大鼠脑范文10篇

大鼠脑范文篇1

【关键词】深低温停循环;甲基强的松龙;N-甲基-D-天门冬氨酸受体R1;脑保护;蛋白表达

深低温停循环（deephypothermiccirculatoryar-rest，DHCA）技术自上世纪50年代诞生以来，已广泛应用于复杂和严重的先天性心脏病及大血管手术中，但其可能并发脑损伤的问题尚未得到较好解决，DH-CA术后中枢神经系统的发病率高达4%～25%。DHCA手术后患者近期不同程度出现手足舞蹈症、抽搐，远期出现认知障碍，儿童出现智力发育障碍等神经系统并发症［1］。DHCA后脑组织缺血缺氧导致突触前兴奋性氨基酸（EAA）大量释放和再摄取减少，从而激活突触后N甲基D天门冬氨酸（NMDA）和α氨基3羟基5甲基4异戊丙酸（AMPA）受体，引起大量K+外流和Na+、Ca2+内流，造成渗透分解和Ca2+相关性损害。本实验通过观察甲基强的松龙（MP）对DHCA大鼠脑NMDA受体1（NMDAR1）蛋白表达的影响，以探讨其脑保护机制。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

早产儿培育箱、自制大鼠冰窝、水合氯醛（南京市儿童医院提供）、MP（美国辉瑞制药公司）、NMDA受体R1（SantaCruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析系统（江苏捷达）。

1.2动物

成年健康雄性普通级SD大鼠（南京医科大学实验动物中心）175只，体重250～300g，随机分为3组，A组（假手术组）15只;B组（DHCA模型组）和C组（MP处理组）各80只，每组再分为DHCA后2、6、12h，1、2、3、7d共7个小组，每小组10只，其中DHCA后6h、1d两个组为15只。术前6h禁食禁水。A组仅暴露双侧颈总动脉，不降温不阻断;B组深低温停循环60min;C组于深低温停循环前30min腹腔注射MP，剂量为30mg·kg-1。

1.3大鼠DHCA模型建立

术前30min肌肉注射阿托品0.02mg·kg-1，5%水合氯醛6ml·kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定于实验台上。温度计插入肛门3cm，用胶带将其与鼠尾相固定，监测肛温。颈部正中切口，分别游离两侧颈总动脉及左、右颈外动脉，并双重过线。游离一侧股动脉，动脉置管，取动脉血作血气分析后，用肝素充满连接管后接压力换能器，多功能监护仪监测血压、心电变化及外周血氧饱和度。最后将大鼠放入特制的冰窝，物理降温，每隔5min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度，调整降温速度。当肛温降至21℃时，将大鼠取出，取动脉血做血气分析后，经左股动脉进行肝素化（肝素钠300IU·kg-1）。随后用24G静脉留置针顺行穿刺左颈外静脉，扎线固定后与三通相连。接着阻断两侧颈总动脉，最后用24G静脉留置针逆行穿刺颈外动脉，扎线固定留置针，与左侧颈外静脉的静脉留置针相连，开始转流。转流后，将体温维持在（21±1）℃之间，并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。停循环60min后，拔出颈外动脉处留置针并结扎，回收其管道内血液，经左侧颈外静脉输入，再退出其管内留置针并结扎。最后松开两侧颈总动脉处动脉夹，恢复颈总动脉血流，检查穿刺处无出血后，逐层缝闭切口。然后将大鼠放入35℃早产儿培育箱复温，恢复正常体温4h后放置室温下正常饲养。

1.4免疫组化方法

检测NMDAR1蛋白表达各组取10只大鼠于DHCA后相应时间点，用含4%多聚甲醛的0.1mol·L-1磷酸缓冲液经心脏升主动脉灌流固定，断头置于冰盒玻璃板上取出全脑，放入同样固定液中再固定约24h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（×400）观察并取其平均值，以灰度值来表示NMDAR1的表达水平，灰度值越高，免疫组化染色越浅，NMDAR1表达越低。

1.5脑组织超微结构观察

于DHCA再灌注后6h和1d，各组取5只大鼠处死，每只大鼠于海马区取1mm×1mm×1mm的小块组织，于2.5%戊二醛固定后，经0.1mol·L-1的磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸固定，丙酮脱水，纯树脂浸透包埋，固化后切片。切片厚度为50～60nm，醋酸铀与枸缘酸铅染色，透射电镜下观察神经元及神经胶质细胞超微结构的变化。

1.6统计学处理

所有数据以x-±s表示，用SPSS11.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析并以LSD法比较两两差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫组化表达

见表1。DHCA模型组和MP处理组大鼠脑NMDAR1蛋白从再灌注2h起开始升高，于24h到达高峰（P<0.01），后逐渐下降，于7d后基本恢复正常水平。同时在2、6、12h，1、2d5个时间点，MP组大鼠脑NMDAR1蛋白表达明显低于DHCA模型组（P<0.01）。表1各组大鼠各时间点脑NMDAR1蛋白表达（略）

2.2脑组织电镜超微结构观察

DHCA模型组和MP处理组大鼠脑组织在DH-CA后6h脑组织超微结构未见明显区别，基本正常;DHCA后1d模型组出现神经胶质细胞凋亡（图1），MP处理组未见明显异常（图2）。

3讨论

NMDAR是中枢神经系统内一类重要的EAA受体，广泛存在于中枢和外周神经系统。NMDA受体由NR1、NR2、NR3A三部分组成。对NMDA受体来说NR1是不变的［2］，它是NMDAR药理学和电生理学特性的基础，而NR2A、B、C、D亚型单独存在时并不表现受体活性，只是在与NMDAR1结合后决定离子通道开放的时间，并调节受体兴奋剂及拮抗剂的作用。因此，DHCA再灌注后脑NMDAR1表达的变化即可反映NMDAR在DHCA再灌注后的变化。DHCA对大脑的损伤机制有许多假说，其中Kris-tian等［3］认为EAA在DHCA脑损伤中起主要作用，DHCA期间，脑组织缺血缺氧导致突触前EAA大量释放和再摄取减少，从而激活突触后NMDA和AM-PA受体，使位于离子通道内起阻断作用的镁离子释放，NMDA受体介导的钙通道及电压敏感的钙通道开放。一方面使Ca2+、Na+、水进入细胞内，K+大量流出细胞膜，引起水钠潴留导致神经元急性肿胀坏死;另一方面钙离子大量内流导致细胞内钙超载，钙离子激活一系列与细胞毒性有关的酶，如蛋白激酶C、磷脂酶等，经过这些酶的共同作用，最终引发神经细胞膜降解、细胞骨架解体、DNA断裂，直至细胞死亡。MP脑保护作用机制复杂，包括抗炎、阻断氧自由基诱导的脂质过氧化、维持组织血流量和有氧能量代谢等。Langley等［4］研究发现MP处理组DHCA后大脑氧代谢率、脑血流量明显高于对照组，表明DHCA前MP预处理能有效地保护脑组织。Baumgartner等［5］通过以狗为模型DHCA2h后，发现谷氨酸等兴奋性氨基酸大量释放引起较严重的脑损害。较多研究表明，MP对DHCA大脑具有保护作用，但并没有探讨其保护机制［4，6］。大量研究表明，具有神经保护作用的干预方法不仅可以减轻脑缺血再灌注病理损伤过程，同时可使NMDAR的表达下调。本研究发现，DHCA模型组大鼠脑NMDAR1蛋白表达从再灌注2h起开始升高，于24h到达高峰，其机制可能是DHCA后脑释放大量谷氨酸作用于突触后膜NMDAR1的谷氨酸结合位点，使神经细胞处于兴奋状态，NMDA受体转录和翻译活性增大，对表达起上调作用。另外在DHCA再灌注后期NMDAR1表达明显降低，其机制可能与早期细胞坏死和凋亡、细胞功能被抑制、健存细胞大量减少以及NMDAR基因转录和翻译功能下降等因素有关;也可能与受体内化有关。大鼠DHCA后脑组织因缺血释放大量谷氨酸，致NMDAR1过度激活，使大量NMDAR1发生内化，其结果不仅增加了NMDAR1自身的代谢过程，减少胞膜表面NMDAR1的密度，同时还可能发挥某种信号作用（包括下调NMDARmR-NA的转录）［7］。

另外，在DHCA后2、6、12h，1、2d5个时间点，MP处理组大鼠脑NMDAR1蛋白表达明显低于DHCA模型组，说明MP能明显抑制DHCA后脑NMDAR1蛋白的表达，减少NMDA受体介导的钙通道开放，从而起到脑保护作用。从组织超微结构发现，DHCA模型组和MP处理组大鼠在DHCA后6h脑组织超微结构未见明显区别，属基本正常;DHCA后24h模型组大鼠脑组织出现神经胶质细胞凋亡，MP处理组未见异常，说明MP能明显抑制DHCA后脑细胞凋亡，起到脑保护作用。基于已有的实验结果推测，MP对DHCA的脑保护作用机制可能是通过多途径实现的，并不能仅用单纯抑制NMDAR1蛋白表达解释，或许还与其他非NMDA受体有关系。另外本研究结果仅仅提示MP可能是通过调控EAANMDAR1Ca2+通路而产生脑保护作用，但是其对NMDAR1的抑制作用是直接作用于NMDAR1还是通过其他途径间接影响NMDAR1，这些问题还有待于更进一步的研究。

【参考文献】

［1］DeLeonSY，ThomasC，RoughneenPT，etal.Experimentalevidenceofcerebralinjuryfromprofoundhypothermiadur-ingcardiopulmonarybypass［J］.PediatrCardiol，1998，19（5）:398-403.

［2］MeldrumBS.Glutamateasaneurotransmitterinthebrain:reviewofphysiologyandpathology［J］.JNutr，2000，130（4SSuppl）:1007S-1015S.

［3］KristianT，SiesjoBK.Calcium-relateddamageinischemia［J］.LifeSci，1996，59（5-6）:357-367.

［4］LangleySM，ChaiPJ，JaggersJJ，etal.Preoperativehighdosemethylprednisoloneattenuatesthecerebralresponsetodeephypothermiccirculatoryarrest［J］.EurJCardiothoracSurg，2000，17（3）:279-286.

［5］BaumgartnerWA，WallinsPL，SalazarJD，etal.Assessingtheimpactofcerebralinjuryaftercardiacsurgery:willdeter-miningthemechanismreducethisinjury［J］.AnnThoracSurg，1999，67（6）:1871-1873，1891-1894.

大鼠脑范文篇2

【关键词】尼莫地平；铝负荷大鼠；单胺氧化酶B

由于阿尔茨海默病（AD）发病机制未明，目前尚缺乏理想的治疗手段。尼莫地平是双氢吡啶类钙通道拮抗剂，脂溶性高，易通过血脑屏障，其扩张脑血管，改善脑血供应等作用已得到肯定并应用于临床，而其对老年痴呆认知记忆障碍的改善作用〔1〕，机制至今仍不很清楚。有研究报道单胺氧化酶B（MAOB）的活性改变与神经元损伤和神经元退变可能有密切关系〔2，3〕。为探讨尼莫地平在改善老年痴呆等导致的认知记忆障碍中的作用，本研究拟采用铝负荷大鼠脑损伤模型，观察脑损伤学习记忆障碍与脑组织MAOB改变的关系及尼莫地平对铝损伤大鼠脑组织MAOB表达的影响，为神经元退行性疾病的发病机制研究奠定实验与理论基础，为防治药物的开发探寻新方法与新途径。

1材料与方法

1.1动物与分组清洁级3月龄Wistar大鼠100只，雄性，180～220g，由重庆医科大学动物实验中心提供〔动物生产许可证号:SCXK(渝)2005002〕。按体重随机分成3组，每组10只，即空白对照(溶剂为0.5%羧甲基纤维素钠)组，铝模型(AlCl3400mg/kg)组与尼莫地平组(80mg/kg)，灌胃容积1ml/100g体重。在实验过程中，铝模型组死亡2只鼠。

1.2方法

1.2.1试剂、药品与仪器AlCl3·6H2O和葡萄糖酸钠为国产分析纯，临用前用蒸馏水配制；尼莫地平(重庆科瑞制药厂)，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠配制；乙酰胆碱转移酶(ChAT)、胆碱脂酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、MAOB试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RTPCR试剂盒（日本TaKaRa）、RNATriol、单去污剂裂解液、考马斯亮蓝、封闭液与辣根过氧化物酶等。DTT2型大鼠跳台仪(中国医学科学院药物研究所)、DMS2型电脑全自动程控Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)、高速冷冻离心机(美国Sigma公司)、UV265紫外分光光度计(日本岛津公司)、PCR扩增仪(美国genecycleTM，BioRad公司)与凝胶电泳成像分析系统(美国BioRad公司)等。

1.2.2模型制备采用AlCl3(400mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5d/w，持续3个月，建立铝负荷致大鼠慢性脑损伤的动物模型。

1.2.3检测指标

1.2.3.1训练次数与跳台潜伏期分别在给予药物3月后次日，用跳台法测定每组大鼠被动回避性学习记忆能力。先将动物放入反应箱中适应1min，然后通以电压为36V的交流电5min，大鼠遭受电击会跳上安全平台，而走下平台后会再次遭受电击，记录5min内大鼠受电击次数，作为大鼠学会逃避电击的学习能力。24h后测定大鼠的记忆成绩，把大鼠置于安全平台上，记录大鼠第一次跳下平台的时间即潜伏期，以此潜伏期作为大鼠的记忆成绩，超过5min记为5min。

1.2.3.2寻台潜伏期每组大鼠在完成被动回避性学习记忆能力测试后，用Morris水迷宫法进行大鼠空间定向能力测试。水温24～25℃。整个训练过程分为2个阶段：第1阶段，第1次训练时将大鼠放到平台上适应1min，后让其自由游泳至平台，3min内未找到平台者，实验者协助将其引至平台，从第2天起，每天分上、下午分段训练，每段训练4次，每次训练时选择1个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，让大鼠进行定向航行，持续训练4d；第2阶段，即在第5天时进行测试，撤去平台，并任意将大鼠从最后一次训练时的入水方位放入，电脑记录大鼠第1次跨越原平台的时间即寻台潜伏期(Stepdownlatency，SDL)，以此潜伏期作为大鼠的空间定向能力成绩，超过2min以2min计算。

1.2.3.3脑组织ChAT、AchE、SOD活性和MDA含量测定在完成全部行为学测试后，处死大鼠，分离其海马，用生理盐水做成10%匀浆，按相关试剂盒说明书进行具体操作。

1.2.3.4脑组织MAOB活性、mRNA及蛋白表达水平的检测10%海马及皮质组织匀浆各取0.1ml，按照MAOB试剂盒说明书中的操作步骤测定MAOB活性。参照大鼠MAOB基因库，根据cDNA设计引物，引物由北京鼎国生物技术发展中心合成，用来扩增535bp的MAOB片段。另外从北京鼎国生物技术发展中心购买GAPDH引物一对作为内参照，用来扩增983bp的GAPDH片段。MAOB的上游引物为5′TGCTAGATAAGATCTGCTGG3′；下游引物为5′ATCCAATGTGTACGCAATTG3′；GADPH的上游引物为5′TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC3′；下游引物为5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′；PCR反应条件为95℃5min预变性，95℃1min、60℃55s与72℃90s，27个循环，72℃10min。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳，BioRad凝胶成像分析系统成像与分析。Western印迹测定MAOB蛋白表达水平，以βactin为参照，辣根过氧化物酶系统显色，用可见紫外光凝胶扫描分析系统对蛋白条带进行分析。

1.3统计学处理结果用x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行方差分析，组间差异采用Dunnett方法进行显著性检验。

2结果

2.1铝负荷大鼠脑组织生化指标的变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝模型组大鼠脑组织的ChAT与SOD活性明显降低，AchE活性与MDA含量显著增高（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠脑组织的ChAT与SOD活性明显增加，AchE活性与MDA含量显著降低（均P＜0.01）（表1）。

2.2铝负荷大鼠学习记忆功能的变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝模型组大鼠5min内学会逃避电击而需要的电击次数明显增加，而跳台潜伏期明显缩短，寻台潜伏期明显延长（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠学会逃避电击而需要的次数明显减少(P＜0.01)，而跳台潜伏期明显延长，寻台潜伏期明显缩短（均P＜0.01）（表2）。

2.3铝负荷致大鼠脑组织MAOB活性与表达变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝负荷组大鼠脑组织MAOB活性与MAOBmRNA及蛋白表达均显著增高（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠脑组织MAOB活性与MAOBmRNA及蛋白表达均显著降低（均P＜0.01）（表3）。表1尼莫地平对铝负荷大鼠脑组织ChAT、AchE、SOD活性与MDA含量的影响表2尼莫地平对铝负荷致大鼠学习记忆能力与空间识别能力损害的影响与铝模型组比较：1）P＜0.01，下表同表3尼莫地平对铝负荷大鼠脑组织MAOB活性与表达的影响

3讨论

转基因方法可以建立AD大鼠模型，并能较好地模拟AD特征改变，但建模时间长，成本昂贵，很难广泛用于研究〔4〕。动物脑室注射、腹腔给予或者长期口服铝盐，铝可在脑皮层各区以及海马异常沉积，引起动物学习记忆功能的进行性损害和神经元退变〔5〕。因此，本室采用AlCl3(400mg/kg)持续灌胃大鼠的方法，建立铝负荷致大鼠慢性脑损伤模型。ChAT的表达和活性降低以及AchE活性的升高会造成乙酰胆碱含量下降，进而出现学习记忆功能障碍。因此ChAT和AchE表达和活性改变是AD等神经元退行性疾病特征变化之一。本研究中，铝模型组大鼠脑组织ChAT活性降低，AchE活性升高，同时大鼠被动回避性学习记忆能力与空间识别能力损害，故此法建立神经元退变大鼠模型是成功的。

关于铝致神经毒性，特别是致神经元退变的机制，目前尚不完全清楚。本实验结果显示，慢性铝负荷可导致大鼠海马SOD活性降低、MDA含量升高，提示与其他原因所致脑损伤相似，氧化应激也参与了慢性铝负荷致脑损伤、神经元退变过程。

本实验发现铝负荷大鼠脑组织MAOB活性、MAOBmRNA与蛋白表达显著增高，提示铝负荷致大鼠神经元退变的毒性机制也与MAOB活性及表达增加有关。

本结果还发现，尼莫地平能明显改善铝负荷导致的大鼠被动回避性学习记忆能力损害和空间学习记忆障碍，减轻海马神经元损伤，明显增加铝负荷大鼠海马ChAT与SOD的活性，明显降低铝负荷大鼠AchE活性与MDA含量，表明尼莫地平对铝负荷大鼠脑损伤具有保护作用；同时，尼莫地平也能显著降低铝负荷大鼠脑组织MAOB活性，对抗铝负荷引起的大鼠脑组织MAOBmRNA和蛋白表达增加。但尼莫地平对MAOB活性与表达的改变是该药物直接作用引起，还是作为钙通道拮抗剂间接作用所致，尚不清楚，有待深入研究。

【参考文献】

1王玮,付晶晶.尼莫地平的药理作用及临床应用〔J〕.沈阳医学院学报，2000;2(2):1147.

2KurthJH，KurthMC，PodusloSE,etal.AssociationofamonoamineoxidaseBallelewithParkinson′sdisease〔J〕.AnnNeurol,1993;33（4）:36872.

3YangJQ，ZhouQX.Protectiveeffectofnimodipineagainstcerebralinjuryinducedbysubacutecarbonmonoxideintoxicationinmice〔J〕.ActaPharmacolSin，2001;22(5):42337.

大鼠脑范文篇3

【关键词】深低温;脑缺血再灌注;二氮嗪;脑保护;NR1表达;大鼠

脑缺血再灌注损伤及其机制十分复杂，至今尚不完全清楚。脑缺血再灌注损伤包括神经细胞坏死和凋亡两个方面，其中线粒体ATP敏感性钾通道被认为是关键环节之一［1］。二氮嗪是线粒体ATP依赖性钾离子通道开放剂，已广泛应用于缺血再灌注心肌保护方面的研究，而对脑保护方面的研究相对较少。N-甲基天冬氨酸受体（NMDAR）是目前研究最为深入的兴奋性氨基酸（EAA）受体之一，是一种离子型EAA受体。目前已证实，NMDAR是由NR1、NR2A～2D5种亚单位组成的异聚体。其中NR1亚单位是NMDAR的功能单位，NR2是其调节单位，只有和NR1组合才表现出活性。NR1基因紊乱就会使NMDAR的活性丧失。EAA的毒性是通过受体活性改变而发挥作用，缺氧缺血能影响NMDAR的数量和功能，诱导和加强NR1的表达，上调NMDAR的数量。基于上述研究背景，本试验主要采用脑缺血再灌注大鼠模型，观察二氮嗪预处理对脑缺血再灌注损伤后脑含水量、形态学及NR1的表达变化来探讨二氮嗪对深低温缺血再灌注大鼠是否具有脑保护作用及其可能的机制。

1材料和方法

1.1实验动物

成年健康SD大鼠306只，雌雄不限，体重200～250g，由南京市儿童医院实验动物中心提供。动物饲养与实验均符合我国卫生部《医学实验动物管理实施细则（1998）》的要求。

1.2主要仪器与试剂

水合氯醛（南京市儿童医院提供）、二氮嗪（美国Sigma公司）、NR1（SantaCruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析系统（江苏捷达）。

1.3动物模型建立

用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉后固定大鼠四肢及头部。剃除颈部及腹股沟处鼠毛，碘伏消毒皮肤，酒精脱碘后，纵行剪开颈部皮肤，从正中打开颈外肌层，分别向左右沿颈外斜肌间隙分离筋膜，找到颈总动脉，从伴行的神经旁游离出动脉并套上丝线，用纱布盖好切口;用涂有石蜡油的温度计插入肛门3cm，探测大鼠的体温（通过对大鼠深部体温检测来估计脑部的温度）。将鼠置冰盒并用冰块袋包埋大鼠行物理降温。当体温降至21℃时停止降温，用动脉夹阻断两侧颈总动脉，使体温维持在（21±1）℃，60min后恢复颈总动脉血流。用电吹风给大鼠复温，每分钟体温恢复不超过0.5℃，大约在0.5h内将体温恢复到32℃，再将大鼠放入35℃早产儿孵育箱复温，在2h内将体温恢复到37.5℃体温，维持正常体温4h后放置室温下正常饲养。

1.4动物分组

①假手术组:102只，不夹闭左右颈总动脉，不注射药物;②模型组:102只，术前腹腔内注射等体积生理盐水;③二氮嗪组:102只，术前腹腔内注射二氮嗪5mg·kg-1。模型组和二氮嗪组再分为缺血60min再灌注后2、6、12h和1、2、3、7d共7个小组，假手术组分为术后2、6、12h和1、2、3、7d共7个小组，每个小组16只，其中6只用于脑组织含水量测定，10只用于石蜡包埋后行免疫组化检测。

1.5脑组织含水量测定

待测含水量的脑组织标本测定其湿质量及在电热恒温干燥箱中100℃48h的干质量，以计算含水量。公式如下:含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.6脑组织中NMDAR1的表达情况

大鼠脑组织予多聚甲醛灌注、固定，完毕后断头取脑，脑组织采用4%多聚甲醛溶液再固定约24h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。步骤如下:切片常规脱蜡，3%H2O2灭活内源性酶，热修复抗原，5%BSA封闭，加入兔抗大鼠NMDAR1多克隆抗体（1∶100）4℃过夜，再滴加生物素化山羊抗兔IgG室温保存20min，SABC室温20min，滴加新鲜配置的DAB显色液进行显色，苏木素复染，常规脱水，透明，中性树胶封片后，光镜下观察。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（400×）观察并取其平均值，以灰度值来表示NR1的表达水平，灰度值越高，免疫组织化学染色越浅，NR1表达越低。

1.7统计学处理

所有实验数据用x-±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行析因设计资料的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，两两组间均数之间比较采用SNK检验，相同时间点两组间比较用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠脑组织含水量

结果见表1。3组脑组织含水量在缺血再灌注后2、6h未见明显区别，再灌注12h、1d时3组之间差异有统计学意义（P<0.01），模型组含水量明显高于二氮嗪组和假手术组，二氮嗪组高于假手术组，2d时模型组和假手术组之间比较差异有统计学意义（P<0.01），二氮嗪组和假手术组间差异无统计学意义（P>0.05）。3d和7d3组间无统计学差异（P>0.05）。表13组大鼠缺血再灌注不同时间脑含水量比较（略）

2.2脑组织NR1的表达

模型组NR1在2h开始升高，1d达到高峰后下降，7d达到正常水平。二氮嗪组变化与模型组类似，但NR1表达水平低于模型组，假手术组NR1表达水平最低，3组各时间点（除7d外）均有统计学差异（P<0.05）。3组灰度值见表2（灰度值越高，表明NR1表达越低）。表2各组再灌注后NR1的表达情况比较（略）

3讨论

ATP依赖性钾通道（KATP）属于内向整流型钾通道，由完全不同的两个亚单位构成，即内向整流亚单位Kir61x（Kir611和Kir612）和磺酰脲受体（SUR）两种蛋白质构成［2］。KATP同时存在于细胞膜和线粒体膜上，是一种应激活化分子，缺氧、代谢毒物等均可将其激活，从而调节机体对外界刺激的适应性。其中线粒体ATP依赖性钾通道（mitoKATP）被认为是组织缺血、缺氧保护的共同效应器［1］。mitoKATP的开放剂能有效地保护缺血再灌注损伤，是减轻缺血损伤和介导缺血预适应的主要机制［3］。mitoKATP开放剂二氮嗪原来仅被认为是一种作用于血管内膜钾通道的血管扩张剂，临床上主要用于治疗高血压。近年来mi-toKATP在脑缺血中的地位引起广泛关注，本实验研究发现，模型组脑组织含水量在12h及1d时间点明显高于二氮嗪组和假手术组，而二氮嗪组高于假手术组，2d时脑含水量模型组高于假手术组，两者之间有统计学意义（P<0.01），二氮嗪组和假手术组间未见区别，无统计学意义。其余各时间点未见差别。这说明了二氮嗪预处理对深低温缺血再灌注大鼠具有脑保护作用。NR1是NMDAR的基本功能亚单位，NMDAR是兴奋性神经递质谷氨酸的离子型受体，生理状态下，NMDAR的兴奋对神经系统的发育、学习、记忆起着关键作用，但是在缺血缺氧时，它却是谷氨酸神经毒性的主要通路。谷氨酸是脑内主要的兴奋性氨基酸，但是在一定条件下，也具有神经毒性。缺血缺氧时谷氨酸通过直接和间接两种途径产生兴奋毒性。目前已证实，缺血缺氧时谷氨酸的释放增加，清除减少，突触间隙的谷氨酸浓度迅速升高，激活NMDAR，产生兴奋毒性。高国栋等［4］研究发现，二氮嗪预处理可抑制EAA的释放，NMDA受体数量的增加可能反映着与受体结合的谷氨酸和（或）转运体量的增加。Selkirk等［5］研究报道谷氨酸的过多释放和中枢神经系统的发育畸变有关，它可以使其受体过度激活并产生兴奋性毒性，谷氨酸转运体的过度表达使小鼠海马CA1区锥体细胞的易损性增加。本试验同时检测了各组NR1的表达水平，结果表明模型组NR1在2h开始升高，1d达到高峰后下降，7d达到正常水平。二氮嗪组变化与模型组类似，但NR1表达水平低于模型组，假手术组NR1表达水平最低，3组各时间点（除72h外）均有统计学差异（P<0.05）。由此推断，二氮嗪发挥脑保护作用可能是通过下调NR1的表达水平来实现，这可能是其脑保护作用机制之一。认识到mitoKATP的存在已近10年，但有关检测这种通道在完整细胞中活性的方法最近才发展起来。越来越多的证据表明mitoKATP的药理学特征是独特的，然而这方面的研究进展缓慢。最新研究表明，KATP通道在“缺血或缺氧预适应”所诱导的大脑自身保护机制中起关键作用［6-7］。因此，KATP通道开放剂作为脑保护剂将日趋成为研究热点［8-9］。

mitoKATP开放剂二氮嗪预处理对缺血再灌注大鼠具有脑保护作用，是一种有潜力的脑保护药物。明确其保护作用机制，可以为研制开发新型抗脑缺血药物及其二氮嗪应用于临床提供实验依据。

【参考文献】

［1］DzejaPP，HolmuhamedovEL，OzcanC，etal.Mitochondriagatewayforcytoprotection［J］.CircRes，2001，89（9）:744-746.

［2］YokoshikiH，SunagawaM，SekiT，etal.ATP-sensitiveK+channelsinpancreatic，cardiac，andvascularsmoothmusclecells［J］.AmPhysiol，1998，274（1pt1）:25-37.

［3］CrestanelloJA，DolibaNM，BabskyAM，etal.Openingofpotassiumchannelsprotectsymitochondrialfunctionfromcalciumoverload［J］.JSurgRes，2000，94（2）:116-123.

［4］高国栋，龙村，李明等.二氮嗪预处理对深低温停循环兔脑组织兴奋性氨基酸含量的影响［J］.中国分子心脏病学杂志，2004，4（2）:97-99.

［5］SelkirkJV，StiefelTH，StoneIM.OverexpressionofthehumanEAAT2glutamatetransporterwithinneuronsofmouseorganotypichippocampalsliceculturesleadstoincreasedvulnerabilityofCA1pyramidalcells［J］.EurNeurosci，2005，21（8）:2291-2296.

［6］YamadaK，JiJJ，YuanH，etal.ProtectiveroleofATP-sen-sitivepotassiumchannelsinhypoxia-inducedgeneralizedsei-zure［J］.Science，2001，292（5521）:1543-1546.

［7］BlondeauN，PlamondonH，RichelmeC，etal.KATPchannelopeners，adenosineagonistsandepilepticpreconditioningare-stresssignalsinducinghippocampalneuroprotection［J］.Neuroscience，2000，100（3）:465-474.

大鼠脑范文篇4

【关键词】深低温停循环;甲基强的松龙;N-甲基-D-天门冬氨酸受体R1;脑保护;蛋白表达

深低温停循环（deephypothermiccirculatoryar-rest，DHCA）技术自上世纪50年代诞生以来，已广泛应用于复杂和严重的先天性心脏病及大血管手术中，但其可能并发脑损伤的问题尚未得到较好解决，DH-CA术后中枢神经系统的发病率高达4%～25%。DHCA手术后患者近期不同程度出现手足舞蹈症、抽搐，远期出现认知障碍，儿童出现智力发育障碍等神经系统并发症［1］。DHCA后脑组织缺血缺氧导致突触前兴奋性氨基酸（EAA）大量释放和再摄取减少，从而激活突触后N甲基D天门冬氨酸（NMDA）和α氨基3羟基5甲基4异戊丙酸（AMPA）受体，引起大量K+外流和Na+、Ca2+内流，造成渗透分解和Ca2+相关性损害。本实验通过观察甲基强的松龙（MP）对DHCA大鼠脑NMDA受体1（NMDAR1）蛋白表达的影响，以探讨其脑保护机制。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

早产儿培育箱、自制大鼠冰窝、水合氯醛（南京市儿童医院提供）、MP（美国辉瑞制药公司）、NMDA受体R1（SantaCruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析系统（江苏捷达）。

1.2动物

成年健康雄性普通级SD大鼠（南京医科大学实验动物中心）175只，体重250～300g，随机分为3组，A组（假手术组）15只;B组（DHCA模型组）和C组（MP处理组）各80只，每组再分为DHCA后2、6、12h，1、2、3、7d共7个小组，每小组10只，其中DHCA后6h、1d两个组为15只。术前6h禁食禁水。A组仅暴露双侧颈总动脉，不降温不阻断;B组深低温停循环60min;C组于深低温停循环前30min腹腔注射MP，剂量为30mg·kg-1。

1.3大鼠DHCA模型建立

术前30min肌肉注射阿托品0.02mg·kg-1，5%水合氯醛6ml·kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定于实验台上。温度计插入肛门3cm，用胶带将其与鼠尾相固定，监测肛温。颈部正中切口，分别游离两侧颈总动脉及左、右颈外动脉，并双重过线。游离一侧股动脉，动脉置管，取动脉血作血气分析后，用肝素充满连接管后接压力换能器，多功能监护仪监测血压、心电变化及外周血氧饱和度。最后将大鼠放入特制的冰窝，物理降温，每隔5min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度，调整降温速度。当肛温降至21℃时，将大鼠取出，取动脉血做血气分析后，经左股动脉进行肝素化（肝素钠300IU·kg-1）。随后用24G静脉留置针顺行穿刺左颈外静脉，扎线固定后与三通相连。接着阻断两侧颈总动脉，最后用24G静脉留置针逆行穿刺颈外动脉，扎线固定留置针，与左侧颈外静脉的静脉留置针相连，开始转流。转流后，将体温维持在（21±1）℃之间，并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。停循环60min后，拔出颈外动脉处留置针并结扎，回收其管道内血液，经左侧颈外静脉输入，再退出其管内留置针并结扎。最后松开两侧颈总动脉处动脉夹，恢复颈总动脉血流，检查穿刺处无出血后，逐层缝闭切口。然后将大鼠放入35℃早产儿培育箱复温，恢复正常体温4h后放置室温下正常饲养。

1.4免疫组化方法

检测NMDAR1蛋白表达各组取10只大鼠于DHCA后相应时间点，用含4%多聚甲醛的0.1mol·L-1磷酸缓冲液经心脏升主动脉灌流固定，断头置于冰盒玻璃板上取出全脑，放入同样固定液中再固定约24h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（×400）观察并取其平均值，以灰度值来表示NMDAR1的表达水平，灰度值越高，免疫组化染色越浅，NMDAR1表达越低。

1.5脑组织超微结构观察

于DHCA再灌注后6h和1d，各组取5只大鼠处死，每只大鼠于海马区取1mm×1mm×1mm的小块组织，于2.5%戊二醛固定后，经0.1mol·L-1的磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸固定，丙酮脱水，纯树脂浸透包埋，固化后切片。切片厚度为50～60nm，醋酸铀与枸缘酸铅染色，透射电镜下观察神经元及神经胶质细胞超微结构的变化。

1.6统计学处理

所有数据以x-±s表示，用SPSS11.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析并以LSD法比较两两差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫组化表达

见表1。DHCA模型组和MP处理组大鼠脑NMDAR1蛋白从再灌注2h起开始升高，于24h到达高峰（P<0.01），后逐渐下降，于7d后基本恢复正常水平。同时在2、6、12h，1、2d5个时间点，MP组大鼠脑NMDAR1蛋白表达明显低于DHCA模型组（P<0.01）。表1各组大鼠各时间点脑NMDAR1蛋白表达（略）

2.2脑组织电镜超微结构观察

DHCA模型组和MP处理组大鼠脑组织在DH-CA后6h脑组织超微结构未见明显区别，基本正常;DHCA后1d模型组出现神经胶质细胞凋亡（图1），MP处理组未见明显异常（图2）。

3讨论

NMDAR是中枢神经系统内一类重要的EAA受体，广泛存在于中枢和外周神经系统。NMDA受体由NR1、NR2、NR3A三部分组成。对NMDA受体来说NR1是不变的［2］，它是NMDAR药理学和电生理学特性的基础，而NR2A、B、C、D亚型单独存在时并不表现受体活性，只是在与NMDAR1结合后决定离子通道开放的时间，并调节受体兴奋剂及拮抗剂的作用。因此，DHCA再灌注后脑NMDAR1表达的变化即可反映NMDAR在DHCA再灌注后的变化。DHCA对大脑的损伤机制有许多假说，其中Kris-tian等［3］认为EAA在DHCA脑损伤中起主要作用，DHCA期间，脑组织缺血缺氧导致突触前EAA大量释放和再摄取减少，从而激活突触后NMDA和AM-PA受体，使位于离子通道内起阻断作用的镁离子释放，NMDA受体介导的钙通道及电压敏感的钙通道开放。一方面使Ca2+、Na+、水进入细胞内，K+大量流出细胞膜，引起水钠潴留导致神经元急性肿胀坏死;另一方面钙离子大量内流导致细胞内钙超载，钙离子激活一系列与细胞毒性有关的酶，如蛋白激酶C、磷脂酶等，经过这些酶的共同作用，最终引发神经细胞膜降解、细胞骨架解体、DNA断裂，直至细胞死亡。MP脑保护作用机制复杂，包括抗炎、阻断氧自由基诱导的脂质过氧化、维持组织血流量和有氧能量代谢等。Langley等［4］研究发现MP处理组DHCA后大脑氧代谢率、脑血流量明显高于对照组，表明DHCA前MP预处理能有效地保护脑组织。Baumgartner等［5］通过以狗为模型DHCA2h后，发现谷氨酸等兴奋性氨基酸大量释放引起较严重的脑损害。较多研究表明，MP对DHCA大脑具有保护作用，但并没有探讨其保护机制［4，6］。大量研究表明，具有神经保护作用的干预方法不仅可以减轻脑缺血再灌注病理损伤过程，同时可使NMDAR的表达下调。本研究发现，DHCA模型组大鼠脑NMDAR1蛋白表达从再灌注2h起开始升高，于24h到达高峰，其机制可能是DHCA后脑释放大量谷氨酸作用于突触后膜NMDAR1的谷氨酸结合位点，使神经细胞处于兴奋状态，NMDA受体转录和翻译活性增大，对表达起上调作用。另外在DHCA再灌注后期NMDAR1表达明显降低，其机制可能与早期细胞坏死和凋亡、细胞功能被抑制、健存细胞大量减少以及NMDAR基因转录和翻译功能下降等因素有关;也可能与受体内化有关。大鼠DHCA后脑组织因缺血释放大量谷氨酸，致NMDAR1过度激活，使大量NMDAR1发生内化，其结果不仅增加了NMDAR1自身的代谢过程，减少胞膜表面NMDAR1的密度，同时还可能发挥某种信号作用（包括下调NMDARmR-NA的转录）［7］。

另外，在DHCA后2、6、12h，1、2d5个时间点，MP处理组大鼠脑NMDAR1蛋白表达明显低于DHCA模型组，说明MP能明显抑制DHCA后脑NMDAR1蛋白的表达，减少NMDA受体介导的钙通道开放，从而起到脑保护作用。从组织超微结构发现，DHCA模型组和MP处理组大鼠在DHCA后6h脑组织超微结构未见明显区别，属基本正常;DHCA后24h模型组大鼠脑组织出现神经胶质细胞凋亡，MP处理组未见异常，说明MP能明显抑制DHCA后脑细胞凋亡，起到脑保护作用。基于已有的实验结果推测，MP对DHCA的脑保护作用机制可能是通过多途径实现的，并不能仅用单纯抑制NMDAR1蛋白表达解释，或许还与其他非NMDA受体有关系。另外本研究结果仅仅提示MP可能是通过调控EAANMDAR1Ca2+通路而产生脑保护作用，但是其对NMDAR1的抑制作用是直接作用于NMDAR1还是通过其他途径间接影响NMDAR1，这些问题还有待于更进一步的研究。

【参考文献】

［1］DeLeonSY，ThomasC，RoughneenPT，etal.Experimentalevidenceofcerebralinjuryfromprofoundhypothermiadur-ingcardiopulmonarybypass［J］.PediatrCardiol，1998，19（5）:398-403.

［2］MeldrumBS.Glutamateasaneurotransmitterinthebrain:reviewofphysiologyandpathology［J］.JNutr，2000，130（4SSuppl）:1007S-1015S.

［3］KristianT，SiesjoBK.Calcium-relateddamageinischemia［J］.LifeSci，1996，59（5-6）:357-367.

［4］LangleySM，ChaiPJ，JaggersJJ，etal.Preoperativehighdosemethylprednisoloneattenuatesthecerebralresponsetodeephypothermiccirculatoryarrest［J］.EurJCardiothoracSurg，2000，17（3）:279-286.

［5］BaumgartnerWA，WallinsPL，SalazarJD，etal.Assessingtheimpactofcerebralinjuryaftercardiacsurgery:willdeter-miningthemechanismreducethisinjury［J］.AnnThoracSurg，1999，67（6）:1871-1873，1891-1894.

大鼠脑范文篇5

【关键词】五福心脑清；多发脑梗死性痴呆；SOD；MDA

EffectofWuFuXinNaoQingoncerebralmulti-infarctiondementiaratmodel

【Abstract】ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsofWUFUXINNAOQINGoncerebralmulti-infarctiondementia(MID)ratmodel.MethodsThemulti-infarctiondementiamodelwasinducedbyinjectingcruorembolusofthesamekindratsintotheinternalcarotidartery.TheSODandMDAofserumwasmeasured.Andthepathologyofbrainwasobserved.ResultsComparedwiththecontrolgroup，thecontentofSODinserumofthemulti-infarctiondementiaratswasreduced，thecontentofMDAwasincreased.FuFangDanShenDiWanandWuFuXinNaoQingcanreversethecontentofthem.Moreover，themorphologydemonstratedthatFuFangDanShenDiWanandWuFuXinNaoQingcandecreasethepathologicaldestroyofthebrain.ConclusionTheresultsofthisstudysuggestthatWuFuXinNaoQinghaveprotectiveeffectsonmulti-infarctiondementiaratmodel.

【Keywords】WuFuXinNaoQing；cerebralmulti-infarctiondementia；SOD；MDA

血管性痴呆是一系列脑血管因素导致脑组织损害而产生的痴呆症状的总称。在血管性痴呆中，以多发梗死性痴呆(MID)发病率最高，且有不断增高的趋势。MID是由于反复多次脑缺血发作，或多发性脑梗死、或一次严重的脑血管病引起的智能减退。由于患者的生活能力下降，严重威胁着老年人的健康和生存质量，给家庭和社会造成了巨大负担，随着血管性痴呆的发病率绝对及相对地增多，使血管性痴呆的防治研究具有实际应用前景。五福心脑清由精制红花油、冰片等组成，具有活血化瘀、通络开痹等功效。故本实验通过用大鼠自体血栓造成的多发性脑梗死模型，观察五福心脑清对此模型的保护作用。

1材料与方法

1.1仪器全自动生化分析仪（TBA-120FR，日本）。

1.2试剂与药物超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购于南京建成生物试剂公司。五福心脑清软胶囊：0.4g/粒，由神威药业有限公司提供（批号：0403171），含精制红花油、冰片、维生素E、维生素B6。复方丹参滴丸：天津天士力制药股份有限公司产品(批号：20040306)。

1.3实验动物Wistar大鼠，购于北京维通利华公司，SPF级，雄性，体重240～260g。合格证号：SCX（京）2002-0003。

1.4实验分组五福心脑清软胶囊低、中、高剂量组（162、324、648mg/kg），复方丹参滴丸组，模型组，假手术组和正常组。

1.5大鼠多发性脑梗死模型的复制参照文献方法复制脑多发性梗死模型［1］，同种Wistar大鼠左心室内采血，于37℃温箱内干燥，研碎后用200目筛孔过筛，应用时取血栓栓子1mg加生理盐水0.3ml，摇匀成混悬液。10%水合氯醛按3.5ml/kg体重腹腔麻醉，颈正中切开皮肤，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，暴露颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉，暂时夹闭颈总动脉以及翼突腭动脉，于颈外动脉逆行插管注入栓子溶液0.3ml，推注同时开放颈总动脉，使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成多发性脑梗死，开放翼突腭动脉，结扎颈外动脉，缝合皮肤。

1.6药物干预各组动物于术后即刻灌胃给药，以后每24h给药一次，连续2周。正常组、模型组及假手术组：生理盐水灌胃，五福心脑清软胶囊低剂量组五福心脑清软胶囊162mg/kg灌胃；五福心脑清软胶囊中剂量组五福心脑清软胶囊324mg/kg灌胃；五福心脑清软胶囊高剂量组五福心脑清软胶囊648mg/kg灌胃；复方丹参滴丸组：复方丹参滴丸36.45mg/kg灌胃。各组给药体积用生理盐水调整至10ml/kg。

1.7指标检测

1.7.1血清SOD、MDA于复制模型2周后，各实验组大鼠球后静脉丛取血，全自动生化分析仪参照试剂盒说明书检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。

1.7.2病理形态于复制模型2周后，各实验组部分大鼠10％水合氯醛按3.5ml/kg体重腹腔麻醉，经左心室灌注0.01M磷酸盐缓冲液，pH值7.4，待灌注液清亮，灌注4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液10min，取脑，放入4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液外固定。石蜡包埋，切片，行HE染色，光镜观察。

1.8统计学方法数据以x±s表示，进行方差分析，F检验，组间比较，q检验。

2结果

2.1五福心脑清软胶囊对大鼠多发性脑梗死模型血清SOD、MDA的影响见表1。

实验结果表明，模型组大鼠血清SOD活性较正常组降低，各治疗组与模型组比SOD活性均有所升高，模型组大鼠血清MDA浓度较正常组升高，各治疗组与模型组比，MDA浓度均有所降低。

2.2五福心脑清软胶囊对大鼠多发性脑梗死模型形态学的影响HE染色结果表明，模型组可见大片脑组织坏死，坏死区周围可见胶质细胞增生，残余组织可见神经细胞变性，脑实质有水肿，坏死区的血管可见栓塞。各治疗组脑实质坏死面积明显小于模型组，在皮层可见筛状软化灶，软化灶周围及坏死灶中可见散在胶质细胞增生，神经元仍有变性(图1～12)。

3讨论

MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化可间接地反映组织中氧自由基含量变化。SOD作为一种抗氧化酶，有助于清除氧自由基，具有清除、防止活性氧合成和蓄积，阻断脂质过氧化连锁反应，保护细胞免受毒害的作用［2］。脑缺血时产生大量氧自由基，细胞内SOD减少，氧自由基不能被清除，细胞膜磷脂中多聚不饱和脂肪酸的不饱和双酯键易受氧自由基攻击，导致脂质过氧化反应，激起自由基的连锁-增殖反应，形成一系列的脂质自由基及其降解产物丙二醛(MDA)，这些脂质自由基将进一步引起细胞膜的流动性降低，加重脑损伤，是导致该模型动物神经细胞发生迟发性神经元死亡的一个重要原因。

五福心脑清由精制红花油、冰片等组成。红花，其性辛温，归心肝经，具活血通经、祛瘀止痛的功效，临床用于治疗缺血性心脏病、脑中风等。冰片芳香开窍、醒神，能恢复神经系统功能，现多用于治疗心脑血管疾病，如脑动脉硬化症、脑萎缩、中风后遗症引起的神志不清、健忘、痴呆等。近年来开展对醒脑开窍药的筛选研究，观察到冰片本身有直接的醒神开窍作用，且作用很强，而不止是仅作为“引药”［3］。有研究表明，冰片具有促进血脑屏障通透性增加和引药上行的作用［4，5］，诸药合用可以起到活血化瘀、醒脑开窍的功效。

本实验结果，五福心脑清可以使多发脑梗死性痴呆大鼠的血清SOD含量升高，MDA含量下降，抑制多发脑梗死引起的过氧化损伤，可使脑组织病理形态学改变减轻。提示本药对多发性脑梗死模型有积极的治疗作用，实验结果为该方药的进一步研究及新药开发提供了一定的实验依据。

【参考文献】

1梅建勋，张允岭，张伯礼.多发梗死性痴呆大鼠模型的改进与应用.中国中西医结合杂志，2000，20（2）：113-115.

2周小青，刘旺华，李花，等.丹龙醒脑片对血管性痴呆大鼠学习记忆及脑组织脂质过氧化和钙超载的影响.湖南中医学院学报，2002，22（3）：1.

3方永奇，邹衍衍，李翎，等.芳香开窍药和祛痰药对中枢神经系统兴奋性的影响.中医药研究，2002，18(3)：404.

大鼠脑范文篇6

【关键词】银杏叶提取物；学习记忆；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶；点燃模型；大鼠

EffectofextractsofGinkgobilobaleafonthelearning-memoryabilityandtheactivity

ofAChEandChATinthehippocampusinratswithkindling-inducedepilepsy

DUANFangrong,YUANBaoqiang*

(DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofextractsofGinkgobilobaleaf(EGb)onthecognitivefunctionssuchaslearningandmemoryabilitiesandpossiblemechanismsinyoungratswithkindling-inducedepilepsy,andontheactivityofacetylcholinesterase(AChE)andcholineacetyltransterase(ChAT)inrat.Methods40postnatalday21(P21)and40postnatalday35(P35)Sprague-Dawley(SD)ratswererandomlyassignedrespectivelyinto5groups:normalsaline(NS)control,kindlingepilepsymodel,high,middleandlowdosageofEGb-treatedkindlingepilepsyafterpreliminaryscreeningbyY-mazetest.Thekindlingmodelwasestablishedbyanintraperitonealinjectionofpentetrazole(PTZ).Thevariationsoflearning-memoryabilityandtheactivityofAChEandChATinthehippocampuswereobservedbyY-mazetestandbiochemistrydetermination.ResultsEGbcouldobviouslyimprovetheachievementofY-mazetestofthekindlingmodelinadose-dependentmanner,withtheactivityofAChEandChATinthehippocampusinhibitedandincreased,respectively.ConclusionEGbcanimprovelearning-memoryabilityinepilepticratsofdevelopmentalphasebyincreasingtheChATactivityandreducingtheAChEactivity,whichmaycontributetoitsactioninimprovingtheabilityofcholinergicnervoussystem.

Keywords:extractsofGinkgobilobaleaf;learning-memory;AChE;ChAT;kindlingmodel;rats

银杏叶提取物(extractsofGinkgobilobaleaf,EGb)是从银杏叶中利用醇溶液提取出的混合成分，主要含有银杏总黄酮苷、银杏内酯和有机酸等，具有多价性药理作用［1］。其作为一种中枢神经赋活剂，目前国内外已将EGb广泛应用于治疗脑动脉硬化、脑梗死后遗症和老年神经精神症状如注意力不集中、记忆力减退、意识模糊等，在临床上明显地改善了脑功能不全患者的学习记忆能力，因而被认为是一种“认知增强剂”［2-4］。目前认知问题亦是癫疒间儿童在临床诊断和治疗中的常见症状，但尚缺乏较好的处理措施。而关于EGb对癫疒间患者尤其是癫疒间儿童学习记忆等认知功能障碍影响的实验研究或临床研究少见报道。本研究旨在探讨EGb对癫疒间模型幼鼠认知功能的影响及可能机制，为临床应用EGb治疗癫疒间儿童认知功能障碍提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物21、35日龄SD幼鼠，体重55～95g，雌雄不分，由徐州医学院实验动物中心提供。

1.1.2药物及试剂EGb（银杏总黄酮苷＞24%，银杏内酯＞6%，峰比0.8～1.0,银杏酸＜1×10-6%），由徐州富伟生化制品有限公司惠赠；戊四氮(PTZ)购于Sigma公司；AChE、ChAT试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3仪器Y型电迷宫，张家港生物医学仪器厂生产；GL20C超速冷冻离心机，武汉科学仪器厂生产；752紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产;水浴箱，上海医学仪器厂。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立参考文献［5］方法。用PTZ亚惊厥剂量（32mg/kg）,腹腔注射,每天1次,连续注射28天。停药1周后,再用相同剂量的PTZ测试。癫疒间发作行为按Racine标准分为6级,即：0级，未发作；Ⅰ级，头面部抽搐；Ⅱ级，肌阵挛、跳起,但无直立；Ⅲ级，肌阵挛,双前肢抬起伴有直立；Ⅳ级，强直-阵挛性惊厥；Ⅴ级，全身强直-阵挛性惊厥伴有翻滚、跌倒。凡显示连续5次2级以上惊厥的大鼠,被认为达到点燃标准，即点燃模型制备成功。

1.2.2动物分组及药物处理先用Y型电迷宫初步筛选21、35日龄大鼠各40只，然后进行点燃模型的制备，造模成功后随机分为5组(n=8)：生理盐水组(NS组)、点燃对照组(PTZ组)、EGb大剂量300mg/kg治疗组(PTZ+EGb1组)、EGb中剂量200mg/kg治疗组(PTZ+EGb2组)、EGb小剂量100mg/kg治疗组(PTZ+EGb3组)。EGb以5%的乙醇为溶剂制备成10%的混悬液，采用灌胃给药,NS组和PTZ组给予相同体积的生理盐水,每日1次，连续给药7天。所有大鼠均在同一实验室和动物中心操作和饲养，以保持喂养、光照、噪声等条件相同。

1.2.3学习记忆功能的训练与评定参照王跃春［6］方法，电流强度0.7mA，电压50V，电击延时5s。

筛选：将大鼠放入Y型迷宫箱中适应3min后，给予适当电击，至其对3臂均探索进入为止，选择活跃、对点击反应较敏感、逃避反应迅速者供测试用。淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠。

训练及评定：采用随机休息不固定训练次数法，以大鼠在足底通电后15s内一次性进入安全区的反应为正确,直至大鼠在连续10次电击中有9次或以上正确（9/10标准）为达到学会标准，以每只大鼠达学会标准所需电击次数表示大鼠的学习记忆成绩。所有训练在1个实验日内完成。各组在造模后次日及治疗后7天进行认知功能的评定。

1.2.4海马AChE、ChAT活性的测定在完成认知功能评定步骤后断头处死大鼠,冰台上迅速取脑并剥离海马,用滤纸吸去海马上的血液,精密称重,脑重∶生理盐水以1∶9比例加入4℃生理盐水制成脑匀浆,3000r/min离心10min,取上清液待测。

海马AChE、ChAT活性的测定严格按试剂盒说明进行，752型紫外分光光度计进行比色。脑组织蛋白测定采用考马斯亮兰试剂盒。

设定每毫克组织蛋白样本在37℃保温6min,水解反应体系中1μmol基质为1个AChE活力单位；在pH7.2条件下，25～30℃时每分钟转移1nmol乙酰胆碱的能力定义为一个ChAT活力单位。

1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，所有计量资料数据以±s表示；多组间的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，治疗前后的比较采用配对t检验（Paired-SamplesTTest）,不同日龄组的比较采用独立样本t检验(Independent-SampleTTest)；P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1点燃模型的建立PTZ腹腔注射1周左右大鼠陆续出现程度不等的疒间性发作,为Ⅰ～Ⅲ级,以后发作程度逐渐加剧,在连续注射28天后所有大鼠均达到点燃标准。大鼠的疒间性发作基本上在每次腹腔注射PTZ后5～6min出现,一般在10min左右达到高峰,高峰过后时而表现安静,时而有阵发性阵挛,一般30min后很少再有抽搐发作。PTZ点燃成功的大鼠,有慢性、自发性、复发性的发作过程。

2.2各组大鼠行为学测试Y型电迷宫测试结果见表1。

2.2.1治疗前不管是21日龄还是35日龄的大鼠，PTZ各组与其同龄NS组相比，达到学会标准所需的电击次数明显增多(P<0.01)，而PTZ各组之间没有明显差异(P>0.05)；21日龄与35日龄的PTZ各组相互比较，前者达标次数亦明显增多(P<0.05);21日龄与35日龄的NS组相互比较差异无统计学意义。表1各组大鼠Y型电迷宫试验达标所需电击次数与NS组比较：*P<0.01；与治疗后PTZ组比较：#P<0.01；与PTZ+EGb2组比较：※P<0.01；与同组治疗前比较：☆P<0.05；与21日龄组比较：△P<0.05。

2.2.2治疗后2个日龄EGb治疗组达到学会标准的次数均明显少于同龄PTZ组(P<0.01)；同龄EGb大、中、小剂量治疗组相互比较,达到学会标准的次数随EGb治疗剂量的减少逐渐增多，呈现剂量依赖性递增(P<0.01)；各EGb组的2个年龄段之间却未示明显差异(P>0.05)。

21日龄、35日龄各组治疗前后相互比较，EGb各剂量治疗组治疗后达标次数均明显少于治疗前(P<0.01或P<0.05)；NS组、PTZ组治疗前后差异无显著性统计学意义。

2.3生化检测不管是21日龄还是35日龄的大鼠，PTZ组与各自的NS组比较，海马AChE、ChAT的活性都明显降低(P<0.01)；各EGb治疗组与其同龄PTZ组相比，随治疗剂量的增加，AChE活性逐渐降低、ChAT活性则逐渐提高，呈剂量依赖性(P<0.01)；各组的2个年龄段之间AChE、ChAT的活性均未示明显差异(P>0.05)。见表2。表2各组大鼠海马AChE、ChAT活性的比较与PTZ组比较：☆P<0.01；与PTZ+EGb2组比较：△P<0.01；与21日龄PTZ组比较：▲P>0.05

3讨论

点燃模型作为一种最常用的癫疒间动物模型,具备慢性、自发性和复发性特征,点燃一旦建立,动物的这种脑细胞及惊厥行为敏感性可长期维持及至终身,较好地模拟了人类癫疒间的进行性发展和长期反复的自限性发作形式。许多研究表明，不同形式癫疒间发作过程中常伴有海马结构内选择性神经元脱失、苔藓纤维出芽(sprouting)和特异性突触重建等形态学改变［7-9］，在人类复杂部分性发作和儿童期癫疒间患者亦可观察到同样的变化［10］,这表明点燃与人类癫疒间的形成可能有共同的机制，因此点燃模型是研究慢性癫疒间较理想的动物模型。临床资料显示癫疒间患者中30%～40%存在认知功能障碍［11］，在儿童患者更为显著，临床上表现为某种程度的学习困难或学习不能、语言能力的损伤等，但临床上对此缺乏有效的手段来改善这一现状。

本实验采用戊四氮化学点燃方法,复制出了接近人类癫疒间的慢性癫疒间模型，本实验的行为学观察结果发现:点燃组大鼠学习记忆能力显著低于NS组,与文献报道结果相似，说明本造模法稳定可靠,适用于学习记忆等高级神经功能活动的研究。试验结果还显示，21日龄模型鼠的行为学指标与35日龄的相比，差异具有显著性，与以往研究结果相一致，即癫疒间幼鼠起病越早，对学习记忆等认知功能损伤越严重［12］。

目前认为中枢胆碱能系统与学习记忆功能的关系极为密切，有资料表明,海马的胆碱能系统直接参与信息的储存和回忆。而AChE及ChAT是胆碱能神经元的标志酶，两者共同维持着中枢胆碱能系统重要的神经递质——乙酰胆碱（ACh）的动态平衡,在多种高级脑功能包括学习记忆过程中发挥重要作用，所以用AChE及ChAT的活性来反映胆碱能系统的功能较为可靠。许多药理学及临床研究已证实海马和新皮层的胆碱能损伤可以损害大鼠和人的记忆功能。我们的研究显示,点燃大鼠的学习记忆能力明显减退,同时伴有海马AChE、ChAT活性降低,提示戊四氮诱导的学习记忆障碍与海马及新皮层胆碱能系统的功能降低有关，这与以往的研究结果一致。在应用银杏叶提取物EGb治疗后发现，EGb显著改善了癫疒间鼠的学习记忆功能，还显著降低AChE的活性，增强ChAT的活性，并且在100～300mg/kg范围内，EGb的这种药理作用呈剂量依赖性增强。表明EGb能改善癫疒间大鼠学习记忆功能的机制可能与抑制脑AChE活性、增加ChAT的活性,从而提高ACh含量,增强中枢胆碱能神经系统的功能有关。诸多的研究显示，EGb还可能通过促进大脑海马胆碱的再摄取、减少M型胆碱受体和肾上腺素受体及递质的丢失、促进大脑循环代谢、增强胆碱能神经元神经营养因子受体的敏感性等途径发挥改善学习和记忆能力的功能［13］。近年来的临床研究也发现EGb可明显改善血管痴呆患者的智能障碍，这种作用可能与EGb加速神经冲动的传导,易化突触传递,从而有利于信息获得、记忆巩固和再现有关［14］。本实验中2个不同年龄段对应组间生化指标比较未示显著差异，说明除胆碱能系统外可能还有其他机制影响癫疒间幼鼠的学习记忆功能。

本实验结果提示：EGb可以通过抑制学习记忆功能脑区AChE活性、增强ChAT活性、增强中枢胆碱能神经系统的功能来改善点燃模型幼鼠的学习记忆功能障碍，为EGb用于临床治疗癫疒间儿童认知功能障碍提供了理论和实验依据，并且进一步拓展了EGb的药用价值。

【参考文献】

［1］危华玲.银杏叶提取物和山楂提取物的药理作用研究进展［J］.海峡药学，2006，18（2）：5-7.

［2］汪建龙.银杏叶提取物在心脑血管疾病上的临床应用概况［J］.时珍国医国药,2003,14（4）:243-244.

［3］GertzHJ,KieferM.ReviewaboutGinkgobilobaspecialextractEGb761(Ginkgo)［J］.CurrPharmDes,2004,10(3)：261-264.

［4］WangY,WangL,WuJ,etal.TheinvivosynapticplasticitymechanismofEGb761-inducedenhancementofspatiallearningandmemoryinagedrats［J］.BrJPharmacol,2006,148(2)：147-153.

［5］王丽，OnoJ,WalsonPD.大鼠戊四唑点燃模型的建立［J］.药学学报,1993,28(7):486-489.

［6］王跃春.Y型电迷宫在大鼠学习记忆功能测试中的合理应用［J］.中国行为医学科学，2005，14(1):69-70.

［7］刘月影，袁宝强.c-fos反义寡聚核苷酸对癫疒间发作后细胞凋亡的影响［J］.实用儿科临床杂志，2006，21（15）：1017-1018.

［8］陈静，袁宝强.戊四氮诱导发育鼠癫疒间持续状态后海马突触素的变化及MK-801的影响［J］.徐州医学院学报，2006，26（2）：120-124

［9］MortazaviF,EricsonM,StoryD,etal.Spatiallearningdeficitsandemotionalimpairmentinpentylenetetrazole-kindledrats［J］.EpilepsyBehav,2005,7(4):629-638.

［10］MohamedA,WyllieE,RuggieriP,etal.Temporallobeepilepsyduetohippocampalsclerosisinpediatriccandidatesforepilepsysurgery［J］.Neurology,2001,56(2):1643-1649.

［11］洪霞，黄茂盛，王蓓.癫疒间患者的认知功能状况分析［J］.临床神经电生理学杂志，2002，11（2）：88-90.

［12］HermannB,SeidenbergM,BellB,etal.Theneurodevelopmentalimpactofchildhood-onsettemporallobeepilepsyonbrainstructureandfunction［J］.Epilepsia，2002,43(9):1062-1071.

大鼠脑范文篇7

【关键词】川芎生物碱；缺血再灌注；超氧化物歧化酶；丙二醛；自由基

近年来，人们倾向于采用超早期溶栓治疗脑梗死，迅速恢复局部血供，以达到理想的治疗效果，但缺血再灌注（I/R）损伤可引起一系列复杂的继发改变，导致缺血组织损伤恶化〔1〕。如何防止脑I/R，寻找有效的防治药物，促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复，一直是相关学科研究的重点之一。某些中药如叁附、大黄、川芎等经临床验证可通过多种环节防止缺血性损伤〔2〕,但目前国内有对照的临床研究病例数较少,本实验通过观察川芎（CHX）中的生物碱对大鼠脑I/R损伤后血清中的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量及动物苏醒后神经功能评分、脑梗死容积大小的影响探讨CHX生物碱对脑I/R损伤的保护作用，为CHX防治中枢神经系统缺血性损伤提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物分组及给药方法选择健康Wistar大鼠50只,体重280～350g，由吉林大学实验动物中心提供。编号：SCXK(吉)20030004，随机分成5组，每组10只。CHX生物碱由北华大学药学院中药研究室制备,用时调配至所需浓度。①I/R组（生理盐水组10ml/kg），腹腔注射（ip）生理盐水10ml/kg7d，每天1次。②I/R＋CHX50mg/kg组，ipCHX生物碱50mg/kg连续7d，每天1次。③I/R＋CHX100mg/kg组，ipCHX生物碱100mg/kg连续7d，每天1次。④I/R＋CHX200mg/kg，ipCHX生物碱200mg/kg连续7d，每天1次。⑤假手术组，进行手术而未制造大鼠局灶性脑I/R病理模型。⑥阳性对照组，用葛根素（GGS）5mg/kg，连续7d，每天1次。除假手术组外，其余各组用药7d。后制造大鼠局灶性脑I/R病理模型。

1.2I/R造摸方法大鼠用25％乌拉坦ip（0.3ml/100g）加乙醚吸入麻醉。背位固定，颈右侧切口，暴露右颈总动脉（CCA）。向外牵引二腹肌和胸锁乳突肌，由CCA分叉处向头端依次游离。电凝颈外动脉（ECA）的所有分支。在甲状腺上动脉远端结扎，切断ECA，使其主干游离备用，然后分离颈内动脉（ICA）至颅底，结扎其分支翼腭动脉，仅保留ICA入颈主干。用1号丝线在ECA根部打一松扣，用动脉夹暂时关闭CCA和ICA，将预先制备好的尼龙线经ECA主干的切口插入至CCA分叉处,将ECA根部的丝线缚紧,以防止其中的尼龙线滑出或出血，然后移去ICA的动脉夹，将动脉夹缓慢向ICA入颈的方向推进，以分叉处为标记，推进约17mm时可感到阻力，表明尼龙线的头端已通过大脑中动脉（MCA）的起始处,到达较细的大脑前动脉内，移去CCA上的动脉夹，此时即完成右侧MCA的阻塞，缝合切口，将尼龙丝的尾端留在皮外，再灌注时将尼龙线轻轻抽感到阻力时，表明尼龙线的头端已回到ECA的主干中，从而实现MCA的再灌注。术中及术后注意保持体温，室温保持在20℃～24℃。

1.3检测指标及方法采用黄嘌呤氧化酶法检测血清中SOD活性（单位：U/ml）；硫代巴比妥酸显色法检测血清中MDA含量（单位：nmol/L）;TTC染色法及图像处理软件（AdobePhotoshop6.0）计算脑梗死面积，各脑片梗死面积之和乘以厚度（2mm）为总脑梗死容积。动物苏醒后放回鼠笼，自由饮食。脑缺血2h再灌注2h后，由一名不了解情况的观察者评估记录神经行为学评分,方法参考Zealonga等的报道〔3〕，即7级评分方法：0级，无异常；0.5级，竖毛，轻度运动低下；1级，前肢屈曲，运动障碍；2.0级，行动不协调，屈取姿势，旋转运动；3.0级，偏瘫，不能站立和行走；4.0级，痉挛，昏睡；5.0级，死亡。

1.4统计学处理采用SPSS10.0统计学软件，组间进行方差分析，两两比较用SNKq检验。

2结果

2.1CHX生物碱对大鼠血清中SOD活性和MDA含量的影响见表1。I/R组与假手术组相比，血清中SOD活性降低，MDA含量增加（P＜0.01）。CHX50mg/kg组、100mg/kg组及200mg/kg组与I/R组相比，血清中的SOD活性均升高（P＜0.01），MDA含量均降低（P＜0.05）。

2.2CHX生物碱对I/R组大鼠脑梗死容积的影响见表2。各用药组梗死容积与I/R组相比有明显下降（P＜0.01）；各用药组间梗死容积差异无统计学意义。表1CHX生物碱对大鼠血清中SOD活性和MDA含量的影响与I/R组比较：1）P＜0.01，2）P＜0.05。下表同表2CHX生物碱对I/R组大鼠脑梗死容积的影响

2.3CHX生物碱对I/R大鼠神经功能的影响见表3。各用药组大鼠I/R后神经功能评分与I/R组比较差异显著（P＜0.05）。表3CHX生物碱对I/R大鼠神经功能的影响

3讨论

自由基是最外层轨道上有单个未配对电子的原子、原子团和分子的总称。常见的自由基有超氧阴离子（·O-2）、羟自由基（·OH）、还原性一氧化氮（NO·）等〔4〕。在正常情况下，人体内约1％～2％的氧通过多种途径产生自由基，但由于细胞内存在SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、过氧化氢酶（CAT）等可迅速清除自由基，使其生成和清除处于平衡状态，但在缺血，特别是再灌注后（因其带有大量的氧）等条件下，产生大量的自由基，而SOD等酶的清除能力有限，使生成与清除平衡失控，积累大量的自由基，自由基主要通过许多氧化反应造成组织细胞的损伤，主要的损伤为细胞膜磷脂分子中的不饱和脂肪酸的过氧化产生脂质过氧化物，再经过氧化酶催化生成MDA，最终使磷脂结构发生变化，膜受到严重损伤，引起迟发性功能损害。MDA是其反应的主要产物，由于脑组织中富含脂质，因此脑组织对自由基特别敏感〔5〕。血中MDA含量的变化间接反映了脑组织中氧自由基含量的变化，反映脑组织中脂质过氧化程度及脑细胞损伤程度。SOD是机体清除自由基的主要酶，SOD活性高低间接反映脑组织清除自由基的能力〔6〕。

本实验显示，与假手术组相比，I/R后血清中的MDA含量显著升高（P＜0.01），而SOD活力明显下降（P＜0.01），说明自由基引起的脂质过氧化损伤在脑I/R损伤中非常显著。与I/R组相比，CHX50mg/kg组、CHX100mg/kg组、CHX200mg/kg组血浆中MDA含量显著降低（P＜0.05），SOD活力明显升高（P＜0.01），说明CHX生物碱对脑I/R引发的自由基损伤有保护作用，从而减轻脑I/R后脑组织的损害。

本研究还发现，CHX50mg/kg组、CHX100mg/kg组、CHX200mg/kg组与I/R组相比，脑梗死容积明显降低（P＜0.01）。大鼠脑缺血2h再灌注2h后，均表现一定的神经功能障碍，神经功能评分显示，CHX50mg/kg组、CHX100mg/kg组、CHX200mg/kg组和GGS5mg/kg组与I/R组相比差异显著（P＜0.05），均进一步证实了CHX生物碱对脑I/R损伤具有保护作用。

【参考文献】

1HsckeW，KasteM，OlsenTS,etal.Acutetreatmentofischemiastroke〔J〕.CerebrovascDis，2000;10(supple10):223.

2朱正华，熊利泽，董海龙，等.参附注射液对兔脊髓缺血损伤的保护作用的研究〔J〕.第四军医大学学报，2002;21(3)：27882.

3IealongaE，WeinsteinPR，CarlsonS.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcranectomyinrat〔J〕.Stroke,1989；20(10):8491.

4CuzzocreaS,RileyDP,CaputiAP,etal.Antioxidanttherapy：anewpharmacologicalapproachinshock,inflammationandischemiareperfusioninjury〔J〕.PharmacolRes，2001;53：13559.

大鼠脑范文篇8

1.1动物KM小鼠，SPF级，雌雄各半，体重(20±2)g，合格证号：SCXK（甘）2004-0006-0000025；Wistar大鼠80只，SPF级，雌雄各半，体重(90±10)g，合格证号：SCXK（甘）2004-0006-0000025，由甘肃中医学院实验动物中心提供。

1.2药物活血定眩丸（由甘肃中医学院附属医院提供，批号070501）因丸剂中含有一定量的辅料，动物实验配制供试样品浓度达不到实验要求的剂量，故采用与丸剂相同工艺方法制得该药的浸膏（1g浸膏相当于2.242g生药），实验前用蒸馏水配制成实验所需浓度用于急性和长期毒性实验。

1.3仪器

CD-1200型血细胞分析仪（美国，雅培）；ALCYON300型全自动生化分析仪（美国，雅培）；电子显微镜BX60-32FB3-F01型（日本，OLYMPUS）；切片机RM2135型（德国，徕卡）；全自动组织包埋机TEC-V.CM-JZ型(日本，樱花)；自动组织脱水剂VIP-JJZ-JZ型（日本，樱花）。

2方法与结果［2～4］

2.1小鼠急性毒性实验

2.1.1方法

经对小鼠预试验，结果显示不能测出活血定眩丸剂对小鼠的LD50，故进行对动物的最大给药量测定。取KM小鼠40只，雌雄各半，按体重随机分为两组，分别为给药组和空白对照组，每组20只。于禁食12h后（不禁水），给药组以最大给药浓度（1.86g生药/ml），0.4ml/10g体重的给药体积，对照组以等体积的生理盐水，灌胃2次/d，间隔6h，给药后观察14d，记录动物的死亡及毒副反应症状。实验结束时，将全部动物处死，解剖，肉眼观察各主要脏器组织病变情况。计算小鼠口服活血定眩丸的最大给药量。

2.1.2结果

1日内灌服活血定眩丸148.8g生药/kg体重后，动物活动、进食进水、毛发未见任何异常。观察14d动物无死亡。肉眼尸检未见主要脏器组织明显异常。由此可见，活血定眩丸小鼠口服最大给药量>148.8g生药/kg体重。此剂量相当于临床成人（按60kg计）每日口服剂量0.2242g生药/kg体重的663倍。体重变化情况见表1。表1活血定眩丸对急性毒性实验小鼠体重的影响(略)

结果显示，给药组与对照组小鼠的体重变化无显著性差异。

2.2大鼠长期毒性实脸

2.2.1方法取Wistar大鼠80只，按体重随机分为4组，雌雄各半，每组20只，分别为活血定眩丸高、中、低剂量组和空白对照组，给药量分别为每日22.42，11.21，2.242g生药/kg（分别相当于临床日用药剂量的100倍，50倍，10倍），给药体积为1.5ml/100g体重，各剂量组用等体积不等浓度给药，空白对照组给予等体积生理盐水溶液1次/d，每周给药7d，连续灌服6周。给药前及给药期间每周称体重1次，并按平均体重调整给药剂量，实验期间每天观察大鼠一般状态、体征、摄食量、饮水及粪便状况。发现有中毒反应的动物应取出单笼饲养，重点观察。发现死亡或濒死动物应及时尸检。于末次给药结束后24h，每组取一半的大鼠从腹主动脉取血，检查血液学和血液生化学指标，取血后，立即剖取脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、子宫等脏器称重，根据体重计算器官重量系数，并对心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠、大肠、垂体、脊髓、骨髓、淋巴结、膀胱、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胸腺、肾上腺等组织做病理学检查。

2.2.2结果

用药组及对照组大鼠在8周实验期间均未见异常症状，动物的活动、体重、摄食量、大便和毛发光泽程度等未见异常。80只大鼠无一死亡。

活血定眩丸剂对大鼠体重增长的影响：在活血定眩丸连续给药及停药恢复期间，各组大鼠体重变化一致，无明显异常。结果见表2。表2活血定眩丸剂对实验大鼠体重的影响(略)

结果显示，给药6周及停药2周后，活血定眩丸各给药组大鼠体重变化与对照组相似，未见明显的体重改变。

活血定眩丸剂对大鼠血液学的影响：活血定眩丸剂连续给药42d时各剂量组大鼠外周血象检查均在正常范围。结果见表3。表3活血定眩丸剂对实验大鼠血液学的影响(略)

结果显示，给药6周及停药2周后，活血定眩丸各给药组大鼠各项血液学指标与对照组相似，未见明显改变。

活血定眩丸剂对大鼠血液生化指标的影响：活血定眩丸剂连续给药6周及停药恢复2周时，各剂量组与空白对照组比较无明显差异。实验结果见表4。表4活血定眩丸剂对实验大鼠血生化指标的影响(略)

结果显示，给药6周及停药2周后，活血定眩丸各给药组大鼠各项血液生化学指标与对照组相似，未见明显血液生化学改变。

活血定眩丸对大鼠主要脏器重量系数的影响：连续给药6周及停药2周，各组动物体质、脏器质量无显著性差异，其脏器系数（g/100g体重）亦无显著性差异。结果见表5。表5活血定眩丸对大鼠脏器系数的影响(略)

结果显示，给药6周及停药2周后，活血定眩丸各给药组大鼠脏器系数与对照组相似，未见明显的脏器系数改变。

活血定眩丸对大鼠重要器官组织病理形态的影响：连续给药6周及停药恢复2周后，放血处死各组大鼠，尸解对脏器进行肉眼观察未发现异常现象。给药各组动物各个脏器组织病理切片检查未见明显病变（主要脏器的病理切片见图1～10）。说明活血定眩丸高，中，低3个剂量连续服用6周，对大鼠主要脏器无明显器质性损伤。

3结论

活血定眩丸成人临床每日用量为0.2242g生药/kg体重，小鼠1日口服最大给药量为148.80g生药/kg。相当于成人用量的663倍。表明该药无明显急性毒性作用。

活血定眩丸以22.42，11.21，2.242g生药/kg体重3个剂量灌胃(分别为成年人临床日用剂量100，50，10倍)，1次/d，连续给药6周，与灌胃蒸馏水的空白对照组比较，对大鼠一般状态(外观形态、活动、饮食、大便形状等)、生长发育(体重增大)、外周血象、血液生化、病理学检查未见明显毒性作用；停药恢复2周后亦未见明显的迟缓毒性反应。实验结果表明，该药长期使用不会引起机体结构和功能的改变，无毒副作用，提示按临床规定的疗程、剂量用药时是安全的。

【参考文献】

［1］宋敏，蒋宜伟，邱桐.活血定眩丸对椎动脉型颈椎病兔血液流变学，ET，NO的影响［J］.甘肃中医学院学报，2005，22(6)：23.

［2］谢秀琼.中药新试剂开发与应用，第3版［M］.北京：人民卫生出版社,2006:721.

［3］中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南(药学、药理学、毒理学)［M］.北京：人民卫生出版社，1994：199.

［4］国家食品药品监督管理局.中药新药研究的技术要求［S］.1999.

大鼠脑范文篇9

绞股蓝为葫芦科多年生攀援草本植物Gynostemmapentaphylla(Thunb.)Makino，又名小苦叶、公罗锅底、遍地生根等。绞股蓝在我国药用历史悠久，其药用部位为根状茎或全草，味甘、苦，性寒，有益气健脾、化痰止咳之功效；现代研究表明绞股蓝中含有皂苷、氨基酸、黄酮、糖和多种无机元素等等，其中皂苷有80多种，6种与人参皂苷相似，绞股蓝的提取物具有抗疲劳、抗缺氧、免疫调节、降血脂、降血糖等作用。本文就其药理作用研究进展情况作一综述，为进一步开发研究提供依据。

1药理作用

1.1对心脑血管系统的作用

1.1.1对脑循环系统的作用昆明种小鼠腹腔内注射绞股蓝总皂苷（GP）后，小鼠耳廓血管、脑膜血管的血流速度及流量明显增加，微循环微镜下可见小动脉血管交通支开放数明显增多，证明绞股蓝增加组织血流量与加快血流速度及增加脑动脉侧支循环有关，对缺血性脑损伤可呈现较好的防治作用［1］。GP还可明显抑制谷氨酸引起的Wistar大鼠胚胎大脑皮层神经细胞内NO、H2O2含量的升高，有效地防止线粒体膜电位的下降，从而提高细胞存活率，减少大脑皮层神经元的损伤［2］。绞股蓝提取物还能明显的改善由东莨菪碱和乙醇造成的大鼠学习和记忆的获取与再现的障碍。

1.1.2对心脏的作用绞股蓝总皂苷1mg/kg静脉注射，使麻醉犬动脉收缩压、舒张压、平均动脉压均显著升高，明显增加左室收缩压(LVSP)、室内压最大上升速率(+dp/dtmax)及室内压最大下降速率，20mg/kg静脉注射，则出现心率减慢，动脉收缩压、舒张压、平均动脉压、LVSP、-dp/dtmax均降低，呈现剂量大小不同而出现正负双向效应。绞股蓝总皂苷100mg/kg腹腔注射，能缩小兔冠脉结扎引起的心肌梗塞范围，对大鼠的梗塞心肌，可降低其丙二醛含量，并保护心肌超氧化物歧化酶活性。绞股蓝皂苷5，10mg/kg静脉管注射，明显降低麻醉犬血压和总外周阻力,也降低脑血管及冠状血管阻力,增加冠脉流量,减慢心率,使心脏张力-时间指数下降,对心肌收缩性能和泵血功能无明显影响。绞股蓝总皂苷5mg/只静脉注射,可对抗垂体后叶素引起蟾蜍心电图T波的降低。绞股蓝皂苷静脉注射家兔3d后，夹闭肠系膜上动脉复制肠缺血再灌注心肌损伤模型，利用MedlabU/4c生物信号采集处理系统采集并分析，发现与静脉注射生理盐水的对照组比较，绞股蓝皂苷组左心室收缩峰压（LVSP）、室内压最大上升速率（+dp/dtmax）、室内压最大值（Vpm）均显著升高，室内压最大下降速率（-dp/dtmax）明显降低，表明绞股蓝皂苷可明显改善心肌的收缩功能，对损伤的心肌有保护作用［3］。

1.2对血液系统的作用

1.2.1对血脂的作用GP能够不同程度地降低高脂喂养的大鼠血清中的血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度，尚可显著提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）,并且可显著降低血浆内皮素（ET），从而减少动脉粥样硬化的发生［4］；用高脂乳剂灌胃的小鼠服用不同剂量复方绞股蓝胶囊后发现大、小剂量复方绞股蓝胶囊均能提高高血脂小鼠的超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低血清过氧化产物丙二醛（MDA）含量，降低高血脂小鼠体重，对血脂（TC，TG，LDL-C）含量有明显降低作用，及对HDL-C有升高作用，表明绞股蓝提取物具有调节高血脂小鼠脂质紊乱作用［5］。

1.2.2对血糖的作用GP体外对a-淀粉酶有一定的抑制作用，而淀粉酶可促进消化道内的淀粉水解为单糖，使单糖的吸收增加，血糖升高；GP对四氧嘧啶致糖尿病大鼠灌胃后血糖水平有显著降低，提示GP在体内外都有一定的降血糖作用［6］。

1.2.3对血液流变学的影响绞股蓝可显著降低高脂血兔的全血黏度及血浆黏度、红细胞压积，提高红细胞变形能力，提示绞股蓝对血淤兔的血液流变学有明显的改善作用［7］。

1.2.4对血小板聚集和花生四烯酸代谢的影响绞股蓝水煎醇提物0.25～2g/L的终浓度,明显抑制花生四烯酸诱导的兔血小板聚集和血栓素B2(TXB2)释放,剂量与效应相关,其半数抑制剂量(ID50)为0.28g/L；35mg/kg静脉注射，对兔血小板聚集及TXB2的释放也有抑制作用；0.25～4g/L对家兔离体胸主动释放6-Keto-PGF1α无明显影响，表明绞股蓝提取物对降低TXA2-PGI2比值有较好作用。绞股蓝总皂苷50mg/kg皮下注射，可明显抑制大鼠血小板血栓及静脉血栓；0.25，0.5，1.0mg/ml体外试验可抑制兔血小板TXB2生成，1mg/kg可抑制兔主动脉环6-Keto-PGF1α生成，对TXB1及Keto-PGF1α生成的ID50分别为1.07mg/ml及1.15mg/ml。也有不同结果，绞股蓝叶热水提取物1/100、1/200浓度，体外实验对牛血小板有聚集作用，此聚集作用可为PGIα抑制，不为阿斯匹林所影响，不为蛋白酶所破坏，但可为β-葡萄糖苷酶所灭活，认为该物质可能是一种葡萄糖苷或多糖。GP也具有对抗血小板聚集诱导剂引起的血栓形成作用［8］。

1.3对呼吸系统的作用绞股蓝在体外可减轻由石英(SiO2)粉尘所致大鼠肺纤维化的肺泡巨噬细胞线粒体过氧化脂质（LPO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以及肺泡巨噬细胞死亡率，减轻石英所致的肺纤维化［9］。

1.4对消化系统的作用

1.4.1抗溃疡作用绞股蓝皂苷100mg/kg对水浸造成的应激性胃溃疡有明显的保护作用，对照组的溃疡系数为20.08，绞股蓝皂苷(GPs)组为11.95，溃疡抑制率为40.49%，同样剂量连续5d，对大鼠胃溃疡的治愈率为46.79%，如延长至15d，可使治愈率提高至56.72%。大鼠醋酸性胃溃疡在给予冻干幽门螺旋杆菌（HP）后，胃黏膜溃疡面积明显加大，胃黏膜组织内白细胞介素-8（IL-8）、前列腺素E2（PGE2）和MDA生成明显升高，SOD含量明显下降；而再给予GP后，结果显示，黏膜内MDA生成抑制，IL-8，PGE2水平平行下降，SOD活性提高，溃疡面积、溃疡面积百分率明显减小，有明显促进溃疡愈合作用［9］。

1.4.2对肝脏的作用GPs能明显降低CCl4诱导肝损伤升高的SGOT，SGPT，且可升高白蛋白/球蛋白(A/G)比率；使胶原质降低33%，病理学观察亦发现肝胶原质变薄。证实GPs有保护肝脏和抗肝脏纤维化作用。绞股蓝的水提取物(100,300和500mg/kg)可加快肝脏的恢复。在扑热息痛模型中，绞股蓝水提取物可逆转天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高。组织学观察在肝小叶中心区的坏死总量和窦状隙充血、肝中央静脉周围的淋巴细胞和肝巨噬细胞的滤过，以及细胞边界模糊和气球样变性均被GPs逆转。用GP对由四氯化碳致肝功能受损的Wistar大鼠灌胃，发现大鼠的血清谷丙转氨酶(ALT)显著降低，但与正常水平比较扔有差距，表明GP只能减弱四氯化碳对肝功能的损害，而不能完全阻抑其对肝脏的毒性作用。而线粒体过氧化脂质(LPO)含量下降、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性增加，并接近正常水平，表明GP在一定程度上能减弱四氯化碳所致大鼠肝脏脂质过氧化作用［9］。

1.4.3对胆囊的作用同时服用GP和高胆固醇饲料的豚鼠与单纯服用高胆固饲料的对照组相比，胆汁中胆固醇的含量显著降低，胆汁酸含量显著升高，从而提高了对胆固醇的溶解能力，减少了因胆固醇过饱和而致结石的几率［10］。

1.5对泌尿系统的作用在大鼠被动型Heymann肾炎模型，GPs能减轻蛋白尿，降低血脂黏度，提高氧化能力并改善肾功能。GPs对灌服腺嘌呤所致的大鼠慢性肾功能衰竭、肾组织纤维化不仅具有抗纤维化作用，而且可使肾功能明显改善，血浆内皮素和肿瘤坏死因子含量明显降低，血红蛋白量明显升高。在体实验已证实GPs对庆大霉素所致大鼠急性肾功能衰竭具有保护作用。离体实验研究表明，GPs通过抗氧化、拮抗膜的流动性下降、激活并保护膜Na+，K+-ATP酶、减轻DNA合成的受抑等机制减轻庆大霉素肾毒性损伤。用GP对单侧输尿管结扎（UUO）大鼠灌胃后，经测定发现与用标准饲料喂养的大鼠相比，肾组织结缔组织生长因子（CTGF）、转换生长因子β1(TGF-β1)和a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）及肾小管间质损伤指数明显降低，表明GP能够抑制肾纤维化的进展从而保护肾功能［11］。

1.6对中枢神经系统的作用绞股蓝浸膏450mg/kg灌胃，用小鼠热板法实验表明有镇痛作用；对小鼠自发活动有抑制作用。绞股蓝水提物、20%醇提物、95%醇提物3g/kg皮下注射，连续4～5d，可改善樟柳碱引起的小鼠记忆获得障碍；20%醇提物0.75g/kg、单体Rb150mg/kg，腹腔注射，连续3d，可部分对抗乙醇引起的小鼠记忆获得障碍；Tb125mg/kg腹腔注射1次，可拮抗戊巴比妥钠造成的小鼠记忆获得障碍；20%醇提物0.75，1.5g/kg皮下注射，连续5～6d，或1次性给药，可对抗环己酰亚胺、氯霉素所致小鼠记忆巩固障碍和乙醇引起的记忆再现障碍，表明本品有改善记忆的作用。有实验表明,模型组大鼠海马区存在大量神经细胞凋亡,而复方绞股蓝总苷胶囊高、低剂量组神经细胞凋亡与模型组比较明显减少,说明复方绞股蓝总苷胶囊均具有抑制神经细胞凋亡、保护神经细胞的作用［12］。

1.7抗菌的作用研究表明绞股蓝对不同种细菌呈不同程度的体外抗菌活性，对金黄色葡萄球菌，藤黄八叠球菌抗菌活性最高，具有杀菌作用，而对其它细菌如短小芽孢杆菌、痢疾杆菌等在同样浓度下则为抑菌作用［13］。

1.8对肿瘤的作用动物实验证明，绞股蓝总皂苷（GP）能显著抑制小鼠S180肉瘤的生长，显著增加肿瘤坏死面积（TNA）与肿瘤总面积（TTA）的比率，瘤周尤其是瘤内淋巴细胞、巨噬细胞浸润数量明显增加，带瘤小鼠脾重增加、脾白髓数目增多、体积增大，同时对K562细胞株也具有明显的生长抑制作用，表明GP能直接杀伤瘤细胞，并能通过活化免疫细胞来发挥一定的抑瘤作用［14］。

1.9对免疫功能的影响绞股蓝总皂苷400mg/kg灌胃，连续5d，可对抗环磷酰胺引起的小鼠血清溶血素抗体的减少，150，300mg/kg灌胃连续15d，可对抗地塞米松引起的大鼠脾脏空斑形成细胞、特异性玫瑰花结形成细胞及脾细胞抗体分泌量的减少，400mg/kg灌胃，连续12d，对肉瘤-180荷瘤小鼠的免疫功能低下也有增强作用，绞股蓝总皂苷200，400mg/kg灌胃，连续10d，对环磷酰胺引起的小鼠胸腺缩小、血清溶血素抗体的降低，E-玫瑰花结减少均有明显对抗作用，但对正常小鼠的这些免疫指标，绞股蓝总皂苷表现了双向调节作用；400mg/kg灌胃连续12d，或对抗环磷酰胺引起的自然杀伤细胞活性的降低。对正常小鼠和免疫功能低下小鼠，绞股蓝总皂苷10，30mg/kg皮下注射，可增强由ConA诱导的脾T淋巴细胞的增殖反应，和由LPS诱导的脾B淋巴细胞的增殖反应，并提高脾细胞的白细胞介素-2(IL-2)的生成。绞股蓝总皂苷300mg/kg灌胃，连续7d，可增强小鼠腹腔巨噬细胞活性，提高血清IgG含量，便降低血清溶血素抗体水平，延长小鼠移植心肌的存活时间。绞股蓝浸膏250，500mg/kg灌胃，连续6d，可对抗环磷酰胺引起的小鼠外周血白细胞的减少。绞股蓝总皂苷10mg/kg腹腔注射，连续10d，可对抗地塞米松引起的大鼠肾上腺和胸腺萎缩。绞股蓝总皂苷350mg/kg灌胃，连续6d，对抗地塞米松引起的小鼠肾上腺萎缩及肾上腺皮质功能的低下。绞股蓝皂苷10mg/kg腹腔注射，连续10d，对抗地塞米松引起的大鼠肾上腺、胸腺萎缩及血浆皮质醇含量的下降。200mg/kg的GP能显著促进刀豆蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）诱导的小鼠外周血T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖反应，显著增加小鼠免疫器官重量，提高小鼠血清溶血素含量，但此作用随着剂量的增加（300，400mg/kg）而逐渐减弱，证明适当剂量的GP对细胞免疫和体液免疫有促进作用［15］。绞股蓝总皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞内酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶活性及巨噬细胞吞噬功能有增强作用,且存在一定剂量效应［16］。

1.10抗衰老及抗氧化作用绞股蓝水提物0.5%，1.0%混于培养基中饲养果蝇，可延长果蝇的平均寿命，并能促进果蝇幼虫的生长发育。有d-半乳糖造成的小鼠亚急性衰老模型，绞股蓝浸膏15mg/只灌胃40d，可提高衰老小鼠学习主动逃避反应能力，降低脑内单胺氧化酶-B(MAO-B)的异常升高及脑内脂褐质的增加，以及胸腺的缩小和脾脏的增大。绞股蓝浸膏0.5%，1.0%溶液给家蝇饮用，可延长家蝇寿命，并使其脑内超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，丙二醛(MDA)含量降低。绞股蓝总皂苷15.6～500mg/L，可降低大鼠微粒体丙二醛(MDA)的形成，对自发性的及Fe2+-半胱氨酸、Vitc-NADPH或四氯化碳诱发的大鼠肝微粒体脂质过氧化，均有抑制作用；2.5～160mg/L对Fe2+-半胱氨酸诱发的大鼠肝微粒体膜及线粒体膜流动性损伤有保护作用。绞股蓝能使D-半乳糖所致的亚急性衰老大鼠下丘脑匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活性明显增高，同时丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）活性明显降低，而SOD的活性反应了机体清除氧自由基的能力，MDA反应体内自由基产生和老化程度，NO则加速细胞死亡从而使脑老化，证实绞股蓝能够延缓D-半乳糖所致的大鼠衰老［17］。

1.11抗疲劳、抗高温、耐缺氧作用绞股蓝总皂苷200mg/kg灌胃，使小鼠游泳耐力增强。绞股蓝水提取物200mg/kg灌胃，连续14d，对大鼠游泳1h及2h，可保持其较高血糖水平，减少肌糖的消耗。绞股蓝浸膏450mg/kg灌胃，增强小鼠耐缺氧、耐高温(42±0.5)℃及抗疲劳(小鼠泳法)的能力。绞股蓝总皂苷50mg/kg灌胃，连续3d，增加小鼠持续游泳时间，400mg/kg灌胃，增强小鼠耐缺氧能力。绞股蓝皂苷能明显提高小鼠常压缺氧、异丙肾上腺素作用下的缺氧、强迫游泳应激能力及大鼠急性心肌缺血应激能力，且该种作用与人参皂苷类似［18］。

2发展与展望

我国绞股蓝资源丰富，近年来在日常生活保健以及临床上的应用日益广泛。近年来国内外对绞股蓝的药理作用和临床应用进行了多方面的研究，随着对其有效成分的药理活性和有效单体的提取更深层次的研究，绞股蓝必将会更好地造福于人类。

【参考文献】

［1］史以菊，邢国庆，邱玉芳，等.绞股兰对小鼠脑血流量及耐氧能力的影响［J］.现代康复，2001,5（5）：117.

［2］王旭平，赵玲，冯玉新，等.绞股蓝总苷对谷氨酸诱导的胎鼠大脑皮层神经元氧化性损伤保护机制的研究［J］.山东大学学报，2006,44（6）：564.

［3］葛君，朱妤捷，吴军，等.绞股蓝皂苷对家兔肠缺血再灌注致心肌损伤的保护作用［J］.蚌埠医学院学报，2006，31（4）：347.

［4］田健，董晓晖，于信民，等.绞股蓝总皂苷对实验性高脂血症大鼠内皮素的影响［J］.中国煤炭工业医学杂志，2005，8（8）：906.

［5］王树，桂潘莹.复方绞股蓝胶囊对高脂血症小鼠血脂的影响［J］.广西中医药，2005，28（3）：54.

［6］魏守蓉，薛存宽，何学斌，等.绞股蓝多糖降血糖作用的实验研究［J］.中国老年学杂志，2005，25（2）：418.

［7］马平勃，朱全红，黄中伟.绞股蓝泡服对实验性高脂血症及血液流变学的影响［J］.中国现代应用药学杂志，2005，22（6）：454.

［8］董晓晖.绞股蓝总甙与乙酰水杨酸对血小板聚集和血栓形成的影响［J］.济宁医学院学报，2006，29（3）:47.

［9］潘峰,刘迪,黄翠霞,等.绞股蓝皂甙的药理与临床研究［J］.现代中西医结合杂志,2006,15(5):674.

［10］李均乐，田立新.绞股蓝预防豚鼠胆囊胆固醇结石形成［J］.中华肝胆外科杂志，2002，8（10）：609.

［11］张永，丁国华，张建鄂，等.绞股蓝总皂苷防治单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化的实验研究［J］.中国中西医结合肾病杂志，2005，6（7）：382.

［12］彭跃钢,黄立武.复方绞股蓝总甙胶囊对血管性痴呆大鼠海马神经细胞凋亡的影响［J］.广西医科大学学报,2005，22(3):368.

［13］曾晓黎.绞股蓝的体外抗菌活性试验［J］.中成药，1999，21（6）：308.

［14］徐长福，王冰，任淑婷，等.绞股蓝总皂甙对小鼠S180肉瘤及K562细胞的抑制作用［J］.西安医科大学学报，2002，23（3）：217.

［15］张海燕，郭强，温伟业.绞股蓝总皂苷对小鼠免疫功能的影响［J］.中兽医学杂志，2006，2：13.

［16］段炳南,陈庆林.绞股蓝总皂甙对小鼠腹腔巨噬细胞内酶活性及吞噬功能的影响［J］.江西医学院学报,2007，47(3):38.

大鼠脑范文篇10

摘要：目的：探讨短暂性右侧大脑中动脉闭塞所致局灶性脑缺血再灌注模型的脑梗死比和脑水肿的变化。方法：线栓法制作大鼠脑缺血/再灌注不同时间点模型，行TTC染色测量脑梗死比及干湿称重法测量脑含水量。结果：脑缺血再灌注6h时大鼠脑组织即有含水量的增加，并随着时间的推移呈上升趋势，且未损伤侧中段脑组织含水量升高最为显著。TTC染色在缺血再灌注6h即可见白色梗死灶，梗死比在再灌注72h内逐渐增加。结论：局灶性脑缺血再灌注72h内脑梗死比和脑水肿均呈进行性加重。

关键词：大脑中动脉闭塞；局灶性脑缺血/再灌注；脑水肿；

脑梗死比缺血性脑损伤（ischemiabraininjury）是危及患者生命的疾病之一。而脑缺血及再灌注引起的脑水肿（hydrocephalus）是影响病人急性期与亚急性期生存的重要因素。较大面积的缺血因脑水肿致病变脑组织体积急剧增大，可诱发脑疝。缺血后的脑水肿被认为是加重脑缺血原有病变，导致脑疝及危及患者生命的主要原因［1~3］。另外，血脑屏障（bloodbrainbarrier,BBB）破坏也是缺血性中风继发出血的原因，而这也是患者死亡的原因之一。目前缺血后BBB破坏引起血管源性脑水肿（vasogenicbrainedema,VBE）及其对缺血病变进展的影响尚未引起足够的重视。本实验旨在进一步明确局灶性脑缺血再灌注后脑水肿的时程变化，为临床诊治提供参考资料。

1材料与方法

11实验动物与材料

SD大鼠56只（由武汉大学医学院动物实验中心提供），SPF级，雄性，体重280～320g。随机分为空白组（n＝8）、假手术组（n＝8）和缺血再灌注组2h、6h、12h、24h、48h每组各8只。尼龙线为上海申丁实业有限公司生产，TTC为Amresco公司（美国）生产。其余试剂均为市售。

12栓线的制备

采用6cm长3/0单股尼龙线，用记号笔在双侧距头端18mm、20mm和22mm点分别作标记，然后浸入肝素钠（12500单位）中浸泡30min后晾干备用。

13右侧大脑中动脉闭塞（middlecerebralarteryocclusion,MCAO）局灶性脑缺血再灌注改良模型的建立

采用longa法，略有改良。采用10％水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉，颈部正中略偏右侧长约2cm的竖直切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。用6/0丝线结扎CCA近心端和ECA起始端，在CCA远心端和ICA起始端各置6/0丝线备用，用眼科剪在CCA近心端和远心端之间距离颈总动脉分叉约5mm处剪一个小口，经CCA插入3/0尼龙线至大脑中动脉起始段，插入深度为19.5±0.5mm；术中维持体温37.0±0.5℃。术后两小时用乙醚再次麻醉老鼠后将尼龙线轻轻拔退约1cm，此时记为再灌注0h。假手术插线深度为10mm，余同实验组。空白组不作任何处理。术后单笼饲养，进食颗粒食物。剔除术中出血较多、呼吸困难、取脑时有蛛网膜下腔出血及提前死亡的大鼠。

14神经功能缺损评分

动物缺血2h待苏醒后,按ZeaLonga方法评定神经功能缺损现象。0分:无任何神经功能缺失体征；1分:未损伤侧前肢不能伸展；2分:向未损伤侧行走；3分:向未损伤侧转圈成追尾状；4分:意识障碍,无自主行走［4］。动物评分在1～3分之间为造模成功,否则弃之不用。

15红四氮唑（TTC）染色确定梗死效果

每组取4只大鼠麻醉后迅速断头取脑，从前额极开始行冠状切片，片厚约2cm，置入2％TTC水溶液中，37℃避光孵育30min后，用眼科镊分离白色区(梗死区)和红色区(正常区),分别称取重量,计算梗死比。梗死比(%)=白色区重量/(白色区重量+红色区重量)［5］。

16脑含水量的测定

剩余每组大鼠在相应时间点麻醉后断头取脑，以视交叉前2mm和乳头体为标志冠状切为前、中、后三段，每段分为健侧和患侧。万分之一电子分析天平称取脑湿重,置100℃烤箱中烘烤至恒重（即两次测量重量相同）时称取脑干重,按公式:脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重,测算出脑组织的含水量［6］。

17统计学处理

组间行单因素方差分析，经SPSS统计软件处理。

2结果

21神经病学表现

缺血组所有动物在麻醉清醒后均出现不同程度的偏瘫，缺血再灌注组每只大鼠在麻醉清醒后均出现左前肢不能伸展，其中15只大鼠出现向左侧行走的症状，18只大鼠出现向左侧转圈的症状，平均评分为2.28分；而假手术组和空白组未出现任何神经功能缺损症状，平均评分为0分。缺血再灌注组与空白组和假手术组间差别均具有统计学意义（P<0.05；P<0.05）。

22TTC测量梗死比（％）

正常组织经TTC染色呈红色，而梗死组织呈白色。空白组和假手术组经TTC染色后均未见有白色梗死灶（图1、2），其梗死比为0；缺血再灌注12h即可见有白色梗死灶形成(图3)，随着再灌注的进行，白色梗死灶区域逐渐增大(图4)，梗死灶主要分布于损伤侧顶叶皮质，部分额叶皮质和基底节区。缺血再灌注组与空白组和假手术组间的梗死比的差异均具有显著性（P<0.01；P<0.01），再灌注各组间差异均具有显著性（P<0.01）。其梗死比的时程变化见图51。表1各组大鼠脑梗死比的比较

23脑含水量（％）的测定

正常大脑外观左右两侧对称，背侧表面血管呈淡红色，左右分布大体均一。损伤1d和2d，肉眼可见右侧脑组织肿胀明显，MCA供血区组织苍白。各组脑组织含水量的变化如表2所示，缺血再灌注各组损伤侧脑组织含水量明显高于未损伤侧（P<0.05），且损伤侧中段脑组织水肿最为突出。如图52我们可以看到各部位脑水肿的时程变化，在脑缺血再灌注2h后脑组织含水量开始增加，在再灌注48h时增加比较明显，并持续至再灌注72h。再灌注各组间差别均具有统计学差异（P<0.05）。表2各组大鼠各脑段不同时段含水量（％）的比较注：*：与空白组比较，P<0.01；#：与前一组比较，P<0.05；##：与前一组比较，P<0.01。

3讨论

31建模的改进

在脑血管疾病的研究中，动物模型是研究缺血性脑损伤必不可少的方法，模型成功与否关键在于脑梗塞部位与范围的恒定，重复性好，并且病理生理过程尽可能模拟人的发病过程。临床上出现较多的就是颈内动脉系的大血管栓塞造成的缺血性脑损伤，其中大脑中动脉栓塞较为多见。因此本实验采用线栓法闭塞大脑中动脉所致的局灶性脑缺血与临床脑缺血的病理过程类似，具有一定的参考价值。本实验采用longa线栓法复制大脑中动脉闭塞所致的缺血性脑损伤模型，并有了以下改进：①采用略偏右侧切口。此种切口更容易暴露颈动脉鞘，且可以避免从气管旁分离血管，从而可以避免刺激气管而造成呼吸道分泌物增加，改善了术后生存质量。②栓线的预处理。本实验所用栓线事先经肝素浸泡，一者可以软化栓线，避免因栓线过硬造成插线时刺破血管，二者可以减缓血液在栓线头端凝固而减轻拔线的困难度。③拔线时的二次麻醉。拔线时用乙醚麻醉可以避免大鼠因拔线的痛苦而挣扎从而增加死亡率，而且乙醚麻醉为吸入麻醉，起效快，苏醒快，可以避免因水合氯醛二次麻醉不易掌握剂量而造成麻醉意外，也可以减短动物的麻醉时间，增加术后生存质量。此外，本实验采用单一性别的大鼠可以避免雌激素的干扰，因为雌激素对梗死灶的大小有影响，同时在整个实验过程中剔除术中呼吸困难，出血较多，取脑时有蛛网膜下腔出血和提前死亡的大鼠，可以避免人为误差，增加模型的稳定性和可重复性。

32脑梗死比

脑代谢非常活跃，对血流和氧的需要量很高，而且几乎没有葡萄糖和氧的储备，完全依赖血流供给葡萄糖和氧气，供应相应脑组织区的某支大的动脉一旦闭塞，就会造成局部脑损伤［1］。通常急性脑梗死病灶由中心坏死区及周围的缺血半暗带（ischemicpenumbra）组成。坏死区由于完全性缺血导致脑细胞死亡，为不可逆损伤；而缺血半暗带仍存在侧支循环，可获得部分血液供应，且神经元死亡方式主要为凋亡，尚存在大量可存活的神经元，因此对于该区的脑组织，如果能够及时中和由死亡的细胞释放的毒性代谢产物和恢复血供，则可能获得挽救［8，9］。在本实验中，由脑梗死比测量结果可以看出，再灌注各组脑梗死比与空白组和假手术组间均有差异，且脑梗死比在再灌注72h内呈逐渐增加的趋势，提示除了恢复血供外可能尚需要其它的处理措施。目前相关研究认为MMP29［5］、MMP3、TIMP3［15］等的表达与脑梗死比高度相关，这为缺血性脑损伤发生后早期防止脑梗死体积的增大提供了一定的参考价值。

33脑水肿

通常脑水肿是指脑组织含水量增加所引起的脑体积增大，它有3种类型：细胞毒性脑水肿、血管源性脑水肿和混和性脑水肿。脑缺血再灌注后的脑水肿是一种细胞毒性和血管源性脑水肿的混和型。细胞毒性脑水肿在缺血性脑卒中时即刻发生，是由于急性脑缺血死亡细胞释放的细胞毒性物质引起，继发于神经元和胶质细胞肿胀，这个阶段全脑体积下降。随着缺血再灌注的进行，由于各种分子生物学机制导致血脑屏障（bloodbrainbarrier,BBB）的开放或破坏，引起血浆成分外渗至细胞外间隙，出现血管源性脑水肿（vasogenicbrainedema,VBE）。血管源型水肿伴有细胞外液体聚积，发生在梗死后24～48h［12］。当出现大面积的脑水肿可导致颅内压增高，使得血管受压阻塞、管腔变窄，引起脑循环机能障碍，形成缺血、水肿和颅内高压恶性循环，甚至发生脑疝危及生命。如在脑梗死超早期给予溶栓治疗，可以减轻脑损伤，改善脑梗死患者的预后，而溶栓也就是再灌注的过程，它可以通过氧自由基的释放、兴奋性氨基酸的作用等而引起非缺血性、缺氧性的损伤而加重原有的损伤，加重病情。

根据文献指出［13、14］，脑组织含水量增加的多少，反映脑水肿的程度。从本实验脑组织含水量的变化结果可以看出，正常鼠脑的含水量约为7454%，在再灌注6h时含水量即有增加(7623%)，随着再灌注的进行，含水量逐步增加，在再灌注12h时显著增加，再灌注48h～72h达到高峰，这说明在72h内脑水肿程度都是呈进行性加重，这与其他结果也是相类似的［13］。此外，水肿部位位于损伤侧，以中段为主，也就是大脑中动脉供应区域为主，而未损伤侧未出现明显水肿，因此导致一侧脑容积增大，颅内压力不均衡，如果损伤侧水肿过于严重，就会因为压力差而引发脑疝，危及患者生命。

本实验中，空白组和假手术组均未见脑梗死和脑水肿，缺血再灌注组则在再灌注72h内随着时间的推移梗死比和脑水肿逐渐加剧。当缺血持续时，缺血中心区域逐渐扩大，半暗带的可逆损伤也逐渐变为不可逆损伤，因此出现了梗死比逐渐增加的结果。急性脑缺血后死亡细胞释放的细胞毒性物质可以引起细胞毒性脑水肿，因此在缺血的同时死亡细胞的不断增加也不断加重细胞毒性脑水肿，同时由于各种分子生物学机制导致血脑屏障（bloodbrainbarrier,BBB）的开放或破坏，引起血浆成分外渗至细胞外间隙，出现血管源性脑水肿（vasogenicbrainedema,VBE），所以脑水肿在72h内呈加重趋势。脑梗死区血流再通后氧与葡萄糖供应及脑代谢恢复，脑组织损伤理应得到恢复。然而，实际上并非如此，这是因为存在再灌注损伤（reperfusiondamage）。目前认为再灌注损伤的机制可能为：①毛细血管水平无复流或不再流现象；②细胞膜与线粒体受损引起钙超载；③缺血后白细胞粘附引起局部血流环境改变，内皮细胞肿胀、变形，毛细血管狭窄、痉挛；④氧自由基导致的细胞损伤［10，11］。脑缺血再灌注后继发的脑水肿，会降低脑的灌注压，损害毛细血管和增大氧气从血液弥散到细胞的距离，从而进一步加重原有的脑缺血改变。

缺血半暗带和再灌注损伤概念的提出更新了急性脑梗死的临床治疗观念，抢救缺血半暗带的关键是超早期溶栓治疗，减轻再灌注损伤核心是积极采取脑保护治疗。本实验仅仅模拟了大脑中动脉闭塞造成局灶性脑梗塞后的脑梗死比及脑水肿的变化，而对其影响因素的研究将在日后的实验工作中作进一步探讨。

参考文献

1HeyeN,PaetZC,CewosNJ.Theroleofmicrothrombiandmicrocirculatoryfactorsinlocalizationandevolutionoffocalcerebralischemia.NeurosurgRev,1991,14(1):7～16

2DempseyRJ,RoyMW,MeyerKL,etal.Indome2thacin2mediatedimprovementfollowingmiddlecerebralarteryocclusionincats,Effectsofanesthesia.JNeurosurg,1995,62(6):874～881

3PaczynskiRP,HeYY,DiringgerMN,etal.Multiple2dosemannitolreducesbrainwatercontentinaratmodelofcorticalinfarction.Srtoke,1997,28:1437～1444

4GiddayJM,GascheY,ShahAR,etal.ReductionincerebralvasogenicedemaandinfarctvoluminMMP29nullmiceandfollowingMMP29inhibition.SocietyforNeuroscienceAbstracts,2000,26(12):287.

5刘华，廖维靖，杨万同，等缺血性脑损伤基质金属蛋白酶29的表达与梗死面积研究中国康复理论与实践，2003，9（10）：600~601

6OsamuG,TakaoA,TohruK,etal.Ischemicbrainedmafollowingocclusionofthemiddleeerebralarteryintherat.Stroke,1985,16(1):101～109

7WalzW.Boleofastrocytesinthespreadingdepressionsignalbetweenischemiccoreandpenumbra.NeurosciBiobehavRev,1997,21（2）:135~142.

8SiejoBK.Pathophysiologyandtreatmentoffocalcerebralischemia.Part1:pathophysiology.JNeurosurg,1992,77(20):169～184

9HeissWD,GrafR,WienhardK,etal.DynamicpenumbrademonstratedbysequentialmultitracerPETaftermiddlecerebralarteryocclusionincats.JCerebBloodFlowMetab,1994,14(6):892～902

10HatashitaS,HoffJT.Brainedemaandcerebrvascularpermeabilityduringcerebralischemiainrats.Stroke1990;21(3):582~588

11黄海威，黄如训，苏镇培磁共振显像对缺血性脑水肿的动态试验研究中华神经精神科杂志，2000，26（4）：212~214

12杨伟中缺血性脑卒中并发症的治疗中国中医药报，2004，1，8

13MenzieaSA,BetzAL,HoffJT,Contributionsofionsandalbumintotheformationandresolutionofischemicbrainedema.JNeurosurg,1993,78(2):257～266