胃幽门螺杆菌染色质量控制研究

经大量临床病例证实，消化系统的胃黏膜病变、溃疡、胃淋巴增生性病变、慢性胃炎甚至胃癌均与幽门螺杆菌(HP)感染有一定的关系。我国目前处于HP感染高发区，通常HP感染缺乏典型的临床特征，故早期的临床诊断及治疗显得尤为重要。病理诊断HP感染是临床诊断的重要依据，但在常规病理HE切片中不易观察到HP，难以明确病理诊断，因此只能用特殊染色法才能使HP更清晰的显示出来。目前检测HP的方法有10余种，哪些方法最好、如何进行HP染色的质量控制、使染色结果稳定可靠且准确是目前工作中的关键。本文就这些染色法中的关键问题、注意事项以及HP实验操作问题、染色液配制及染色结果观察判断等问题进行探讨。

1材料与方法

1.1材料。选取本院2018-05—08间临床诊断的活动性胃炎胃黏膜活检标本65例。1.2方法。将65例石蜡标本连续切片，制成4μm厚的切片，每例取3张，分别进行硼酸亚甲蓝染色、改良Giemsa染色和硝酸银染色。1.2.1试剂配制①硼酸亚甲蓝染液配制:把1g亚甲蓝和1g硼酸加入100ml蒸馏水中充分混合溶解。②改良Giemsa染液配制:Giemsa染液:Giemsa染液0.75g加甲醇50ml于50度水浴箱中使其充分溶解，其间不断搅拌，冷却后加入50ml甘油;石炭酸复红液:碱性品红50mg溶于95%乙醇100ml，再加入4%苯酚250ml及蒸馏水650m，充分混合即可。③硝酸银液配制:醋酸贮备液:双蒸馏水加1%柠檬酸液，调节PH值为3.6～4.0之间;5%明胶液:明胶5g加醋酸贮备液100ml溶解;③显影液:3%对苯二酚1ml与5%明胶15ml充分混合，显影前5min加入2%硝酸银3ml混合。1.2.2染色步骤①硼酸亚甲蓝染色:切片脱蜡至水，硼酸亚甲蓝染液染色5min，水洗，烘干切片，中性树胶封固。②改良Giemsa染色:组织切片脱腊至水，改良Giemsa染液染色20min后水洗，石炭酸复红液染1min，不洗直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。③硝酸银染色:切片脱蜡至水，醋酸贮备液洗切片，把切片置入1%硝酸银于56℃水浴箱45min，切片取出不经水洗，滴入显影液56℃水浴反应2min，切片立即取出，自来水稍洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。1.3结果判定。切片高倍镜下，阳性的幽门螺杆菌形态弯曲，短杆状，分布在胃黏膜凹陷内。硼酸亚甲蓝染色法幽螺杆菌呈蓝色;改良Giemsa染色法幽门螺杆菌呈红色;硝酸银染色法幽门螺杆菌呈棕黑色。

2结果

65例胃黏膜标本中，经硼酸亚甲蓝检出55例HP阳性，阳性率85%(图1);经Giemsa染色49例阳性，阳性率75%(图2);经硝酸银染色检出52例阳性，阳性率80%(图3)。三项染色阳性的数据比较差别显著(P＜0.05)。

3讨论

本实验显示，3种染色方法胃幽门螺杆菌均有较高的阳性检出率，三者阳性率相差不明显。胃幽门螺杆菌中含有蛋白和多糖物质，在一定温度的硝酸银溶液作用下能够吸附银离子，再经过还原的显色剂使幽门螺杆菌显示金属银，银颗粒沉淀于细菌上，结果显示幽门螺杆菌着棕黑色，胞质与黏液着浅黄色，此法着色细菌与组织对比明显，易镜下观察，但染色时间长、试剂价格昂贵、配制复杂、操作繁琐。改良Giemsa染色法胃黏膜细胞核呈蓝紫色，胞质和黏液呈红色，幽门螺杆菌呈红色，此法操作简单、价格低、耗时短，但组织易被染成红色，较难区分组织内的幽门螺杆菌。硼酸亚甲蓝染色胃黏膜细胞核呈蓝紫色，形态结构清晰，亚甲蓝为碱性染料，溶于水中电离成有色的阳离子，与带阴离子的幽门螺杆菌相结合而着蓝色，此液耗时短、操作简单、价格低廉、试剂来源方便、染液使用寿命长，可常温保存2～3年。染色的操作质量是保障切片染色对比清晰的关键，如何提高胃幽门螺杆菌染色的质量，笔者在日常工作中总结出以下几个要点:①硝酸银染色:A．醋酸储备液的配制最为关键，必须采用双蒸馏水，因为自来水中含氯离子，氯离子与硝酸银起反应产生白色的沉淀;B．酸化水的PH值调整到3.6～4.0之间，高于或低于3.6～4.0时配制出的染液无法使幽门螺杆菌着色;C．除了醋酸储备液及5%明胶可保存较长时间，显影液必须现配现用，5%明胶可4℃保存于冰箱，临用前取出水浴融化即可;D．染色过程中的显影液应严格把握水浴温度，最好控制在56℃～58℃之间。显影2min立即取出切片镜下观察，如显影不足，幽门螺杆菌浅淡;显影过度，切片背景深黑，且易出现银粒沉淀污染切片，不利于镜下观察;E．显影液必须染片前5min配制好再放入水浴，显影液一旦配制好就会产生反应，根据笔者经验，即使采用立式染色缸显影1次后就应该废弃，如果继续染片，切片背景不清晰、银颗粒沉淀后污染严重，螺杆菌与污染的切片难以分辨;F．终止显色时最好用55℃左右的热水将显影液冲洗干净，因为显影液中含的明胶遇冷水后迅速凝结，导致未结合的显色剂残留在切片;G．因日光会破坏分解硝酸银液，因此配好的染液用棕色玻璃瓶保存，染液可保存半年;H．染片可长期保存不易褪色。②Giemsa染色:Giemsa在常温下难于溶解，因此在55℃左右与甲醇液能达到完全溶解。改良后Giemsa省去很多复杂步骤，改良添加了碱性品红，因Giemsa染液可使细菌初染呈紫色，碱性品红不仅作为复染的衬托，且不易被乙醇脱色，使切片对比清晰。碱性品红对革兰阴性菌的菌壁有亲和力，加强幽门螺杆菌着染，此类染色切片长期保存不易，易褪色。③硼酸亚甲蓝染色:硼酸亚甲蓝染后不经乙醇脱水，而直接烤干封固，是因为乙醇会褪去亚甲蓝的染色，造成切片颜色不清晰。硼酸亚甲蓝染液应密闭、室温、暗处保存，防止霉菌污染，定期过滤。染液能保存2～3年。此染色随保存时间延长，切片易逐渐褪色。综上所述，只要在以上操作流程中严格掌握和控制染色过程中的染色温度、染色时间、PH值、试剂配制及保存等有关细节，就能保证幽门螺杆菌的染片质量，保持染色的稳定性和可靠性，从而更好地服务于临床诊断及后续治疗。

作者:黄希帆 董愉