微生物培养方法十篇

微生物培养方法篇1

微生物检验培养基质量的好坏、配制使用和保存是否正确等直接影响到检测结果的准确性。现就微生物检验培养基的质量控制方法浅谈如下：

1　培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处，避免阳光直射。开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在6个月内用完。应定期对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。

2　培养基的制备

称量时要用专用的角匙，避免交叉污染。复水时不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长。含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟：加热培养基时一定要进行搅拌。为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热。一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，通常是121℃ 15min；含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH值，应在25℃温度下采用精密酸度计进行测量，固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。使用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。灭菌以后的培养基应该迅速冷却至所需温度并妥善保存。

3　培养基的性能测试

3.1　外观控制：制备好的培养基应有相应的颜色，一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化，是否蒸发/脱水。

3.2　污染控制：从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试(无菌试验)，确定无微生物生长方可使用。

3.3　性能测试

3.3.1　测试菌株：选择测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株，应来自国际/国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株，菌株的选择参考卫生行业标准WS/T232-2002《商业性微生物培养基质量检验规程》。

3.3.2　定量测试方法：常用改良Miles-Misra法。测试菌株、过夜培养物10倍递增稀释；测试平板和参照平板划分为4个区域并标记；从最高稀释度开始，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域；将稀释液涂满整个1/4区域，37℃培养18h；对易计数的区域计数，按公式计算生长率(生长率=待测培养基平板上得到的菌落总数/参考培养基平板上获得的菌落总数)。非选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.7，选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.1。

3.3.3　半定量测试方法：常用改进的划线法接种法。平板分AB-CD四区，共划16条线，平行线大概相隔0.5cm，每条有菌落生长的划线记作1分，每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分，没有菌落生长或生长量少于划线的一半记作0分，分数加起来得到生长指数G。目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制，目标菌的生长指数G大于6时，培养基可接受。

3.3.4　定性测试方法：常用平板接种观察法。用接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养，目标菌应呈现良好生长，并有典型的菌落外观、大小和形态，非目标菌应是微弱生长或无生长。

总之，做好微生物检验培养基的质量控制是保证结果准确的基础和关键。

微生物培养方法篇2

关键词：微生物检验；质量控制措施；浅谈

目前在实际进行微生物检验的过程中，最为常见的一种检验方式就是通过培养基，对于微生物进行相应的培养，等到微生物能够大量的繁殖后进行相应的检验。为了保证到微生物检验过程中的相关效果，对于培养基的质量实施相应的控制就显得尤为重要。但在实际的使用微生物检验培养基的过程中，往往无法严格按照相关要求进行，因此对于微生物检验培养基质量控制措施进行讨论，就显得尤为重要。

1 对于微生物培养基在进行质量控制的措施

目前在实际的对于微生物培养基在实施质量控制的过程中，主要是需要在进行购置的过程中，可以对于进行检验的各种药品、试剂以及相关的培养基均需要严格的按照相关的质量标准来进行，同时对于生产厂家而言，也需要提供培养基的编号、批号以及名称等，同时对于培养基在使用过程中的储存相关资料、PH值以及产品的有效期限等信息，也需要进行准确的标注[1]。我们可以尽量的选择一些大厂生产的培养基进行使用。这主要是由于微生物培养基大厂生产的培养基能够较好的保证到在实际的使用过程中，能够严格的按照相关质量标准来进行检验，因此能够较好的保证到对于微生物实施检验过程中的准确程度。同时在进行验收的过程中，需要足以到应该由专人来进行检验以及验收，通过这种方法，可以对于在实际的进行微生物培养基的使用过程中的相关质量标准可以在一种较高的水平之上，并对于培养基的质量进行检测完成后，若能够符合相关的检测要求，就能够进行使用。

2 对于培养基的储存质量控制措施

对于不同种类的培养基，实际上在进行质量控制过程中所需使用的方法，实际上是不同的。对于一些粉末状的培养基，在实际的进行储存的过程中，需要注意避免出现阳关直射的情况。若培养基没有进行开封，可以保存最长2年的时间，若已经开封，则使用时间为6个月。若在此过程中没有将培养基进行使用完[2]，需要放弃培养基采购全新的培养基。同时为了定期的对于培养基进行常规的检验，若在此过程中，检查的是没有开封的培养基，可以对于培养基的生产日期或是开封日期等进行观察，若在此过程中，出现培养基的颜色异常或是出现了诸如结块等情况，需要放弃培养基。

3 对于培养基实施制备过程中的质量控制措施

在对于培养基实施制备的过程中，制备培养基使用的水应该使用蒸馏水或是和蒸馏水相同质量的水，以保证对于培养基进行制备的过程中不会出现污染等情况，同时也需要避免出现使用离子交换器水的情况。在对于培养基进行称量的过程中，也需要注意到在实际的实施称量的过程中，需要通过使用专用的工具进行称量，同时在此过程中，也需要保证到避免出现污染的情况。由于干粉状态的培养基在实际的使用过程中，极易出现受潮的情况，因此如果条件能够允许，尽量在干燥的房间中对于培养基进行称取[3]。同时在进行配制的过程中，可以按照生产厂家提供的配制内容方面进行相应得到配制，以保证能够正常的对于培养基进行制备。在制备完成后若需要使用复水的工作，尤其要避免出现使用金属锅具进行复水，通过这种形式可以较好的避免出现离子混入培养基中的情况，导致对于微生物的生长不利。同时在此过程中，对于容器的选择方面，大小需要在复水后的培养基实际体积的至少2倍，通过这种形式能够较好的避免在进行培养的过程中[4]，出现了培养基的溢出的情况，而在对于培养基在实施培养加热的过程中，一定要注意到不断的进行搅拌，通过搅拌的方法，能够较好的避免出现培养基的溢出或是烧焦的情况。由于烧焦的培养基会产生有毒物质，对于微生物的培养而言，会出现抑制的效果，因此若是在此过程中已经出现了培养基的烧焦情况，需要重新的制备培养基，以保证正常的对于培养基进行制备并能够对于微生物的培养较好的进行[5]。在对于培养基实施测定以及灭菌的过程中，我们一般可以选择在121℃的环境之下实施灭菌，同时灭菌的时间一般在15min左右，通过这种方式，能够保证到微生物的生长繁殖的消耗养分能够进行消除，同时对于培养基的酸碱度能够得到相应的保证。在对于PH值实施测定的过程中，常见的测定方法主要是氢氧化钠的测定方法，但需要避免在此过程中出现渗透压的改变现象。对于已经进行配置完成后的培养基，我们需要进行较好的保存，在此过程中，应该迅速的对于培养基进行冷却的处理，冷却的温度为微生物进行培养过程中的所需温度，在此过程中可以对于培养基实施密封的保存，以保证其使用效果。

参考文献：

[1]刘春梅，蔡芷荷，吴清平，等.食品卫生微生物检验中培养基的质量控制[J].中国卫生检验杂志，2007，17（4）：700-701.

[2]周桂桃.微生物检验中培养基的质量控制对策分析[J].按摩与康复医学（下旬刊），2012，3（11）：26-27.

[3]贾月波.论食品微生物检验中培养基的质量控制措施[J].中国保健营养（中旬刊），2013，（4）：18-19.

微生物培养方法篇3

关键词：微生物；发酵工艺；工艺优化；培养基；培养条件 文献标识码：A

中图分类号：TQ920 文章编号：1009-2374（2017）01-0031-02 DOI：10.13535/ki.11-4406/n.2017.01.015

根据已有的相关参考文献可知，微生物发酵影响的因素包括发酵培养基中的碳源、氮源，无机盐，pH值以及温度等，本文对这些影响因素展开了详细的研究。微生物发酵工艺的优化可以有效地提升发酵生产效率，进而使得发酵生产成本有效降低。针对于此本文探讨了正交试验设计法、响应面设计法以及Plackett-Burman设计法等微生物发酵工艺的优化方法。

1 培养基对发酵的影响

微生物发酵的培养基在微生物生长或者代谢时提供所需的营养物质和能量，对发酵产物的生物合成效率以及保障产品的质量可谓是意义重大。在微生物发酵中由于菌种和发酵条件的差异以及发酵阶段的不同，所需的培养基成分也有所差异。在通常情况下，碳源、氮源、o机盐以及生长因子是微生物生长的四大营养要素。

1.1 发酵培养基碳源和氮源的选择

碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞以及形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂等，比如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及豆油等。氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的重要来源，与此同时，氮源也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源以及有机氮源，比如氨盐、硝酸盐、蛋白胨以及豆粉等。需要保持培养基配方中碳/氮源比例均衡，从而保证满足菌体的正常生长，同时提高产物的合成速率。

1.2 发酵培养基中无机盐对发酵的影响

无机盐对代谢产物的生成及微生物的正常生长都具有相当重要的影响。在微生物的生长代谢过程中，磷参与了微生物细胞中核酸等辅酶的构成，是微生物能量代谢、生长的重要因素之一。在苏云金芽抱杆菌的发酵产物苏云金素的分子结构中包含磷酸根，所以在其发酵培养基中添加更多磷酸盐，更有利于产物苏云金素的合成。钙离子在微生物发酵过程中的主要作用是调节细胞的生理状态，比如说维持细胞的胶体状态、降低细胞膜的通透性等。与此同时，在大多数发酵培养基里面，添加适量的CaC03，能够对发酵液含菌量的变化起到相当明显的影响，其主要原因是CaC03的添加对发酵液的pH值具有非常良好的缓冲作用，从而大大改善了菌体的生长环境。镁元素是许多酶的催化剂。锰、锌、铁、钼以及钴等元素是微生物所需要的微量元素。已有大量的相关研究表明，锰离子是枯草芽抱杆菌生长必不可少的元素，有很多相关方面的学者及研究人员通过研究指出，将适量的MnCl2添加到发酵培养基里面，能够使枯草芽抱杆菌发酵产物抑菌物质活性得以有效地提升。

2 培养条件对发酵的影响

2.1 种子质量对发酵的影响

微生物发酵中接入的种子质量对菌的生长以及产物的合成具有非常大的影响。种子的质量取决于以下两个方面，其分别为接种量以及接种的种龄。在发酵培养基中接入合适的接种量以及种龄适宜的优质种子液，能够使目标微生物更加迅速地进入到对数生长期，从而使发酵周期大大地减短，进而促使产物质量得以有效提升。如果种龄过长则会直接导致菌体过早的发生衰退，菌体的生产能力也随之而有一定程度的下降；如果种龄过短，则会直接导致菌体生长缓慢，产物合成时间大大推迟。若接种量过小，那么便会使得菌体细胞的生长量变小，从而使得对数生长期的时间、发酵时间有所延长，进而对一些酶及产物的生成造成极为不利的影响；如果接种量过大，那么便会直接加快微生物培养基的消耗速度，促使菌体生长过快，进而使得菌体提前进入到稳定期与衰亡期，对产物的合成造成极大的负面影响。

2.2 温度对发酵的影响

温度是保证酶活性的重要条件之一。过高的温度环境会对微生物细胞内的酶活性造成一定程度的破坏，严重地抑制微生物的正常生长，并且微生物细胞内的蛋白质在过高的温度环境下极易发生凝固或者变性，最终造成细胞死亡；而过低的温度环境也会对微生物的生长造成较大程度的抑制作用，故在发酵过程中必须保证最为适宜的温度环境。不同微生物菌种的生长温度不同，而生长与产物合成阶段的最适温度也有差异。在发酵温度的设计过程中要综合考虑其他的发酵条件及因素，比如培养基成分、能源消耗、发酵周期和产率水平等，必要时还可以考虑变温培养。

2.3 pH值对发酵的影响

最适pH值在很大程度上会直接影响到不同种类微生物生长以及产物的合成。pH值对微生物的影响主要是影响各种酶的生命活力，进而使得微生物的新陈代谢与生长繁殖发生较大的改变；除此之外，pH值对营养物质的利用以及细胞结构也有相当重要的影响。pH值会显著地影响培养基中的营养物以及中间代谢产物的解离，进而使微生物对这些物质的利用与吸收发生一定的改变。常亚飞等人在探究苏云金芽抱杆菌的过程中发现其芽抱萌发率在pH值7.0时最高，其芽抱萌发率在pH值过大或者过小时仅为40%，除此之外，若培养基pH值过高或者过低，还会直接影响到毒素产量，甚至有可能导致完全不产生伴胞晶体毒素。

2.4 溶氧对发酵的影响

溶氧是好氧微生物生长所必须的关键因素之一，只有提供足够量的氧才能维持菌的正常生长、代谢。溶氧对次生代谢产物的合成途径影响显著，而且还会对代谢的合成速度造成一定程度的影响。如果氧不足，那么便会造成微生物对营养物质的有氧氧化过程不能彻底地进行，从而影响发酵液pH值，产生有毒物质，与此同时，还会影响产物合成所需的前体物质的积累，进而影响菌体的生长以及产物的生成。在微生物发酵的过程中，通过调节通气量、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。摇瓶发酵可以采取降低装液量、增加转速来有效地增加溶氧量。叶云峰等人通过实验研究发现，装液量对枯草芽抱杆菌B47产抗菌物质的影响是最为显著的，菌体生成产物的能力随装液量的减少而大大增多，这充分地说明溶氧对产物合成具有正面的影响。

3 微生物发酵工艺优化的方法

通常情况下，微生物发酵工艺优化可以从培养基成分比例及培养条件两个方面进行优化。最近几年以来，随着统计学在微生物发酵领域的有效应用，优化方法从单因子设计法逐步发展成为正交试验设计、均匀设计等方法，更加系统高效。愈来愈多的研究人员通过统计软件对试验结果进行数学模拟与优化，利用Plackett-Burman试验设计方案来对优化因子进行科学的筛选，再在中心组合实验设计基础上采用响应面分析法以达到优化的目的。本文对目前集中比较常用的优化方法进行了比较详细的探讨。

3.1 正交试验设计法

正交试验设计法是利用正交表来分析多因素问题，通过多因素多水平实验得出相应的结果，然后再通过直接对比与直观分析来找出最佳的因素水平组合，通过这种方法可以对影响微生物发酵的主要因素进行确定。正交试验设计法具有方法简单、效率高以及工作量小等S多显著的优点，所以在对微生物发酵工艺进行优化的过程中，正交试验设计法是应用得最为普遍的方法。

3.2 Plackett-Burman设计法

Plackett-Burman法主要针对因子数较多且未确定众因子相对于响应变量的显著影响，采用的试验设计方法。能够及时有效地筛选出对试验结果具有显著影响的关键因素。在通常情况下，使用Plackett-Burman设计法开展的N次试验最多能够研究（N-1）个因素，对每个因素取两个水平，通常是设低水平为原始培养条件，高水平为低水平的1.25倍，通过对各个因素两水平的差异与整体的差异进行对比分析来对因素显著性进行确定。需要加以注意的是，如果因素水平选取得不合适有可能导致Plackett-Burman试验结果无效，从而需要重新选取因素来进行再一次的试验；如果Plackett-Burman试验的模型有效，那么则可以确定对试验具有显著影响的因素，然后下一步可以通过开展响应面设计等方法来筛选出最优的条件。袁辉林等利用Plackett-Burman设计方法获得了预期结果。

3.3 响应面设计法

响应面设计法主要结合统计分析、数学建模等方法经过试验设计来对相关数据进行分析，并利用多元二次回归方程来拟合函数关系，进而实现优化工艺参数的目的。响应面设计法对变量因素比较多的微生物发酵的参数优化效果是相当良好的，在Plackett-Burman试验结果的基础上，可以准确地确定出最优培养基配方、发酵因素等，从而有效地提高微生物发酵的产量。响应面设计法的适用范围是非常广泛的，其在生物学、制药、医学等方面已经获得了非常成熟的应用，且取得了良好的应用效果。

4 结语

随着科技的不断进步以及生物技术水平的持续提升，微生物发酵技术已经得到了非常广泛的发展，除了在农业与工业方面获得了广泛的应用外，其在医药领域的应用更加值得期待。利用微生物发酵技术可以有效地解决许多正常生产不能够解决的难题。合理运用微生物发酵技术，并对发酵工艺进行持续地优化与改进，可以有效地提升生产效率，推动发酵工程技术不断前进与健康发展，从而扩大微生物发酵在各领域的应用价值。

参考文献

[1] 张文芝，郭坚华.微生物发酵工艺优化研究进展[J].

广东农业科学，2013，（6）.

[2] 董昌健.对如何推动微生物发酵工艺优化的研究[J].

吉林农业，2013，（10）.

[3] 陈坚，刘立明，堵国成，等.发酵过程优化原理与技

术[M].北京：化学工业出版社，2009.

[4] 朱秀清，王玲.微生物发酵高温豆粕菌种筛选及发酵

工艺优化[J].食品与发酵工业，2012，（4）.

[5] 罗立新.微生物发酵生理学[M].北京：化学工业出

微生物培养方法篇4

[关键词]乌芪舒筋通络片；微生物限度；方法学研究；《中国药典》2015年版

[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）06（c）-0093-04

[Abstract]Objective To establish a microbial limit test method of Wuqi Shujin Tongluo tablets.Methods Methodology research on microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets was conducted according to the "1105，1106，1107" of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition with the fourth part.Results The total number of aerobic bacteria could be tested by plate dilution method and membrane filtration method，the total number of fungus and yeasts could be tested by the plate routine method，and the recovery was between 0.5 and 2，Escherichia coli，Salmonella，Bile salt resistant Gram-negative bacteria could be detected through control bacteria by direct inoculation method.Conclusion The total number of aerobic bacteria can be tested by plate dilution method，the total number of fungus and yeasts can be tested by plate routine method，and the control bacteria can be tested by direct inoculation method，the methods used are feasible，and easier to operate，which are suitable for the microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets.

[Key words]Wuqi Shujin Tongluo Tablets；Microbial limit；Methodology research；Chinese Pharmacopoeia 2015 edition

踯问娼钔络片是根据我院省名中医验方制成的纯中药制剂，具有补肝肾，通络止痛的作用，由细辛、制川乌、制草乌、桂枝、牛大力、防己、黑老虎、蜈蚣、走马胎、羚羊角骨、牛膝、黄芪、杜仲、续断、甘草等药味组成[1]。该制剂微生物限度检查法原按《中国药典》2010年版进行方法学验证[2]，随着《中国药典》2015年版的实施，新版微生物限度检查方法变化很大，必须重新进行验证。为此，本研究按《中国药典》2015 年版四部“1105、1106、1107”项下方法[3]，对该制剂的微生物限度检查方法进行了再次验证研究，制订了新的切实可行的微生物限度检查法，替代了旧标准，并应用于该制剂的日常检验，使该制剂的微生物限度检查法提升到新版《中国药典》的水平。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SZX型超净工作台（上海沪南科学仪器联营厂）；BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司）；YXQWF32-500卧式榘形压力蒸气消毒器（湖南衡阳医疗器械厂）；LRH-250A生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；MJ-160B-Ⅱ霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；CX31生物显微镜（奥林巴斯）；HTY HOMO761匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）；JA2003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；JC101型电热鼓风干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司、南通嘉程仪器有限公司合作出品）。

1.2 样品

乌芪舒筋通络片（肇庆市中医院，批号：15050401；15051102；15052401）。

1.3 菌种

实验所用的菌株传代次数不得超过5代[4]，并采用适宜的保藏方法保存，确保试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]。以上菌种均来自于中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：3105210）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：3105120）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：3105305）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：3105054）、麦康凯液体培养基（批号：3105291）、麦康凯琼脂培养基（批号：3105138）、RV沙门增菌液体培养基（批号：3104847）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号：3104852）、三铁塘琼脂培养基（批号：3105052）、肠道菌增菌液体培养基（批号：3105093）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号：3104750），均由广东环凯微生物科技有限公司生产，使用前先进行培养基的适用性检查，并且在有效期内使用，培养基的制备按照标示方法进行。

1.5稀释液、冲洗液

pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3105256）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：3105305）、0.9%无菌氯化钠溶液（自制）。

2 方法与结果

参照《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度检查法[3]进行验证。

2.1 菌液制备

2.1.1 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24 h；分别取各培养物 1 ml，加 0.9%无菌氯化钠溶液9 ml，按10 倍递增稀释级数制成每毫升含菌数为

2.1.2 白色念珠菌

取白色念珠菌的新鲜培养物接种至100 ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 d，取培养物 1 ml，加 0.9%无菌氯化钠溶液9 ml，按10 倍递增稀释级数制备成每毫升含菌数

2.1.3黑曲霉

取黑曲霉新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20～25℃培养5～7 d，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子。再选用适宜的方法将孢子悬液吸至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制备成每毫升含菌数

2.2 供试液的制备

取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基至100 ml，用匀浆仪打碎，混匀，作为1∶10的供试液。量取1∶10的供试液10 ml，加胰酪大豆胨液体培养基稀释至100 ml，混匀，作1∶100的供试液。

2.3 微生物计数方法适用性试验

2.3.1 平皿常规法

2.3.1.1 试验组 需氧菌总数计数：取1∶10的供试液5份，每份100 ml，分e加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制备2份，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，凝固，30～35℃中培养≤3 d，计数。

霉菌和酵母菌总数计数：取1∶10的供试液2份，每份100 ml，分别加入白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制备2份，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固，20～25℃中培养≤5 d，计数。

2.3.1.2 供试品对照组 取1∶10的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作。

2.3.1.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶10的供试液，按试验组项下方法操作，加入试验菌液并进行微生物回收试验。

2.3.1.4 计算 各菌株的回收率（R）=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%[5-6]，依据《中国药典》2015年版四部规定，比值R应为0.5≤R≤2[7-9]（表1）。

2.3.2 平皿稀释法

2.3.2.1 试验组 需氧菌总数计数：取1∶100的供试液5份，每份100 ml，按“2.3.1.1”项下方法操作。

霉菌和酵母菌总数计数：采用平皿常规法R为0.5～2，所以不再进行稀释法研究。

2.3.2.2 供试品对照组 取1∶100的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。

2.3.2.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶100的供试液，按试验组项下操作方法加入试验菌液并进行微生物回收试验。

2.3.2.4 计算 按“2.3.1.4”项下公式计算，结果见表2。

2.3.3 薄膜过滤法

2.3.3.1试验组 取1∶10供试液10 ml，滤过，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml，分2次冲洗滤膜，在第2次冲洗中加入相应的菌液适量（含菌量≤100 cfu），滤过，取出滤膜，需氧菌检查将膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基中，在30～35℃下培养，≤3 d，霉菌和酵母菌检查将膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，在20～25℃下培养≤3 d。

2.3.3.2 供试品对照组 取1∶10供试液10 ml，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。

2.3.3.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶10的供试液，按试验组项下操作方法加入试验菌液，同时进行微生物回收试验。

2.3.3.4 计算 按“2.3.1.4”项下公式计算，结果见表3。

由表1～3可知，乌芪舒筋通络片需氧菌总数计数检查采用平皿稀释法、薄膜过滤法，霉菌和酵母菌计数检查采用平皿常规法、薄膜过滤法，R均在0.5～2内，符合《中国药典》2015年版四部微生物学限度检查验证的要求。考虑到实际操作中，平皿常规法、平皿稀释法操作简便，优于操作繁琐的薄膜过滤法，故需氧菌总数计数法可选用培养基稀释法，霉菌和酵母菌总数计数检查选用平皿常规法为最佳方法。

2.4 控制菌适用性试验

2.4.1耐胆盐革兰阴性菌检查验证试验

取1∶10供试液适量，混匀，20～25℃培养2 h，作为预培养供试品。取预培养供试品3份，每份10 ml，分别加入10 ml肠道菌增菌液体培养基，第1份加入1 ml缓冲液作为供试品组，第2份加入1 ml大肠埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml）作大肠埃希菌阳性对照组，第3份加入1 ml铜绿假单胞菌（含菌量≤100 cfu/ml）作为铜绿假单胞菌阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培养基10 ml，加入10 ml肠道菌增菌液体培养基及1 ml缓冲液，作为阴性对照组。于30～35℃培养24～48 h，划线接种到紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃下培养18～24 h，观察菌落形态，结果见表4。

2.4.2大肠埃希菌检查验证试验

取1∶10供试液2份，每份10 ml，分别加入到100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，第1份加入1 ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份加入1 ml大肠埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml），混匀，作阳性对照组；另取胰酪大豆胨液体培养基110 ml，加入1 ml缓冲液，作为阴性对照组，均于30～35℃中培养18～24 h。

取以上培养物1 ml加入到100 ml麦康凯液体培养基中，在42～44℃下培养24～48 h。然后划线接种于麦康凯琼脂平板上，在30～35℃下培养18～72 h，观察菌落形态，结果见表5。

2.4.3沙门菌检查验证试验

取1∶10供试液2份，每份100 ml，第1份加入1 ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份加入1 ml沙门菌（含菌量≤100 cfu/ml），混匀，作阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培养基100 ml，加入1 ml缓冲液，作为阴性对照组，在30～35℃下培B18～24 h。然后分别取培养物0.1 ml，接种至10 ml RV沙门增菌液体培养基中，在30～35℃下培养18～24 h，取少量RV沙门增菌液体培养物，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂的培养基上，在30～35℃下培养18～48 h，用接种针挑选疑似菌落，进行斜面和高层穿刺接种于三糖铁琼脂培养基上，于30～35℃中培养18～24 h，观察菌落形态，结果见表6。

由表4～6可知，控制菌检查采用直接接种法，即可达到要求。

3讨论

2015年版与2010年版《中国药典》相比[10-11]，微生物计数法适用性试验，从对细菌总数作方法适用性检查，变成对需氧菌总数作方法适用性试验，试验菌株3种变为5种；培养基由胰酪大豆胨琼脂替代营养琼脂，用于检查需氧菌，沙氏葡萄糖琼脂培养基代替玫瑰红钠培养基，用于检查霉菌与酵母菌，虽然增加了试验的工作量，但却具有良好的广谱性，提高检出率，方法更灵敏[12]。对控制菌的检查，新版删除了大肠菌群的检查，新增了耐胆盐革兰阴性菌的检查[13]，对含有药材粉末的固体口服给药制剂都必须检查沙门菌，提高了对致病菌控制的要求。

乌芪舒筋通络片处方药味中多种成分含有抗菌活性[14-15]，由实验可知，对需氧菌具有抑制作用，故需氧菌总数计数检查时采用常规平皿法回收率较低，需选用平皿稀释法或薄膜过滤法。

在实际工作中，匀浆仪打碎样品时，经常出现泡沫，往往对验证结果造成影响，待泡沫消除后再加入菌种，基本能消除由操作引起的影响。

[参考文献]

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微生物培养方法篇5

“微生物的实验室培养”是人教版高中生物学“生物技术实践”模块中的重要学生活动。该课题中包括了培养基配制，微生物接种，微生物菌落形态观察以及微生物的分离纯化。这部分内容与人们的生活息息相关，学生也对实验充满兴趣，但按照教材实验设计及顺序安排实验会遇到一系列问题（如菌种的来源及保存，无菌条件等）。因此，笔者设计此实验，希望通过此实验让学生掌握微生物实验室培养的操作。

2 培养基的配置及灭菌

按照教材方法与步骤配置牛肉膏蛋白胨固体培养基。并将实验所需的培养皿以及配置好的培养基进行高压蒸汽灭菌。

3 培养手指上的微生物菌落并计数

3.1 倒平板

待培养基冷却凝固后，将每个培养皿底部用记号笔均分为两份。一侧用未清洗过的手指均匀涂抹培养基表面；另一侧用洗手液或者香皂清洗过的手指均匀涂抹培养基表面（需要标注区分两侧）。实验操作时，将学生分为两组，一组学生探究不同品牌洗手液的抑菌效果；另一组学生探究不同品牌香皂的抑菌效果。

3.2 培养

在28℃的条件下，培养微生物48 h后（若环境温度较低，需要延长培养时间），观察培养基表面的菌落的种类和数量，如图1所示。

3.3 统计菌落数

设计表格统计菌落数，见表1。

4 分离培养手指上的微生物

在培养基上不同形态的菌落中分别取菌种，然后用划线法接种到培养皿中进行单独培养。将各培养皿标记后置于培养箱中培养48 h，观察菌落的形态及颜色。

5 观察抑菌圈比较抑菌效果

5.1 制备洗手液和香皂溶液和滤纸片

称取等量洗手液与香皂分别与等量的蒸馏水混合后搅拌溶解备用。将滤纸剪成半径为6 mm的小圆片，将滤纸片与制备的溶液充分混合后靠在小烧杯壁，一段时间后待用。

5.2 纸片琼脂扩散法检测抑菌圈

用涂布法分别将分离培养的各种微生物接种至灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基上。将含有香皂和洗手液的滤纸片用灼烧灭菌的镊子分别贴在涂布接种微生物的培养基的表面，相互间隔一定的距离，置于室内倒置培养。

5.3 观察并测量抑菌圈大小

28℃条件下培养48 h后（若环境温度较低，需要延长培养时间），观察是否有抑菌圈的出现，并测量抑菌圈大小，如图2所示。

6 教学结果与反思

实验中学生可以直观地观察到不同的菌落形态，根据菌落形态的不同可以判断出微生物的种类不同，同时理解我们生活的环境及体表均有微生物存在。通过统计洗手前后培养基表面的菌落数量，可以发现洗手后培养基上微生物菌落数量确实少于洗手前。为了防止“病从口入”，勤洗手很重要。

在整个实验过程中，学生可以深刻理解微生物培养中无菌操作的重要性，也能体验微生物实验室培养的一般过程和方法。

微生物培养方法篇6

Abstract： This paper conducted an innovational reform research and constructed scientific teaching system of veterinary microbiology experiment from the aspects of the system of teaching content of veterinary microbiology experiment, teaching method and teaching security, around the practice skill training of students' comprehensive quality training, the ability of beginning, experimental comprehensive, independent thinking and clinical application etc. Based on some problems that the teaching method of veterinary microbiology experiment was inflexible and single, which separated from actual working procedure of veterinary clinic and was not conducive to the realization of training target of applied talents.

关键词： 兽医微生物学实验；实验教学体系；构建

Key words： veterinary microbiology experiment；system of experimental teaching；constructing

中图分类号：G42文献标识码：A文章编号：1006-4311（2010）35-0258-02

0引言

兽医微生物学是动物医学专业必修课程又是重要的专业基础课，是一门应用型和实践性都很强的学科[1]。兽医微生物学实验技术和方法广泛渗透其它专业课程，对动物疾病的诊断、预防和治疗等控制动物传染性疫病工作能力的综合培养有着重要意义。目前，兽医微生物学实验教学体系仍以传统教育模式为主，教学内容完全依附于理论课，教学方法刻板单一，脱离了兽医临床的实际工作程序，不利于培养学生独立发现问题、分析问题、解决问题的能力[2]，不利于学生实验技能和创新精神的培养，不利于应用型人才培养目标的实现，教学模式改革刻不容缓。

本研究拟从兽医微生物学实验教学内容、教学方法及评估体系等方面入手，围绕学生综合素质培养，强调动手能力、实验综合能力、独立思考能力、临床应用能力等实践技能的训练，进行创新改革研究，构建科学的兽医微生物学实验教学体系。

1确立兽医微生物学实验教学体系改革指导思想

基于教学研究型本科院校人才培养目标的定位特点，确立使学生得到微生学实验的基本操作技能，强调动手能力、实验综合能力、独立思考能力、临床应用能力等实践技能的训练，使学生学会利用这些技能解决兽医临床出现的问题作为兽医微生物学实践教学体系改革的指导思想。

2实验教学体系的构建与实践

2.1 实验教学内容体系构建与实践

2.1.1 对实验内容进行合理的删减和整合传统的兽医微生物学实践教学项目是为了配合理论教学内容安排的，设置的实验项目具有局限性、孤立性和单一性，并且与其他专业课程实验项目有重复，这样实验项目对于培养学生创新能力及兽医临床综合应用能力无疑是无益的，并且可能阻碍了学生创新思维和系统综合分析思维的发展。这与素质教育的要求格格不入。根据专业培养需要及实践教学改革需要，删去单纯验证理论知识的验证性实验项目，例如微生物数量的测定和细胞大小的测定实验项目、消毒和灭菌实验项目等。将一些孤立性的实验项目整合，例如将消毒和灭菌实验项目整合到培养基的制备及微生物学实验室常用玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌等实验项目中，不单独设置实验项目。细菌的分离培养技术（平板划线技术）与细菌菌落特征观察实验项目整合为细菌的分离培养和菌落特征观察，将细菌的简单染色和复染色技术整合为细菌的形态学观察，将细菌的形态学观察与细菌的纯培养技术实验项目整合为细菌的形态学观察及纯培养技术。要求学生对可疑菌落的细菌形态染色特征进行观察，同时对该菌落进行纯培养，以求获得可疑菌落的纯培养物，纯培养物的成功获得为后续的实验项目顺利开展打下基础。通过对实验内容合理的删减和整合，使兽医微生物学实践教学体系更加系统、完整和科学。

2.1.2 调整实验顺序，注重实验项目的连续性和完整性兽医微生物学实验教学体系是一个连续、系统的知识体系，实验教学最总目标是教给学生一种连续的微生物技术方法和手段，以便解决临床工作实际遇到的问题。据此，对实验项目开课顺序进行了调整，强调实验过程的整体性、系统性。调整顺序为：①微生物学实验室常用玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌；②培养基的制备和灭菌；③细菌的分离培养（四种未知病原菌）与细菌菌落特征观察；④细菌的形态学观察（简单染色、革兰氏染色）和纯培养技术；⑤细菌的生化实验；⑥细菌的药敏试验；7）动物实验法。通过调整，把一些孤立分散的实验项目有机整合成连续、系统、完整的组合实验，整个实验过程尽量符合病原微生物临床检验及科学研究的实际程序，模拟了现场工作中实验室诊断程序，培养了学生科学的思维方式和理论知识联系实际的能力，使学生养成工作有程序的良好习惯。

2.2 实验教学方法体系的构建与实践

2.2.1 以学生为本，构建能力开发型教学模式从查阅资料、制定实验方案、实验材料的准备，实验步骤地实施、结果的记录和分析及按研究论文形式撰写实验报告等方面，放手让学生自己完成，教师发挥指导作用，为学生创造科学研究的情境与途径，突出对学生独立工作能力的训练。在教学中，教师布置实验教学课题方向，要求学生查阅资料、制定详细实验方案，教师启发分析评价，引出兽医微生物学实验课堂教学内容。每个实验小组选出代表组成兽医微生物学实验兴趣小组，兴趣小组同学自行为本小组同学准备实验材料（实验所需试剂的配制、实验所需材料的消毒和灭菌、玻璃器皿的洗涤、带菌材料的处理等）。课堂教学时，向实验小组内每个同学提供不同实验对象（病原菌种类），确保实验小组内所有同学的实验步骤在大体相同前提下略有不同，致使小组内每个同学实验结果各不相同，要求学生认真观察自己的实验结果，并注意与小组内其它同学实验结果相比较，充分讨论分析，严格依据实验结果按照研究论文形式撰写实验报告。实验实施过程中，教师发挥引导作用，对不规范的操作加以纠正，注重审阅学生实验报告的结果和分析，以便更好了解学生在实践教学中实验技能和综合分析能力掌握情况。发现的问题可通过课前讨论，集中进行点评和指导，为学生创造科学研究的情境与途径，突出对学生独立工作能力的训练。

2.2.2 采用启发式、渐进式教学模式，教学设计采用环环相扣式 兽医微生物学实践教学体系是一个连续、系统的知识体系，良好的启发式教学开端对于学生顺利完成整个实践教学体系内容具有重要作用。整个实验教学过程可以从教师提出的对感染动物的某一未知病原微生物的分离和鉴定，并要求筛选到有效抗生素对症治疗课题开始，学生讨论解决办法，教师启发分析评价，引出课堂教学内容。由于设置的实验内容是解决临床工作实际遇到的问题，并与学生今后工作应对技能相联系，极大激发学生学习兴趣。学生顺着教师问题的启发，开展一系列的实验项目，每一实验项目的顺利完成，直接关系到下一个实验项目的顺利开展，通过一系列环环相扣的实验项目解决了教师在实践教学前设置的问题，整个实验教学过程完整、系统，教给学生一种连续的微生物技术方法和手段。具体操作为：课前教师可将未知病原菌编号，并向学生告知每个编号的未知病原菌引起疾病的临床症状表现，要求同学通过整个实践教学环节完成病原菌的分离，确定微生物大致的种类和筛选到有效的抗生素对症治疗。由于设置的实验内容是解决临床工作实际遇到的问题，并与学生今后工作应对技能相联系，极大激发学生学习兴趣。学生会顺着教师问题的启发，开展一系列的实验项目来完成课题。首先学生将完成常用《玻璃器皿的洗涤、包装和灭菌》实验项目，用自己处理并灭菌的玻璃器皿进行下一实验项目《培养基的制备（血平板的制备）和分装》；用自己配置的培养基进行下一实验项目《细菌的分离培养和菌落特征观察》；对分离培养所见的可疑菌落进行下一个实验项目《细菌的形态学鉴定和纯培养》；获得的病原菌纯培养物可进行下一个实验项目《细菌的生化鉴定实验》，同时可进行《细菌药敏实验》项目，筛选有效的抗生素对症治疗；也可将病原菌纯培养物进行下一个实验项目《动物实验》，在动物实验项目中可同时进行接种和采血技术的实验。整个实践教学采取“教师提出课题―学生讨论―教师启发点评―引出课堂教学内容”的启发式教学模式，课题相关实验项目函盖《兽医微生物学》重要基本实验，并且实验项目间环环相扣，与兽医临床实际工作紧密结合，组成完整的实验教学体系。加之每个学生待鉴定的病原微生种类不同，极大激发了学生学习的积极性、主动性和创造性，有利于培养学生创新性思维和综合素质。

2.3 实验教学测评体系的构建与实践改变传统实验测评体系，建立基本操作技能为考核重点的科学新型实验测评平台。兽医微生物学实验教学目的是使学生得到微生学实验的基本操作技能，学会利用这些技能解决兽医临床出现的问题。传统实验测评体系仅针对单一孤立的实验内容进行简单的笔试，考核结果不能很好反映学生的综合素质和创新性思维能力水平。研究尝试将考核内容整合为对微生物实验常用玻璃器皿的处理技术、培养基的配制和灭菌技术、细菌分离培养技术（平板划线分离法）、无菌操作技术、细菌抹片的制备和染色技术、动物接种和采血技术等几个重要技能的测评[3]。采用学生随机抽签方式，现场让学生公开操作并回答教师问题，教师当场打分和点评。教师可根据学生技能掌握情况、操作的熟练程度、回答问题的情况以及学生的实验报告书写等方面综合给出学生考试成绩。这种测评方式能使学生将已作过的实验再重复操作或观察一次，加深实验内容的理解，可操作性强，具有很强的实践性。

3实验教学保障体系构建与实践

3.1 修定兽医微生物学实验教学大纲大纲实验教学内容的选择必须涵盖要求学生掌握的基本实验技能，能较密切地联系临床实际，体现应用型人才培养目标的要求。以培养实践能力和创新精神为目标，以实验技术为主线，精选兽医微生物学实验项目。

3.2 建设实验教材实验教材是指导学生上好实验课的重要工具。教材应在原则上与理论教材保持一致的前提下，对实验内容进行合理删减和整合，注重实验内容的连续性和完整性，尽量符合临床检验实际和科学研究的实际程序，突出对学生独立的工作能力的训练。

3.3 建设“双师型“实验教学师资队伍为了保证实验教学的质量，必须建设“双师型”师资队伍体系。这是实践教学的基础性工程。为此，一方面鼓励专职教师参与各种类型的生产实践横向课题项目的研究，努力使其成为“双师型”或“双师素质”教师；另一方面引进“双师型”教师，或外聘具有实验经验的业界行家作为兼职教师，充实师资队伍力量。

参考文献：

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微生物培养方法篇7

关键词：纤维机构 微生物实验室 质量控制

目前，我国纺织品检测涉及微生物的标准主要有：《羽绒羽毛检验方 法》（ GB/T 10288―2003）?《抗 菌 针 织 品》（ FZ/T 73023―2006）?《絮用纤维制品通用技术要求》（GB 18383―2007）?《地毯抗微生物活性测定》（GB/T 23164―2008）?《 抗 菌 毛 巾 》 （ FZ /T62015―2009） 等?检测的产品涵盖羽绒羽毛及其制品填充物?抗菌针织品?生活用絮用纤维制品?地毯?抗菌毛巾等?涉及的微生物种类主要包括：嗜温性需氧菌?粪便链球菌?还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌?沙门氏菌?绿脓杆菌?溶血性链球菌?大肠杆菌?金黄色葡萄球菌?白色念珠菌等?作为纤检机构，应具备上述诸多标准的检测能力，最根本的是需形成科学?安全?高效的微生物实验室质量控制体系?

1、培养基

应建立和保持有效的适合试验范围的培养基（试剂）质量控制程序?培养基是指液体?半固体或固体形式的，含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖或保持其活力的物质?其质量的好坏将直接影响最终的检测结果?

1.1 购买

购买培养基时，要选择国内外知名品牌和市场信誉度高的产品，选择有质量保证能力和服务保证能力的企业?购买的数量要有计划，应控制在一年内使用完毕，尽可能买小包装的产品?

1.2 接收

接收培养基时，供应商需提供的文件有：培养基?独立成分?添加成分的名称及产品编号；批号；培养基使用前的 pH 值；储藏信息和有效期；技能评价和所使用的测试菌株；技术数据清单；质控证书；必要的危害数据?实验室收到培养基后，需检查?记录以下项目：培养基的名称?批号?数量；接收日期；首次开封日期；有效期；包装及其完整性；内容物的感官检查?

对于关键性的培养基，必须采取技术性验收，主要包括物理指标控制（pH 值?琼脂层的厚度?色泽?透明度和是否存在肉眼可见的杂质?凝胶稳定性?黏稠度和湿度）和微生物指标控制（污染测试?生长率测试?选择性测试?特异性测试）?发现下述情况的培养基应拒收：超过保质期；发生结块?颜色异常?脱水?有微生物生长和其他变质迹象?

1.3 保存和使用

应严格按照供应商提供的储存条件?有效期和使用方法进行培6养基的保存和使用?通常情况下，基础培养基在 4 ℃ 冰箱中保存应不超过 3 个月，或在室温（20 ℃）下保存不超过 1 个月?

1.4 制备记录

对各种培养基（试剂）的制备过程需有相应记录，其内容包括：培养基的名称和类型；配置日期和配置人员的标识；培养基的体积；分装的体积；成分?每种成分物质的含量?制造商?批号；最初 pH 值和最终 pH 值；无菌措施?

2、菌种

应建立所有菌种或标本的收集?接种传代?确认试验?贮藏的质量控制程序?

2.1 收集

标准菌种或标本需从认可的菌种保藏中心[如中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CMCC）]或经 ISO9001 认证的商业机构[如美国细菌收集和分型中心（ATCC）]处获得?接收菌种时，需记录菌种的名称?来源?接收日期等信息?

2.2 接种传代

将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作称之为接种，方法主要有斜面接种?液体接种等?接种传代时需记录菌种名称?接种日期?接种数量?支取数量?传代序数?废弃处理等信息?所有标准培养物从储备菌株传代培养次数不得超过 5 次，除非标准方法中要求并规定，或实验室能够提供文件化证据证明其相关特性没有改变?工作菌株不能传代，不可替代标准菌株?标准菌株的商业派生菌株仅可用作工作菌株?

2.3 确认试验

为保证试验质量，需对标准储备菌株进行确认试验?确认试验主要包括菌种纯化和生理生化鉴定（革兰氏染色?糖类发酵试验?乙酰甲基甲醇试验?甲基红试验?吲哚试验），需记录好菌种纯化方式及各试验的结果等信息?

2.4 贮藏

目前，贮藏方法主要有斜面贮藏?半固体穿刺贮藏?石蜡油封存?沙土管贮藏等?其中，冷冻干燥贮藏比较常见?实验员需记录贮藏方法?贮藏条件?有效期等信息?贮藏时，对于购买的标准菌株，要以原始的包装形式进行贮藏，复苏和使用应按照厂商提供的使用说明进行?

冷冻菌种在 - 70 ℃ 以下可无限期存放，在 - 50 ～ - 70 ℃ 可存放一年，但此方法并不适用于所有菌株?

3、废弃物处理

对于微生物实验室涉及到的弃置的培养基及其他可能受到污染的废弃物，都应采用安全且符合相关法律法规规定的方式进行处理?可参考的方法有：-使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂（次氯酸盐?乙醇?甲醛?戊二醛?碘载体等）处理一定时间，或121 ℃高压灭菌至少30 min?-记录并保留废弃物处理的记录，包括废弃物名称?处理原因?处理方式?处理日期?处理人等?

4、设施与人员

微生物实验室的布局以区域尽头为宜，以减少潜在的对样本的污染和对人员的危害?对无菌条件要求的工作区域，应予以明确标识，并能有效地控制?监测和记录?实验室内无菌工器具和器皿应有明显的标识，目的是与非无菌工器具和器皿加以区别?微生物检测所涉及的常规的仪器设备的情节?维护，应做好相应的记录?无菌室空气灭菌效果应至少每月检验一次，方法可参考沉降法，同时做好记录?

专业人才的缺乏是制约纤检机构开展纺织品微生物检测的最大瓶颈，应加大对此类人才的引进与储备?由于微生物检测的菌种多为致病菌，因此从事检测的人员须具备一定的微生物学或相近专业的资质?对新进员工应进行相应的检测技能的培训，结束后需进行确认，以保证其具备胜任工作所必需的设备操作?微生物检测技能，符合实验室生物安全要求，并开展针对所有级别检测人员的继续教育计划?

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微生物培养方法篇8

关键词：微生物限度；检验成本；检验经费

药品微生物限度检验技术发展30多年来，不管是从可靠性还是准确性上都取得了突破性的提高。但同时我们也应看到，检验的要求提高了，环节复杂了，仪器的使用度也提高了，最为明显的是增加了微生物限度的方法验证和培养基的适用性检查，并规定任何一种药品在进行微生物限度检查前，都要进行方法学的相关验证[1]，即使有验证方法，但由于药品组分或检验条件发生了变化，也应重新进行方法验证，这都需要有一定的人力与物力作为支持。目前药品的监督抽验检验经费由财政拨付，对微生物限度检查的检验经费远远不足，这直接影响了药品微生物限度检查的检验率，制约了药品的全检率。为了更好地促进药品检验事业的健康发展，笔者在平时试验的基础上结合当前物价水平就药品微生物限度检验成本的费用问题进行了调查与分析。

1 药品微生物限度检验经费现状

目前，各地市药检所包括省药检所在这一项目上的经费拨付主要是依据《国家发展和改革委员会财政部关于调整药品检验收费标准及有关事项的通知》（发改价格[2003]213号）这一文件执行的，常规微生物限度检查项目规定收费380元。这个就带来两个问题：①没有考虑方法验证（2010版中国药典没有要求），只是单纯的检查费用，举个简单的例子，若计数全部采用常规法，控制菌仅检查大肠埃希菌，那么按照这个文件检验费用大概为600元左右，但如果按照目前的检验标准，仅成本费就远远不够，如果验证方法复杂，耗材费用还会更高；②2003年到现在已有10年之久，物价水平截然不同，所以不能以当时的物价来确定现在的检验费用。因此，这一标准完全不能补偿药品微生物限度检查的成本支出。目前地市药检所每年仅做极少数的微生物限度检查，有的干脆不做，严重影响了药品检验工作的开展。

2 药品微生物限度检验成本费用分析

2.1菌液的制备 首先要从菌种保藏中心购买原始菌种管，也就是冻干粉，接下来是标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备，最后按照药典要求把每种菌株稀释成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。试验中用到的菌株主要有大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌以及铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌和生孢梭菌8种。其中，前5种菌株主要用于计数方法验证，后3种主要用于控制菌的方法验证。我们根据平时的试验过程及大量的调查研究，得出做一次方法验证（菌株种类按前5种进行核算）菌液的制备费用=菌种购买及活化（163元）+斜面传代（87元）+菌的稀释和计数（467元），合计为717元。

2.2培养基的适用性检查 由于当前培养基种类繁多，质量也是参差不齐，这势必给检验带来一定的影响，最终将影响结果的准确性和一致性。针对这一问题，2010年版《中国药典》新增了培养基适用性检查这一项目，以确定培养基质量是否满足检验所需要求。它包括计数培养基的适用性检查和控制菌检查用培养基的适用性检查。对计数培养基的适用性检查我们采用的方法是回收率测定法，即被检培养基上的菌落平均数应不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致[2]。控制菌检查是用于检查某些特定微生物，主要包括大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌7种，它的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。相应的参考费用见表1。

2.3计数方法验证

2.3.1无抑菌性的供试品 我们直接采用平皿法（1ml/皿）分别对每种代表菌株一一进行验证，验证试验一般分为试验组、菌液组、供试品组，而且要进行3次独立的平行试验，且任意一次试验组的菌数回收率均不应低于70%[3]，只有这样验证方法才算通过。

2.3.2有抑菌性的供试品 首先应先采用平皿法进行验证试验，如果回收率不满足要求，应依次采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌性，并重新进行方法验证。因此，此类样品的检验费用应再进行追加，而不是一概而论。

我们根据以往的试验经验，列举了几种常见的验证方法。其中，细菌计数主要以平皿法（1ml/皿）、稀释法（0.5ml/皿）、稀释法（0.2ml/皿）和薄膜过滤法（冲洗液为500ml）为主；霉菌以平皿法（1ml/皿）为主，相关检验费用见表2。

2.4控制菌检查方法验证 当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。试验组验证过程基本上可以分为增菌、分离、纯培养、革兰染色和生化鉴定几个步骤。同计数验证一样，如果样品抑菌性很强，常规法无法进行增菌，也应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性。我们结合平时的试验耗材，对主要的7种控制菌的方法验证费用（包括检查费用）做了一些调查和分析，以常规法为主。具体费用见表3。

3 建议

药品检验成本应以检验项目为单位，分为能源资源消耗成本摊入成本、一次性实验耗材成本、多次性使用实验耗材成本、仪器及配套设备损耗成本（本文未考虑）、检验人员的工费（本文未考虑）五个部分进行计算。我们以2010年版《中国药典》微生物限度检验标准为依据，结合表2和表3对不同品种药品微生物限度的检验成本做了小结（见表4），也得出了一个成本费用的参考数字2400元。也就是说，按照2010年版《中国药典》对微生物限度的相关标准，一个药品的微生物限度检查的投入成本费用大概在2400元左右，这还没有把检验人员的工费（大概在2000元左右）考虑在内。希望上级有关部门对以上得出的数据能予以参考，使药品微生物限度检验经费能够随检验标准及物价水平的变化等因素得以及时调整，避免因检验经费标准滞后影响药品微生物限度检查项目正常开展，制约药品的全检率，确保检验经费公正、合理、贴近实际，促进药品检验事业健康发展[4]。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典2010年版[S]一部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-88.

[2]马仕洪，杨美琴，刘鹏，等.《中国药典》2010年版对照培养基的研制与应用[J].中国药事，2012，26（8）：847-851.

微生物培养方法篇9

关键词：微生物高细胞密度 食品添加剂 应用

引言

目前，微生物高细胞密度培养技术已经发展为生物化工领域的重点研究课题，也是微生物技术生产的核心技术。微生物高细胞密度培养技术具有很多优点，它可以缩短产品生产周期，降低企业生产成本，减少设备投资。通过对微生物高细胞密度培养技术的研究，充分了解微生物的生产特性，进而提高微生物产品生产率。通过技术的革新，提高生产水平，促进食品添加剂行业的发展。

一、微生物高细胞密度培养技术研究

1.影响高密度细胞生长的因素

微生物高细胞密度培养技术是生物工程中的一项新技术，实现高细胞密度培养需要调解影响细胞生长速度和生长周期的制性因素。在高细胞密度培养过程中，影响细胞培养的因素主要包括限限制性底物、生长抑制性物质、溶解氧、发酵液流变学特性等等。

在高细胞密度培养过程中，要满足高细胞密度的新陈代谢和生长需要，我们需要在细胞内加入高浓度的底物，为细胞生长提供营养需要。从目前阶段的细胞培养来看，多数情况的底物采用甘油作为碳源，从而减少细胞培养过程中产生的乙酸，从而提高细胞密度。

在高细胞密度培养过程中，细胞的新陈代谢出现许多副产物例如乙酸、乙醇等等，这些副产物对细胞的生长和细胞浓度具有很强的抑制性作用。在培养过程中，如果乙酸浓度过高，培养皿内的大肠杆菌就会停止生长，因此，如果通过生物技术维持较高的溶解氧浓度，可以维护高细胞浓度的生长。

高细胞密度经过发酵的过程，由于细菌的生长，菌体体积会发生变化。在发酵体系培养过程中，会存在气、液、固三种形态的变化。而且菌体的变化会影响微生物细胞的增殖、生长和代谢。通过发酵液流变学特性，影响细胞的生长。

2.高细胞密度培养生物反应器

在微生物高细胞密度培养过程中，需要用到良好的生物反应器。在培养过程中，常用的反应器皿主要有搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、膜生物反应器等等。搅拌式生物反应器可以保证培养物的混合均匀，从而保证培养液的浓度。气升式生物反应器可以实现较高的溶解氧密度，从而为微生物的生长提供高浓度的溶解氧的要求。

膜生物反应器是通过膜分离技术可以将培养物与产物进行分离，从而促进产物的分离，从而保证产物的浓度。在大多数情况下，微生物细胞培养底物与产物存在连续性的输入和输出。而且通过膜分离技术，有助于菌体的生长。

在微生物反映过程中，透析反应器可以根据不同溶质分子对半透膜的扩散速度，从而促进细胞的分离。通过透析反应可可以将培养液中的低分子代谢产物透析出来，在培养液中保留细胞与大分子产物。在细胞培养过程中，通过半透膜的透析反应器，我们可以有效解除代谢产物乙酸、乙醇的抑制作用。

二、微生物高细胞密度培养技术在食品添加剂中的应用

在食品添加剂生产中，一般主要采用化学合成、生物合成和天然提取三种途径进行生产。生物合成技术是现代食品添加剂生产的重要方式，也是发酵工程的首选生产方式。利用微生物发酵生产技术，可以生产维生素、防腐剂、色素等多种食品添加剂。这里重点介绍几种微生物高细胞密度培养技术生产的食品添加剂。

1.虾青素

虾青素是一种存在于鱼、藻类等生物中的色素物质，它具有很强的抗氧化性，同时还能增强机体免疫力的作用。通过微生物高细胞密度培养技术，会对细胞的培养具有很大的影响。而真菌细胞可以产生虾青素，通过真菌细胞的培养技术，以法夫酵母的方式培养细胞，从而提高虾青素的高产率。

法夫酵母技术的培养中，ph值是影响细胞浓度的关键因素之一。在细胞的培养过程中，我们需要根据菌体的生长需要，将培养液的ph值维持在6.0左右，从而保证微生物菌体生长速度达到最大值。一般情况下，在虾青素培养过程中，虾青素的大量积累会导致ph值下降，进而影响到菌体的生长。

2.植酸酶

植酸酶是一种胞外酶，它广泛存在于动植物和微生物中，作为植酸酶能够降低食物中的植酸而且改善人体对磷、钙等矿物质的吸收。植酸酶是食品加工助剂，它可以有效地改善食品性能，从而提高食品的营养价值。而且，近年来，随着微生物发酵技术的发展，微生物高细胞密度培养技术具有很多中培养方法，它可以有效地改善营养液的环境，从而提高微生物的生产环境。

在培养高细胞密度培养技术培养植酸酶，需要根据菌体浓度和酶的活性，根据酵母膏条件获取较高的菌体浓度，从而提高植酸酶的浓度。但是，这就要求我们要保证菌体的生产环境，减少乙酸等细胞副产物对细胞生产的抑制作用，从而提高添加剂产量。

结语：微生物高细胞密度培养技术是生物工程中的一项重要生产技术，它可以改变微生物的生产环节，提高微生物的生产速率，缩短微生物生长周期，从而增加食品添加剂的产量，大大提高产品生产效率。通过分析微生物高细胞密度培养技术的影响因素，希望可以大大提高微生物高细胞产物的生产量，从而提高食品添加剂的生产效率。

参考文献：

[1]李寅，高海军，陈坚.高细胞密度发酵技术[M].北京：化学工业出版社，2006：4-5.

微生物培养方法篇10

例1（2009年安徽理综卷）下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（）

A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时

D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

解析：确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的进行计数，求其平均值，再通过计算得出土壤中细菌总数。

点拨：配置培养基时，要用无菌水，不能用自来水，以防止杂菌污染，同时防止自来水中的其他物质影响培养基的成分。

二、考查微生物的分离、培养

例2（2009年宁夏理综卷）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑______、______和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、______等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。

（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行______（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和______；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能______。

（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的______。

（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的______。

（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是______。

（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过______处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。

解析：（1）大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。

（2）灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，对培养基和培养皿要进行灭菌。消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，对操作者的双手需要进行清洗和消毒。紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。

（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养，应保证样品稀释的比例适合。

（4）对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定。

（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。

（6）因为有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症状，使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。

点拨：注意区分消毒和灭菌，不能把消毒和灭菌的概念混淆。消毒一般只是消灭体表大部分微生物，而灭菌是杀灭所有的微生物及其孢子等。

三、综合考查微生物的应用

例3（2007年宁夏理综卷）某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。

（1）培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了______和______。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是______和______。

（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是______。

（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于______中培养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种______作为对照进行实验。

（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有______种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越______。

（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐______细菌，这种培养基被称为______。