成年兔心耳肌细胞分离标记研究论文

【关键词】心肌/细胞学Isolation,labellingandautotransplantationofleftauriclemyocytesinadultrabbit【Abstract】AIM:Todevelopareliablemethodforisolationandfluorescentlabelingofadultrabbitleftauriclemyocytesandtoinvestigatethesurvivalofgraftedautologousleftauriclemyocytes.METHODS:TwentyadultNewZealandrabbitswererandomlyassignedtotransplantgroupandcontrolgroup(n=10).TheleftauricleofrabbitwasligatedandharvestedandtheauricularcellswereisolatedandlabeledwithDAPIexvivo.Eitheracellsuspension(transplantgroup)orculturemedium(controlgroup)wasinjectedintothenormalleftventricularanteriorwall.Therabbitsweresacrificedafter4weeksandspecimenswereharvestedandobservedbyhistologicmethods.RESULTS:Mostoftheisolatedcellswereobservedrodshaped.Themorphologicfeatureofthesecellscorrespondedtothatofauriclecardiomyocytesandthecellactivitywasgood.The“cellisland”couldbefoundinmyocardialinfarction(MI)areaoftransplantgroup,andthenucleiwithbluefluorescencecouldbefoundintransplantgroup,butnotincontrolgroup,whichconfirmedthesurvivalofimplantedcellsandthereliabilityofDAPIlabeling.Vasculardensityintransplantgroupwasbetterthanthatincontrolgroup(P=0.02).CONCLUSION:EnzymedigestionandDAPIlabelingarereliablemethodsfortheisolationandlabelingofleftauriclemyocytesinadultrabbits.IsolatedandDAPIlabeledauriclemyocytescansurviveafterautograftedintonormalventricularanteriorwallandmayimproveperipheralvascularproliferation.【Keywords】myocardium/cytology;isolation;label;transplantation,autologous【摘要】目的：建立可靠的成年兔心耳心肌细胞的急性分离和荧光标记的方法，观察心耳肌细胞移植到自体左室前壁的存活状况.方法：成年新西兰白兔20只，随机分为移植组和对照组（n=10）.结扎并剪取自体左心耳组织，急性消化分离为单细胞，经DAPI标记后分别将细胞悬液和培养基注射到移植组和对照组自体正常左室前壁内.4wk后处死兔子，取移植区组织进行组织学观察.结果：急性分离的细胞中绝大部分为杆状，形态结构符合心耳肌细胞的特征，且细胞活性好.移植组梗死区内可以观察到“细胞岛”状结构，行荧光检测可见蓝色荧光的细胞核，而对照组梗死区内无细胞结构，证明移植的心耳肌细胞在移植区存活以及DAPI标记的可靠性.与对照组相比,移植区血管密度增高（P=0.027）.结论：酶消化法和DAPI荧光标记是一套可靠的心耳肌细胞急性分离和标记方法；急性分离的心耳肌细胞移植到自体左室前壁后可以存活，并能够促进周围血管生长.【关键词】心肌/细胞学；分离；标记；移植，自体0引言目前正在研究的心肌细胞移植技术是通过向已梗死的心肌组织内移入新的细胞，以改善心脏功能［1］.本文旨在建立一套可靠的成年兔心耳肌细胞的分离标记方法，并对其移植到自体心肌组织进行研究,为进一步应用心耳肌细胞移植治疗缺血性心脏病提供实验基础.1材料和方法1.1材料成年健康新西兰白兔20只,雌雄不限,体质量2.0~2.5kg,购自第四军医大学实验动物中心.将实验动物随机分为移植组和对照组（n=10）.小牛血清(Gibco),DMEM高糖培养基(Gibco公司),胰蛋白酶(Gibco公司),胶原酶Ⅱ型（Sigma公司）,4,6二脒基2苯茚二酮(Sigma公司).1.2方法1.2.1自体左心耳心肌组织的取材取成年兔经耳缘静脉注射戊巴比妥钠（30mg/kg），左侧胸骨旁切口，切断第4肋骨进胸，向上推开胸腺，剪开心包，显露并牵引左心耳，用4号丝线结扎左心耳基底部后，剪取左心耳并立即置于预冷（4℃）的普通台式液中.用盐水纱布覆盖伤口.1.2.2左心耳心肌细胞的消化分离参照文献［2］，在无钙台式液(mol/L:NaCl140,KCl5.4,MgCl21,酶糖10,HEPES5,pH7.4)中洗去血凝块，用眼科剪将心耳组织剪碎，移入含有1.25g/L胰酶、0.25g/L胶原酶的无钙台式液中，37℃消化10min.轻柔吹打，自然沉淀后弃上清.再加入酶消化10min，轻柔吹打后，吸取上清，移入等体积含100mL/L新生牛血清的DMEM培养液中.重复消化剩余组织2～3次，直至基本不可见有形组织.将收集的细胞悬液1000r/min,离心5min,弃上清，调整细胞密度为2×109/L.1.2.3分离细胞的活性鉴定参考文献［3］将40g/L的台盼蓝溶液与细胞悬液按照1：9混匀，进行染色,3min后用红细胞计数板分别计数活细胞和死细胞,计算活细胞率［3］.1.2.4分离细胞的标记参照文献［4］加入0.2g/L的4,6脒基2茚二酮(DAPI)于孵箱内（37℃）荧光标记细胞2h,使用锡箔包裹.用普通台式液(mol/L:NaCl140,KCl5.4,CaCl21.8,MgCl21,glucose10,HEPES5,pH7.4)漂洗以去除未结合的DAPI.离心后收集细胞，加入无血清DMEM培养液制成细胞密度为2×109/L的细胞悬液,以备细胞移植.1.2.5分离细胞的观察心肌细胞移植术前,动态观察分离的心肌细胞,荧光显微镜观察用DAPI标记好的心肌细胞.1.2.6心肌细胞移植在左室前壁缝50涤纶线以作标记，移植组将心肌细胞悬液经特制的微量注射器注入左室前壁缝线标记上方0.5cm处，对照组以相同量的DMEM培养液注射.逐层关胸,伤口局部应用抗生素,手术中未发生气胸及恶性心律失常.1.2.7结果观察4wk后用过量麻醉剂处死动物,取左室前壁缝线标记点上方心肌组织，40g/L甲醛固定48h,行常规HE染色，使用荧光显微镜观察并拍照.观察移植区内组织结构及血管密度.同时,对移植部位石蜡切片(移植组及对照组动物取样2个/只,共取样本40个)，用第Ⅷ因子免疫组织化学染色移植区内血管,光学显微镜200倍视野下血管计数,统计移植区血管密度.统计学处理：结果以x±s表示，采用SPSS11.5软件进行数据处理,组间比较用t检验.2结果2.1分离细胞的形态学观察及细胞活性对用酶消化法分离获得的成年兔左心耳心肌细胞进行形态学观察,倒置显微镜下可见细胞大部分呈杆状，边缘清楚，胞质丰富(Fig1),DAPI标记2h后可见细胞核大,多为单核或多核.经台盼蓝染色,死细胞染成淡蓝色,活细胞拒染，计算活细胞率为95%.2.2移植细胞在移植部位的存活情况细胞移植后4wk，对移植部位心肌组织切片进行HE染色后观察，光镜下可见移植部位心肌组织内心肌纤维排列整齐，方向基本一致，在移植细胞周围没有观察到淋巴细胞浸润.在相差荧光显微镜下可以观察到移植组标本中带有蓝色荧光的细胞核，证实移植的心耳肌细胞在移植部位存活.2.3血管增生对移植部位石蜡切片，用第Ⅷ因子行免疫组织化学染色,光学显微镜200倍视野下观察血管计数,移植区血管密度(6.7±2.1)，高于对照组(3.6±1.2,P=0.027)，提示将自体心耳肌细胞移植到左室前壁后可以促进周围血管增生.3讨论本实验中,我们选用左心耳作为细胞来源，取材简便，取材后对心功能影响不明显.考虑到成年心肌细胞不能继续分裂，故未进行体外培养，而是选择分离标记后进行细胞移植.在酶消化的过程中，除了按预定的时间进行消化外，还应根[1][2]据肉眼观察心耳肌组织碎块的絮状变化的程度，来决定中止酶消化的时机.无钙环境和酶消化时间过长将会损害细胞膜，并导致“钙反常”，使细胞功能受损.我们将分离的兔自体心耳肌细胞移植到正常左室前壁后,4wk后荧光检测可以发现心肌标本中带蓝色荧光的细胞核,说明移植的心肌细胞在梗死区内存活，同时可以观察到有血管形成，提示移植的心耳肌细胞可能分泌一些细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)［5,6］等，促进移植区内血管的增生，以适应性加强局部血液供应.我们在移植细胞周围没有观察到大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，说明自体心肌细胞移植不会产生免疫排斥相关的炎性反应.通过本实验对自体心肌细胞移植的可行性研究，为下一步研究自体心肌细胞移植到梗死区心肌以治疗缺血性心肌病提供了实验基础.【参考文献】［1］LiRK,YauTM,SakaiT,etal.Celltherapytorepairbrokenhearts［J］.CanJCardiol,1998;14:735-744.［2］LiRK,MickleDAG,WeiselRD,etal.Humanpediatricandadultventricularmyocytesinculture:Assessmentofphenotypicchangeswithpassaging［J］.CardiovascRes,1996;32:362-373.［3］司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.西安：世界图书出版公司1996:181.［4］DorfmanJ,DuongM,ZibaitisA,etal.Myocardialtissueengineeringwithautologousmyoblastimplantation［J］.JThoracCardiovascSurg,1998;116:744-751.［5］LiRK,JiaZQ,WeiselRD,etal.Cardiomyocytetransplantationimprovesheartfunction［J］.AnnThoracSurg,1996;62:654-661.［6］RedaelliG,MalhotraA,LiBS,etal.Effectsofconstitutiveoverexpressionofinsulin2likegrowthfactor1onthemechanicalcharacteristicsandmolecularpropertiesofventricularmyocytes［J］.CircRes,1998;82:594-603