切除部分Ranvier 区对骺板软骨细胞 bcl-2和ba表达的影响

【关键词】bax

摘要:目的:探讨凋亡相关基因bax、bcl-2在Ranvier区部分切除后骺板软骨组织中的表达。方法:切除12mm长的新西兰大耳白兔的胫骨近端Ranvier区，于术后1、4周处死实验兔，从免疫组化方面观察凋亡相关基因bax、bcl-2在Ranvier区部分切除后不同周龄的兔胫骨近端骺板软骨组织中表达的变化特征。结果:随着Ranvier区部分切除后，骨桥形成前骺板软骨组织中的软骨细胞凋亡率明显低于对照组，骨桥形成后软骨细胞凋亡率明显高于对照组。结论:Ranvier区和骨桥对骺板软骨细胞的凋亡率有促进作用，骨桥的促进作用更明显。

关键词:bax;bcl-2;Ranvier区;骺板

累及Ranvier区的损伤常导致骺板横向和纵向的发育紊乱［1］，也有可能导致骨软骨瘤等骨肿瘤的发生［2］，Ranvier区在骨发育中的作用越来越受到重视。Ranvier区的损伤对骺板软骨细胞凋亡相关基因bax和bcl-2的表达是否有影响，目前仍然不清楚。因此，本研究利用切除Ranvier区后的骺板软骨作为研究模型，试图从骺板软骨组织的整体上了解bax及bcl-2在切除Ranvier区后的骺板软骨细胞增殖和凋亡过程中的表达，探讨bax及bcl-2在切除Ranvier区后骺板软骨细胞凋亡中的分子生物学机理。

1材料与方法

1.1动物模型制作

选用封闭群系日本大耳白兔24只，兔龄5周，体重0.5～0.7kg，随机分为两个实验组，每组12只。两个实验组均采用一侧胫骨近端骺板为实验部位，另一侧作对照组。1%戊巴比妥钠3ml/kg静脉麻醉，手术野常规消毒，根据兔的解剖作各实验侧膝前内侧直切口，长约3cm切开皮肤皮下组织，暴露胫骨结节以上胫骨体前内侧面。暴露干骺端骺板骨软骨膜环，于骺板上方1.5mm至下方1.0mm处以小尖刀环形切除，厚约0.5mm、宽2～3mm、长度为12mm骨软骨膜。然后结扎止血，逐层缝合组织。对照组暴露干骺端骺板骨软骨膜环后，不作切除，全层缝合组织。分别于术后1、4处死实验兔，每次每组处死6只。解剖出双侧胫骨。

1.2检测方法及指标项目

1.2.1组织学观察新鲜标本在10%中性甲醛溶液中固定1周，然后用10%EDTA室温下脱钙1月。冠状面纵行剖开，制作成4μm连续石蜡切片，HE染色染色。镜下观察骺板损伤后的病理改变。

1.2.2bcl-2和bax表达检测方法bcl-2、bax单克隆抗体、SP试剂盒均为武汉博士德生物技术公司产品。采用SP免疫组化染色法，按照试剂盒的操作步骤进行。400倍显微镜下分别观察bcl-2和bax蛋白的表达，并计算每10个随机高倍镜视野中阳性细胞的表达率。1.3统计学处理应用SPSS11.5统计软件包进行统计，采用方差分析，检验水准α=0.05。

2结果

2.1骺板损伤后的病理演变术后1周:RG切除区由开始纤维化的肉芽组织覆盖，骺板外侧软骨细胞增生带明显增厚。有薄层骨质从二次骨化中心紧贴骺板外缘向下爬行至骺板外侧软骨细胞增生带，肥大带向下延长，骺板呈向下弯曲现象（图1A）。术后4周:RG切除区由纤维结缔组织覆盖，骺板外缘的骨质明显增厚，覆盖整个骺板，骺板外侧软骨细胞较一周时细胞数量明显减少，并向下延续形成一条由增生、肥大及钙化软骨细胞组成的软骨带（图1B）。

2.2bcl-2蛋白的表达结果bcl-2蛋白在细胞内为胞浆表达，光镜下呈现棕黄色颗粒，正常细胞表达程度较强而凋亡细胞表达程度较弱或不表达。本实验1W切除组bcl-2蛋白表达的细胞数量多，颜色深，呈强表达（图2A）;对照组则表达细胞数少，且色泽浅，呈弱表达（图2B）;1W切除组的阳性表达率为41.53%，对照组的阳性表达率为32.46%，两者的差异具有显著性（χ2=14.32，P<0.05）。4W切除组的表达程度弱于对照组（图2C，D）。

2.3bax蛋白的表达结果bax蛋白在细胞内表达部位及表达形态、色泽与bcl-2蛋白相同，但表达强度和意义有所区别，即正常细胞表达程度通常较弱或不表达而凋亡细胞表达程度较强。本实验1W切除组细胞数表达且色泽浅，呈弱表达（图3A）;对照组表达细胞数量多，颜色深，呈强表达（图3B）。1W切除组的阳性表达率为30.44%，对照组的阳性表达率29.02%，两者的差异不具有显著性（χ2=8.64，P>0.05）。4W切除组的表达程度强于对照组（图3C，D）。表1两组骺板软骨bcl-2和bax的RNA表达阳性率比较

3讨论

早在1873年Ranvier曾描述了骨骺板周围有一个环形切迹3］，该区包含三个不同的细胞群［4，最内层有一组密集成团的细胞，它们和骺生长板增生层上部的软骨细胞大约在同一水平，系胚胎的原始细胞演变成能生成骨皮的前骨母细胞，骨钙素（BGP）免疫组化定位染色阳性［5］，细胞核癌基因蛋白myc、jun免疫活性呈阳性［6］，具有成骨特性及非常活跃的增生、分裂和/或迁移的活性。该层细胞生成的骨皮除对骺板有机械支持作用外［7、8］，是否对骺板软骨细胞的凋亡有影响，目前仍不清楚。与骺板软骨细胞的凋亡有关的基因中，bcl-2是体内细胞重要的抗凋亡基因之一［9］。bcl-2抑制细胞凋亡，在免疫调节中发挥重要的作用，其高表达可阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，促进细胞生存。bax是bcl-2的同源基因，其过度表达可拮抗bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡。在体内bcl-2家族的成员通常以bcl-2/bax二聚体的形式发挥作用，两者的比值决定了细胞对凋亡信号敏感性。当bcl-2/bax升高，表示细胞对凋亡信号敏感性减弱，呈现抑制凋亡作用。两者的比例决定细胞的生死，如bcl-2过量，形成bcl-2二聚体，那么细胞就存活;如bax过量，形成bax二聚体，细胞就会凋亡［10］。本实验首次观察到，随着Ranvier区部分切除后，凋亡相关基因bcl-2、bax在骺板软骨中的表达具有数量积累的趋势。首先，骨桥形成前在靠近Ranvier区切除部分，骺板软骨细胞凋亡率明显低于对照侧，bcl-2表达明显增高而bax表达差异不具有显著性，同时，骺板软骨基质表现出相应的增生，同一骺板的Ranvier区相对未切除侧骺板软骨细胞凋亡率较对照侧没有明显差异。说明骺板软骨细胞凋亡率的改变与局部细胞或炎性因子有关。其次，骨桥形成后软骨细胞凋亡率明显高于对照侧，切除组较对照侧bcl-2表达降低而bax表达增高，其软骨细胞凋亡率明显增高，说明骨桥引发骺板软骨细胞凋亡，引起bcl-2与bax表达改变。研究表明参与软骨细胞的凋亡进程的细胞因子中，目前研究较多的NO、PGE2、TNF-α、IL-l等炎性因子多抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞的凋亡。仅甲状旁腺激素相关肽（para-thyroidhormone-relatedpeptide，PTHrP）等既抑制软骨细胞凋亡，又促进软骨基质表现出相应的增生，其作用最符合本实验的观察结果。故认为PTHrP在Ranvier区部分切除后，骺板软骨细胞相应的凋亡率变化中，具有重要意义。Amling等［11］的研究则显示PTHrP可以上调bcl-2的表达，并指出这一作用可能是PTHrP抑制细胞分化和凋亡的机制所在。PTHrP选择性抑制col-Ⅹ的合成，合成col-Ⅹ是软骨细胞分化成熟的标志，提示PTHrP可抑制软骨细胞成熟过程［12］。PTHrP又可显著刺激软骨基质-蛋白多糖的合成［13］。PTHrP促进软骨细胞增殖及合成软骨基质同时其分化成熟的机制尚未完全明确根据本实验的观察结果，可以认为Ranvier区内层细胞生成的骨皮除对骺板有机械支持作用外，尚具有屏障作用，参与Ihh/PTHrP负反馈环路［14］，在骺板软骨细胞增生层上部的水平上，阻断PTHrP等细胞因子对软骨细胞增殖及软骨基质合成的促进作用，防止软骨细胞过度增殖所致的软骨发育不全，在保持骺板的生理发育过程中具有重要作用。其具体机制有待进一步研究。

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