种植体骨磨片组织学效果对比

目前，对种植体周围骨愈合和骨结合的研究方法主要采用骨形态计量学分析方法。而种植体与其周围骨组织的结合状态、成骨效果以及骨细胞学研究可通过组织学方法观察、研究和分析。不脱钙种植体骨磨片能完整显示种植体与骨结合的界面和矿化结构，不同磨片染色后，骨组织细微结构显示不同。本实验通过3种不同特殊染色方法进行种植体骨磨片染色，对组织显示效果进行比较分析，探讨种植体骨组织形态学的研究方法，为种植体骨形态计量参数的研究提供依据。

1材料和方法

1．1种植体骨组织取材与预处理

在Beagle犬胫骨植入12枚BLB纯钛圆柱状种植体(北京莱顿生物材料有限公司)，8周后处死动物，制取种植体骨组织标本，将其固定于甲醛溶液48h，酒精逐级脱水，氯仿透明，甲基丙烯酸甲酯与邻苯二甲酸二丁酯混合液浸润、包埋［1］。

1．2种植体骨磨片的制作

将修整好的包埋块固定于EXAKT300CP切片机(Leica公司，德国)切取200～300μm厚的切片，然后用EXAKT400CS磨片机(Leica公司，德国)，分别以粒径18μm(800目)、11．5μm(1200目)、5．2μm(2500目)水砂纸将切片磨至10～15μm厚，最后以粒径3．2μm(4000目)水砂纸抛光切片组织表面至完全无磨痕。每个标本制作3张磨片，分别采用3种不同染色方法进行染色。

1．3配制染色液

1．3．1亚甲基蓝－酸性品红染色液［2］亚甲基蓝染液包括溶液A和溶液B。溶液A:亚甲基蓝1g，蒸馏水75mL;溶液B:高锰酸钾1．5g，蒸馏水75mL。将溶液A、B混合，100℃水浴至沉淀溶解后冷却至室温过滤。苦味酸酸性品红染液:冰醋酸0．5mL，酸性品红0．25g，甘油10mL，蒸馏水90mL，加苦味酸至饱和。

1．3．2Goldner’s三色染色液［3］①Weigert’s铁苏木素液由溶液A和溶液B混合而成。溶液A:1g苏木素溶于100mL95%乙醇溶液;溶液B:1．16g三氯化铁、100mL蒸馏水、1mL盐酸混合。②丽春红－酸性品红液:0．4g丽春红、0．1g酸性品红、0．6mL冰醋酸与300mL蒸馏水混合。③磷钨酸－橙黄G液:15g磷钨酸与300mL蒸馏水混合后，加入6g橙黄G混匀。④亮绿液:0．9g亮绿、0．6mL冰醋酸、300mL蒸馏水混合。

1．3．3甲苯胺蓝染色液①柠檬酸(枸椽酸)磷酸缓冲液由溶液A、B混合而成。溶液A:0．1mol/L柠檬酸溶液，由柠檬酸20．01g加蒸馏水至1000mL配制而成;溶液B:0．2mol/L磷酸氢二钠溶液，由十二水磷酸氢二钠71．6g加蒸馏水至100mL配制而成;取溶液A32．3mL、溶液B17．7mL，混合即成pH值为3．8的缓冲液。②甲苯胺蓝液:甲苯胺蓝2．0g溶于100mL缓冲液，溶解后过滤，用1mol/LNaOH调pH值至3．8。

1．4磨片染色

1．4．1亚甲基蓝－酸性品红染色法［4］将磨片置于亚甲基蓝染液染色，60℃水浴15min，滤纸吸干染液;60℃蒸溜水漂洗，干燥;酸性品红染液染色5min，滤纸吸干染液;95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片。

1．4．2Goldner’s三色法［4］将磨片脱塑至水，Weigert’s铁苏木素液15min，蒸溜水漂洗1次，流水冲洗15min，蒸馏水漂洗1次，丽春红－酸性品红液15min，1%醋酸液漂洗2次，磷钨酸－桔黄G液8min，1%醋酸液漂洗2次，亮绿液15min，1%醋酸液漂洗2次，70%乙醇漂洗1次，100%乙醇漂洗2次，二甲苯透明，树脂封片。

1．4．3甲苯胺蓝染色法将磨片脱塑至水，甲苯胺蓝染色液10min，柠檬酸(枸椽酸)磷酸缓冲液冲洗2次，1min/次，吸干磨片水分，乙醇脱水2次，1min/次，二甲苯透明2次，1min/次，树脂封片。

1．5组织学观察

将3种特殊染色法染色后的磨片置于倒置相差显微镜下，观察并采集图像。

2结果

2．1亚甲基蓝－酸性品红染色法

亚甲基蓝－酸性品红染色后种植体骨结合界面清晰，种植体表面羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂层为紫红色，成骨细胞及细胞核、类骨质显示清晰，成骨细胞核染成深蓝色，细胞基质染成淡蓝色，类骨质为紫灰色。新骨组织为深红色，与种植体骨界面分界清晰，原矿化骨组织为红色，与新生骨分界较模糊(图1A)。

2．2Goldner’s三色法

Goldner’s三色法染色后种植体骨结合界面清晰，种植体表面HA涂层为亮绿色，新生骨为深绿色，原矿化骨为绿色，二者界限清楚，成骨细胞为橘黄色，着色浅，不能分辨细胞核及其基质，类骨质染成橘红色，成骨细胞与类骨质分界模糊(图1B)。

2．3甲苯胺蓝染色法

甲苯胺蓝染色显示种植体骨结合界面较模糊，种植体表面HA涂层为蓝紫色，新生骨为深蓝色，原矿化骨为淡紫色，二者界限清楚;类骨质为浅蓝色，钙化前缘为绛紫色颗粒，成骨细胞呈深蓝色，与新生骨分界模糊，类骨质与新生骨界限不清(图1C)。

3讨论

骨组织形态计量学是一门体视学技术，能直观定量观察和研究骨组织形态及结构。对未脱钙骨种植体磨片的骨组织形态学分析能直观显示种植体与骨组织间的细微结构、结合状态及成骨效果等，经不同染色方法可以观察到骨组织及种植体骨界面的不同细胞和组织结构。组织学染色方法可大体分为常规染色法(如HE染色)及特殊染色法，后者包括Masson染色法、甲苯胺蓝－酸性品红染色法［5－6］、Goldner’s三色法、银染色法、抗酸染色法等。不同染色法可获得不同参数信息，不同研究目的可选择不同染色法，对种植体骨磨片采用合适的染色法可以更清晰显示骨成熟状态和骨组织各种分化状态。黄鹏等［7］研究发现Masson染色硬组织切片，染色整体效果不佳。本实验采用3种特殊染色方法对种植体骨磨片染色，Goldner’s三色法和甲苯胺蓝染色法染色后，新生骨与原矿化骨间界限清晰，可较准确地测量新生骨面积。朱震坤等［8］采用甲苯胺蓝染色法研究种植体骨结合界面新生骨与矿化骨也取得较好效果。本研究显示种植体骨结合界面采用亚甲基蓝－酸性品红染色法和Goldner’s三色法染色更清晰，故在研究种植体骨结合面积时较精确。亚甲基蓝－酸性品红染色法能清楚显示成骨细胞、细胞基质及类骨质，对骨形成静态参数如成骨细胞指数、类骨质均宽、类骨质表面、类骨质体积的研究效果理想。Goldner’s三色法在研究骨结构参数如矿化骨均宽、矿化骨体积方面占优势。王东胜等［1］研究表明亚甲基蓝－碱性品红染色能更好辨析骨细胞状态，与甲苯胺蓝染色相结合，更好地反映骨的矿化状态。本研究也显示联合应用染色方法可更好获得骨组织形态计量学信息。

综上所述，在种植体骨组织改建研究方面，Gold-ner’s三色法及甲苯胺蓝染色法有优势，利于观察新矿化骨与原板层骨，利于骨形态计量学的测量。而在种植体骨结合界面的细胞学研究方面，骨磨片染色宜采用亚甲基蓝－酸性品红染色法。如需对种植体骨结合界面进行全面研究，则须行2种或以上的染色方法以弥补染色显示的不足，获得全面的骨结合与骨愈合及骨改建成熟的参数。本研究仅对HA涂层种植体骨磨片染色进行比较，其他表面种植体骨界面染色效果需进一步研究。