生物样品原子荧光光谱法测试技术研究

[摘要]在原子荧光的含量分析过程中，由于生物样品成分复杂，对于不同种类的生物样品，其前处理方法的多样性对分析测试的效率和精密度均有影响，并有多种进样技术被用于生物样品的分析测试中。本文归纳总结了目前原子荧光光谱技术中常见的生物样品如绿叶植物、果蔬、粮食制品、酒类、动物源制品等生命应用等领域的常见生物类样品的预处理及仪器进样与联用技术，旨在为与生物样品相关的原子荧光分析提供参考。

[关键词]生物样品；原子荧光；前处理；消解；进样技术

原子荧光光谱分析技术基于不同原子的波长辐射特异性，经荧光强度对样品进行定量分析，具有高效率和高准确率的特点，被广泛应用于污染检测，食品科学，生命科学，地质学等领域[1-3]。目前，我国已将利用原子荧光光谱分析技术检测食品中的重金属含量列为国家检测标准之一。在原子荧光光谱分析领域，所涉及的生物样品种类繁多，且不同种类的样品如植物、肉类、粮食、粮油、毛发等的有机物组成和元素含量有较大差别，在实际测试时，选用有针对性的样品预处理方法与进样预处理联用技术，有利于提高测试效率，降低基体干扰，减少仪器损耗。不同于常规岩石，矿石，沉积物，土壤等固体样品，为了保证样品的代表性和结果的可靠性，在样品消解前，需有针对性地进行选材，干燥，匀浆和研磨等预处理流程。此外，生物样品含有大量有机物，目前采用的前处理消解方法有直接稀释法、萃取法、干灰化法、酸溶法、加压分解法、微波消解法和酶分解法等。其中，低温干灰化法和高温干灰化法中高温或干燥的处理过程，会使微量金属离子损失严重，导致各微量元素的回收率降低。一般采用酸溶法破坏样品中的有机物，释放被测元素，以利于后续测定。常见的酸溶法有敞口酸消解法、加压消解法和微波消解法等。针对不同类型的生物样品，在消解前，需要进行预处理。

1样品预处理

1.1植源性样品

植物根、茎、叶样品经清洗，低温干燥，研磨，过筛后，使用酸溶法溶解。在敞开酸溶法中，一般采用硝酸+高氯酸组合，加热溶解样品。使用微波消解时，一般采用硝酸+过氧化氢溶解样品。陈双等[4]优化了微波消解茶叶的硝酸和过氧化氢最佳含量，提出硝酸8mL和过氧化氢1mL进行消解时，可将0.2000g茶叶完全消解，且荧光强度较好。蔬菜、水果类样品，将样品清洗干净后，将样品分为皮、果肉和种子，果肉可用搅拌机打成糊状并匀浆；或将果皮，果肉，种子分别用烘箱低温烘干至恒重，粉碎研磨后备用。大米，淀粉类粮食样品，直接研磨，过筛后，使用酸溶法溶解。酒类样品，将样品先进行低温消解，挥发酒精，整个过程中应注意防止样品沸腾以致碳化。在样品剩余1~2mL时加入硝酸进行常规酸溶法消解。粮油类样品，可直接称取样品后进行消解处理。沈佳等[1]在使用原子荧光光谱法测定山茶油中的痕量砷时发现，使用湿法消解过程中，样品反应剧烈，易有泡沫溢出且易爆沸，且样品容易发生碳化。经优化后发现消化0.30g样品油，使用硝酸6mL和过氧化氢4mL进行消解时，消解最完全，测定结果的精密度较为理想。开建荣[6]等将大米用粉碎机粉碎，过100目筛，称取适量过筛后的大米粉分别按照10毫升混合酸(硝酸与高氯酸体积比为4︰1)湿法消解和6mL硝酸混合2mL过氧化氢微波消解进行前处理，测试的结果表明，微波消解试剂消耗量少，耗时短，过程繁琐，从可量化的指标来看，微波消解优于湿法消解。此外，对于菌类样品，金针菇等携带培养基质的鲜品，需去除根部培养基；双孢蘑菇、草菇、香菇等鲜品，需将带有培养基质或覆土的菇脚部分去除，并用干净纱布或毛刷轻轻擦去样品表面的附着物。水分含量在15%以上的干制食用菌样品，清洗完后需在60~70℃下烘至适宜粉碎(用于农药残留检测的样品除外)，同时测定烘干前后样品水分。食用菌干品，用干净毛刷或纱布除去表面附着物，不可水洗。经碎样后进行常规酸溶法消解。

1.2动物源性样品

由于动物源性样品具有含量较高的蛋白质和营养物质，在使用硝酸+高氯酸进行敞开酸溶时，容易出现碳化现象，一般采用微波消解法消解。对于鱼/肉类样品，将鱼/肉类解剖并取对应组织，去掉组织样品中的皮，脂肪，筋，用纯水洗净后匀浆后冻干，保存于-20度冰箱中待测。测试时，称取已冻干的样品，在室温下自然解冻至稍微变软，且冻水未流出时，使用微波消解法消解。对于鸡蛋，牛奶类样品，用高速离心分散器匀浆至完全混匀后，取适量样品使用微波消解法消解。吴平[7]等在使用原子荧光法测定牛奶中的铅时，使用了免消解的酸蛋白沉淀方法，在还原剂中加入弱酸，测试方法具有良好的准确度。

1.3生命样品

人发样品，原始发样先用洗洁精溶液搅拌浸洗数次后，再用去离子高纯水洗净，沥干。浸入丙酮中2~3h脱脂后，用不锈钢剪将其剪成3~5mm的发段，置于80℃烘箱中烘至恒重。游富英等[8]采用了三种消解方法对比，在电热板消解和灰化法的基础上，使用浓硝酸消解部分样品后，滴加过氧化氢的非完全消解法，只要求消解液均匀、透明，不要求分解其中的可溶有机物，提高了消解反应的速度，大大缩短了消解时间，与前2种方法比较，具有耗用试剂量少、温度低、消解时间短等优点。血液样品[9]，将采集的血液样品置于肝素钠采血管中，充分混匀，常温下运输，于4度冰箱中保存。将样品从冰箱中取出，室温条件下放置30min，将样品充分摇匀后，取1mL血样于微波消解管中，加入3mL质量分数65%浓硝酸和1mL30%过氧化氢，密封后置于微波消解仪消解。

2进样技术

原子荧光光谱的仪器进样方式与仪器的原子化器类型有关。通常分为直接进样，化学蒸气发生进样和电热蒸发进样等。其中直接进样技术受到实验室环境，原子干扰及背景干扰等多重约束，基本用于激光剥蚀原子荧光光谱研究。2.1蒸气发生法蒸气发生法指将待测物气化后传输进行测定，常见的蒸气发生形式有冷蒸气、氢化物、冷蒸气、卤化物、氧化物、烷基衍生物、羰基衍生物、挥发性金属螯合物、电化学、紫外光化学和等离子体诱导等。其中，氢化物发生法是目前应用最广泛的方法之一，具有高原子化率，高灵敏度的特点。此外，基于元素的不同形态所需的蒸气发生条件不同，还可用于元素的形态分析。硼氢化物-酸体系使用硼氢化钠还原法实现待测元素的氢化物蒸气发生，可实现批量样品加入，具有快速高效反应的特点，是目前最为广泛采用的原子荧光测试方法之一。通常使用盐酸作为分解剂，也可使用柠檬酸、草酸、酒石酸、磷酸、硫酸、硝酸等[10]。硼氢化物-酸体系易受到过度金属离子，氢化物发生元素等基体干扰；常用的硼氢化物还原剂易分解，需当天配置；氢化反应效率不稳定，受多种因素干扰等缺点，因此，开发非硼氢化物-酸体系的蒸气发生方法具有较大研究潜力。相比于硼氢化物-酸体系，电化学氢化物发生(EcHG)通过电解还原获取氢化物，具有绿色环保的优点。近年来，电化学氢化物发生法蓬勃发展，最为广泛的测试应用为砷、锑、硒等元素、已经开展的相关研究有树叶、茶叶、猪肾、贻贝组织、大米、中药、牛肝、鱼肉等样品的测定[11-12]。紫外光化学蒸气发生利用紫外光将溶液中的离子转化为挥发性氢化物，也可以将一些金属离子从高价态还原为低价态或原子态。研究表明[13]，使用紫外光还原Se，用原子荧光光谱测定，其蒸气发生效率比用KBH4还原提高53.3%。Li等[14]采用样品基体辅助化学蒸气发生技术，在紫外光下，用乙醇还原汞离子，检测酒中的痕量汞，利用酒中的乙醇(样品基体辅助)作为还原剂，在紫外光下还原酒中的汞，将甲基汞氧化分解为无机汞，使用原子荧光光谱进行测定。Sturgeon等[13]利用紫外光UV低压汞灯还原法生成了多种Se化合物，显著降低了共存离子的干扰，实现了样品的高效定量分析，这一方法常被应用于测量样品的汞元素和硒元素的总量及形态分析。等离子体诱导蒸气发生利用冷等离子体与液体相互作用产生活性物质，诱导样品中待测元素发生等离子体化学反应生成挥发性物质，无需使用还原剂，反应效率高，速度快。其中，介质阻挡放电(Dielectricbarrierdischarge，DBD)是一种低温等离子产生的有效方式。He[14]等使用PVG作为介质阻挡放点(DBD)激发源的进样接口，实现了疫苗中的硫柳汞分析。Liu等[15]将悬浊液进样氢化物生成方法与DBD-原子荧光光谱法结合，进行生物样品中的超痕量砷的检测。将制备好样品的悬浊液引入HG-DBD-AFS中，同时优化原位DBD的放电和工作气体条件，无需额外的预富集就可分别获得8pg微量生物样品和14pg人发样品的LOD(2mL样品)。与传统的消解预处理原子光谱法相比，该方法在简便、快速、低成本、绿色和安全性方面具有优势，适合测定生物样品中的痕量砷，保护人体健康和环境安全。2.2电热蒸发法电热蒸发(Electrothermalvaporization，ETV)是一种高进样效率的固体直接进样技术，其特点是在惰性介质中将样品中的待测元素以固体气溶胶的形式激发传输，无需进行样品消解。常见的电热蒸发技术分为金属材料-电热蒸发，石英管-电热蒸发和石墨管-电热蒸发，电磁感应加热技术等，通常用于汞、镉元素的测定。ETV装置主要采用石墨和多孔碳作为电极材料，其寿命较短，且部分元素可能生成碳化物影响分析的准确性。通常将高熔点金属(钨、钼、铂、铼)等均匀覆盖在石墨管表面，可以有效改善这一情况。Jiang等[16]使用钨丝电热蒸发进行原子荧光光谱仪进样，在Ar/H2还原性气氛下，消解处理后同时测定人发样品中的痕量Cd和Pb。催化热解-金汞齐法利用ETV技术，将ETV-催化热解得到的Hg原子蒸气用金，铂等材质的汞齐装置捕获，再通过快速升温释放汞原子，是目前被广泛采用的固体进样重金属速测技术之一。Li等[17]利用氯化亚锡还原样品中的汞，使用电热蒸发直接进样，实现了鱼肉样品的痕量汞快速测定。电磁感应加热技术是一种利用电磁感应原理实现电热蒸发方法，可以在短时间内实现金属介质的快速升温，近年来，也展现出了应用于生物样品的测试的潜力。Duford等[18]将IH-ETV装置与AFS串联，用于测定人发发样品中Hg。Liu等[19]利用介质阻挡放电(DBD)微等离子体缠上的自由基和紫外辐射，针对水产品中有机物含量高的极致特点，研制了了用于消解气态有机物的DBD装置，对ETV导入鱼肉样品所产生的气象干扰物质进行降解，水产品中Hg的LOD可达到0.5ug/kg。

3萃取技术

受限于原子荧光光谱进样技术的复杂性，在生物样品的测试过程中，萃取技术常与原子荧光结合，展示其独特的优越性。郑宇等[20]使用固相萃取技术与原子荧光光谱技术结合，对稻米中的无机硒进行固相分离萃取后再进行原子荧光光谱检测，无需对样品进行酶解，优化了样品处理过程，并获得了较好的精密度与准确。史永富等[21]采用甲苯萃取-原子荧光光谱法对鱼肉中甲基汞进行了检测，并对方法的准确度和精密度进行了验证，获得了较高的回收率。

4结论与展望

原子荧光光谱法是检测生物样品中的重金属和污染元素的重要检测技术，在测试不同的生物样品时，采用不同的预处理，消解及进样技术，提高了分析效率。原子荧光光谱的预处理及进样技术也在日趋进步，基于蒸气发生和电热蒸发的多重联用测试体系，可以满足生物样品的各类元素及形态分析的测试需求。未来，拓展各进样方法对各类生物样品的普适性，将使原子荧光光谱技术更加蓬勃发展。

作者：胡伟康 方晓青 单位：湖北省地质实验测试中心