天然药物化学实验引入分子探索

摘要:目前天然药物化学实验课程中缺少对天然产物立体构型确定的内容。在多年教学科研工作基础上，提出以青蒿素构型和构象为主题，将实物球棍HGS分子模型和ChemOffice软件中模拟分子模型应用到天然药物化学实验中，同时整合TopSpin核磁共振图谱处理软件和CCDC晶体数据库网络资源，构建“天然产物立体结构分析”互动实验教学平台。旨在帮助学生更好地理解相对构型、绝对构型、构象等概念，提高学生对复杂天然产物进行结构解析的能力。

关键词:天然药物化学实验;立体化学;分子模型;青蒿素

天然药物化学作为国内药学和中药学相关专业的必修专业课程，从天然产物的提取分离、理化性质和结构鉴定等方面，为未来创新天然药物研发人才提供了重要的知识储备。随着2015年中国科学家屠呦呦因对青蒿素研究的贡献获得诺贝尔生理学或医学奖，以及2016年国家实施《中医药发展战略规划纲要(2016－2030年)》，方兴未艾的天然药物研究也给该课程的理论和实验教学提出了更高的要求。作为理论教学的重要辅助课程，天然药物化学实验给学生提供了对理论知识点加以验证的机会，同时还可以培养学生的观察、思考和操作能力。国内相关院校也以提高学生兴趣、参与度和创新能力为目标，在教学方法上进行了大胆的改革尝试。例如，引入慕课辅助教学模式［1］、开展自主设计性实验［2］和发现式实验教学［3］等。然而，目前国内天然药物化学实验仍局限于特定结构类型化合物的提取分离和理化鉴别反应，而缺失通过波谱学方法对复杂天然产物化学结构，尤其是立体结构确证的教学内容。众所周知，利用波谱学方法确定化合物平面结构及立体构型一直以来是传统天然药物研究中必不可少的一个环节，而目前通过计算机软件预测化合物生物学靶标之前也需要明确化合物的立体构型和构象。因此，天然产物立体化学及其相关波谱学方法和其他确定手段(包括单晶X-射线衍射、分子模型分析等)，应该成为天然药物化学理论和实验教学中学生必须掌握的基础知识，并且应该通过教学改革，学校提供给学生更多可视化、可操作、可记录的实践机会。分子模型是天然产物立体结构确证中应用最广泛的手段，其可以获得最直观的分子空间结构，并帮助学生更好地解读核磁共振波谱数据。目前主要有两种构建分子空间模型的方法:一种是传统的球棍模型。例如，日本Maruzen公司的HGS分子构造模型，其可以使学生在手动搭建模型的过程中获得更多的体验感和直观认识，因此这种模型在日本药学高等院校的化学相关课程教学中得到很好的应用;另外一种为ChemOffice等化学结构绘图软件中包含的Chem3D组件，其可以将ChemDraw绘制的二维结构转化为三维空间结构，并通过能量优化获取化合物最稳定的空间构象，在目前天然产物构象的确定中应用广泛。基于以上分析，围绕天然产物立体结构确证这一重要知识点，笔者提出将HGS分子模型引入天然药物化学实验教学内容，同时激活整合ChemOffice软件包、TopSpin核磁共振图谱处理软件、剑桥晶体学数据中心［TheCambridgeCrystallographicDataCentre(CCDC)］网络资源、互动教学系统等教学资源，构建“天然产物立体结构分析”的互动实验教学平台。在巩固天然药物化学理论教学效果的基础上，提升天然药物化学实验课程的教学水平，进而全面促进学生对天然产物结构鉴定相关知识的学习，为他们未来就业或研究生学习提供更强的竞争力。

1基于分子模型互动教学的“天然产物立体结构分析”实验平台的构建

为了提高学生对该实验教学内容的兴趣，笔者以青蒿素立体结构的确定为例，以数码互动教学系统为载体，在引入HGS分子构造模型动手操作环节的基础上，结合计算机操作，构建起“化学结构绘制”“NMR信号分析”“分子模型搭建”和“晶体结构验证”等相关模块(图1)。1.1“化学结构绘制”模块。笔者应用ChemOffice2004软件［4-7］中的Chem-DrawUltra8.0组件完成青蒿素结构的绘制。该模块旨在提高学生绘制天然产物化学结构的规范性。例如，绘图模板的选择、键长键角的选择、杂原子的字体大小，尤其是涉及立体构型方面手性碳的标识和楔形键的摆放角度等问题。结合青蒿素的结构，学生在绘制的过程中还需要注意:同一手性碳上仅标识1个基团的朝向即可。例如，C-10和C-11位上无需标识氢原子的朝向，而C-4位上无需标识甲基的朝向;所有手性碳均应明确构型。例如，C-1、C-5和C-7位等两个环状结构骈合的位置上应标识氢原子的朝向;应在综合相关文献的基础上对结构中所有碳原子进行编号，以方便后续模块操作中NMR信号的归属，以及结合分子模型和NOESY图谱进行构象和构型的分析。1.2“NMR信号分析”模块。应用Bruker公司面向学校和科研院免费提供的TopSpin软件，学生在掌握软件常规操作(例如定标、积分、标识位移等)的基础上，对青蒿素对照品在氘代氯仿中测试得到的1HNMR、13CNMR、HSQC和HMBC图谱进行分析，归属所有的1H和13CNMR信号，并整理成规范的NMR信号列表。进一步对NOESY图谱分析，准确寻找到所有可以用于“分子模型搭建”模块使用的相关信号。1.3“分子模型搭建”模块此模块操作中，学生应在NOESY相关数据的指导下，开展实物球棍模型的搭建和计算机模拟分子模型的构象优化两方面内容。1.3.1实物球棍模型的搭建。结合国内其他院校将分子模型应用在理论教学中的工作基础［8-10］，笔者选择Maruzen公司的C型套装(有机化学实验用)HGS分子构造模型(其含有30个sp3杂化的碳原子、14个苯环碳原子以及相配套的氢原子，可以满足绝大多数天然产物球棍模型的搭建)。每个学生使用一套模型，完成下列实验内容:熟悉模型的基本使用方法(包括不饱和键，例如羰基的装配方法)，并搭建青蒿素分子模型;根据NMR信号归属情况及NOESY相关信号，对化合物的相对构型进行确证，归属C-2、C-3、C-8和C-9位亚甲基上两个不同朝向的质子，对结构中所有杂环的构象进行判断。1.3.2模拟分子模型的优化。学生将在ChemDrawUltra8.0组件中绘制的青蒿素结构导入到Chem3DUltra8.0组件中，然后利用“MM2”工具栏下的“MinimizeEnergy”选项对其空间结构进行优化，获取能量最低的构象;通过视图放大及构象旋转按钮对构象进行调整，结合NOESY图谱相关信号及实物分子模型，核对各杂环的构象，并掌握对分子构象进行调整的方法;选择能够看到绝大多数关键质子的观察角度，调整构象大小和清晰度后，将其导入ChemDraw组件中，标识各个质子的化学位移及关键的NOESY相关信号后，以图片形式进行保存。1.4“晶体结构验证”模块。以青蒿素的英文名“artemisinin”为关键词，在AccessStructures界面检索到存储号为1243346的晶体结构，学生在3DViewer中通过构象旋转选择合适角度，与搭建的实物模型及模拟分子模型三者进行比对，验证分子模型构建的准确性。1.5实验平台各操作模块间的协调和运行。整个实验平台包含动手操作部分(“分子模型搭建”模块中实物球棍模型的搭建)和上机操作部分，后者又包含四个模块中绝大部分的操作。因此，该平台应以数码互动教学系统为载体来运行，从而可以使学生和教师间的信息反馈更加及时准确。四个模块间的顺序安排，一般应以“化学结构绘制”模块起始，绘制的青蒿素结构用于Chem3D构象分析;然后，通过“NMR信号分析”模块归属青蒿素的碳氢信号，并在此基础上寻找到关键NOESY相关信号用于对“分子模型搭建”模块中两种模型构象和相对构型的校正;最后，通过“晶体结构验证”模块对在NOESY图谱指导下搭建的实物和模拟分子模型进行进一步验证。

2分子模型互动教学平台教学内容的拓展

在上述“青蒿素立体结构确证”的实验教学内容以外，基于分子模型互动教学平台，笔者选择了几个典型的天然产物立体构型和波谱学特征相互联系的案例，供学生选择学习。2.1青蒿素类似物结构中的船式构象和烯丙偶合的探究。化合物HHHY-D-16(图2)是从黄花蒿中分离得到的青蒿素类似物，学生通过测试1HNMR、13CNMR、HSQC和HMBC图谱可确定其平面结构，进一步对NOESY图谱进行分析确定其相对构型，同时证实了C-1/C-2/C-3/C-4/O/C-6和C-1/C-6/C-7/C-8/C-9/C-10两个六元环均为椅式构象。根据双氢青蒿素的晶体结构，学生可推测C-5/C-6/C-7/C-11/C-12/O所在的六元环也应为扭椅式构象。然而，在NOESY图谱中却没有观察到C-12位连氧亚甲基上任何一个质子同H-5或H-8存在相关信号，反而观察到亚甲基上其中一个质子4.58(1H，dt，J=14.5，2.0Hz)同CH3-15(1.51，3H，s)的NOESY相关。根据上述异常现象推测C-5/C-6/C-7/C-11/C-12/O六元环应为扭船式构象。通过搭建实物分子模型和Chem3D构象优化，证实了上述推断，并且发现扭船式构象的能量(40.9463Kcal/mol)要略低于扭椅式构象(42.5864Kcal/mol)。上述构象同时也解释了4.58处质子信号(朝向)的偶合裂分情况，即第二级的三重峰是由于其与C-13位两个烯氢质子二面角均为90°，从而受到明显的烯丙偶合影响而产生的。图2青蒿素类似物HHHY-D-16分子模型及其构象和烯丙位偶合这项实验内容可以让学生结合NOESY数据，动手搭建实物分子模型，从而比较生动地理解这一特殊构象，纠正固有的“椅式构象能量一定低于船式构象”的错误观念，并使学生对烯丙位偶合的强弱与二面角之间的关系建立起直观的认识。2.2含半缩酮结构片段三萜中的质子W型偶合的探究。HJSJ-D-1(图3)是从火炬树中分离得到的含有六元半缩酮结构的羽扇豆烷型五环三萜类化合物。在其1HNMR中给出4.25(1H，dd，J=8.7，2.7Hz)和3.73(1H，dd，J=8.7，1.6Hz)两个连氧亚甲基上质子信号，归属为结构中CH2-25。其中两个质子的第一级偶合(偶合常数为8.7Hz)为同碳偕偶，但考虑到CH2-25邻位的C-10为季碳，研究者对其各自第二级偶合是无法解释的，推测可能存在质子间远程偶合。图3含半缩酮结构三萜HJSJ-D-1分子模型及质子间W型偶合通过Chem3D模拟和搭建实物分子模型，学生可以很容易地观察到CH2-25两个质子分别和处于直立键且为朝下的H-5和H-1间表现出非常典型的W型偶合，从而可以解释各自第二级偶合的产生。同时，学生通过HJSJ-D-1实物分子模型，可以很好地掌握天然药物化学第七章(三萜及其苷类)和第八章(甾体及其苷类)教学内容中环系骈合方式的判断。2.3二氢黄酮H-2/H-3偶合裂分情况分析。天然药物化学第五章中二氢黄酮和二氢黄酮醇的1HNMR特征和立体化学一直以来都是教学中的难点。学生通过平面结构或者教材中给出的构象很难准确地理解其H-2/H-3之间特征的质子偶合关系。在二氢黄酮类化合物圣草酚(eriodictyol，图4)的1HNMR(CD3OD)图谱中，给出了H-2特征的信号5.28(1H，dd，J=12.7，3.0Hz)，以及两个H-3质子信号:3.07(1H，dd，J=17.1，12.7Hz)和2.70(1H，dd，J=17.1，3.0Hz)。学生通过分析可以发现，H-3两个质子和H-2分别表现出偶合常数为12.7Hz和3.0Hz的邻位偶合。通过ECD图谱中331nm处正的Cotton效应，判断C-2为S构型。学生通过搭建其分子模型，可以很清楚地观察到在B环这一大基团位于平伏键的情况下，处于朝向直立键上的H-2与处于直立键的H-3和平伏键的H-3之间的二面角分别约为180°和60°，从而分别呈现出12.7和3.0Hz的邻位偶合。

3分子模型互动教学平台的初步应用

虽然目前互动教学系统尚未投入使用，但笔者已经将“化学结构绘制”“NMR信号分析”“分子模型搭建”和“晶体结构验证”四个模块的教学在两个专业的天然药物化学实验中加以应用。初步探索式的运行采取自愿报名的方式从学生中选择参与人，以兴趣小组的形式组织教学活动:笔者首先进行ChemOffice2004和Topspin软件(含青蒿素的1D及2DNMR图谱)的安装和操作讲解;学生课前查阅相关文献，通过ChemDraw组件进行青蒿素结构的绘制，并整理NMR信号列表;学生课上搭建实物球棍分子模型，并通过Chem3D组件获取模拟分子模型，结合NOESY数据对两种模型进行校正;在CCDC数据库检索获取青蒿素晶体结构，与实物和模拟分子模型进行比对，熟悉青蒿素各个杂环的构象，并在此基础上学生进一步检索学习双氢青蒿素的晶体结构。参与此项教学活动的学生普遍反映:通过“分子模型搭建”和“晶体结构验证”两个模块的学习，真正理解了天然产物立体化学涉及的相对构型、绝对构型、构象等概念，并掌握了其确定方法;掌握了NMR图谱处理软件的使用方法，并且对复杂质子峰形的解析方面积累了丰富的经验;掌握了复杂天然产物结构的规范画法。

4结语

由于教学手段和教学条件的局限，传统的天然药物化学实验课程主要围绕提取分离和理化鉴别开设不同的教学内容，而未能给理论教学中非常突出的难点———结构鉴定提供一个通过具体操作来加深理解的机会。而笔者通过实物和虚拟分子模型的引入，激活了NMR处理软件和结构绘制分析软件在实验教学中的应用，并构建起了完整的“天然产物平面结构———立体结构解析”的教学平台。在今后的教学活动中，笔者将逐步完善该平台在数码互动教学系统中的运行，同时也会在科研工作中寻找更多适合应用到该平台的化合物立体化学解析实例，以不断提高学生对天然产物结构解析和立体化学的学习效果，并在此过程中全面提升学生自主学习的积极性和能力。

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作者:李占林 朱玲娟 张雪 高慧媛 单位:沈阳药科大学中药学院