荧光范文10篇

荧光范文篇1

【关键词】眼底荧光造影；不良反应；护理；素质

1眼底荧光血管造影的简介及重要性

眼底荧光血管造影（fundusfluoresceinangiography，FFA）是一项特殊的诊断眼底疾病的检查方法，目前已广泛应用于对眼科疾病患者的诊治中[1]。这项技术的原理是对患者静脉注射荧光造影剂，利用荧光造影剂在眼睛血液循环过程中产生的荧光，采用眼底照相机动态地记录病人眼底血管的结构及异常状况，从而反映病人眼底血管的生理及病理变化[2]。眼底荧光血管造影检查是眼科一种重要的形态检查，可以发现眼底镜难以确定的视网膜脉络膜病变[3]，能够尽快了解到视网膜的血液循环情况及血管状态，为临床提供重要诊断参考[4]。但是荧光素钠注入人体后可能发生一系列不良反应，如恶心、呕吐、皮疹、过敏性休克，严重的甚至威胁生命[5]。因此，在实施FFA前应向病人做好细致的沟通及有效的护理，消除病人的疑虑和紧张心理，医护人员熟悉FFA容易引起的各类不良反应的表现及应对方法，有利于减少不良反应的发生、提高病人的检查配合度，因此提高眼底荧光造影室护士的自身素质有着非常重要的意义。

2眼底荧光造影室护士应具有的素质

眼底荧光造影检查存在一定的潜在风险，荧光造影室护士的技术水平、护理经验及对抢救病人的熟练程度直接关系病人的安危及不良反应的发生几率，为减少不良反应的发生，提高造影检查效果，必须科学、严格、规范地对造影室进行管理，并提高造影室护理人员的专业素质水平。2.1遵循护理原则。造影前应严格遵循“三查七对”制度，检查药液有无破损、变质，有效期，观察药物是否有浑浊或颗粒物。充分告知患者眼底荧光造影检查的意义，不良反应及禁忌症，患者知情同意书上患者及家属双人签字，为患者做造影编号，记录患者电话，疾病种类，住址，对患者基本情况进行造册登记。2.2做好造影前的宣教。2.2.1对患者进行饮食护理。由于空腹患者接受眼底造影检查更易发生呕吐、恶心、晕厥等不良反应，因此造影前应做好充分告知患者不能空腹进行造影检查，鼓励患者正常进食后再进行检查。检查前，嘱咐患者清淡饮食，尽量不要食用刺激、辛辣及易导致腹胀的食物，也不要暴饮暴食，患者应在机体处于正常的状况下接受检查。2.2.2对患者进行常规检查。询问病人既往史、药物过敏史、全身疾病史及家族史，对孕妇及严重过敏体质的患者必须禁止其做造影检查以防止不良事件的发生。2.2.3对患者进行心理护理。造影前向患者及其家属详细介绍检查的流程及造影时需要注意的事项。由于造影是在暗室进行，患者易出现紧张、恐惧、无助的心理，因此应主动与患者进行互动，给予患者鼓励与肯定，让患者情绪稳定，配合医护人员进行造影检查。还应告知患者散瞳后出现视物模糊及畏光属于正常现象，6～8h后症状消失，以消除患者的疑虑、缓解患者的紧张、无助情绪，增强患者的安全感[6]。2.3抢救药物及设备的准备。造影室内要备齐各项抢救物品及抢救器械，如血压计、听诊器、供氧管、输液器、刀片、头皮针、手电筒、电动吸引器、氧气袋、心内注射针等及急救药品，如阿托品、盐酸肾上腺素、异丙肾上腺素、多巴胺、尼克刹米、盐酸洛贝林、地塞米松、25%葡萄糖、0.9%NS等。由造影室护士每天清点、审核并记录，保证抢救仪器设备均处于备用状态，抢救药品无过期情况。造影室门口备用平车，便于转送患者时使用，造影室内有完善的患者过敏性休克抢救操作流程，眼科医护人员要做到全员掌握。2.4明确造影过程中可能出现的不良反应及应对措施。2.4.1胃肠道刺激反应、恶心、呕吐与应对措施。造影过程中常常出现胃肠道刺激反应、恶心、呕吐等一过性的不良反应，一般发生在荧光素钠注入后的30～80秒内，此时嘱咐患者深呼吸数次，精神放松，休息片刻，同时按掐患者的内关穴，数秒后症状即自行缓解。2.4.2皮肤瘙痒、荨麻疹与应对措施。如果遇到病人出现皮肤瘙痒、荨麻疹，若症状较轻可给予患者口服抗过敏药扑尔敏4mg，若症状较为严重，需要给患者注射5mg地塞米松。吸氧对症处理后大多数患者当天瘙痒症状即消失，皮疹逐渐减退[7]。2.4.3呼吸困难、晕厥，胸闷、气促与应对措施极少数患者在造影开始后出现呼吸困难、晕厥，胸闷、气促等不良反应，此时应立即停止检查，医护人员辅助患者取平卧体位，就地抢救，遵医嘱给予患者静脉注射地塞米松、肾上腺素，同时给予氧气吸入5L/min，密切关注患者血压、脉搏的变化情况[8]。必要时给患者建立静脉通道并请急诊内科或麻醉科医师协助抢救。2.5造影结束后的健康宣教。造影检查结束后叮嘱患者在造影室内休息30min以进一步观察病人情况，确定无不良反应后方可让其离去。造影检查完后应注重交代患者因散瞳及注射荧光造影剂会导致暂时的视觉改变，视物模糊，流泪、畏光等现象，叮嘱病人多休息，避免强光，禁止驾车等活动。荧光素钠染料大部分经肾脏代谢随尿液快速排出体外，因此注射荧光素钠数小时后尿会变黄，必须向病人及家属解释这是正常现象，以消除患者的恐惧心理。指导患者检查结束当天大量饮白开水，促进体内的荧光素尽快排出体外，通常24h内造影剂即可从患者体内完全排出。2.6加强责任心。护理职业的高风险性质决定了从业人员必须具备高度的责任心，一个优秀的造影室护士必须具有高稳定性、高自律性、高慎独性，眼睛是一盏明灯，作为一名造影室护士更应具备时刻维护患者生命和安全的责任心。

3小结

荧光范文篇2

[关键词]生物样品；原子荧光；前处理；消解；进样技术

原子荧光光谱分析技术基于不同原子的波长辐射特异性，经荧光强度对样品进行定量分析，具有高效率和高准确率的特点，被广泛应用于污染检测，食品科学，生命科学，地质学等领域[1-3]。目前，我国已将利用原子荧光光谱分析技术检测食品中的重金属含量列为国家检测标准之一。在原子荧光光谱分析领域，所涉及的生物样品种类繁多，且不同种类的样品如植物、肉类、粮食、粮油、毛发等的有机物组成和元素含量有较大差别，在实际测试时，选用有针对性的样品预处理方法与进样预处理联用技术，有利于提高测试效率，降低基体干扰，减少仪器损耗。不同于常规岩石，矿石，沉积物，土壤等固体样品，为了保证样品的代表性和结果的可靠性，在样品消解前，需有针对性地进行选材，干燥，匀浆和研磨等预处理流程。此外，生物样品含有大量有机物，目前采用的前处理消解方法有直接稀释法、萃取法、干灰化法、酸溶法、加压分解法、微波消解法和酶分解法等。其中，低温干灰化法和高温干灰化法中高温或干燥的处理过程，会使微量金属离子损失严重，导致各微量元素的回收率降低。一般采用酸溶法破坏样品中的有机物，释放被测元素，以利于后续测定。常见的酸溶法有敞口酸消解法、加压消解法和微波消解法等。针对不同类型的生物样品，在消解前，需要进行预处理。

1样品预处理

1.1植源性样品

植物根、茎、叶样品经清洗，低温干燥，研磨，过筛后，使用酸溶法溶解。在敞开酸溶法中，一般采用硝酸+高氯酸组合，加热溶解样品。使用微波消解时，一般采用硝酸+过氧化氢溶解样品。陈双等[4]优化了微波消解茶叶的硝酸和过氧化氢最佳含量，提出硝酸8mL和过氧化氢1mL进行消解时，可将0.2000g茶叶完全消解，且荧光强度较好。蔬菜、水果类样品，将样品清洗干净后，将样品分为皮、果肉和种子，果肉可用搅拌机打成糊状并匀浆；或将果皮，果肉，种子分别用烘箱低温烘干至恒重，粉碎研磨后备用。大米，淀粉类粮食样品，直接研磨，过筛后，使用酸溶法溶解。酒类样品，将样品先进行低温消解，挥发酒精，整个过程中应注意防止样品沸腾以致碳化。在样品剩余1~2mL时加入硝酸进行常规酸溶法消解。粮油类样品，可直接称取样品后进行消解处理。沈佳等[1]在使用原子荧光光谱法测定山茶油中的痕量砷时发现，使用湿法消解过程中，样品反应剧烈，易有泡沫溢出且易爆沸，且样品容易发生碳化。经优化后发现消化0.30g样品油，使用硝酸6mL和过氧化氢4mL进行消解时，消解最完全，测定结果的精密度较为理想。开建荣[6]等将大米用粉碎机粉碎，过100目筛，称取适量过筛后的大米粉分别按照10毫升混合酸(硝酸与高氯酸体积比为4︰1)湿法消解和6mL硝酸混合2mL过氧化氢微波消解进行前处理，测试的结果表明，微波消解试剂消耗量少，耗时短，过程繁琐，从可量化的指标来看，微波消解优于湿法消解。此外，对于菌类样品，金针菇等携带培养基质的鲜品，需去除根部培养基；双孢蘑菇、草菇、香菇等鲜品，需将带有培养基质或覆土的菇脚部分去除，并用干净纱布或毛刷轻轻擦去样品表面的附着物。水分含量在15%以上的干制食用菌样品，清洗完后需在60~70℃下烘至适宜粉碎(用于农药残留检测的样品除外)，同时测定烘干前后样品水分。食用菌干品，用干净毛刷或纱布除去表面附着物，不可水洗。经碎样后进行常规酸溶法消解。

1.2动物源性样品

由于动物源性样品具有含量较高的蛋白质和营养物质，在使用硝酸+高氯酸进行敞开酸溶时，容易出现碳化现象，一般采用微波消解法消解。对于鱼/肉类样品，将鱼/肉类解剖并取对应组织，去掉组织样品中的皮，脂肪，筋，用纯水洗净后匀浆后冻干，保存于-20度冰箱中待测。测试时，称取已冻干的样品，在室温下自然解冻至稍微变软，且冻水未流出时，使用微波消解法消解。对于鸡蛋，牛奶类样品，用高速离心分散器匀浆至完全混匀后，取适量样品使用微波消解法消解。吴平[7]等在使用原子荧光法测定牛奶中的铅时，使用了免消解的酸蛋白沉淀方法，在还原剂中加入弱酸，测试方法具有良好的准确度。

1.3生命样品

人发样品，原始发样先用洗洁精溶液搅拌浸洗数次后，再用去离子高纯水洗净，沥干。浸入丙酮中2~3h脱脂后，用不锈钢剪将其剪成3~5mm的发段，置于80℃烘箱中烘至恒重。游富英等[8]采用了三种消解方法对比，在电热板消解和灰化法的基础上，使用浓硝酸消解部分样品后，滴加过氧化氢的非完全消解法，只要求消解液均匀、透明，不要求分解其中的可溶有机物，提高了消解反应的速度，大大缩短了消解时间，与前2种方法比较，具有耗用试剂量少、温度低、消解时间短等优点。血液样品[9]，将采集的血液样品置于肝素钠采血管中，充分混匀，常温下运输，于4度冰箱中保存。将样品从冰箱中取出，室温条件下放置30min，将样品充分摇匀后，取1mL血样于微波消解管中，加入3mL质量分数65%浓硝酸和1mL30%过氧化氢，密封后置于微波消解仪消解。

2进样技术

原子荧光光谱的仪器进样方式与仪器的原子化器类型有关。通常分为直接进样，化学蒸气发生进样和电热蒸发进样等。其中直接进样技术受到实验室环境，原子干扰及背景干扰等多重约束，基本用于激光剥蚀原子荧光光谱研究。2.1蒸气发生法蒸气发生法指将待测物气化后传输进行测定，常见的蒸气发生形式有冷蒸气、氢化物、冷蒸气、卤化物、氧化物、烷基衍生物、羰基衍生物、挥发性金属螯合物、电化学、紫外光化学和等离子体诱导等。其中，氢化物发生法是目前应用最广泛的方法之一，具有高原子化率，高灵敏度的特点。此外，基于元素的不同形态所需的蒸气发生条件不同，还可用于元素的形态分析。硼氢化物-酸体系使用硼氢化钠还原法实现待测元素的氢化物蒸气发生，可实现批量样品加入，具有快速高效反应的特点，是目前最为广泛采用的原子荧光测试方法之一。通常使用盐酸作为分解剂，也可使用柠檬酸、草酸、酒石酸、磷酸、硫酸、硝酸等[10]。硼氢化物-酸体系易受到过度金属离子，氢化物发生元素等基体干扰；常用的硼氢化物还原剂易分解，需当天配置；氢化反应效率不稳定，受多种因素干扰等缺点，因此，开发非硼氢化物-酸体系的蒸气发生方法具有较大研究潜力。相比于硼氢化物-酸体系，电化学氢化物发生(EcHG)通过电解还原获取氢化物，具有绿色环保的优点。近年来，电化学氢化物发生法蓬勃发展，最为广泛的测试应用为砷、锑、硒等元素、已经开展的相关研究有树叶、茶叶、猪肾、贻贝组织、大米、中药、牛肝、鱼肉等样品的测定[11-12]。紫外光化学蒸气发生利用紫外光将溶液中的离子转化为挥发性氢化物，也可以将一些金属离子从高价态还原为低价态或原子态。研究表明[13]，使用紫外光还原Se，用原子荧光光谱测定，其蒸气发生效率比用KBH4还原提高53.3%。Li等[14]采用样品基体辅助化学蒸气发生技术，在紫外光下，用乙醇还原汞离子，检测酒中的痕量汞，利用酒中的乙醇(样品基体辅助)作为还原剂，在紫外光下还原酒中的汞，将甲基汞氧化分解为无机汞，使用原子荧光光谱进行测定。Sturgeon等[13]利用紫外光UV低压汞灯还原法生成了多种Se化合物，显著降低了共存离子的干扰，实现了样品的高效定量分析，这一方法常被应用于测量样品的汞元素和硒元素的总量及形态分析。等离子体诱导蒸气发生利用冷等离子体与液体相互作用产生活性物质，诱导样品中待测元素发生等离子体化学反应生成挥发性物质，无需使用还原剂，反应效率高，速度快。其中，介质阻挡放电(Dielectricbarrierdischarge，DBD)是一种低温等离子产生的有效方式。He[14]等使用PVG作为介质阻挡放点(DBD)激发源的进样接口，实现了疫苗中的硫柳汞分析。Liu等[15]将悬浊液进样氢化物生成方法与DBD-原子荧光光谱法结合，进行生物样品中的超痕量砷的检测。将制备好样品的悬浊液引入HG-DBD-AFS中，同时优化原位DBD的放电和工作气体条件，无需额外的预富集就可分别获得8pg微量生物样品和14pg人发样品的LOD(2mL样品)。与传统的消解预处理原子光谱法相比，该方法在简便、快速、低成本、绿色和安全性方面具有优势，适合测定生物样品中的痕量砷，保护人体健康和环境安全。2.2电热蒸发法电热蒸发(Electrothermalvaporization，ETV)是一种高进样效率的固体直接进样技术，其特点是在惰性介质中将样品中的待测元素以固体气溶胶的形式激发传输，无需进行样品消解。常见的电热蒸发技术分为金属材料-电热蒸发，石英管-电热蒸发和石墨管-电热蒸发，电磁感应加热技术等，通常用于汞、镉元素的测定。ETV装置主要采用石墨和多孔碳作为电极材料，其寿命较短，且部分元素可能生成碳化物影响分析的准确性。通常将高熔点金属(钨、钼、铂、铼)等均匀覆盖在石墨管表面，可以有效改善这一情况。Jiang等[16]使用钨丝电热蒸发进行原子荧光光谱仪进样，在Ar/H2还原性气氛下，消解处理后同时测定人发样品中的痕量Cd和Pb。催化热解-金汞齐法利用ETV技术，将ETV-催化热解得到的Hg原子蒸气用金，铂等材质的汞齐装置捕获，再通过快速升温释放汞原子，是目前被广泛采用的固体进样重金属速测技术之一。Li等[17]利用氯化亚锡还原样品中的汞，使用电热蒸发直接进样，实现了鱼肉样品的痕量汞快速测定。电磁感应加热技术是一种利用电磁感应原理实现电热蒸发方法，可以在短时间内实现金属介质的快速升温，近年来，也展现出了应用于生物样品的测试的潜力。Duford等[18]将IH-ETV装置与AFS串联，用于测定人发发样品中Hg。Liu等[19]利用介质阻挡放电(DBD)微等离子体缠上的自由基和紫外辐射，针对水产品中有机物含量高的极致特点，研制了了用于消解气态有机物的DBD装置，对ETV导入鱼肉样品所产生的气象干扰物质进行降解，水产品中Hg的LOD可达到0.5ug/kg。

3萃取技术

受限于原子荧光光谱进样技术的复杂性，在生物样品的测试过程中，萃取技术常与原子荧光结合，展示其独特的优越性。郑宇等[20]使用固相萃取技术与原子荧光光谱技术结合，对稻米中的无机硒进行固相分离萃取后再进行原子荧光光谱检测，无需对样品进行酶解，优化了样品处理过程，并获得了较好的精密度与准确。史永富等[21]采用甲苯萃取-原子荧光光谱法对鱼肉中甲基汞进行了检测，并对方法的准确度和精密度进行了验证，获得了较高的回收率。

4结论与展望

荧光范文篇3

常用的电光源主要有热致发光光源，气体放电发光光源，固体发光光源等三类。

热致发光光源如白炽灯，它利用斯涅藩－波尔兹曼定律，即物体温度越高，它幅射出的能量越大。这可用式（1）表示。

E=μ×ξ×T4（1）

式中：E为物体在温度T时单位面积和单位时间内的红外幅射总能量；

图1

μ为斯涅藩－波尔兹曼常数（μ=5.6697×10－12W/cm2·K4），ξ为比幅射率，即物体表面幅射本领与黑体幅射本领之比值；

T为物体的绝对温度。

利用热致发光原理制成的电光源制作简单，成本低，但是发光效率低，只有11％左右，而其余的能量则以热的形式消耗掉（红外、热能消耗分别占69％及20％）。

图2

固体发光光源，如发光二极管、等离子体发光器件等，尽管它们的发光效率高，但目前还不能做到大功率（如上百瓦），所以，固体发光器件要进入大规模实用阶段还有一段距离。

气体放电发光器件，如荧光灯（Florescent）、金卤灯（Hilide）、高强度放电灯（HID）等，它们的发光效率为普通白炽灯的几倍。由于气体放电灯的功率可以做得较大（上千瓦），发光效率又高，是一种绿色照明光源。其中，荧光灯是一种充有氩气的低气压汞气体放电灯，发光效率和寿命都比白炽灯高。荧光灯发光效率约23％，红外、热能占总耗能的36％及41％。荧光灯发光均匀、亮度适中、光色柔和，是理想的室内照明灯，在照明中得到了广泛的应用。荧光灯是通过引燃灯管内稀薄汞蒸汽进行弧光放电，汞离子受激产生紫外线，激发灯管内壁涂层荧光粉发出可见光。但是由于荧光灯工作的负阻特性，在使用时须配用镇流器件。

2有关荧光灯的灯丝预热

国际电工委员会标准IEC929和我国的专业标准ZBK74012－90，都有关于电子镇流器在“正常情况下使用时，应使灯启动，但不对灯性能造成损害”；“施加阴极预热电压的最短时间应不少于0.4s”和“开路电压的波峰系数不得超过1.8；在最低预热期间，不得产生即使是极窄的、不影响有效值的电压峰值”等规定。

预热启动是指在灯阴极被加热至热电子发射温度后才触发灯。通常采用控制阴极电流进行预热或控制阴极电压进行预热的方式。无论采用哪种方式启动，都应满足下列要求：

1）在灯阴极达到电子发射状态之前，灯两端之间或灯与启动辅助装置之间的开路电压应保持在低于导致阴极受损害的辉光放电的水平；

2）在阴极达到发射状态之后，开路电压应足够高，可使灯迅速启动而无须重复多次才能启动；

3）在阴极已处于发射状态，若开路电压须升高后才能使灯启动，则开路电压从低到高的转变过程中，必须在阴极仍处于热电子发射温度期间完成；

4）在阴极预热阶段，预热电流或预热电压不得过大或过高而使阴极上发射物质因过热而受到损害。

灯阴极预热启动可分为以下两种情况。

2.1采用控制灯阴极电流进行的灯丝预热

2.1.1有效预热电流和发射时间（te）

为使某一类型阴极达到最低发射温度所需的热量，可用时间、电流和由该类阴极的物理特性所决定的一个常数来表示。这种关系可由式（2）表示。

式中：te为达到发射状态的时间，≥0.4s（1）；

a为特定类型阴极的常数；

ik为获得te所需的最小灯丝有效预热电流（A）；

im为达到发射状态所需的灯丝最小电流绝对值（A）（2）；

注：（1）达到发射状态的预热时间<0.4s通常是不可取的，实践证明在此时间内不总是可以使阴极灯丝达到充分预热。

（2）此值是假定从冷态开始施加灯丝预热电流的时间足够长（如≥30s）的情况。

2.1.2有效预热电流的最大值

可以在短时间（t≤0.4s）内施加较大的灯丝有效预热电流而又不损坏阴极，但超过0.4s后，随着时间的延长，此电流值应逐步减小，直至达到2s或更长时间，此值不得明显地超过50Hz时用辉光启动器启动的数值。

上述要求的图解如图1和图2所示。

开路电压和转换时间ts在灯的启动过程中，当开路电压在te时被提高，而阴极预热过程在te时结束（预热电流中断）的情况下，开路电压的转换时间ts应≤100ms（如图2所示）。

在开路电压的转换时间内阴极始终保持发射状态的情况下，转换时间ts可以>100ms。

由于灯阴极在预热时间达到te时被加热到发射状态，因此，在灯启动过渡阶段有效预热电流不得降低到绝对最小值（im）以下，以确保灯阴极处于发射状态。

有一些类型的灯规定，在达到te之前的开路电压最大值高于或等于达到te之后的开路电压的最小值，因此，为这类灯设计的镇流器无须为了使灯可靠启动而提高开路电压。

2.2采用控制灯阴极电压进行预热的镇流器

2.2.1方均根电压和施加电压的时间

当阴极电压超过3.0V（低电阻阴极）或6.0V（高电阻阴极），且电压施加的时间≥0.4s时，即可达到阴极发射温度。

为了防止阴极温度过高，应规定施加电压的最大值。当施加电压大于10V时，所有阴极两端都会出现横向弧光放电。

2.2.2开路电压

在达到阴极热电子发射之前，如灯的开路电压低于可进行冷启动的值，则允许同时施加阴极预热电压和灯电压。虽然电子镇流器可以提供多种电压控制方式，但均应遵守在达到热启动之前将灯电压保持在灯冷启动水平以下的原则。

灯丝最大有效预热电流在预热过程中的任何时刻，不得超过规定的最大值，预热时间≥0.4s。

2.2.3对镇流器的要求

镇流器应向灯提供所需阴极预热电压、阴极工作电压和灯启动电压。

镇流器应按规定值向灯提供启动电压。启动电压可与阴极预热电压同时施加，也可在0.4s间隔后上升至该项值。但在0.4s之前施加的任何电压必须低于可导致灯启动的电压水平。

一个性能良好的电子镇流器的预热、点火和荧光灯工作与电子镇流器工作频率变化之间的变化规律如图3所示。电子镇流器的预热、点火和荧光灯工作与工作频率变化关系曲线图如图4所示。

3几种常用荧光灯的灯丝预热方法与特点

3.1单灯灯丝电流预热型

单灯灯丝电流预热型电路结构如图5所示。在这种灯丝预热电路中，利用在电路预热期间通过灯丝与启动电容之间的电流实现灯丝预热。具有电路简单，易于实现的特点，实际应用得较多。

3．2单灯灯丝电压预热型

单灯灯丝电压预热型电路结构如图6所示。在这种灯丝预热电路中，利用和镇流电感（L）绕在一起的两个灯丝绕组上的电压实现灯丝预热。特点是在灯的整个工作过程中，灯丝都有电压施加于灯丝两端。

3．3双灯串联灯丝电压预热型

双灯串联灯丝电压预热型电路结构如图7所示。在这种灯丝预热电路中，利用和镇流电感绕在一起的三个灯丝绕组（L）上的电压实现灯丝预热。特点是在灯的整个工作过程中，灯丝都有电压施加于灯丝两端，并且通过中间的灯丝绕组（L）的电流应为上、下两个灯丝绕组（L）的灯丝电流两倍。

3．4双灯串联灯丝电流预热型

双灯串联灯丝电流预热型电路结构如图8所示。在这种灯丝预热电路中，利用和镇流电容串在一起的一个灯丝变压器（T2）上的次级电压实现灯丝预热。

3．5双灯并联灯丝电流预热型

双灯并联灯丝电流预热型电路如图9所示。电路工作原理与单灯灯丝电流预热电路相同。

3．6双灯并联平衡变压器灯丝预热型

双灯并联平衡变压器灯丝预热型电路结构如图10所示。电路中利用一个平衡变压器（T）来实现灯丝的预热。电路工作原理与单灯灯丝电压预热型电路相同。电路特点是由于电路中的平衡变压器可使两只灯的工作电流一致。

3．7双灯并联灯丝电压预热型

双灯并联灯丝电压预热型电路如图11所示。电路工作原理同单灯灯丝电压预热电路。

荧光范文篇4

关键词：荧光灯；灯丝电流预热型；灯丝电压预热型

1常用照明方法与特点

常用的电光源主要有热致发光光源，气体放电发光光源，固体发光光源等三类。

热致发光光源如白炽灯，它利用斯涅藩－波尔兹曼定律，即物体温度越高，它幅射出的能量越大。这可用式（1）表示。

E=μ×ξ×T4（1）

式中：E为物体在温度T时单位面积和单位时间内的红外幅射总能量；

图1

μ为斯涅藩－波尔兹曼常数（μ=5.6697×10－12W/cm2·K4），ξ为比幅射率，即物体表面幅射本领与黑体幅射本领之比值；

T为物体的绝对温度。

利用热致发光原理制成的电光源制作简单，成本低，但是发光效率低，只有11％左右，而其余的能量则以热的形式消耗掉（红外、热能消耗分别占69％及20％）。

图2

固体发光光源，如发光二极管、等离子体发光器件等，尽管它们的发光效率高，但目前还不能做到大功率（如上百瓦），所以，固体发光器件要进入大规模实用阶段还有一段距离。

气体放电发光器件，如荧光灯（Florescent）、金卤灯（Hilide）、高强度放电灯（HID）等，它们的发光效率为普通白炽灯的几倍。由于气体放电灯的功率可以做得较大（上千瓦），发光效率又高，是一种绿色照明光源。其中，荧光灯是一种充有氩气的低气压汞气体放电灯，发光效率和寿命都比白炽灯高。荧光灯发光效率约23％，红外、热能占总耗能的36％及41％。荧光灯发光均匀、亮度适中、光色柔和，是理想的室内照明灯，在照明中得到了广泛的应用。荧光灯是通过引燃灯管内稀薄汞蒸汽进行弧光放电，汞离子受激产生紫外线，激发灯管内壁涂层荧光粉发出可见光。但是由于荧光灯工作的负阻特性，在使用时须配用镇流器件。

2有关荧光灯的灯丝预热

国际电工委员会标准IEC929和我国的专业标准ZBK74012－90，都有关于电子镇流器在“正常情况下使用时，应使灯启动，但不对灯性能造成损害”；“施加阴极预热电压的最短时间应不少于0.4s”和“开路电压的波峰系数不得超过1.8；在最低预热期间，不得产生即使是极窄的、不影响有效值的电压峰值”等规定。

预热启动是指在灯阴极被加热至热电子发射温度后才触发灯。通常采用控制阴极电流进行预热或控制阴极电压进行预热的方式。无论采用哪种方式启动，都应满足下列要求：

1）在灯阴极达到电子发射状态之前，灯两端之间或灯与启动辅助装置之间的开路电压应保持在低于导致阴极受损害的辉光放电的水平；

2）在阴极达到发射状态之后，开路电压应足够高，可使灯迅速启动而无须重复多次才能启动；

3）在阴极已处于发射状态，若开路电压须升高后才能使灯启动，则开路电压从低到高的转变过程中，必须在阴极仍处于热电子发射温度期间完成；

4）在阴极预热阶段，预热电流或预热电压不得过大或过高而使阴极上发射物质因过热而受到损害。

灯阴极预热启动可分为以下两种情况。

2.1采用控制灯阴极电流进行的灯丝预热

2.1.1有效预热电流和发射时间（te）

为使某一类型阴极达到最低发射温度所需的热量，可用时间、电流和由该类阴极的物理特性所决定的一个常数来表示。这种关系可由式（2）表示。

式中：te为达到发射状态的时间，≥0.4s（1）；

a为特定类型阴极的常数；

ik为获得te所需的最小灯丝有效预热电流（A）；

im为达到发射状态所需的灯丝最小电流绝对值（A）（2）；

注：（1）达到发射状态的预热时间<0.4s通常是不可取的，实践证明在此时间内不总是可以使阴极灯丝达到充分预热。

（2）此值是假定从冷态开始施加灯丝预热电流的时间足够长（如≥30s）的情况。

2.1.2有效预热电流的最大值

可以在短时间（t≤0.4s）内施加较大的灯丝有效预热电流而又不损坏阴极，但超过0.4s后，随着时间的延长，此电流值应逐步减小，直至达到2s或更长时间，此值不得明显地超过50Hz时用辉光启动器启动的数值。

上述要求的图解如图1和图2所示。

2.1.3开路电压和转换时间ts在灯的启动过程中，当开路电压在te时被提高，而阴极预热过程在te时结束（预热电流中断）的情况下，开路电压的转换时间ts应≤100ms（如图2所示）。

在开路电压的转换时间内阴极始终保持发射状态的情况下，转换时间ts可以>100ms。

由于灯阴极在预热时间达到te时被加热到发射状态，因此，在灯启动过渡阶段有效预热电流不得降低到绝对最小值（im）以下，以确保灯阴极处于发射状态。

有一些类型的灯规定，在达到te之前的开路电压最大值高于或等于达到te之后的开路电压的最小值，因此，为这类灯设计的镇流器无须为了使灯可靠启动而提高开路电压。

2.2采用控制灯阴极电压进行预热的镇流器

2.2.1方均根电压和施加电压的时间

当阴极电压超过3.0V（低电阻阴极）或6.0V（高电阻阴极），且电压施加的时间≥0.4s时，即可达到阴极发射温度。

为了防止阴极温度过高，应规定施加电压的最大值。当施加电压大于10V时，所有阴极两端都会出现横向弧光放电。

2.2.2开路电压

在达到阴极热电子发射之前，如灯的开路电压低于可进行冷启动的值，则允许同时施加阴极预热电压和灯电压。虽然电子镇流器可以提供多种电压控制方式，但均应遵守在达到热启动之前将灯电压保持在灯冷启动水平以下的原则。

灯丝最大有效预热电流在预热过程中的任何时刻，不得超过规定的最大值，预热时间≥0.4s。

2.2.3对镇流器的要求

镇流器应向灯提供所需阴极预热电压、阴极工作电压和灯启动电压。

镇流器应按规定值向灯提供启动电压。启动电压可与阴极预热电压同时施加，也可在0.4s间隔后上升至该项值。但在0.4s之前施加的任何电压必须低于可导致灯启动的电压水平。

一个性能良好的电子镇流器的预热、点火和荧光灯工作与电子镇流器工作频率变化之间的变化规律如图3所示。电子镇流器的预热、点火和荧光灯工作与工作频率变化关系曲线图如图4所示。

3几种常用荧光灯的灯丝预热方法与特点

3.1单灯灯丝电流预热型

单灯灯丝电流预热型电路结构如图5所示。在这种灯丝预热电路中，利用在电路预热期间通过灯丝与启动电容之间的电流实现灯丝预热。具有电路简单，易于实现的特点，实际应用得较多。

3．2单灯灯丝电压预热型

单灯灯丝电压预热型电路结构如图6所示。在这种灯丝预热电路中，利用和镇流电感（L）绕在一起的两个灯丝绕组上的电压实现灯丝预热。特点是在灯的整个工作过程中，灯丝都有电压施加于灯丝两端。

3．3双灯串联灯丝电压预热型

双灯串联灯丝电压预热型电路结构如图7所示。在这种灯丝预热电路中，利用和镇流电感绕在一起的三个灯丝绕组（L）上的电压实现灯丝预热。特点是在灯的整个工作过程中，灯丝都有电压施加于灯丝两端，并且通过中间的灯丝绕组（L）的电流应为上、下两个灯丝绕组（L）的灯丝电流两倍。

3．4双灯串联灯丝电流预热型

双灯串联灯丝电流预热型电路结构如图8所示。在这种灯丝预热电路中，利用和镇流电容串在一起的一个灯丝变压器（T2）上的次级电压实现灯丝预热。

3．5双灯并联灯丝电流预热型

双灯并联灯丝电流预热型电路如图9所示。电路工作原理与单灯灯丝电流预热电路相同。

3．6双灯并联平衡变压器灯丝预热型

双灯并联平衡变压器灯丝预热型电路结构如图10所示。电路中利用一个平衡变压器（T）来实现灯丝的预热。电路工作原理与单灯灯丝电压预热型电路相同。电路特点是由于电路中的平衡变压器可使两只灯的工作电流一致。

3．7双灯并联灯丝电压预热型

双灯并联灯丝电压预热型电路如图11所示。电路工作原理同单灯灯丝电压预热电路。

荧光范文篇5

［关键词］妊娠相关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙烯胺—4,7二氯磺苯基1，10啡罗啉2，9二羧酸—铕复合物；唐氏综合征

DevelopADirectSolidPhaseLanthaneTimeresolvedFluoroimmunoassayReagentofPAPPAutilizingPVA

Abstract:ObjectiveTodevelopadirectsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassayreagentofPAPPAbysynthesizingacomplexof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+.MethodsPolyvinylamine(PVA)waslabeledwithbiotinstreptavidinandeuropiumchelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid(BCPDA).UsinglabeledPVAcomplex,WedesignedtwositesandwichtimeresolvedfluoroimmunoassayofPAPPAandevaluatedassaycharacteristicsofPAPPAkit.ResultsWesuccessedsynthesizingaconjuageteof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+andareagentofPAPPA.Detectionlimitsachievedwere0.7mIU/L.Thecalibrationcurvewaslinear010000mIU/L.Intraandinterassayimprecision(CV)was3.89%4.96%and7.35%9.27%.Recoverywas95.8%104.2%.ConclusionsTheconjugateof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+synthesiziedwasreactive,highlyfouorescent.Asortsofkitcouldbesynthesized,takingadvantageofit.ThereagentofPAPPAwaspotentiallysuitedforuseinclinicalwithhighlyanalyticalsensitivity.

Keywords:PregnancyassociatedplasmaproteinA;Directsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay;StreptavidinbiotinPolyvinylamineeuropiumchelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid;Down''''sSyndrome

妊娠相关血浆蛋白A(PregnancyassociatedplasmaproteinA，PAPPA)是一种高分子α2糖蛋白，20世纪70年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要PAPPA是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为200000~250000亚基构成。PAPPA亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白(Proformofeosinophilmajorbasicprotein)以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在微量游离单体PAPPA。PAPPA亚基由1547个多聚核苷酸构成，包括1个拉长的锌指结构，3个Lin—notch重复序列，以及5个短一致重复序列［3］。在体内PAPPA是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)起作用。胰岛素样生长因子I(IGFI)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主要通过IGF1受体起作用，IGFI、II的生物活性受6个高亲和性IDFBP调节［4，5］。PAPPA主要用于产前筛查唐氏综合征(Down''''sSyndrome，DS)，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止DS儿的出生，但目前开展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有1%～3%的流产率,且方法繁琐,出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为PAPPA可作为DS胎儿产前筛查的的标志物。在15周～20周通过结合孕妇孕周、超声诊断和FreeβHCG可以鉴别65%～75%，但要在3个月～6个月结合AFP、游离E3以及抑制素上述成分可鉴别85%～90%［6］。有文献［7］报道PAPPA在急性冠状动脉综合征(ACS)的早期诊断有一定的意义，PAPPA在ACS患者血清含量＜30mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的PAPPA且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法进行检测。国内PAPPA的诊断试剂大多为ELISA和PerkinElmer公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫分析(dissociatedenhancelanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay,DELFIA)试剂，无国产PAPPA时间分辨荧光试剂。我们利用PVA(聚乙烯胺)作为载体结合BCPDA镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析(directsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay,DSLFIA)试剂。为提高检测灵敏度和克服BCPDA标记抗体使抗体失活的问题，我们引入了生物素亲和素(biotinstreptavidinsystem)系统。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1试剂4,7二氯磺苯基1，10啡罗啉2，9二羧酸［4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid,BCPDA自制］；纯化亲和素(Streptavidin，SA，Sigma公司)；硫代琥珀酰亚氨6生物素氨基己酯类［Sulfosuccinimidyl6''''(biotinamido)6hexanamidohexanoate，SulfoNHSLCLCBiotin，pierceChemicalCompany］；聚乙烯胺氢氯化物(Polyvinylaminehydrochloride，PVA,ChemicalDynamicsCorp)；硼酸钠、二甲亚砜(天津化学试剂有限公司)；单克隆抗体根据文献［5］选择Hyb234—5(StatensserumInstitut)作为检测抗体，mAb10E1(HyTestOy，Finland)作为捕获抗体；PAPPA标准品和质控品购于PE公司(质控血清：Control1508mIU/L，Control22325mIU/L，Control3为4952mIU/L)；鼠IgG(晶美公司)。

1.1.2仪器Wallac1420多标记计数仪(WallacOY，Finland)；HPLC硅柱TSK250尺寸排阻柱(BIORAD公司)；96白色微孔板(NUNC公司)、亲和素包被板(InnotracDiagnosticsOy公司)；Amicon可浓缩离心管(Amiconmicroconcentrationunits，MW30000Cutoff)

1.2方法

1.2.1BCPDA的制备参见文献详细步骤［8～10］。

1.2.2生物素聚乙烯胺BCPDA［(Bio)xPVA(BCPDA)y］复合物的构建［11］用0.5M的碳酸盐(pH9.1)缓冲液配制浓度为10mg/ml聚乙烯胺(PVA)溶液，将200μgNHSLCLCBiotin溶于20μl碳酸盐缓冲液中，取200μl上述PVA溶液加入20μl上述NHSLC—LCBiotin溶液中，振荡混匀，室温反应1.5h(PVA∶Bio=1∶15)，用0.5M碳酸盐缓冲液将混合液稀释到1ml，将固体BCPDA研磨成粉末状，先在上述1ml混合液中加入5mgBCPDA，用力搅拌，直到溶解，重复加3次BCPDA，5mg/次，共计20mgBCPDA，在室温放置5h～6h，直到溶液澄清，转移到透析袋中，用0.1MNaHCO35L透析、过夜、重复透析2次，尽可能除去没反应的BCPDA和生物素。

1.2.3HPLC纯化(Bio)xPVA(BCPDA)y复合物离心浓缩上述(Bio)xPVA(BCPDA)y复合物到0.3ml～0.5ml(用Amiconmicroconcentrationunits，MW30000Cutoff)。流动相0.05MTris缓冲液(pH7.70)，控制HPLC流速0.8ml/min，在325nm处监测层析液(325nm为BCPDA最大吸收峰)，上样后，马上收集，(Bio)xPVA(BCPDA)y在10管～16管约5ml左右，取10μl(Bio)xPVA(BCPDA)y层析液加入90μl水滴入亲和素包被板微孔中，温育30min，洗板，加入用Tris缓冲液配制的10M～5MEuCl3100μl，反应10min，洗板、干燥，用Wallac1420检测Eu3+的荧光强度，没结合复合物的被洗去了，没结合BCPDA的复合物因无法结合Eu3+而没有荧光，计算标记的PVA，大约每分子结合50个～100个BCPDA分子。

1.2.4构建亲和素生物素PVABCPDA［(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+］复合物［11］用0.1MTris缓冲液(pH7.8)配制小牛血清白蛋白(BSA溶液)60g/L，同时加入EuCl3，使Eu3+浓度为10-6mol/ml，用双蒸水配制亲和素溶液浓度为1mg/ml，取上述BSA溶液1ml，加入10μl亲和素溶液，再加入50μl的(Bio)xPVA(BCPDA)y复合物(通过固相免疫分析，棋盘滴定法确定最佳用量比，步骤略，结果见后)，混匀，55℃温育1.5h，4℃保存备用。

1.2.5(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物反应活性用生物素化的各种浓度(0ng/50μl，0.5ng/50μl，5ng/50μl，50ng/50μl，100ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板(同第7步)，用60g/LBSA和0.1mol/LTris缓冲液(pH7.8)10倍稀释(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，在板的微孔中加入100μl稀释后的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，室温反应30min，洗板、干燥，测量荧光强度(cpm)。本实验是验证复合物的反应活性。

1.2.6生物素标记10E1抗体［12］用二甲亚砜制备硫代琥珀酰亚氨6生物素氨基乙酯溶液(10mg/ml)，将抗体10E1溶于0.1mol/L硼酸钠溶液(pH8.8)，每1mg抗体中加硫代琥珀酰亚氨6生物素氨基己酯类溶液210μg混合，室温放置4h，在上述溶液中加入20ml1mol/LNH4Cl，室温反应10min，将反应液进行透析，除去未结合的生物素，将抗体浓度用分析缓冲液配置成8ng/μl，-20℃保存备用。

1.2.7单克隆Hyb234—5抗体包被96孔微滴定板将抗体溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH4.9)，配置成5μg/ml抗体溶液，在每一孔中加入80μl抗体溶液，室温反应20h，然后用生理盐水洗3次，然后每孔加120μl0.05MTrisHcl缓冲液(pH7.4含0.9%生理盐水、0.05%NaN3、0.5%小牛血清白蛋白BSA)浸泡2h。吸干缓冲液，干燥，密封4℃保存。

1.2.8样本收集、定标、灵敏度、精密度和回收实验分析过程选取怀孕8周、9周、11周妇女血清各一份，经PE公司的DELFIA试剂和D&G公司的ELISA试剂多次精确测定，值分别为：P1863.27mIU/L；P21273.63mIU/L；P32727.23mIU/L。用标准品稀释液(6%BSATSA缓冲液：150mmol/LNaCl、60g/LBSA、50mmol/LTrisHCl，pH7.8)将标准品稀释浓度为：S00mIU/L(稀释液)、S120mIU/L、S2200mIU/L、S31000mIU/L、S45000mIU/L、S510000mIU/L。标准品定标根据WHOIRP78/610(WHOInternationalLaboratoryforBiologicalstandards，StatensSeruminstitut，Denmark)，单位换算：1000mIU/L=4.5μg/ml。在单克隆Hyb234—5抗体包被96孔微滴定板，每孔加入定标液10μl，作8次平行测量，加入50μl生物素标记10E1抗体50μl，混匀，36℃，室温反应20min，洗板6次，加入100μl10倍稀释的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，室温反应25min，洗板6次，吹干，Wallac1420测量荧光强度(cpm)，取均值，作标准曲线。将S00mIU/L做20次重复测试，计算均值(X)和标准差(s)，以X+2s为试剂的最小检测限。将Control1，Control2，Control3依据定标分析过程，同批测量20次，批间测量12次，用于评价精密度。对收集样本(P1、P2、P3)依据定标分析过程进行测量，然后将Control1、Control2、Control3分别等体积加入P1、P2、P3中进行测量，用于评价回收实验。

2结果

2.1用HPLC纯化(Bio)xPVA(BCPDA)y复合物在10min～16min出现(Bio)xPVA(BCPDA)y的吸收峰，没有结合BCPDA的吸收峰在17min～24min出现,见图1。

图1净化（Bio）x－聚乙烯醇（BCPDA）y在高性能液化色谱（TSK－250过滤柱）上的变化图。（略）

流速控制在0.8ml/min，吸光率325nm

2.2用滴定法确定亲和素和(Bio)xPVA(BCPDA)y最佳配比SA量恒定0.01mg/ml，生物素标记的抗体包被分别浓度为0ng/孔、0.5ng/孔、5ng/孔、50ng/孔，缓冲液为pH7.8TrisHcl0.1M，Eu3+10-5M，(Bio)xPVA(BCPDA)y用量从40μl～55μl选择最佳值，50μl复合物荧光强度值(cpm)最佳，如图2。

图2滴定链球菌，（Bio)x－聚乙烯醇（BCPDA）y在10-3MEu3+,0.1MTris-Hclbuffer(pH7.8)缓冲液中的变化，0.01mg/ml链球菌，容积变动范围40μl~55μl，观察到最佳容积为50μl（略）

2.3验证活性用生物素化的各种浓度(0ng/50μl，0.5ng/50μl，5ng/50μl，50ng/50μl，100ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板验证(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物的反应活性，在测定范围内成线性分布，见图3。

图3IgG维生素定量法标定曲线（略）

2.4PAPPA定标曲线及灵敏度在0mIU/L～10000mIU/L范围内定标曲线为线性分布，见图4。S0标准重复20次检测均值加2个标准差值代入标准曲线，计算出检测限为0.7mIU/L(数据没显示)。

图4PAPP-A标定曲线（略）

2.5批内、批间精密度对质控血清批内进行20次分析，批间进行12次分析，得到批内变异系数3.89%～4.96%,批间变异系数在7.35%～9.27%之间,见表1。

表1批内、批间变异系数比较（略）

2.6回收实验对收集样本(P1、P2、P3)依据定标分析过程进行测量，然后将Control1、Control2、Control3分别等体积加入P1、P2、P3中进行多次测量，分别计算回收率95.8%～104.2%,见表2。

表2回收实验结果比较（略）

3讨论

临床化学家最关心的问题是分析技术灵敏度，这也是临床诊断试剂的核心。近来，在临床化学检测物质的浓度的范围10-3mol/L～10-16mol/L。PCR以及其他的体外扩增技术使DNA、RNA检测方便、高效、特异。不幸的是蛋白不能复制，最敏感的定量方法是依靠蛋白之间的特异性结合如抗原抗体反应。一个提高蛋白检测灵敏度的方法就是信号放大，即在蛋白上标记可以检测的标记物，通过标记物的信号放大而达到更容易检测的目的。时间分辨免疫学技术是80年代迅速发展起来的的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术，其中荧光镧系螯合物具有较大的Stokes位移(275nm)，较窄的发射光谱(10nm)，较长的荧光寿命(10us～1000us)，而被广泛构建时间分辨荧光免疫试剂。临床运用最广泛的是PE公司生产的解离增强镧系时间分辨荧光免疫分析(dissociationenhancedlanthanidefluoroimmunoassay，DELFIA)试剂，它必须使Eu3+与螯合物分离，由于其信号较弱，必须加入增强液来发大信号，操作烦琐且在加样的过程中可能引起外源性的污染，这些弊端影响了它的应用。在1987年，Evangelista和Diamandis合成一种新的螯合物BCPDA，开创了固相时间分辨免疫荧光技术，解决了DELFIA上述问题［8，9］，但是BCPDA的较大分子量、表面特性和直接标记蛋白容易引起蛋白的失活对它应用带来一些问题，解决的办法就是连接一个载体。我们实验中引入了PVA作为载体，连接BCPDA和生物素亲和素。PVA直接连接蛋白技术难度较大，而生物素标记蛋白技术比较成熟，同时亲和素有4个生物素结合位点，可以起到信号放大作用，而提高检测灵敏度。我们实验中成功的合成了(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，用它去识别生物素标记的抗体(见图3)，结果显示亲和力非常高。实验关键问题是选择SA和(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物最佳比，我们实验中做了7个浓度梯度，选取结合后荧光强度最大的(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物浓度。利用HPLC层析纯后的(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物回收率是68%。通过实验选择最佳检测抗体浓度、生物素化抗体浓度和标本用量。Jackson［13］分析了提高灵敏度的因素即两个关键的因素与最终的结合分析灵敏度相关：我们监测标记分子(放射性同位素、化学发光剂、荧光团)的能力；结合试剂的质量和实验条件，在临床化学存在一种误导是特别敏感的监测方法(化学发光、时间分辨荧光)能获得好的结果。其实这是错误的，如果实验试剂和条件(抗体的亲和性和特异性，固相结合物的自然特性以及清洗效率)不被选择，很难达到理想的检测效果。为达到较高的灵敏度，需要选择高灵敏度的标记技术、高亲和力的试剂和最好的分析条件(可将试剂的非特异性结合降到最小)。利用镧系螯合物的时间分辨荧光免疫分析是一种高灵敏的标记技术，关键是实验条件的选择，我们验证不同孵育时间下，(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物产出率，以及和生物素化抗体的结合能力(数据不能显示)。经过大量的实验选择了Eu3+的浓度，使其能和BCPDA形成最佳比例(数据不能显示)。反应条件的建立中，我们筛选实验反应温度(18℃～56℃，每5℃选择一次)和反应时间(10min～24h)，考虑到临床结果的报告时间，选择了20min(数据不能显示)。经过实验条件选择，形成了PAPPA的定标曲线，通过定标曲线确定最低检测限(见图3)。我们构建的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物可以用于多种像PAPPA这样利用双抗体夹心法检测的试剂，如AFP等。我们选择构建PAPPA主要考虑到我国产前筛查项目的自产试剂较少，而且DS筛查尤为重要，由于科研经费的问题，没有进行最佳单抗配对实验，只是参考了国外的相关文献。不过我们实验的核心是构建(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，为以后构建其他试剂做一定的前期工作。我们构建的PAPPA试剂,回收实验和精密度试验显示，完全满足试剂盒要求。在今后的工作中，我们主要验证(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物和成品试剂盒的稳定性，以及进一步和PE公司的PAPPA的DELFIA试剂做大量的临床对比实验。总之，我们成功构建了(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物和PAPPA的成品试剂，它有较高的灵敏度、准确度和精密度，又克服了DELFIA试剂的缺点。

参考文献:

［1］lLnTM,GalbertSP,KieferD,etal.Characterizationoffourhumanpregnancyassociateidplasmaproteins［J］.AmJObstetGynecol,1974,118:22336.

［2］OxcigC,SandO,KristensenT,etal.CirculatinghumanpregnancyassociatedplasmaproteinAisdisulfidebridgedtotheproformofeosinophilmajoebasicprotein［J］.JBiolChem,1993,268:122436.

［3］KristensenT,OxvigC,SandO,etal.AminoacidesequenceofhumanpregnancyassociatedplasmaproteinAderivedfromclonedcDNA［J］.Biochemistry,1994,33:15921598.

［4］HwaV,OhY,RosenfeldRG.Theinsulinlikegrowthfactorbindingprotein(IGFBP)superfamily［J］.EndocrRev,1999,20:761787.

［5］QinQP,ChristransenM,PetterssonK.PointofcaretimeresolvedimmunofluorometricassayforhumanpregnancyassociatedplasmaproteinA:useinfirsttrimesterscreeningforDownsyndrome.ClinChem,2002,48(3):47383

［6］WaldNJ,DensemJM,SmithD,etal.FourmarkerserumscreeningforDown''''ssyndrome［J］.PrenatDiagn,1994,14:707716.

［7］QiuPingQin,SaaraKokkala,JuhaLund,etal.MoeculardistinctionofcirculatingpregnancyassociatedplasmaproteinAinMyocardialInfarctionandpregnancy［J］.ClinicalChemistey,2005,51(1):7583.

［8］EvanglistaRA,PollakA,AlloreB,etal.Aneweuropiumchelateforproteinlabelingandtimeresolvedfluorometricapplications［J］.ClinBiochem1988,21:173178.

［9］DiamandisEP,MortonRC.Timeresolvedfluorescenceusingaeuropiumchelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid(BCPDA).Labelingproceduresandapplicationsinimmunoassays［J］.JImmunolMethods,1988,112(1):4352.

［10］PanL,GuoS,DuanT,AnJ,XieW,LinM.Methodoflabelingantibodieswitheuropium(III)4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacidchelate［J］.AnalSci,2005,21(6):7136.

［11］AndreasScorilas,EleftheriosPDiamandis.Polyvinylaminestreptavidincomplexslabeledwithaeuropiumchelator:auniversaldetectionreagentforsolidphasetimeresolvedfluorometricapplications［J］.ClinicalBiochemistry,2000,33(5):345350.

荧光范文篇6

【关键词】钙黄绿素;刚果红;加替沙星

Fluorometrydeterminationofgatifloxacinwithcalcein-congored

【Abstract】ObjectiveToestablishamethodfordeterminationofgatifloxacinbyfluorometry.MethodsThecomplexbetweencongored(CR)andcalceininpH6.0Britton-Robinson(B-R)buffersolutionquenchedfluorescenceofcalcein.Thecomplexofgatifloxacin-CRwasmorestablethanthatofcalcein-CR.Whengatifloxacinwasaddedintosystem,thecalceincouldbefreedanditsfluorescenceappearedagain.ResultsThismethodhadbeenappliedtothedeterminationofgatifloxacinintablet,injectionandurine,andtheresultswereveryclosetothoseobtainedbyusingUVmethodthatreported.ConclusionThismethodissimple,rapid,accurateandsensitive.

【Keywords】calcein;congored;gatifloxacin

加替沙星(gatifloxacin,AM-1155,GFLX)是新的第四代喹诺酮类抗生素药物,具有抗菌谱广,抗菌活性强的特点。它对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌及衣原体均具有强大的抗菌作用[1]。加替沙星的测定方法有高效液相色谱法、荧光光度法、反相离子对色谱法、高效毛细管电泳法和紫外分光光度法[2~6]等。但利用钙黄绿素-刚果红荧光体系来测定加替沙星含量还未见报道。本文经研究发现刚果红能与钙黄绿素生成没有荧光的配合物,使钙黄绿素荧光猝灭,加入加替沙星后,加替沙星与刚果红反应生成比钙黄绿素-刚果红更稳定的配合物,游离出钙黄绿素,释放出荧光。以此为基础,建立了测定加替沙星的新方法。

1实验与方法

1.1仪器与试剂pHS-3CT型酸度计(上海大中仪器有限公司);970CRT型荧光分光光度计(上海精密仪器厂);Labtech-1000紫外-可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)。

加替沙星片(通化金马药业集团股份有限公司,批号:20080201,每片0.1g);沙星粉针剂(浙江亚太药业股份有限公司,批号:070201,每安瓿0.2g)。

加替沙星对照品(GFLX,0.2g/L,河南省药检所提供)溶液:准确称取0.0200gGFLX,加水溶解后定量转移到100ml容量瓶中,用水定容,用时逐级稀释。钙黄绿素(1×10-4mol/L):准确称取0.0175g钙黄绿素,加少量水溶解后配制成溶液250ml。刚果红(CR1×10-4mol/L)准确称取0.6967gCR,加少量水溶解后配制成溶液1000ml。B-R缓冲溶液:取浓度均为0.04mol/L的硼酸,磷酸,醋酸混合溶液,用0.20mol/L的NaOH调至所需pH值。所用试剂均为分析纯,水为二次重蒸水。

1.2实验方法在10ml容量瓶中依次加入1.5mlB-R缓冲溶液(pH6.0)、0.5ml钙黄绿素溶液、5mlCR溶液和适量GFLX溶液,用水稀释至刻度,摇匀。在λex/λem=492nm/514nm,470~540nm之间进行荧光同步扫描。

2结果与讨论

2.1体系的荧光特性在pH6.0的B-R缓冲溶液中按实验方法对钙黄绿素、钙黄绿素-CR、钙黄绿素-CR-GFLX体系进行荧光扫描,由图1可知钙黄绿素在500nm处有强烈荧光,加入刚果红后荧光猝灭,再加入加替沙星,荧光强度增强。

2.2酸度的影响试验不同酸度的B-R缓冲溶液对体系的影响(见图2)。实验表明:pH为6.0时,钙黄绿素和钙黄绿素-CR的荧光最强,并且猝灭程度最大,因此选择pH6.0的B-R缓冲溶液。

2.3缓冲溶液用量的影响试验B-R缓冲溶液(pH6.0)不同用量时对体系的影响(见图3)。实验表明:用量为1.5ml时,体系的荧光强度最强,且猝灭程度最大,因此选择pH6.0的B-R缓冲溶液1.5ml。

2.4CR用量的影响试验CR不同用量时对体系的影响(见图4)。实验表明:随着CR的逐渐增加,荧光强度逐渐降低,当用量大于4.5ml时,体系达到稳定,因此选择CR溶液5.0ml。

2.5时间的影响考察了2h内时间对体系的影响(见图5)。实验表明:反应在常温下很快完成,且在2h内保持稳定。

2.6干扰试验对药品辅料和尿液中常见的物质以及金属离子进行了试验。实验表明:在误差±5%范围内,500倍的葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、尿素、NH+4、Na+和K+不干扰测定;5倍的Mg2+、Zn2+和Fe3+不干扰测定。

2.7标准曲线与检出限按实验方法,在10ml容量瓶中依次加入1.5mlB-R缓冲溶液(pH=6.0)、0.5ml钙黄绿素溶液、5mlCR溶液和适量GFLX对照品溶液,用水稀释至刻度,摇匀,以质量浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标绘制工作曲线(见图6)。实验表明:加替沙星质量浓度在2.0~8.0mg/L范围内与荧光强度呈良好的线性关系,其线性回归方程为:Y=42.066+5.6866C(r=0.9991),检出限为0.051mg/L。

3样品的测定

3.1片剂中GTFX的测定取加替沙星样品10片,研磨均匀,精密称取0.177g(相当于加替沙星0.1g)加水溶解后定量转移置1000ml容量瓶中,用蒸馏水定容,干过滤,弃去初滤液,收集续滤液得样品溶液。按实验方法,用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对照实验,测定结果见表1。

3.2粉针剂中GTFX的测定精密称取0.143g(相当于加替沙星0.1g)粉针剂,加水溶解后置1000ml容量瓶中,用蒸馏水定容,干过滤,弃去初滤液,收集续滤液得样品溶液。按实验方法,用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对照实验,测定结果见表1。表1片剂和粉针剂中加替沙星的测定结果

3.3尿液中GTFX的测定取10ml加替沙星对照品溶液于100ml容量瓶中,用尿液定容,制成人工合成尿样。准确量取尿样溶液1ml于10ml容量瓶中,用甲醇定容后在离心机中离心5min(5500r/min),取上清液用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对照实验,测定结果见表2。

3.4回收率试验在样品溶液中加入适量的加替沙星对照品溶液,按实验方法进行回收率试验(见表3)。表2尿液中加替沙星的测定结果表3方法回收率试验

【参考文献】

1许铁男.新喹诺酮类抗菌剂AM1155.国外医药·抗生素分册,1998,19(4):302.

2邓立东,程强,徐勤.高效液相法测定加替沙星尿药浓度.右江民族医学院报,2002,24(3):344-345.

3连宁,孙春燕,赵慧春.加替沙星的荧光光度法测定.分析测试学报,2002,21(1):79-81.

4徐晓卫,张崇生,潘柔和.反相离子对色谱法测定甲磺酸加替沙星注射剂的含量.安徽医药,2006,10(7):505-506.

荧光范文篇7

关键词：荧光PCR定量技术；基因定位技术；遗传病

在早期的遗传学分子诊断中，主要依赖于SouthernBlotting，寡核苷酸杂交等技术。自1985年Saiki等首次描述聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)以来，PCR技术因为其灵敏特异，省时省力等诸多优点而受到了人们的高度重视，已经应用于生物医学和化学等基础研究的各个领域，并且成为医学临床和法医学研究的强有力分析工具之一[1-3]。然而，近几年来，研究者们不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否，他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。尽管把PCR作为一种定量的工具，在技术上还面临着一些挑战。荧光PCR基因定位技术是近十余年来兴起的一种分子生物学技术，与其他定量方法相比，具有灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素的特点，在基因表达、传染病和遗传病的诊断等方面迅速得到了广泛应用。

一、荧光PCR基因定位技术的原理

荧光PCR定量技术的主要原理为：在PCR前，通过化学方法在引物的5’端通过共价方式连接一个荧光分子。由于在进行PCR时，引物和待扩增模板端的碱基不需要完全匹配，荧光PCR引物和普通PCR引物一样，能够对待测模板进行指数扩增。扩增完成后，根据PCR的产量，将荧光PCR产物直接或按一定比例稀释后，和内标、载样缓冲液混合，在自动测序仪上进行电泳。在自动测序仪内激光的激发下，PCR产物上的荧光分子发出固定波长的激发光，被仪器内的光电管捕获。根据PCR产物从开始电泳到经过光电管的时间，测序仪自动计算出相应产物的实际碱基数。不同泳道之间电泳速度的差别，通过各产物内混合的内标校正。同时，测序仪也自动标出相应产物的荧光强度，该数值就是荧光PCR定量技术对模板进行定量与定位的基础。与非定量PCR分析方法不同，荧光PCR的操作程序有助于评估污染的情况，即测出污染的程度，即使阴性对照产生了正的信号，只要这些信号比实验样品的低得多，依据这样的结果，至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的。在一定程度上，荧光PCR消除了普通PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。荧光PCR常用于研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和药物治疗监测提供科学的依据。目前，该技术已广泛应用于多种遗传病的诊断和产前筛查，如地中海贫血、儿童型脊肌萎缩症、杜氏/贝氏肌营养不良、胖骨肌萎缩症和各种染色体病等。

二、荧光PCR基因定位技术在遗传病诊断中的应用

2.1在α地中海贫血中的诊断作用

1988年，Chehab用两对引物同时扩增α珠蛋白和β珠蛋白基因，并在这两对引物上分别标记上罗丹明和荧光素。在紫外线的照射下，罗丹明产生红色荧光而荧光素产生绿色荧光。在同一循环条件下PCR完成后，通过离心将扩增产物和游离引物分离，根据扩增后产物颜色直接判断基因的缺失情况。如产物为桔红色，则说明α和β珠蛋白基因都得了扩增。如果产物为绿色，说明α珠蛋白基因缺失，只有显绿色荧光的β珠蛋白基因得到了扩增。

2.2在DMD/BMD中的应用

DMD/BMD(杜氏/贝氏肌营养不良症)是最常见的致死性神经肌肉遗传病。在男性中，其患病率约为1/3500，为x连锁隐性遗传，其中73%为缺失或重复突变，新生突变占所有患者的30%。由于x染色体的随机失活比例不同，约40%的DMD携带者不能通过血清CPKH活性诊断。1992年，schwartz将荧光PCR应用于该病的携带者诊断。他们采用荧光引物和测序仪分析位于肌营养不良基因内部的4对CA重复序列。测序仪可以鉴别2个碱基对长度的差异，能够为连锁分析提供更多的信息。在以下情况时，连锁分析有时不足以对携带者进行判断：①CA重复不能提供信息，②家族成员不全，③新生突变或者嵌合体造成的连锁分析失效，因此，他们还采用荧光PCR直接扩增肌营养不良基因外显子，并用测序仪定量分析产物，将结果和连锁分析一起作为判断携带者的依据。通过以上方法，他们对43名可疑携带者进行了诊断。wWw.gWyoO

2.3在PGD的应用

植入前诊断(PGD)只能获得非常有限的模版，而荧光PCR比溴乙锭染色要敏感1000倍，因此，荧光PCR在植入前诊断中的应用已经有较多的探索。等位基因失扩增(ADO)和污染是植入前诊断所面临的两个主要问题，因此PGD需要检测致病基因和连锁分析进行联合判断。但是限于取材，PGD只能提供一次PCR的模版。荧光PCR由于高灵敏度和分辨率，适合对少量模版进行多重PCR扩增，在一个体系中同时完成对疾病基因的检测和连锁分析。Joycec采用荧光多重PCR对6种遗传病：强直性肌营养不良(DM)、囊性纤维(CF)、脆性X综合征、神经纤维化2型和颅面成骨不全症进行了植入前诊断。在进行PCR的过程中都同时扩增了一个多态位点，以确定被扩增细胞的来源以及排除污染。对于显性遗传病，多态位点还能够减少ADO可能带来的误诊。在他们进行的研究中，对14次妊娠进行的植入前诊断都得到明确结论，其中13例进行了胚胎移植，另有1例没有检测到正常胚胎。

总之，PCR技术在定量与定位领域中的应用已经逐渐由实验室中的探索发展成为理解复杂的生物本质的一项关键技术。毫无疑问，在不久的将来，荧光定量PCR技术将以其精确的定量，简单迅速的操作，合理的成本，在分子生物学、实验医学，特别是临床医学领域中得到更加广泛的应用。

[参考文献]

[1]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔.分子克隆实验指南[M].3版.北京：科学出版社，2002：488.

[2]彭志文，朱子平.PCR检测乙肝DNA的注意事项[J].中国医药导报，2006，3（24）：147.

[3]鲁军.荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义[J].中国医药导报，2008，5（33）：78.

[4]刘炜，马俊.FQ-PCR检测沙眼衣原体及解脲支原体[J].中国现代医生，2008，46（6）：139-140.

[5]罗燕春，李勇，郑惠兰，等.荧光定量PCR检测淋球菌、沙眼衣原体结果探讨[J].江西医学检验，2005，23(6)：615-616.

[6]于晓芳，许晏，刘漪，等.PCR-BHEL技术对血清中HCVRNA的检测[J].临床和实验医学杂志，2008，7（9）：40.

[7]张正．分子生物学技术在检验医学中的应用[J].中华检验医学杂志，2003，26：735-736．

荧光范文篇8

1.材料

实验于2013年4～5月在连云港市第一人民医院麻醉科、疼痛科、病理科、影像科、连云港市临床医学实验中心与神经外科实验室完成。健康清洁级三、四月龄家兔8只，雌雄各半，体重2.5～3.1kg，由徐州医学院动物中心提供[许可证号：SCXX（苏）2003～0003]。动物置于安静、温暖（15～20℃）、避强光的环境下正常喂养48h，禁食24h后进行实验。实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。仪器与试剂：单层螺旋CT机(SiemensEmotion)、CM1100冰冻切片机(Leica，Germany)、ZX-004荧光显微镜，PM-30照相系统(Olympus，Japan)、丙泊酚（商品名：得普利麻；200mg/支，AstrZeneca，UK）、氯胺酮（0.1g/支，江苏恒瑞医药股份有限公司）、核黄(Sigma，USA)。

2.实验方法

核黄逆行神经追踪8只家兔按随机数字表法分为2组。经耳缘静脉注射丙泊酚(2mg/kg)和氯胺酮(2mg/kg)麻醉家兔后，在CT引导下经双侧C3/4关节突关节分别注射荧光逆行神经追踪剂核黄50ul(1g/L)，进行神经追踪。组织标本制备及形态学观察：分别于术后18、36h再次麻醉家兔，经心脏依次灌注生理盐水300～400ml、20g/L多聚甲醛和12.5g/L戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）500～800ml、含50g/L蔗糖的磷酸缓冲液（4℃）500ml。随后分别取双侧颈胸椎脊神经节、双侧颈胸交感神经节、肠系膜下神经节、脊髓、颈椎间盘纤维环、颈椎间盘髓核、颈椎关节突滑膜、肩关节滑膜，在含200g/L蔗糖的磷酸缓冲液（4℃）中过夜后，行连续冰冻切片，分别做成2套，一套20um蒸馏水贴片，直接在OlympusZX-004荧光显微镜下观察，拍摄光学相片。另一套7um行苏木精-伊红染色后置于荧光显微镜下，观察有无新的发现。

3.主要观察指标

寻找各组织荧光标记的神经细胞、荧光标记密集的神经末梢部位。

二、结果

1.神经逆行追踪18h组在双侧颈、胸脊神经节、双侧交感神经节及肠系膜下神经节发现标记细胞；在脊髓前、后角未见到标记细胞；肩关节滑膜、颈椎间盘纤维环、颈椎间盘髓核、颈椎关节突滑膜发现明显的荧光密集区；苏木精-伊红染色可见上述部位荧光强度明显增强，各荧光密集区与直接在荧光显微镜下所见相同。

2.神经逆行追踪36h

颈胸脊神经节标记神经细胞明显减少或消失，交感神经节及肠系膜下神经节标记神经细胞与18h基本相似，颈椎间盘纤维环、颈椎间盘髓核、颈椎关节突关节滑膜、肩关节滑膜荧光密集区的部位与神经逆行追踪18h时基本相同，但荧光强度增强。

三、讨论

实验模拟临床在颈椎关节突滑膜注射核黄观察临床上经颈椎关节突滑膜感受器治疗颈肩痛的神经通路。实验进行神经通路研究的依据是核黄可被神经末梢特异性吸收，并沿轴浆运输到达神经元的细胞体，使细胞核在一定条件下呈黄色的荧光，而胞浆无荧光，同时可沿轴浆流顺行到达整个轴突网络。为保证给药部位的准确性本实验在CT引导下将药物准确注入颈椎关节滑膜，并且注药后延长注射针头留针时间，以保证取针后核黄不外漏。感受器通路的实质是长轴突神经细胞的轴突通路，轴突有多个分支，刺激其中一个分支可带动整个轴突网络，或从一个轴突末梢感受器给药，药物可通过逆行轴浆流到达神经细胞，再通过顺行轴浆流到达整个轴突网络从而达到内病外治，深病浅治的效果，如经皮内注药治疗带状疱疹后神经痛、经腰椎关节突滑膜和椎板骨骼肌附着点感受器通路给药及银质针导热治疗颈肩腰腿痛等。临床上运用感受器通路理论，经关节突滑膜和椎板骨骼肌附着点感受器通路给药及银质针导热治疗颈肩腰腿痛效果显著，目前已明确腰椎关节突滑膜的感受器通路，为了进一步明确其治疗颈肩痛的临床效果，探讨颈肩痛治疗的神经形态解剖学机制，因此，本实验对颈椎关节突滑膜感受器通路进行了研究。本实验发现核黄注射18h、36h后均在双侧颈胸脊神经节及交感神经节，肠系膜下神经节发现标记细胞，说明颈椎关节突滑膜感受器神经通路网络主要由颈胸脊神经节、交感神经节及肠系膜下神经节组成。核黄注射后18h、36h在颈椎间盘纤维环、椎间盘髓核、关节突滑膜、肩关节滑膜均发现明显的荧光密集区，且36h荧光强度较18h增强，说明上述部位均有标记的神经末梢分布，上述部位均为颈椎关节突滑膜感受器通路的作用靶点及靶器官。颈椎关节突滑膜及肩关节滑膜均发现荧光密集区，说明神经元末梢分布到颈椎关节突及肩关节滑膜，这与既往研究结果相同。目前多数观点认为这种神经投射是通过DRG周围突分支或交感神经节（干）与DRG之间联系后投射到颈椎关节突关节或肩关节，本实验进一步说明脊神经节及交感神经节与颈椎关节突滑膜及肩关节滑膜之间存在一定联系。在颈椎间盘纤维环、髓核这两个部位发现荧光密集区，说明有神经末梢分布到椎间盘纤维环及髓核，这为解释盘源性颈肩痛的发生和经颈椎关节突滑膜治疗盘源性颈肩痛提供了神经形态解剖学方面的理论支持。此外，临床上针对颈椎关节突滑膜治疗颈肩痛部分患者效果欠佳的原因可能与给药剂量、部位、施术者对解剖掌握程度、患者的心理状态等均有关。感受器通路系列研究的宗旨是寻求治疗复杂疾病的简单方法，主要用于末梢分布在体表的一线神经元的上、下行神经通路网络给药，从神经层面治疗疾病、调节神经功能障碍，并已得到推广。颈椎关节突滑膜感受器神经通路网络的明确，将进一步推动这一宗旨的实施与推广，同时理论上可解释经颈椎关节突滑膜进行治疗可缓解颈交感神经受刺激后引起的上肢冷，颈部肌肉僵硬、痉挛，肌膜增厚，皮肤增厚等症状，这同时证实人体存在自身修复系统，而神经末梢密集区如颈椎关节突滑膜感受器是自身修复的靶点，只要神经末梢工作状态正常，便可即时修复受损组织。因此，现代临床治疗应加入整体概念，从神经层面调节、治疗疾病。

荧光范文篇9

一、关于县科技有限公司原材料的来源

该公司生产用的主要原材料是硼废料和荧光粉废料。其中硼废料来源于硼磁材在生产加工中成型、切削、磨床废料，约占硼产量的30%；荧光粉废料来源于稀土三基色制粉、涂料及废管回收环节。该公司大多股东在冶金行业中工作多年，长期与产品上下游的硼和荧光粉生产或需求企业建立了良好的合作关系，公司成立后，与市新世纪材料有限公司、黄山桂明废旧金属回收有限公司、赣州立强新材料有限责任公司、赣州海川工贸有限公司等企业分别签订了每月提供硼废料100吨的长期合作合同（四个公司合计每月400吨）。原材料供应充分。

二、关于县科技有限公司工艺技术

荧光范文篇10

【关键词】神经干细胞；2型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力

绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一种新的报告基因，由于其表达产物GFP可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如β2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在GFP的基础上进行F64L和S65T的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），EGFP增强了GFP的荧光性能，更容易观察、检测［1］。2型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体DNA介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体［2］。随着神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）的分离、培养、纯化及生物学功能研究深入［3～5］，寻找NSCs基因修饰载体及标记分子，已成为研究NSCs在体内、外分化调控和细胞工程基因治疗中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。

1材料与方法

1.1病毒载体rAAV-2/EGFP购于863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为5×1011v.g/ml。

1.2神经干细胞分离、培养、鉴定［6］按参考文献进行，体外分离胚胎大鼠大脑额叶皮质、悬浮培养，经Nestine鉴定为神经干细胞（见图1），作为实验细胞株。

1.3主要试剂、仪器DMEM/F12培养液、胎牛血清（HyClone公司产品）；表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）（SIGMA公司产品）；兔抗巢蛋白Nestin抗体、罗丹明标记山羊抗兔二抗（北京中杉金桥公司产品）。相差倒置显微镜（Cannon）、倒置荧光显微镜（Nikon）、细胞计数板、CO2培养箱、超净台、流式细胞仪（BD）。

1.4rAAV-2/EGFP体外转染神经干细胞

1.4.1分组取生长良好的NSCs，机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制备成单细胞悬液，以1×105个细胞/孔接种于4块6孔培养板中，分别按感染复数（MOI）（v.g/cell）=0、1×104、1×105、1×106转染，设四组，其中MOI=0作为未转染对照组。

1.4.2转染转染时先按MOI值计算所需加入rAAV-2/EGFP病毒载体的体积数，在试管中将所需加入rAAV-2/EGFP病毒载体与DMEM/F12培养液混合形成转染液，将每组对应孔中加入相应的2ml转染液，MOI=0作为未转染对照组，同样操作但不转染rAAV-2/EGFP，37℃，5%CO2培养箱培养2h后，1000r/min离心5min，如此DMEM/F12清洗细胞2次，弃病毒残液，补充完全细胞培养液（DMEM/F12加2%B27，20ng/ml的EGF、bFGF）5ml，37℃，5%CO2培养箱培养，常规换液、传代。在倒置荧光显微镜下观察、记录rAAV-2/EGFP转染NSCs后EGFP的表达情况。

1.5rAAV-2/EGFP体外转染对神经干细胞存活、增殖、分化的影响rAAV-2/EGFP转染NSCs后，各组分别在7、14、21天细胞传代时台盼兰拒染法检测细胞活力、细胞计数计算增殖倍数。0.2%台盼兰溶液与细胞悬液混匀，死细胞着色，而活细胞不着色，计数活细胞数及死细胞数。细胞活力为活细胞数/（活细胞数＋死细胞数）。EGFP表达稳定时，10％胎牛血清诱导各组NSCs克隆球分化，观察分化情况。

1.6流式细胞仪检测基因转染率和表达效率［7］rAAV-2/EGFP转染NSCs后，各组在各相应的时间点细胞机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制成单细胞悬液，上流式细胞仪（BD），以未转染组为对照，激发光为488nm、吸收光为530nm，进行数据获取与分析；分析结果用转染率和荧光指数（fluorescentindex，FI）表示。转染率即EGFP阳性细胞的阳性率，荧光指数主要反映了目的基因的表达效率。

每一样品收集1×104个细胞，根据细胞大小设定一个单细胞区域，该区域的细胞用于荧光分析。以未转染组的细胞作为阴性对照，设定GFP阳性细胞区（M1区）使阴性对照M1区细胞数不超过0.1%，流式细胞仪分析结果用转染率和荧光指数FI表示。转染率即为GFP阳性细胞阳性率，FI主要反映了目的基因的表达效率，分别用下列公式计算：转染率=样品M1区细胞百分率－阴性对照M1区细胞百分率；FI=样品M1区细胞百分率样品×M1区平均荧光强度－阴性对照M1区细胞百分率×阴性对照M1区平均荧光强度。在上述两个公式中，减数很小，一般情况下可忽略不计。

1.7统计学处理各组数据均用x±s表示，组间比较用单因素方差分析，实验数据用统计软件SPSS11.0进行统计学处理。

2结果

2.1rAAV-2介导的EGFP基因在NSCs中的表达rAAV-2/EGFP转染NSCs，10天后EGFP开始表达，倒置荧光显微镜下可见各转染组神经球受蓝色光激发产生的呈团块状的绿色荧光，但较弱且强度不一，总体上感染复数越大荧光越强；随后表达显著增加，21天时达高峰，这时荧光较强（见图2），表明细胞球中多数细胞被转染并成功表达EGFP，细胞继续传代培养，仍可见大量荧光。

2．2rAAV-2对神经干细胞活力、增殖、分化的影响不同MOI的rAAV-2转染组和未转染对照组的NSCs在倒置显微镜下观察，均生长良好，细胞透光性好，形态完整，细胞碎片少，NSCs形成克隆球速度相当，细胞稳定性好，可连续传代，各组细胞在7、14、21天台盼兰拒染法检测细胞活力差异均无显著性（P＞0.05）（见表1）。同时各组细胞在7，14，21天细胞计数从而计算增殖倍数，转染组与未转染对照组在相应时间点差异亦无显著性（P＞0.05），并在培养过程中呈指数生长趋势（见表2）。表1rAAV-2转染对NSCs活力的影响注：均为同一时间点转染组和未转染组对照比较，组间比较P＞0.05，差异无显著性表2rAAV-2转染对NSCs增殖倍数的影响注:均为同一时间点转染组和未转染对照组比较，组间比较P＞0.05，差异无显著性。

EGFP表达稳定时，10％胎牛血清诱导各组分化后，各组均可见神经干细胞克隆球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中6h左右细胞克隆球贴壁，12h后即发现有突起从团块边缘长出，24h后见有少数细胞从克隆球的边缘向外迁移，分化为有突起的细胞，有的细胞迁移速度较快，以后分化的细胞逐渐增多，从克隆球周围迁移出，呈放射状排列，随着时间的推移，突起不断增粗与延长并互相连接成网状，1周以后，各组NSCs克隆球几乎完全分化，形成大量胞体呈圆形或椭圆形、具有1～2细长突起的神经元样细胞和胞体较大、形态不规则、具有多个粗突起的星形胶质样细胞。MAP-2、GFAP免疫荧光分别鉴定分化细胞，荧光显微镜下各组均可见MAP-2阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。rAAV-2转染的神经干细胞不仅可以分化为神经元和胶质细胞，细胞形态保持正常，且转染不影响神经元和胶质细胞的分化比例。各组MAP-2、GFAP阳性细胞比例见表3，差异均无显著性（P值均＞0.05）。表3不同MOI转染组和未转染对照组MAP-2、GFAP阳性细胞的比较注：组间比较P>0.05，差异无显著性

2.3rAAV-2对神经干细胞的转染效率EGFPEGFP开始表达后，于14、21、28天流式细胞仪检测各MOI的rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率（见表4）：可见21天为其表达高峰，此时MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%（见图3），荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06。表4不同MOI的rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率

3讨论

近年来，神经干细胞的研究发展迅速，但仍存在许多问题，如细胞移植时常常不能区别供体细胞与宿主细胞，不能较精确地观察植入细胞的存活及生长分化情况，也就难以对脑内移植的功效作出一个客观评价。随着基因工程技术的发展，人们可根据不同的科研及治疗目的，对神经干细胞进行不同的遗传学修饰，以期制成基因工程细胞，这些细胞极具科研和应用价值，受到广泛关注。病毒载体和非病毒载体是目前基因修饰中常用的两大类载体。非病毒载体有脂质体、质粒、分子偶联载体等，基因转移效率低。病毒载体应用最广泛，约占85%，其中腺相关病毒、逆（反）转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒是基因治疗中最常用的4种病毒载体，病毒载体安全性问题至关重要［8］。各种病毒载体都有自己的优点和不足，但是逆（反）转录病毒是随机整合入宿主DNA、可能会引起“插入诱变”、也有可能产生具有复制能力的病毒［9］；腺病毒不能整合到宿主染色体DNA上，表达时间短暂，所以不能持续表达所需产物，且可能刺激免疫反应［10］；单纯疱疹病毒对人类具有明显的致病性，能够从潜伏状态激活［11］。而AAV-2是一种单链的微小DNA病毒，需要辅助病毒才能有效地复制，具有与人类疾病无相关、宿主范围广，并能整合入宿主细胞DNA，去除其复制蛋白Rep和包装蛋白Cap基因,仅具有感染宿主的功能,安全性较高,成为较理想的基因修饰载体,倍受瞩目。其具有下列优点:目前尚未发现该病毒在人体中致病,所以比较安全；感染宿主细胞广泛,包括非分裂细胞和分裂细胞,特别是神经元和神经胶质感染性较强；能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减小了插入突变激活原癌基因的可能性，rAAV虽然失去了整合特异性，但反向末端重复序列中没有转录调控组件，因而减少了插入突变的可能性；外源基因表达稳定，可长达2年［2，12］。NSCs具有自我复制、增殖分化的能力，是基因修饰、基因治疗的靶细胞。

AAV-2能否有效地转染神经干细胞，且转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等有无影响，值得探讨。因为如果转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等天然性能产生影响，都会对细胞、机体造成严重后果，那么将会极大地限制其在基因修饰、基因治疗方面的应用。许多学者采用AAV转染神经干细胞，得到的结果各不相同。Hughes等［13］研究认为rAAV-2对神经干细胞球略有效率低下的转染能力，其仅观察5天转入基因的表达情况，而腺相关病毒转染细胞后基因表达的高峰期为1个月左右，转入基因5天时可能没有表达或者表达量很少。本实验分离培养了大鼠胚胎源性神经干细胞，用rAAV-2/EGFP转染NSCs，对其进行基因修饰，我们的结果提示：转染rAAV-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等未产生影响，rAAV-2对神经干细胞没有毒性作用，不影响神经干细胞的生物学特性，是神经干细胞间接体外法基因治疗的理想载体；MOI=1×104、1×105、1×106转染10天后，EGFP开始表达，荧光显微镜下可见弥漫于整个NSCs克隆球中的绿色荧光，起始表达强度不一，随MOI值的增大而增强，而且EGFP的表达强度随着时间的延长而逐渐增强，至转染后第21天达到高峰并维持,此后荧光指数不再增大；此时行流式细胞仪检测：MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%,荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06。仅以转染率不能够全面衡量一个基因载体的转移效率，无法反映多拷贝基因转移，也不能反映目的基因的表达效率。荧光指数能更为全面地反映基因转移和表达效率；以GFP基因为报告基因，用流式细胞仪分析基因转移效率（转染率和荧光指数）优于传统人工计数法，并且还可用流式细胞仪进一步筛选表达EGFP阳性的细胞。AAV是通过靶细胞膜上的表面肝素聚糖蛋白（surfaceheparinproteinofglycans,SHPG）为受体介导转染的［14］，而受体的数目和功能是有限的，当AAV与受体结合达平衡时，发挥最大生物效应，再增大MOI也不会提高转染效率。因此我们可以解释rAAV-2/EGFP转染NSCs的效率随MOI值的增大而增强，但MOI为1×105、1×106转染效率相差不大，可能是AAV与受体结合达到了平衡，转染达到了稳定，结合实验经济因素，因而MOI=1×105为最佳MOI。另外，还有可能是由于神经干细胞AAV受体表达强弱、培养方法、转染时间、检测方法的不同等因素，引起不同学者实验研究结果上的差异。

GFP相对分子质量小，这也是它作为报告基因的一大优点；GFP与目的基因融合后对目的基因的结构功能没有影响，大量表达对细胞也无毒性作用。在我们的研究基础上，将rAAV-2/EGFP与一些促进NSCs存活和定向分化的营养因子，如GDNF、VEGF等目的基因构建成融合基因，以GFP基因为报告基因，rAAV-2为载体，一起转染移植的NSCs，不需用其他检测方法，只需荧光显微镜下观察GFP的表达情况，便可针对另一基因作相关研究，将对中枢系统的研究手段有更好的应用价值。

【参考文献】

1ChalfieM,TuY,EuskirchenG,etal.Greenfluorescenproteinasamarkerforgeneexpression.Science,1994,263:802-805.转载于范文中国网。

2LoWD,QuG,SferraTJ,etal.Adeno-associatedvirus-mediatedgenetransfertothebrain:durationandmodulationofexpression.HumGeneTher,1999,10:201-213.

3ReynoldsBA,WeissS.Generationofneuronsandastrocytesfromisolatedcellsoftheadultmammaliancentralnervoussystem.Science,1992,255:1707-1710.

4MckayR.Stemcellsinthecentralnervoussystem.Science,1997,276:66-71.

5宣爱国,龙大宏,等.BDNF和神经干细胞联用对老年痴呆鼠基底前脑胆碱能神经元和学习记忆能力的影响.神经解剖学杂志，2005,21,365-371.

6徐汉荣，晋光荣，张海军，等.胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离、培养与鉴定.东南大学学报（医学版），2006，25（4）：248-251.

7刘然义,罗慧玲.一种用流式细胞式检测基因转移效率的新方法.癌症,2002,21:267-271.

8MulliganRC.Thebasicscienceofgenetherapy.Science,1993，260：926-932.

9VanTendelooV,VanBroeckhovenV,BrenemanZN.Genetherapy:principlesandapplicationstohematopoieticcells.Leukemia,2001,15:523-544.

10YangY,NunesFA,BerencsiK，etal.CelluarimmunitytoviralantigenslimitsE1-deletedadenovirusesforgenetherapy.ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:4407-4411.

11PalellaTD,HidahaY.ExpressionofhumanHRTPMrnainbrainsofmiceinfectedwitharecombinantherpessimplexvirus-1vectir.Gene,1989,80:137-144.

12DyallJ,SzaboP,BernsKL.Adeno-associatedvirus（AAV）site-specificformationofAAV-AAVS1junctioninaninvitrosystem.ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:12849-12854.