能会引起“插入诱变”、也有可能产生具有复制能力的病毒［9］；腺病毒不能整合到宿主染色体DNA上，表达时间短暂，所以不能持续表达所需产物，且可能刺激免疫反应［10］；单纯疱疹病毒对人类具有明显的致病性，能够从潜伏状态激活［11］。而AAV-2是一种单链的微小DNA病毒，需要辅助病毒才能有效地复制，具有与人类疾病无相关、宿主范围广，并能整合入宿主细胞DNA，去除其复制蛋白Rep和包装蛋白Cap基因,仅具有感染宿主的功能,安全性较高,成为较理想的基因修饰载体,倍受瞩目。其具有下列优点:目前尚未发现该病毒在人体中致病,所以比较安全；感染宿主细胞广泛,包括非分裂细胞和分裂细胞,特别是神经元和神经胶质感染性较强；能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减小了插入突变激活原癌基因的可能性，rAAV虽然失去了整合特异性，但反向末端重复序列中没有转录调控组件，因而减少了插入突变的可能性；外源基因表达稳定，可长达2年［2，12］。NSCs具有自我复制、增殖分化的能力，是基因修饰、基因治疗的靶细胞。

AAV-2能否有效地转染神经干细胞，且转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等有无影响，值得探讨。因为如果转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等天然性能产生影响，都会对细胞、机体造成严重后果，那么将会极大地限制其在基因修饰、基因治疗方面的应用。许多学者采用AAV转染神经干细胞，得到的结果各不相同。Hughes等［13］研究认为rAAV-2对神经干细胞球略有效率低下的转染能力，其仅观察5天转入基因的表达情况，而腺相关病毒转染细胞后基因表达的高峰期为1个月左右，转入基因5天时可能没有表达或者表达量很少。本实验分离培养了大鼠胚胎源性神经干细胞，用rAAV-2/EGFP转染NSCs，对其进行基因修饰，我们的结果提示：转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等未产生影响，rAAV-2对神经干细胞没有毒性作用，不影响神经干细胞的生物学特性，是神经干细胞间接体外法基因治疗的理想载体；MOI=1×104、1×105、1×106转染10天后，EGFP开始表达，荧光显微镜下可见弥漫于整个NSCs克隆球中的绿色荧光，起始表达强度不一，随MOI值的增大而增强，而且EGFP的表达强度随着时间的延长而逐渐增强，至转染后第21天达到高峰并维持,此后荧光指数不再增大；此时行流式细胞仪检测：MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%,荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06。仅以转染率不能够全面衡量一个基因载体的转移效率，无法反映多拷贝基因转移，也不能反映目的基因的表达效率。荧光指数能更为全面地反映基因转移和表达效率；以GFP基因为报告基因，用流式细胞仪分析基因转移效率（转染率和荧光指数）优于传统人工计数法，并且还可用流式细胞仪进一步筛选表达EGFP阳性的细胞。AAV是通过靶细胞膜上的表面肝素聚糖蛋白（surfaceheparinproteinofglycans,SHPG）为受体介导转染的［14］，而受体的数目和功能是有限的，当AAV与受体结合达平衡时，发挥最大生物效应，再增大MOI也不会提高转染效率。因此我们可以解释rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率随MOI值的增大而增强，但MOI为1×105、1×106转染效率相差不大，可能是AAV与受体结合达到了平衡，转染达到了稳定，结合实验经济因素，因而MOI=1×105为最佳MOI。另外，还有可能是由于神经干细胞AAV受体表达强弱、培养方法、转染时间、检测方法的不同等因素，引起不同学者实验研究结果上的差异。

GFP相对分子质量小，这也是它作为报告基因的一大优点；GFP与目的基因融合后对目的基因的结构功能没有影响，大量表达对细胞也无毒性作用。在我们的研究基础上，将rAAV-2/EGFP与一些促进NSCs存活和定向分化的营养因子，如GDNF、VEGF等目的基因构建成融合基因，以GFP基因为报告基因，rAAV-2为载体，一起转染移植的NSCs，不需用其他检测方法，只需荧光显微镜下观察GFP的表达情况，便可针对另一基因作相关研究，将对中枢系统的研究手段有更好的应用价值。

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干细胞范文篇7

【摘要】目的探讨自体骨髓浓缩干细胞在股骨颈骨折中的成骨作用。方法在加压螺纹钉固定股骨颈骨折的基础上，取骼嵴骨髓血进行分离浓缩，获得的浓缩干细胞注射到骨折处。结果63例股骨颈骨折57例得到随防，骨折均愈合，有2例出现股骨头坏死。结论骨髓浓缩干细胞有明显的促进骨折愈合作用。骨折类型、复位效果对股骨头坏死影响较大。该方法简单、易操作，有推广价值。【关键词】骨折；浓缩骨髓干细胞；移植TheTreatmentofFemoralNeckFracturebyConcentratesStemCellsfromtheBodyMarrowSONGJianhua，ZHONGWei，LIANGJinfeng(1.DepartmentofOrthoptaedics，SonggangPeople′sHospital，Shenzhen518105，China；2.DepartmentofOrthopaedicsthePeople′sHospitalofBaoanDistrict，Shenzhen518100，China)Abstract：ObjectiveTodiscussthetreatmentoffemoralneckfracturebyconcentratesstemcellsfromthebodymarrow.MethodsAfterthreadcompressionnailsfixedfemoralneckfracture，theiliaccrestmarrowbloodwastakentocarryontheseparationconcentration，Theconcentrationstemcellswasinjectedtofractureplace.Results57casesof63femoralneckfracturewerefollowedup.2casesoffemoralheadavascularnecrosisoccured.ConclusionBonemarrowconcentratesstemcellsboostboneunionobviously.Femoralheadavascularnecrosiswererelatedtofracturetype，replacementeffect.Thismethodissimple，easytohandleandisworthytoextended.Keywords：bonefracture；concentrationmarrowcell；transplant随着股骨颈骨折治疗方法增多，出现骨不连和股骨头坏死概率呈下降趋势，由于治疗手段、复位情况、个人技术的不同，各家报道的发生率都不一样。寻求一种治疗股骨颈骨折、避免骨不连和股骨头坏死的有效方法是目前临床研究的热点。近年对骨髓干细胞进行了不少的研究，干细胞的成骨作用得到了肯定［1～3］。临床上也有用骨髓干细胞治疗骨不连的报道［4］。但直接用抽取的骨髓血注入骨不连处，干细胞浓度低，需多次注入，成骨作用显然受到一定影响。如将骨髓干细胞进行浓缩再注入骨折处，成骨作用将大大提高。我院自2002年2月至2006年6月采用加压螺纹钉固定自体骨髓浓缩干细胞治疗股骨颈骨折63例，在这方面进行了一些研究，取得满意效果。1临床资料1.1一般资料本组63例，男41例，女22例；年龄15～30岁22例，31～59岁23例，60～82岁18例，平均40.6岁。Garden分型：Ⅰ型9例，Ⅱ型23例，Ⅲ型21例，Ⅳ型10例；其中车祸伤24例，坠落伤25例，摔伤14例。均采用加压螺纹钉固定。Ⅰ型用1枚螺纹钉固定，Ⅱ～Ⅳ型用2枚螺纹钉固定，入院后完善检查后即行手术治疗，陈旧性骨折1例。Ⅰ型病例在手术同时进行骨髓浓缩干细胞移植，Ⅱ～Ⅳ型固定后5～7d行骨髓浓缩干细胞移植。1.2手术方法及术后处理骨髓干细胞浓缩操作技术：在全麻或连续硬膜外麻醉下，于双侧髂前上棘或骼后上棘消毒，铺无菌巾。用内径1.5mm、长6～8cm穿刺套针穿至松质骨，用20mL的塑料针管抽吸骨髓。在抽吸的过程中，每次将刺针斜面转动60°，每次抽4mL左右。完成一整圈的转动抽吸后，再进针1.5cm，同样的旋转方式吸取骨髓，一个进针点可有几个穿刺方向。可在距原穿刺点4cm处重新穿刺抽吸直至每侧抽吸75mL左右骨髓血。抽出的骨髓血放在一个有抗凝剂(内含15000U肝素)的无菌袋中。利用密度梯度离心原理对抽集的骨髓血进行快速细胞分选，速度为3000r/min，离心5min，离心力可将较重的多核细胞置于周边，便于从剩余物中分离和收集。无核细胞由于质量较轻而位于中间，将其消除。获取的淡黄层除骨髓干细胞外，还包括其他一些单核细胞，其中一些细胞可能是对临床有用的血管生成素和成骨细胞活素的来源［5］，每150mL骨髓血可收集浓缩干细胞30mL。手术方法：在硬膜外麻醉下，病人平卧在骨科牵引床上，在C型臂X线机透视下，边牵引边复位，患肢内旋15°，一定要透视证实复位效果好；两骨折端移位不超过1/5，个别游离骨块不强求复位，颈干角要求达到正常角度。常规消毒、铺巾、取外侧切口，长5～7cm。切开皮肤，逐层分离达股骨，剥开骨膜。在大转子顶点下3cm左右，用配套的导针，按照颈干角130°～135°的角度向股骨头方向旋入，沿导针攻丝后，拧入长度合适的加压螺纹钉，钉尖部达头下0.5cm。另在第1颗螺纹钉下方1cm处并与之平行的方向再钻入第2根导针，同样方法拧入加压螺纹钉。C型臂X线机透视螺纹钉位置和复位情况，务必达到上述复位标准，螺纹钉要固定在位。如果是Ⅰ型骨折的病人，采集干细胞和内固定手术同时进行。在做内固定前先采集骨髓，送到另一间手术室进行分离收集，待手术做完马上将采集到的骨髓浓缩干细胞30mL注入到骨折处。如果是Ⅱ～Ⅳ型骨折，因出血较多，马上行干细胞移植会加重关节囊内压力。5～7d后出血停止、血肿开始吸收，再行干细胞移植为宜：即在5～7d后把病人送到手术室，按上述方法采集骨髓干细胞，将收集的骨髓干细胞30mL在透视下一次注入骨折处。髓象分析：数字数据通过均数和标准差的形式表达，设定P＜0.05为差异有统计学意义，采用多变量分析手段对个体间的性别、年龄与干细胞间的相关性通过spearman相关检验来获得。每个病人抽取骨髓数量平均为150mL，不同个体间骨髓内的有核细胞数目在100～2400万/mL之间。结果是干细胞的数量与性别无关(P＝0.26)，但随着年龄的增大而逐渐减少(P＝0.03)，男性干细胞和年龄无相关性(P＝0.28)，而女性随年龄增长而出现显著的下降(P＝0.04)。术后处理：术后所有病例不牵引。Ⅰ、Ⅱ型骨折病人术后可在床上活动，Ⅲ、Ⅳ型骨折病人不主张术后马上活动，可作被动的轻微活动，2周后在床上主动活动。Ⅰ型病人8周后撑拐下床活动，3个月弃拐下床活动；Ⅱ型病人3个月撑拐下床活动，6个月弃拐下床活动；Ⅲ、Ⅳ型病人4～5个月撑拐下床活动，8～9个月弃拐下床活动。前3个月每个月摄1次片，2～10个月每两月摄1次片，1年后每半年摄1次片。2结果有57例得到随防，随防时间1年至5年，平均3年8个月。骨折愈合时间：2～3个月愈合16例，4～5个月愈合17例，6～7个月愈合15例，8～9个月愈合9例。有2例虽然骨折愈合但分别在1年6个月和2年后出现股骨头坏死，均为Ⅳ型骨折，有游离骨块，骨折端移位1/5。坏死的标准是股骨头密度增高不均匀、塌陷。按Harris标准进行评分，优36例(63.2％)，良19例(33.3％)，差2例(3.5％)，优良率达到96.5％。3讨论骨髓干细胞的成骨作用国内外都作了不少的研究，结果是肯定的［1～3］，如果抽吸的骨髓血直接注入到骨折部位，干细胞的浓度低，成骨作用受到一定影响。Connolly等［6］经过动物实验指出骨髓的成骨能力和骨髓细胞浓度存在正相关，临床研究也证实干细胞浓度控制在1000/cm3以上是很有必要的［7］。我院运用骨髓干细胞浓缩技术治疗股骨颈骨折经5年的随防，结果也证实这一点。57例随防病人中骨折均愈合，骨折愈合时间明显缩短。潘显明等［8］报道82例股骨颈骨折愈合时间最早3个月，而本组最早只有2个月，提前1个月愈合。有1例右侧陈旧性股骨颈骨折的病历较典型。患者男性31岁，在外院手术12d复查，螺纹钉脱落，骨折端移位，到我院就诊，考虑到股骨颈短缩，转我院治疗后即行切开复位带旋髂深血管蒂髂骨瓣移植加螺纹钉内固定术，但术中不慎损伤旋髂深动脉，只好将髂骨块植入到骨折端之间，加长股骨颈。众所周知，股骨颈骨折本身就难以愈合，更何况此病例在骨折端加入无血运的骨块，更是难以愈合。术后我们通过3次注入浓缩的骨髓干细胞到骨折处，9个[1][2]月复查X线片见骨折已基本愈合，并取出内固定，遗憾的是此病例失去联系，没有得到继续随访，以后股骨头是否坏死就不得而知了。此例病例说明一点，在常规下不能愈合的骨折在用干细胞治疗后，竟然愈合了，说明骨髓干细胞有明显的成骨作用。本组随防57例病人中有2例出现股骨头坏死，坏死率3.5％，比文献上报道的21％［9］和青壮年组86％、老年组10％～42％低得多。我们在没有进行浓缩干细胞治疗之前，只作单纯加压螺纹钉固定病例54例，股骨头坏死率达18％，比用干细胞治疗的股骨头3.5％的坏死率高得多，有显著的统计学意义(P＜0.001)。股骨头的血运主要依靠骨内的血管网而无骨膜下血管供应。骨折愈合时间越早，为股骨头血运的重建提供了可靠的保障。而骨髓内的干细胞和血管生成素也能促进骨折处的血管再生，这些因素都可能是本组股骨头坏死发生率低的原因之一。本组病例在术后最早是在8周后才撑拐下床活动，而且X线片提示骨折线已模糊，负重活动要在骨折线基本消失后才能进行。胥少汀等［10］用X线图像分析方法发现股骨头在愈合过程中曾经处于坏死状态的发生率为87％。所以即使骨折开始愈合股骨头仍处于缺血状态，过早的活动对于尚无生机的股骨头是致命的损害。张永飞等［9］对非负重下活动的病例进行观察，股骨头仅发现有骨质疏松，无典型头下囊性变、塌陷等情况。股骨头坏死都发生在股骨颈骨折愈合后负重行走时才开始。但也有主张固定后即下床活动。有学者报道用三刃钉治疗112例，结果分成两组，一组术后2周负重57例，另一组术后12周负重55例，随防3年以上，股骨头坏死无差别。这可能是三刃钉固定股骨颈血管损伤大，2周与12周股骨头血运都难以建立的缘故。我们的经验还是要根据骨折愈合情况决定下地活动的时间，不宜太早。2例股骨头坏死都属Ⅳ型，有骨碎片，复位难度大，移位达1/5。Ⅳ型骨折暴力大，骨折处呈粉碎性，血管损伤重，关节囊内出血多，1周内注射干细胞可能受到一定影响，再加上复位不良，角度也可能出现旋转，改变了骨小梁的应力方向，在负重后尚未重塑应力的骨小梁不能承受身体的压力而出现塌陷。陆维举等［11］分析的影响骨折愈合因素：骨折类型(P＝0.0003)，其后依次是复位质量(P＝0.004)，内固定质量(P＝0.032)，年龄(P＝0.047)，复位差对股骨头坏死起到至关重要的作用，本组病例也证实了这一结果。其他因素相同的情况下，良好复位、有效可靠的固定是治疗股骨颈骨折的基本条件。骨折愈合与干细胞的数量有关，干细胞的数量与年龄、性别也有一定的关系。随着年龄的增长，干细胞会逐渐减少，在青春期骨生长旺盛，骨髓中的干细胞较多，青春期后随着生长停止而减少。但男性下降较慢，而女性比较明显，这可能与绝经前后雌激素水平下降而出现骨质疏松有关。但本组未发现男女各年龄组在骨折愈合上有明显的差异(P＞0.05)，这可能与老年组股骨头坏死率较低、弥补了老年组干细胞数量相对不足有关。骨髓干细胞浓缩技术治疗股骨颈骨折，技术要求不是很高，操作也较简单，取材容易，对身体也没有太大影响，有推广价值。但本组在干细胞移植的时间、剂量上没有对照组，还有待进一步研究。在不同的骨折类型，对干细胞的保留情况不是很了解。如何更好地预防股骨头坏死，出现股骨头坏死应采取什么样的补救措施，都有待进一步探讨。【参考文献】［1］WerntzJR，LaneJM，BursteinAH，etal.Qualitativeandquantitativeanalysisoforthotopicboneregenerationbtmarrow［J］.JOrthopRes，1996，14(1)：8593.［2］BoehmCA，MuschlerGF.Rapidconcentrationofbonemarrowderivedosteoblasticpropenitorcell(CFUOs)inallograftbonepowder［J］.JBoneMinerRes，1999，14(SupplD)：474.［3］ConnollyJF，GuseR，TiedemanJ，etal.Autologousmarrowinjectionasasubstituteforoperativegraftingoftibialnonunions［J］.ClinOrthop，1991(266)：259270.［4］梁雨田，张伯勋，卢世璧，等.经皮自体骨髓移植治疗骨折愈合［J］.中华骨科杂志，1999，19(12)：709711.［5］TateishYuyamaE，MatsubaraH，MuroharaT，etal.Therapeuticangiogenesisforpatientswithlimbischanmiabyautologoustransplantationofbonemarrowcells：apilotstudyandarandomisedcontrolledtrial［J］.Lancet，2002，360(9331)：42735.［6］ConnollyJ，GuseR，LippielloL，etal.Developmentofanosteogenicbonemarrowpreparation［J］.JBoneJointSurg(Am)，1989，71(5)：684691.［7］吴浩波，严世贵.经皮自体骨髓移植治疗骨不连［J］.骨科动态，2006：4249.［8］潘显明，胡修德，谭映军，等.82例青壮年股骨颈骨折治疗结束的评价［J］.中华创伤杂志，2003，16(3)：145147.［9］张永飞，张义修.股骨颈骨折术后股骨头坏死的力学因素［J］.骨与关节损伤杂志，2001，16(4)：270272.［10］胥少汀，刘树清.股骨头坏死图像分析的类型和转归［J］.中华骨科杂志，1995，15(3)：165167.［11］陆维举，许斌，赵建宁，等.股骨颈骨折内固定后骨不连、头坏死的因素分析［J］.中华创伤杂志，1998，14(2)：104105.

干细胞范文篇8

【摘要】本文对本世纪以来干细胞治疗糖尿病的若干研究，包括胰岛的体内发育、分化及其标志物，以及应用胰导管干细胞和胚胎干细胞进行定向诱导分化为胰岛对糖尿病进行细胞治疗的实验进行了综述。随着干细胞技术的不断完善，人类最终能治愈糖尿病。全球糖尿病（diabetesmellitus，DM）患者约1.25亿（我国也已达4000万，预计2025年将达3亿［1］，已成为严重危害人类健康的重大疾病之一，特别是久病引发的多系统损害，及最终的肾功能衰竭。DM发病机制复杂，涉及遗传、环境、免疫调控和化学因子。自1922年发现了胰岛素至今，DM的治疗以药物和注射胰岛素为主，目前，学者们开始关注经胰岛移植恢复患者体内代谢紊乱的方法，但因组织来源匮缺，制约了胰岛移植研究的开展，因此寻找合适的胰岛移植物的研究便成为了当务之急。随着分子、细胞和发育生物学技术的进展，增加了干细胞定向诱导分化成胰岛的可能性但由于这一技术还处于实验室的实验阶段，而且方法也并不统一，因此有必要将近期研究进行汇总，希望能对在这方面进行研究的同僚们有所帮助。1胰岛体内的形成、发育、分化与鉴定

1.1胚胎胰岛分化胚胎胰岛的分化分4个阶段:（1）胚胎9～10周为零散的多激素细胞阶段;（2）胚胎11～15周为未成熟的多激素阶段;（3）胚胎16～19周为单激素核心胰岛阶段;（4）胚胎30周后为多形胰岛阶段（Bocian，HistochemCellBiol，1999）。在胰岛形成过程中，内胚层细胞形成许多小导管网，其末端膨大部分的细胞团发育为外分泌腺泡，与此同时，一些细胞群或细胞索不出现管腔，卷曲成团并与其他细胞索分离开，分散在腺泡之间，内含丰富的毛细血管网，最后发育成具有内分泌功能的胰岛。

1.2胰岛细胞分化的调节Ferber［2］认为胚胎发育早期的信号源于脊索，后期的信号源于间质，经诱导的胰管上皮细胞增殖分化形成胰岛细胞，但至今为止其诱导因素并无统一认识。

PDX1:一种同源框转录因子（homeoboxtranˉscriptionfactor），即胰十二指肠同源异型盒基因（pa-ncreaticandduodenalhomeobox1），编码胰腺十二指肠同源框蛋白1，又称IPF-1、IDX-1、IUF-1。Lu（Lu，Endocrinology，1996）认为PDX1是胰腺发育及胰岛素基因转录表达的关键性转录因子，即决定于胰腺前体细胞向B、A、D细胞的分化。Mckinnon［3］认为PDX1对于肠内胚层背胰芽和腹胰芽的生长、分化起重要作用。Dutta［4］认为早期胰腺表达的PDX-1对胰腺上皮的形成和分化是必需的。Gu［5］认为所有胰腺细胞均来源于PDX1表达的前体细胞，是最先发现的胰腺发育决定基因，随着胰腺发育PDX1的表达逐渐减弱，如缺失将导致胰腺无法形成。Docherty［6］的研究证实小鼠PDX1基因的纯合子缺失、突变会导致胰腺无法形成。ngn3:ngn3即神经元素3（neurogenin3），是胰腺发育过程中短暂表达的蛋白，可能是胰腺内分泌细胞系的定向因子，且在成熟胰岛中不存在。用PDX1启动子促进转基因小鼠中早期胰腺前体细胞中ngn3表达，会导致内分泌细胞数增加，外分泌胞数减少。ngn3缺失的纯合子小鼠中胰岛细胞和nestin胰岛前体细胞在发育各阶段都缺失［6］。Lee［7］认为ngn3基因与胰岛分化有密切关系，因为ngn3基因缺陷小鼠不能表达胰岛其他特异性转录因子，包括islet1、PAX4、PAX6，而缺乏PAX6、NeuˉroD1、NKN6.1或NKX2.2的动物胰腺中表达ngn3，表明ngn3位于这些因子的上游，且对启动内分泌细胞分化必不可少，而分化后期关闭。Gasa［8］通过表达的腺病毒感染胰腺导管细胞，建立了体外调控分化模型，发现ngn3和N

euroD1活化胰岛分化的基因并不重叠，表明这两个bHLH蛋白在胰岛发育活动中具有不同的功能。Mellitzer［9］通过将cDNA插入到前体细胞的3′端非翻译区，通过EYFP定位NGN-3表达，发现内分泌前体细胞在缺乏间充质信号刺激情况下，可在体外扩增，向内分泌细胞分化为其默认的途径。Leon［10］用抗新霉素基因筛选用含Nkx6.1前体基因质粒转染鼠胚胎干细胞。培养后用筛选Nkx6.1阳性细胞，发现这些细胞分泌胰岛素，注入糖尿病鼠体内可使其血糖恢复正常。

Foxα2:内分泌的关键调控基因是forkhead基因Foxα2。Guo［11］诱导内胚层分化的研究发现，Foxα2可被Foxd3激活，而被Oct4抑制。内胚层分化可通过抑制Oct4表达实现。Foxα2基因关键参与肺、肝、胰发育。缺乏Foxα2基因，鼠不能产生前、中肠内胚层（Ang，Cell，1994）。HNF:HNF4参与肝、肠、胰分化，缺失可致年轻人成熟期发病的糖尿病（Maturityonsetdiabetesmelliˉtusinyoung，MODY1）。HNF1α（TCF1）HNF4或Foα2及Pdx-1双杂合缺失，导致β细胞功能缺陷，提示这些基因构成β细胞发育的基因网络（Yamagata，Nature，1996）。HNF6-/-鼠，腹胰发育缺陷及胆管发育异常，该基因需ngn3激活（Yamagata，Nature，1996）。HNF6还激活Foxα2a基因。

Pax:Pax-4和Pax-6同属Pax基因家族，其在胰腺内分泌细胞分化中起关键作用。Sosa（Sosa，Nature，1997）将Lac-Z插入到Pax基因中作标记，发现Pax-4失活的新生鼠经免疫组织化学法显示缺少β细胞和δ细胞，α细胞排列不规整。Pax-6缺失，α细胞缺如，而胰岛素和生长抑素分泌细胞却可出现（St-Onge，Nature，997）。由此推断出Pax-6是α细胞发育所必需，而非β、δ细胞发育所必需。

Chiang［12］为分析单个胰腺细胞的转录模式，改进了基于PCR的cDNA扩增方法，即将单个胰腺细胞中的cDNA与含有95个常见胰腺细胞表达基因的DNA芯片进行杂交，芯片上的基因包括转录因子，信号传导分子以及对照基因。研究者观察了胚胎10.5d小鼠的胰腺分离出的单个细胞中的基因表达模式。在这个时期上皮细胞的形态均一，而基因表达模式分析可分为6个不同的亚型。I型只表达Pdx1，Nkx2.2和Nkx6.1，II型还表达P48，III型还表达ngn3。因为Pdx1是最早表达的胰腺脏细胞标记蛋白，因此研究者认为I型细胞是最好的胰腺干细胞候选者。II型细胞表达的P48是外分泌胰腺细胞的标记，而Nkx2.2和Nkx6.1是内分泌细胞分化所必须的。研究者根据这些研究结果推测出一个胰腺细胞分化的模型，每一个阶段都对应相应的基因表达模式。此外，成体的胰岛内分泌细胞40～50d更新一次，其过程包括细胞凋亡和胰导管干细胞增殖分化成新的胰岛细胞。给予葡萄糖或高血糖素样肽（Glucagon-likepeptied，GLP1）等促胰岛因子48h后，胰岛细胞数量可增加一倍，说明机体胰岛在一定的条件与需求下进行着不断更新与增殖的（Rosenberg，CellTransplant，1995）。

1.3胰岛前体细胞的标记Jindal（Jindal，TransplanˉtationProceeding，1997）认为胰脏的外分泌细胞和内分泌细胞都来源于具有导管细胞特征的未分化上皮细胞，提示胰导管细胞可能是胰岛的前体细胞。Berger［13］也发现胰腺中存在干细胞，认为胰腺干细胞是胚胎发生中没有进行终末分化的胰腺细胞，具有自我更新和分裂能力。应用HE染色显示该细胞是一种嗜碱性的单核细胞，直径约8μm，呈圆形，细胞核为圆形或肾形，较大，多含2个核仁，染色质细腻而分散，胞质中不含颗粒，在形态上与小淋巴细胞极为相似。近年来的研究揭示了胰岛前体细胞的特异性标记物，这对胰岛前体细胞的提取将有很大的帮助，目前较为公认的特异性标记物有以下几种，还有很多标记物有待于发现。酪氨酸羟化酶（tyroxinehydroxyˉlase，TH）:在大鼠胰腺发生中表现出发育依赖性变化。第16天胚胎的导管细胞可见TH的表达，但成熟的内分泌细胞中却难以检测到TH，胎儿和刚出生幼儿的胰岛细胞和一些导管细胞TH呈阳性。成年大

鼠胰腺中，TH仅在β细胞中表达。TH的这种表达模式可用于鉴别内分泌前体细胞［14］。葡萄糖转运子2（glucosetransporter，GluT-2）:可在大鼠胚胎的背胰芽和腹胰芽细胞中检出，并在胰芽发育中持续表达。孕17d，可检测到细胞内表达GluT-2和胰岛素，以后，这些细胞聚集形成胰岛的β细胞群，而那些将转变成腺泡细胞的细胞不再表达GluT-2［15］。细胞角蛋白20（cytokeratin，CK20）:CK20是成熟胰腺导管细胞的一个特异标志。在胎鼠和幼鼠的导管细胞和内分泌细胞中表达，而在成年动物的导管细胞中有CK20表达则提示能定向分化成内外分泌细胞的胰腺未分化细胞。诱导与导管连接的β细胞再生时，CK20也可在内分泌细胞中表达，显示了未分化细胞分化为内分泌细胞的过程［15］。PDX-1:是β细胞成熟的标志。在哺乳动物中，这种同源域蛋白（homeodomainprotein）是一种调节胰岛素和抑生长素表达的转录因子，也作为胰岛素启动因子-1（IPF-1）、抑生长素活化因子-1（STF-1）和胰岛十二指肠同源域蛋白（IDX-1）而存在。PDX-1也可在尚未形成胎儿胰腺上皮细胞的所有胰岛素分泌细胞中短暂表达（Bouwens，Micros.Res.Tech，1998）。Kit:Kit在胰岛素细胞系中表达，认为在信号转导方面起作用。胎鼠和成鼠的胰岛中均可检测到Kit，经Kit基因表达的标记物gal证实，Kit在胰岛素细胞中特异表达，在其他内分泌细胞和外分泌细胞中不表达［16］。ngn3:ngn3阳性细胞散在于胎鼠胰腺的导管细胞，胚胎15.5d达高峰，成熟胰岛细胞则转为阴性［17］。由于胰岛激素或成熟内分泌细胞不表达ngn3，因此ngn3阳性细胞可作为胰腺内分泌细胞的前体细胞的标记物［18］。波形蛋白（vimentin）:Schmied［19］将长期培养的胰岛细胞去分化得到未分化的导管样上皮细胞，这些细胞可分化成胰腺内外分泌细胞，并限制性表达波形蛋白，所以波形蛋白可作为胰岛祖细胞的分子标志。

但在此需说明的是，最近研究人员用小鼠做了详细的追踪研究，Matthews［20］通过孕鼠及乳鼠喂养不同剂量的维生素A，发现缺乏维生素A，β细胞数量和体积明显下降。ChenY［21］等发现SOCS-1（-/-）鼠感染后外分泌部细胞死亡高于内分泌部，可能γ干扰素或肿瘤坏死因子促进内分泌部增生分化。Gesina［22］通过糖皮质激素治疗通过转基因技术使激素受体缺陷的鼠，发现胰岛素分泌细胞减少是外分泌细胞的2倍，提示糖皮质激素有利于向外分泌分化。表达Pax-1，Pax-6，Nkx6.1处下游调控序列，而paf-1-p48和Hes-1的mRNA增高。选择非活化激素受体基因，在鼠β细胞无明显效果。而对于缺乏糖皮质激素受体，且表达Pdx-1则β细胞群增长加倍。胰岛细胞数量和体积均增大而α细胞除外。提示糖皮质激素在胰腺β细胞分化中具有重要作用。

2诱导干细胞分化为胰岛的研究近况

应用生物工程技术获取胰岛素分泌细胞可从以下几个途径:（1）胰导管干细胞（2）胚胎干细胞;（3）利用基因工程技术。但将这些细胞诱导成胰岛，仅是实验室研究的初级阶段，并不是最终的成果。

2.1胰导管干细胞应用（1）Peck［23］和Ramiya［24］分离、提取出了存在于胰腺导管中的胰岛干细胞，经体外诱导培养形成了胰岛样细胞。（2）Bonner［25］发现角质化细胞生长因子（keratinocytegrowthfactor，KGF）和烟碱（nicotine）对导管干细胞分化为胰岛产生作用。（3）Ramiya［26］从胰腺导管上皮细胞诱导分化得到“产生胰岛的干细胞（isletproducingstemcells，IPSCs）”，这些IPSCs呈较典型的胰岛样结构，并对高浓度葡萄糖有胰岛素释放应答反应，免疫组织化学染色证实有胰岛素和胰高糖素的表达，RT-PCR显示这些

细胞能表达许多胰岛细胞的标志性基因，如胰岛素基因，胰高糖素，生长抑素，GLUT2及谷氨酸脱羧酶等。将分化成熟的胰岛细胞移植到NOD鼠体内，可完全逆转其DM状态［25］。由IPSCs可诱导分化得到“产生胰岛的细胞”（isletproducingcells，IPCs），IPCs可分化成有组织结构的胰岛细胞团，包括A、B、D细胞，表达一系列胰岛标志，分泌胰岛素并受葡萄糖诱导。将这些细胞移植到NOD鼠体内，可稳定其血糖水平。

2.2胚胎干细胞应用（1）Lumelsky［27］采用胚胎干细胞体外扩增后，筛选巢蛋白（nestin）阳性细胞，加入碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）及B27和尼可酰胺，诱导成为能分泌胰岛素的胰岛样结构，将其植入糖尿病鼠体内，可使血糖降低且有血管形成，只是胰岛素分泌量较低。（2）Assady［28］从ES细胞诱导分化得到可分泌胰岛素的细胞，他们的方法是先将ES细胞在有白血病抑制因子（leukaemiainbibitoryfactor，LIF）存在，但无滋养层的条件下培养，此时有PDX1（pancreaticandduodenalhomeobox1）

表达，然后在无LIF的条件下促进ES细胞增殖分化为拟胚体（EmbryoBodys，EBs），再在无血清环境下培养，提高nestin细胞的比例，加入bFGF继续培养，得到类胰岛组织细胞。这些细胞表达145pgμg的鼠胰岛素Ⅰ和Ⅱ，而且其表达受葡萄糖诱导，还表达胰岛淀粉多肽（isletamyloidpolypepˉtide），GLUT2等胰岛细胞标志。但将这些细胞移植入糖尿病小鼠后，未能使其血糖正常化。（3）Soriˉa［29］通过转基因技术将基因插件插入到小鼠胚胎干细胞中，经潮霉素（hygromycin）筛选，获得含上述基因插件的干细胞，扩增后用G418筛选，从而获得纯化的胰岛。

参考文献

1DochertyK.GrowthanddevelopmentoftheisletsofLangerhans:impl

干细胞范文篇9

关键词：神经干细胞临床应用

1NSC的来源

据来源部位的不同，可分为胚胎来源及成体来源，分别称为胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成体干细胞(AdultStemCell，ASC)。ESC来源于胚胎胚泡阶段，即胚胎发育过程中植入于宫壁内之前阶段。ASC来自于成体组织，能在很长一段时间内准确复制自己，进行自我更新，能生长成成体的细胞类型，具有一定形态特征和指定的功能。由于ESC研究与应用面临伦理、宗教、法律、免疫排斥和潜在致瘤性等问题，在实际操作上仍有一定困难。而ASC“可塑性”的发现及相关研究在不同程度上避免了这些问题，是细胞替代治疗和基因组织工程研究的热点之一。

2临床应用

对于神经系统退行性病变及严重损伤，NSC移植有可能替代衰老、变性和死亡的神经细胞，重建神经网络，恢复受损的脑功能。这种治疗方法具有以下的特点：a.NSC在脑中能根据周围环境的诱导而分化成相应的细胞类型，其形态功能与附近原有细胞非常类似。b.免疫源性弱，免疫反应小。c.低毒性，致瘤性弱。

3细胞替代治疗

传统观点认为中枢神经系统神经元的产生只发生于胚胎期及出生后的一段时间，成熟的神经元很难或不能分裂，各种原因造成神经元的变性坏死，其缺失将是永久性的，只能由胶质细胞来替换。

NSCSHASC可朔性的发现，使神经系统疾病的治疗进入了新的时代。细胞替代治疗策略包括：a.利用调控手段刺激、促进内源性NSC更新修复，产生神经细咆替代变性、坏死的神经细胞，从而达到修复神经功能的目的。b.移植外源性和内源性NSC，使其生长、分化为神经元和神经胶质细胞进行修复。需要说明的是这两种方法并非孤立，而是可以同时使用并互相促进的。NSC移植方法包括：a.细胞悬浮液立体定位注射法；b.胶原基质包埋移植法；c.生物材料(PGA、PLA等)吸附移植法；d.静脉内细胞悬液输入法；e.脑室内或腰穿细胞悬液注射法。从来源上看，细胞替代治疗包括以下几方面。

3.1ESC：主要来源于早期胚胎(桑椹胚一胚泡)，在有分化抑制因子的条件下分化为NSC。

3.2异体NSC：主要来自流产的胎脑室管膜组织，越早期的胎儿NSC的比例越高。

3.3自体NSC：临床志愿者术中脑组织碎片分离得到的NSC或是收集脑室周围的NSC在体外培养扩增后植入患者体内，或是运用药物刺激内源性NSC增殖分化(如把TGF-a注射到帕金森病模型中，发现动物侧脑室和海马齿状回的NSC增殖并迁移到受损区域，分化为多巴胺神经细胞，引起症状的改善)。

3.4MSC：来源广泛，免疫源性弱，注入人体后，无明显的炎症反应和淋巴细胞浸润，同时植入后没有观察到神经胶质细胞增生和肿瘤细胞的发生。

3.5HSC：用于造血系统疾病的治疗已取得了满意的效果。研究发现HSC在星形胶质细胞条件培养液中分化的细胞GFAP、NSE和Nestion阳性表达。Borila等发现成人骨髓的HSC在体外培养条件下可分化为不同的神经细胞，将HSC移植入新生儿体内，一个月后在脑室区和脑室下区检测到了NSC，并进而分化为功能性的少突胶质细胞和神经元。

4基因或药物治疗

载体NSC的应用中枢神经系统损伤后神经修复困难的原因之一，是中枢神经系统内没有稳定的适合神经元轴突再生的微环境，包括胶质细胞增生形成疤痕，对神经元轴突再生形成空间障碍、促神经生长因子或神经营养因子的缺乏和神经元轴突生长抑制因子的存在等。NSC作为基因载体是近几年研究的新方向，其独有的生物学特性：a.良好基因可操作性，可携带多个外源基因，转染后可在体内、外稳定表达；b.具有远距离迁徙能力；d.对外源性基因容受性强；e.免疫源性弱；f.体外易于保持微分化状态；g.随微环境作相应分化的特点能实现神经移植区域的细胞替代等，使其成为中枢神经系统疾病基因治疗的理想载体。转基因NSC一方面分泌细胞因子，产生对NSC和神经元的营养、保护、抗凋亡作用；另一方面，NSC分化的细胞将产生神经元、神经胶质细胞等，有望实现受损细胞结构的重建与替代。同时，作为基因载体，NSC还可通过基因修饰产生特殊的蛋白质，用于神经系统肿瘤和其他疾病的治疗。

5组织培养在适当的条件作用下，NSC有可能在体外培养体系中形成神经组织，如果此目标实现，将大大推进NSC的临床应用。

6病毒致神经疾病机制研究NSC已用于鼠的致肿瘤病毒的神经疾病发病机制的研究。通过将病毒转染到NSC中，利用NSC的生物学特性，使病毒在试验动物脑内扩散，观察其神经毒力。

7NSC联合生物材料应用通过在损伤的神经组织中植入生物材料“支架”，保护了神经组织不受进—步的损害，减少疤痕和空洞的形成，在一定程度上促进和引导了神经轴突的再生和延伸。Suzuki等使用藻酸盐为载体填充损伤的脊髓后，将胚胎海马源性的NSC植入损伤部位，2周后发现NSC明显移行，并整合入受者脊髓中；不使用藻酸盐，移植细胞成活很少。目前这方面的研究不多。可应用的生物材料主要有：a.天然聚合物：藻酸盐水凝胶、Ⅰ型胶原等；b.合成生物可降解材料：聚乳酸等；c.合成生物非降解聚合物：聚甲基丙烯酸羟乙酯等；d.可降解材料复台物：聚羟基丁酸盐与藻酸盐水凝胶复合物等；e.非降解材料复合物导管：丙烯酸聚合物或PNA/PVC的共聚物制成的导管。Borgens等报道，用聚乙烯二醇能使脊髓损伤部位的神经冲动传导恢复，从而恢复脊髓功能。

8问题和展望

虽然NSC应用于临床有广阔的前景，但目前仍有很多问题急需解决，如ESC研究引起法律、生物医学、神学、社会学和伦理道德方面的争议。以及其致畸性，制约着ESC的基础研究和应用。NSC的定向诱导分化，永生化NSC的致瘤性，转染的目的基因长期稳定表达及调节，iNSC迁移的机制和调控，以及基因工程细胞技术中如何选择合适的启动子、基因和移植物以及移植位点的确定等等。但这些并没有影响其临床应用的步伐，相信随着NSC基础和临床研究的不断深入，NSC在临床上的应用将取得突破性的进展。

参考文献

[1]冯定庆.神经干细胞的基础研究进展及应用前景[J];解剖学研究;2004年01期.

干细胞范文篇10

【关键词】干细胞动脉缺血移植护理动脉硬化闭塞症是一种退行性病变，是大、中动脉的基本病理过程，主要是细胞、纤维基质、脂质和组织碎片的异常沉积，在动脉内膜或中层增生过程中复杂的病理变化。经典的治疗方法主要有药物、内膜剥脱术、旁路转流术和球囊扩张支架成形术等，但均有一定指征、创伤和局限性。肢体外周血干细胞移植是下肢动脉缺血性疾病最有前景的方法〔1〕。1资料与方法11病例资料2004年9月～2005年10月我院严重下肢缺血的患者31例，男27例，女4例，年龄33～71(平均52)岁，分别诊断为动脉硬化闭塞症21例，血栓闭塞性脉管炎8例，广泛动脉闭塞2例；所有患者体验均未触及明显的足背和胫后动脉搏动，皮温低于正常肢体；合并高血压17例，糖尿病19例，脑梗死史2例，冠心病史4例，长期吸烟史22例。12移植方法①术前骨髓评估：移植前进行骨髓像评估，发现1例骨髓增殖减低，应用粒、单核细胞集落刺激因子，4d后复查明显好转。②单个核细胞的获得：局麻下抽取自体骨髓300～400ml，在体外经过淋巴细胞分离处理、离心后，提取单个核细胞层，稀释成单个核细胞悬液80～120ml。③干细胞移植：硬膜外麻醉下，根据缺血范围，选取缺血肢体大腿中下段及小腿部前、后、外肌群肌肉注射，每个穿刺点1ml/次，间隔1cm，多点穿刺注射。术后7～10d出院。13判断标准痊愈:术后动脉搏动良好,疼痛缓解,皮温、肤色恢复正常、间歇性跛行消失；显效：动脉搏动恢复较健侧弱,疼痛明显减轻,皮温、肤色明显改变、间歇性跛行距离超过1000m；有效：动脉仍不能触及，但疼痛减轻、皮温较前升高，肤色由术前的苍白、青紫转为暗红色、间歇性跛行距离超过500m；无效:动脉无触及，症状、体征无明显改善、间歇性跛形距离无明显变化。14护理方法在进行常规护理基础上，辅以足部护理、心理护理，并指导患者进行功能锻炼，观察患肢血运情况，对出院患者进行指导。15结果术后第1天患者均反映患肢不适感好转。出院时，所有患者静息痛消失，麻木感和冷感减轻，跛行距离延长。2例术后1个月症状出现反复，表现为跛行距离恢复至术前水平。1例闭塞性血栓血管炎(TAO)患者，术后3个月再次出现晚间患肢麻木、怕冷。所有患者均无病情加重。所有患者均未恢复正常水平。2讨论评估患者心理状况，针对不同心理进行有针对性的疏导。由于长期的情绪波动，会促使机体丘脑/垂体/肾上腺素系统发生变化，外周血管长时期处于收缩紧张状态，神经系统兴奋增强，机体儿茶酚胺增加，一方面促进血管收缩，使血压升高，另一方面降低疼痛阈值，使患者承受疼痛的能力减弱。因此，护理人员应加强与患者的沟通，以消除患者的不安，取得配合。吸烟是动脉缺血性疾病的主要危险因素，力劝患者戒烟，以减少烟碱和尼古丁对血管的刺激。患者宜摄入高热量，高蛋白，高维生素饮食，少食动物脂肪及胆固醇含量较多的食物，改善营养状况，指导患者有规律的下肢功能锻炼，以改善下肢血液循环，促进侧支循环的建立。动脉缺血患者多存在肢体末端血运障碍、缺血营养障碍，进一步发展可造成溃疡和坏疽。护理内容包括：①每日用温水洗脚，用毛巾擦干，不可用力摩擦，揉搓皮肤；②保持皮肤干燥、滋润，穿棉袜及透气性良好松软的鞋子，并及时更换，保持鞋袜干爽，洁净。足部可涂凡士林油保持皮肤滋润；③保护足部免受损伤，注意修剪指甲，注意足部保暖，严禁冷热敷；④有肢端慢性溃疡和坏疽者，湿性坏疽可用消炎液湿敷，分泌物减少后改用生理盐水换药，每日1～2次，干性坏疽应保持干燥，滋润，防止感染〔2〕。自体骨髓干细胞(BMSC)移植后，即可行局部按摩，以促进侧支循环的建立，从而减轻肢体凉、痛症状。术后1d鼓励患者缓步行走，在预计发生间歇性跛行疼痛之前停步休息，如此每天进行数次。另外，也可采用Buerger运动，即病人平卧，先抬高患肢45°，1～2min后再下垂2min，并作伸屈或旋转运动10次，如此每次重复5次，每天数次，循序渐进，逐步增加活动次数和力度。由于此手术方法的目的是改善肢体血运，因此，术后要密切观察患肢皮肤温度、皮色、感觉、肌力、疼痛及肢端动脉搏动情况，每小时观察1次，并做好详细记录。本组资料发现，自体BMSC移植治疗动脉缺血，所有患者术后7d时疼痛均缓解，冷感减轻，间歇性跛行距离缩短，踝/肱指数升高。在术后1～3月出现症状反复，但与术后7d时无显著差异。自发性出血是尿激酶及肝素的主要副作用，在用药过程中，应注意观察口腔黏膜、皮肤、牙龈等处有无出血点，穿刺点有无渗血及血肿发生。31例患者住院期间均接受抗凝、溶栓治疗，5例因凝血指标异常而减小抗凝溶栓药物的剂量；1例因有皮肤出血点而减少用药次数和药物剂量。因此，在抗凝、溶栓治疗期间应每隔2d查凝血指标1次，以及时调整药物用量。出院时指导病人：①功能锻炼：采用被动运动与主动运动相结合的方法，按摩由小肌群到大肌群，由局部到整体，使用助行器到脱离助行器自己行走为原则〔3〕。②用药指导：出院后仍需服用小剂量抗凝、祛聚药物，指导患者观察皮肤黏膜有无出血现象，定期复查凝血时间，血、尿常规等。③复诊：一旦发现肢体疼痛，皮温降低，应立即到医院就诊。【参考文献】1姚燕丹，林少芸，胡以则肢体干外周干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的研究进展〔J〕中国医药导刊，2004;6(6)：42012蒋雪松动脉硬化闭塞症肢体缺血的护理〔J〕医药论坛，2005；26(9)：7673胡琼华，张红，郭晖介入治疗急性肢体动脉栓塞病人的护理〔J〕护理学杂志，2003;8(2):119