大鼠肝卵圆细胞细胞间黏附分子论文

【摘要目的摘要:探索细胞间黏附分子1(ICAM1)在肝卵圆细胞(HOCs)中的表达,及核因子(NFκB)对其表达的调控功能.方法摘要:0.6g/kg3′甲基4二甲基胺偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）饲喂Wistar大鼠4wk,制作肝损伤模型.利用Percoll密度梯度离心法分离HOCs,免疫细胞化学检测HOCs对ICAM1的表达；体外培养HOCs并分别用NFκB激动剂TNFα和NFκB抑制剂TGFβ1干预,RTPCR对ICAM1mRNA进行半定量分析,比较在TNFα和TGFβ1的调控下ICAM1mRNA表达的变化.结果摘要:HOCsICAM1免疫细胞化学检测明显阳性.和对照组比较,体外培养HOCs时TNFα促进HOCs的增殖(P%26lt;0.01),TGFβ1对HOCs的增殖能力无明显影响；RTPCR半定量分析,和对照组比较，TNFα组ICAM1mRNA相对灰度值增高(P%26lt;0.01),而TGFβ1组ICAM1mRNA相对灰度值降低(P%26lt;0.01).结论摘要:在肝损伤组织中HOCs表达ICAM1,TNFα和TGFβ1分别通过对NFκB活性的促进和抑制来调控ICAM1的表达.

【细胞间黏附分子1;肝卵圆细胞；核因子κB

0引言

近年来,肝卵圆细胞（hepaticstemcells,HOCs）的探究受到重视［1］.在大鼠肝损伤和肝癌模型的肝组织中存在HOCs大量增生［2］,但哪种细胞表达ICAM1还不完全清楚.骨髓造血干细胞（hemopoieticstemcells,HSCs）表面存在一组以ICAM1为主的黏附分子,能介导HSCs和骨髓基质的黏附,从而使HSCs产生一种定向迁移的功能［3］.探究表明,HOCs可以来自于HSCs.既然HOCs可以来自于HSCs,且HSCs表达ICAM1,那么HOCs也应象HSCs一样能表达ICAM1.为此,我们探究HOCs表达ICAM1的证据及其调控.

1材料和方法

1.1材料

Wistar大鼠6只,雌雄不限,体质量(110±10)g,由南方医科大学(原第一军医大学)实验动物中心提供.3′甲基4二甲胺基偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）购于日本东京化成株式会社；Percoll分离液购自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM1，即用型SABC试剂盒及DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程公司设计合成,βantinsenseprimer5′GCATTGTAACCAACTGGGACG3′,antisenseprimer5′TTGCCGATAGTGATGACCT3′,扩增产物长度为535bp；ICAM1senseprimer,5′CGTGCTGTATGGTCCTCG3′,antisenseprimer5′GGGCTTGTCCCTTGAGTT3′,扩增产物长度422bp；Marker购于上海生工生物工程公司；总RNA提取试剂盒、mRNA逆转录酶、Taq聚合酶购于Promega公司；Ⅳ型胶原酶、TNFα,TGFβ1购于Sigma公司.

1.2方法

Wistar大鼠正常饲喂1wk后,给予含0.6g/kgDAB饲料饲养,正常饮水,于4wk后大鼠1只,戊巴比妥钠麻醉(25mg/kg,ip),开腹,门静脉切开插管,25mL/min灌注DHanks液至肝表面淡黄除去肝组织里的血液,灌注0.6g/LⅣ型胶原酶至肝组织黄色糜状,将整块肝组织移入烧杯捣碎,于震荡箱37℃恒温震荡消化40min,经100目筛网过滤,未过滤的组织块继续捣碎,加入0.6g/LⅣ型胶原酶继续震荡消化40min,收集过滤液分装于离心管中4℃100g离心10min,取上清液分装于离心管4℃1000g离心30min,弃上清液,用DMEM基础培养液稀释细胞悬液.高速离心管分装Percoll梯度离心液,细胞液铺于上层,4℃12000g离心30min,吸取700mL/L和500mL/L之间细胞液,DMEM基础培养液稀释,4℃1000g离心30min,弃上清液,用150mL/L胎牛血清稀释细胞密度至1.0×109/L.取4个12孔培养板分别标记为A，B，C，D4组,每组又分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ亚组,每亚组4孔,各孔加入上述细胞悬液0.5mL,然后加适量细胞培养基,Ⅰ亚组为空白对照组,Ⅱ亚组和Ⅲ亚组分别加入2.0×105U/L的TNFα和10mg/L的TGFβ1.分别于3，6，9，12d计数A，B，C，D组中各1组的细胞数.

1.2.1ICAM1免疫细胞化学上述细胞液适量滴于防脱片处理的清洁载玻片上,培养8h后细胞黏附贴壁.具体操作按SABC法试剂盒说明进行.光镜下观察结果.

1.2.2ICAM1的RTPCR取上述培养6d的3组培养细胞分别加入不同离心管,参照试剂盒说明书按常规方法提取总RNA，将RNA沉淀于室温晾干,溶于适量无RNA酶水中.在3支0.2mLEppendorf管中依次加入上述总RNA1μL,10×逆转录酶缓冲液2μL,AMV逆转录酶2μL,10mmol/L4×dNTPs2μL,RNA酶抑制剂1μL,ICAM1和βactinantisenseprimer等量1μL,然后加入无RNA酶水至20μL,充分混匀,42℃反应60min,99℃5min.PCR扩增反应摘要:在0.2mLEppendorf管依次加入10×PCR缓冲液2μL,上述逆转录产物1μL,ICAM1和βactinsenseprimer1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,加三蒸水补至20μL,混匀后10000g离心30s,加液体石蜡20μL.在72℃下扩增35个循环,末次循环后延伸6min.取各扩增产物、marker各4μL,于琼脂糖凝胶电泳.紫外检测仪下观察并拍照结果,电泳图用GelProanalyzer3.1进行分析.重复检测.

统计学处理摘要：数据以x±s表示，并采用SPSS10.0统计软件进行析因设计资料的方差分析和单因素方差分析.

2结果

2.1HOCs体外培养Porcoll密度梯度离心法分离出HOCs,呈圆形或卵圆形,大小约为正常肝细胞的1/3(Fig1).ICAM1呈明显阳性表达(Fig2).用TNFα和TGFβ1干预3，6，9和12d计数观察HOCs增殖情况,用SPSS10.0统计软件行析因设计资料的方差分析(Tab1),和对照组比较,TNFα干预组HOCs增殖更显著(P%26lt;0.01),而TGFβ1干预组无显著差异(P%26gt;0.05).3组的增殖在12d内均随时间的增多而增加(P%26lt;0.01).表1TNFα和TGFβ1对HOCs增殖能力的影响（略）

2.2HOCs的ICAM1RTPCR半定量检测和对照组比较，TNFα组ICAM1mRNA相对灰度值增高(P%26lt;0.01,Tab2，Fig3),而TGFβ1组ICAM1mRNA相对灰度值降低(P%26lt;0.01).TNFα组ICAM1表达较对照组增强,而TGFβ1组较对照组减弱.表2ICAM1mRNA灰度值（略）

3讨论

ICAM1是黏附分子免疫球蛋白超家族的一种重要糖蛋白.在生理状态下,肝脏中的内皮细胞、上皮细胞、白细胞等多种细胞均可表达ICAM1,但表达数量不多.肝脏损伤时,肝组织中ICAM1表达明显增多,并且,肝损伤时HOCs大量增生［2］.本结果表明,HOCs表达ICAM1.据此,我们认为,肝损伤时肝组织中ICAM1表达增多的原因,除炎症因子刺激使上皮细胞、白细胞等表达ICAM1增多外,主要是因为HOCs增生,从而使肝组织中ICAM1的表达增多.肝损伤组织中ICAM1表达增强,有二种原因摘要:一是能表达ICAM1的细胞增多；二是受某些因素的调控,细胞对ICAM1的表达增强.Melotti等［4］发现ICAM1的表达受核因子κB(NFκB)的调控,阻断NFκB的活性则可抑制细胞对ICAM1的表达.Hill等［5］发现,TNFα能激活成纤维细胞的NFκB,并使ICAM1的表达增加.我们发现,TNFα干预下的HOCs对ICAM1的表达能力增强,而TGFβ1则抑制HOCs对ICAM1的表达.据此我们认为,TNFα和TGFβ1对HOCs表达ICAM1的调控可能也是通过调节NFκB的活性来实现的,但TGFβ1的抑制功能明显弱于TNFα的促进功能.总之,肝损伤时肝组织中HOCs增生,并表达ICAM1,其表达强度受NFκB的调控.

【参考文献

［1］龚家庆,方驰华.成人肝脏干细胞探究目前状况及展望［J］.中华外科杂志，2002；40(5)摘要：385-387.

GongJQ,FangCH.Thestatusandprospectofadulthepaticstemcells［J］.ChinJSurg,2002；40(5)摘要:385-387.

［2］龚家庆,方驰华,李雅,等.卵圆细胞参和实验性肝癌形成过程的探究［J］.中华外科杂志,2004；42(5)摘要：291-295.

GongJQ,FangCH,LiY,etal.Theexperimentalstudyontheovalcellsparticipatinginhepatocarcinogenesis［J］.ChinJSurg,2004；42(5)摘要:291-295.

［3］SammonsJ,AhmedN,KhokherMA,etal.Mechanismsmediatingtheinhibitoryeffectofalltransretinoicacidonprimitivehematopoieticstemcellsinhumanlongtermbonemarrowculture［J］.StemCells,2000；18(3)摘要:214-219.

［4］MelottiP,NicolisE,TamaniniA,etal.ActivationofNFκBmediatesICAM1inductioninrespiratorycellsexposedtoanadenovirusderivedvector［J］.GeneTher,2001；8(18)摘要:1436-1442.

［5］HillRP,MacNeilS,HaycockJW.αmelanocytestimulatinghormoneantiinflammatoryactioninhumandermalfibroblastcells［J］.EurCellMater,2002；4(2)摘要:50.