颗粒溶素表达载体构建论文

【摘要】目的：构建人颗粒溶素(Granulysin,GNLY)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：抽提体外培养的单个核细胞总RNA，通过RTPCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18T载体，测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28a(+)GNLY，在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化。用SDSPAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了GNLY原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。结论：成功构建了重组表达质粒pET28a(+)GNLY，并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达，获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白，为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础。

【关键词】颗粒溶素原核表达重组蛋白

Constructionofrecombinantexpressionvectorofgranulysingeneanditsprokaryoticexpression

QIANCheng,CHENSunXiao,KEJinShan,ZHOUYe,CHENYan,GUMingLi,LUHuiQi,DENGAnMei,ZHONGRenQian.

LaboratoryDiagnostics,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,andClinicalImmunologyCenterofPLA,Shanghai200003,China

［Abstract］Objective:ToconstructarecombinantexpressionvectorofhumangranulysingeneandtoexpressitinEcoli．Methods：TotalRNAfromculturedcellsandobtaineda222bpcDNAsegmentwithgranulysinspecificprimersbyRTPCRwereextracted.ThenthecDNAsegmentofgranulysinwasinsertedintopET28a(+)plasmid.Expressionoftherecombinantproteinwasinduced,whichwaspurifiedbyNiNTAaffinitychromatographyandapprovedbySDSPAGEandWesternblot.ThebioactivityofgranulysinfusionproteinwasmeasuredbyMTTassay.Results:RestrictionenzymedigestionshowedthattherecombinantprokaryoticexpressionplasmidpET28a(+)GNLYwasconstructedandexpressedinEcoil．Therelativemolecularmass(Mr)oftheexpressionproductwasidenticalwiththepredictedvalue．Conclusion：TherecombinantexpressionplasmidpET28a(+)GNLYhasbeenconstructedsuccessfullyinEcoilBL21(DE3)plysSandthetargetproteinareexpressedwithafineantigenicity，whichishelpfulforthefurtherstudyofthebiologicalfunctionofgranulysin．

［Keywords］Granulysin;Prokaryoticexpression;Recombinantprotein

人颗粒溶素(Granulysin,GNLY)是由激活的T淋巴细胞和NK细胞表达的一种溶细胞蛋白，对细菌、真菌、寄生虫均具有杀伤功能，同时对哺乳动物细胞也有一定的毒性作用[1,2]。它属于脂类结合蛋白皂角素(Saposin)样蛋白家族的成员之一，与穿孔素、颗粒酶共存于CTL和NK细胞毒性颗粒中，最初由Jongstra等[3]学者在系统研究功能性细胞毒性细胞系的cDNA时发现，称为519。1997年，Pena等[1]学者将其命名为颗粒溶素（Granulysin）。在机体免疫应答过程中，GNLY与穿孔素、颗粒酶颗粒分子从细胞毒性颗粒中一起排出体外，参与抗菌、抗病毒和杀伤肿瘤细胞等过程。近年来，国外对颗粒溶素在杀伤肿瘤细胞及病原微生物各方面的研究越来越引起人们的重视。鉴于GNLY具有广阔的应用前景，我们构建了GNLY的原核表达载体并在大肠杆菌中诱导其表达，为进一步研究GNLY的功能及应用奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

pET28a(+)vector、BL21(DE3)plysS、DH5α为本科保存株；pMD18Tvector（TaKaRa公司）；限制性内切酶NdeI、EcoRI、DNA胶回收试剂盒及T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；RNeasyMiniKit(QIAGEN);TaqmanReverseTranscriptionRegents(AppliedBiosystem)；羊抗兔IgG抗体（KPL公司提供）；兔抗6His多抗（NOVUS公司）；HisBindResin（Novagen）。引物的设计与合成：根据检索NCBI数据库提供的GNLY基因的cDNA编码序列（gi:49456672）进行了PCR引物设计。设计扩增3′引入终止密码子（TGA）的GNLY9kD蛋白对应编码区的一对引物。其序列为：上游引物：5′CATATGGGCCGTGACTACAGGACC3′，5′引入NdeI酶切位点；下游引物：5′GAATTCTCACCTGAGGTCCTCACAG3′，5′引入EcoRI酶切位点。

1.2方法

1.2.1人外周血单个核细胞的分离及体外培养

抽取正常人静脉抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液按常规操作方法分离单个核细胞。用含5%胎牛血清（FCS），5%人自体血清的RPMI1640培养基培养调整细胞浓度为1×106～2×106ml-1，于24孔细胞培养板中每孔加入1ml。加入卡介苗5μg和rIL250U用于诱导γδT细胞，根据细胞增殖情况适时扩孔培养，同时每隔3～4天补充rIL250U/孔，以维持细胞生长需要。收集细胞（约106数量级），用冷的无菌的1×PBS(pH7.4)洗涤后，即可用于抽提总RNA。

1.2.2目的基因的扩增与纯化

按说明书操作，抽提培养12天的细胞总RNA。RTPCR反应条件为42℃45分钟，94℃3分钟，94℃预变性3分钟，以94℃变性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸59秒,35个循环后，再于72℃延伸7分钟。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，将目的条带切下，用DNA回收试剂盒回收纯化。

1.2.3重组质粒pET28a(+)GNLY的构建与鉴定

将纯化的PCR产物和载体pET28a(+)vector用NdeⅠ、EcoRⅠ双酶切后，分别回收酶切产物。在T4DNA连接酶作用下定向将GNLY基因片段与pET28a(+)vector连接，以连接产物转化入DH5α感受态细菌，在LB(Kana+)培养基中筛选培养,挑取阳性克隆，培养后小样提取质粒，用NdeI、EcoRI双酶切筛选阳性重组质粒，送联合基因公司测序。

1.2.4重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定

1.2.4.1重组质粒的诱导表达及SDSPAGE分析

将鉴定成功的重组质粒DNA转化感受态细菌E.coliBL21(DE3)plysS，在LB(Kana+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，用NdeⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定，将含有重组质粒的E.coliBL21(DE3)plysS在LB(Kana+)中培养过夜。以1％接种于LB(Kana+)培养液中。于37℃培养至A600约为0.6时，加入1mmol/LIPTG继续培养4小时，经超声碎菌后，提取融合蛋白，利用Hisbindresin亲和层析纯化柱进行纯化。将纯化蛋白进行SDSPAGE分析后，用考马斯亮蓝R250染色后观察结果。另外，取诱导前和诱导后1、2、3、4、5、6小时过夜的裂解菌液及超声裂解菌离心后的上清和沉淀，分别进行SDSPAGE，分析目的蛋白的表达与诱导时间的关系，以及目的蛋白的表达形式。

1.2.4.2Westernblot分析

将表达产物经SDSPAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，用封闭液(含50g/L脱脂奶粉的TBST)室温振摇封闭2小时。依次加入兔抗HIS抗体及HRP标记羊抗兔IgG，二氨基联苯氨(DAB)底物液显色后，观察结果。

1.2.5MTT法检测蛋白生物活性

胰蛋白酶消化收集人胰腺癌细胞株SW1990细胞，用RPMI1640培养液配制细胞悬液，根据初筛结果，确定每孔接种的细胞数为2×104/孔，接种于96孔培养板，37℃、5%CO2孵箱中培养24小时贴壁。将GNLY用RPMI1640完全培养基稀释至实验所需浓度：0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L共9个不同浓度。每板均设有纯培养基空白对照组、癌细胞对照组及实验组(不同浓度GNLY)，每组5复孔。于接种细胞24小时后弃去旧培养基，加入含不同浓度GNLY的完全培养基200μl继续培养24小时，换新鲜1640完全培养基后MTT法测OD值计算相对抑制率。按如下公式计算细胞相对抑制率：

相对抑制率（%）=对照组OD值-实验组OD值对照组OD值×100%。

2结果

2.1重组质粒的构建与鉴定

将重组质粒pET28a(+)GNLY用NdeⅠ、EcoRⅠ双酶切后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，分别在5.4kb和222bp处有两条清晰的条带，表明目的基因已正确插入pET28a(+)载体中（图1）。阳性重组质粒测序结果与GenBank人GNLY基因序列完全一致。

2.2融合蛋白的表达与鉴定

以重组质粒转化感受态E.coliBL21(DE3)plysS，挑取阳性克隆后进行酶切鉴定。将经IPTG诱导表达的产物纯化后，用SDSPAGE分析。结果表明，在分子量Mr为9000处有一条明显的条带，同预期的目的条带相符。表达时间分析结果显示，目的蛋白在诱导4～5小时表达量即达到最大，时间再延长，蛋白表达量无明显变化，诱导过夜，蛋白表达量反而降低（图2）。表达形式分析表明，目的蛋白大多以包涵体形式存在，少量以可溶形式存在于胞质中（图3）。将纯化的融合蛋白经SDSPAGE分析后电转移至硝酸纤维膜上，Westernblot结果显示，在Mr为9000处有一条明显的条带，说明目的蛋白具有良好的抗原性和特异性（图4）。

2.3目的蛋白的活性鉴定

用MTT法检测不同浓度GNLY对SW1990细胞生长抑制作用，结果显示细胞的生长受到抑制且抑制作用呈浓度依赖关系（表1），说明GNLY的细胞毒作用具有剂量依赖性。表1MTT法测定不同浓度GNLY对人胰腺癌SW1990细胞的相对抑制率(略)

3讨论

人颗粒溶素是存在于CTL和NK细胞毒性颗粒中的溶细胞蛋白,具有广谱抗菌活性并且能够诱导肿瘤细胞的凋亡[1,2]。GNLY不仅可以直接杀伤胞外结核杆菌，而且在穿孔素的协同作用下也可杀伤胞内结核杆菌[4]。TakamoriY等[5]研究显示颗粒溶素进入靶细胞核后在核内聚集，诱导靶细胞凋亡。近几年，国外学者研究证实了颗粒溶素在机体宿主免疫防御中起重要作用。Stegelmann等[6]研究CD8+Tcells中颗粒溶素与趋化因子配体5(CCL5)和穿孔素协同表达。在CCL5吸引含结核感染的巨噬细胞后，颗粒溶素和穿孔素发挥杀伤细胞内病原菌的功能。Takemoto等[7]发现颗粒溶素不仅在宿主免疫防御中起重要作用，而且在亚急性硬化性全脑炎的发病机理和病理生理学中也起作用。GNLY在抗菌、抗病毒和杀伤肿瘤细胞中的重要作用，近年来在国内外已经逐渐形成一个研究热点。

在本实验中，我们克隆的cDNA全长222bp，为活性GNLY9kD氨基酸对应的基因序列。相关文献报道，GNLY在结核杆菌刺激的T细胞中有高表达[8]，因此我们经过体外培养，从活化的富含γδT细胞的杀伤细胞中提取GNLY的mRNA，用此为模板克隆GNLY基因的开放阅读框的(ORF)中的目的基因序列，按正确读码框插入到pET-28a(+)原核表达载体中，构建了pET28a(+)-GNLY表达载体。由于GNLY本身对大肠杆菌具有一定的毒性，因此我们用不含T7RNA聚合酶的宿主菌BL21（DE3）pLysS克隆目的基因，这样就避免了由于GNLY对宿主细胞的毒性而造成的质粒不稳定。在E.coli中表达的重组蛋白经常以聚集的形式表达（包涵体），但还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会有一部分可溶性目的蛋白存在。为了得到具有生物活性的GNLY，本实验采用非变性条件纯化目的蛋白。从Westernblot检测结果来看，GNLY融合蛋白具有良好的免疫反应性，N端增加的6个组氨酸并不影响重组蛋白的抗原性。我们最终得到了具有生物学活性的GNLY融合蛋白，为研究GNLY蛋白的功能及进一步应用于临床疾病诊断及实时监测奠定了基础。

【参考文献】

1PenaSV,KrenskyAM.Granulysin,anewhumancytolyticgranuleassociatedproteinwithpossibleinvolvementincellmediatedcytotoxicity\[J\].SeminImmunol,1997;9:117125.

2HansonDA,KasparAA,PoulainFRetal.Biosynthesisofgranulysin,anovelcytolyticmolecule\[J\].MolImmunol,1999;36:413422.

3JongstraJ,SchallTJ,DyerBJetal.TheisolationandsequenceofanovelgenefromahumanfunctionalTcellline\[J\].ExpMed,1987;165:601614.

4StengerS,HansonDA,TeitelbaumRetal.AnantimicrobialactivityofcytolyticTcellsmediatedbygranulysin\[J\].Science,1998;282(5386):121125.

5TakamoriY,OgawaK,NagataKetal.Granulysininducescelldeathwithnuclearaccumulation\[J\].JMedDentSci,2005;52(1):17.

6StegelmannF,BastianM,SwobodaKetal.CoordinateexpressionofCCchemokineligand5,granulysin,andperforininCD8+TcellsprovidesahostdefensemechanismagainstMycobacteriumtuberculosis\[J\].JImmunol,2005;175(11):74747483.

7TakemotoM,KiraR,KusuharaKetal.Geneexpressionprofilesinperipheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithsubacutesclerosingpanencephalitisusingoligonucleotidemicroarrays\[J\].JNeurovirol,2005;11(3):299305.

8ToossiZ,MayanjaKizzaH,KanostAetal.Protectiveresponsesintuberculosis:inductionofgenesforinterferonγandcytotoxicitybymycobacteriumtuberculosisandduringhumantuberculosis\[J\].ScandJImmun,2004;60(3):299306.