刚果红荧光光度法测定论文

【摘要】目的采用荧光光度法测定加替沙星的含量。方法在pH6.0的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液中,刚果红能与钙黄绿素生成配合物,使钙黄绿素荧光猝灭,加入加替沙星后,加替沙星与刚果红可生成比钙黄绿素-刚果红更稳定的配合物,使钙黄绿素游离重现荧光。结果将该方用于片剂、粉针剂和尿液中加替沙星的测定,结果与文献报道的紫外法一致。结论所用方法简单、快速、准确、灵敏。

【关键词】钙黄绿素;刚果红;加替沙星

Fluorometrydeterminationofgatifloxacinwithcalcein-congored

【Abstract】ObjectiveToestablishamethodfordeterminationofgatifloxacinbyfluorometry.MethodsThecomplexbetweencongored(CR)andcalceininpH6.0Britton-Robinson(B-R)buffersolutionquenchedfluorescenceofcalcein.Thecomplexofgatifloxacin-CRwasmorestablethanthatofcalcein-CR.Whengatifloxacinwasaddedintosystem,thecalceincouldbefreedanditsfluorescenceappearedagain.ResultsThismethodhadbeenappliedtothedeterminationofgatifloxacinintablet,injectionandurine,andtheresultswereveryclosetothoseobtainedbyusingUVmethodthatreported.ConclusionThismethodissimple,rapid,accurateandsensitive.

【Keywords】calcein;congored;gatifloxacin

加替沙星(gatifloxacin,AM-1155,GFLX)是新的第四代喹诺酮类抗生素药物,具有抗菌谱广,抗菌活性强的特点。它对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌及衣原体均具有强大的抗菌作用[1]。加替沙星的测定方法有高效液相色谱法、荧光光度法、反相离子对色谱法、高效毛细管电泳法和紫外分光光度法[2~6]等。但利用钙黄绿素-刚果红荧光体系来测定加替沙星含量还未见报道。本文经研究发现刚果红能与钙黄绿素生成没有荧光的配合物,使钙黄绿素荧光猝灭,加入加替沙星后,加替沙星与刚果红反应生成比钙黄绿素-刚果红更稳定的配合物,游离出钙黄绿素,释放出荧光。以此为基础,建立了测定加替沙星的新方法。

1实验与方法

1.1仪器与试剂pHS-3CT型酸度计(上海大中仪器有限公司);970CRT型荧光分光光度计(上海精密仪器厂);Labtech-1000紫外-可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)。

加替沙星片(通化金马药业集团股份有限公司,批号:20080201,每片0.1g);沙星粉针剂(浙江亚太药业股份有限公司,批号:070201,每安瓿0.2g)。

加替沙星对照品(GFLX,0.2g/L,河南省药检所提供)溶液:准确称取0.0200gGFLX,加水溶解后定量转移到100ml容量瓶中,用水定容,用时逐级稀释。钙黄绿素(1×10-4mol/L):准确称取0.0175g钙黄绿素,加少量水溶解后配制成溶液250ml。刚果红(CR1×10-4mol/L)准确称取0.6967gCR,加少量水溶解后配制成溶液1000ml。B-R缓冲溶液:取浓度均为0.04mol/L的硼酸,磷酸,醋酸混合溶液,用0.20mol/L的NaOH调至所需pH值。所用试剂均为分析纯,水为二次重蒸水。

1.2实验方法在10ml容量瓶中依次加入1.5mlB-R缓冲溶液(pH6.0)、0.5ml钙黄绿素溶液、5mlCR溶液和适量GFLX溶液,用水稀释至刻度,摇匀。在λex/λem=492nm/514nm,470~540nm之间进行荧光同步扫描。

2结果与讨论

2.1体系的荧光特性在pH6.0的B-R缓冲溶液中按实验方法对钙黄绿素、钙黄绿素-CR、钙黄绿素-CR-GFLX体系进行荧光扫描,由图1可知钙黄绿素在500nm处有强烈荧光,加入刚果红后荧光猝灭,再加入加替沙星,荧光强度增强。

2.2酸度的影响试验不同酸度的B-R缓冲溶液对体系的影响(见图2)。实验表明:pH为6.0时,钙黄绿素和钙黄绿素-CR的荧光最强,并且猝灭程度最大,因此选择pH6.0的B-R缓冲溶液。

2.3缓冲溶液用量的影响试验B-R缓冲溶液(pH6.0)不同用量时对体系的影响(见图3)。实验表明:用量为1.5ml时,体系的荧光强度最强,且猝灭程度最大,因此选择pH6.0的B-R缓冲溶液1.5ml。

2.4CR用量的影响试验CR不同用量时对体系的影响(见图4)。实验表明:随着CR的逐渐增加,荧光强度逐渐降低,当用量大于4.5ml时,体系达到稳定,因此选择CR溶液5.0ml。

2.5时间的影响考察了2h内时间对体系的影响(见图5)。实验表明:反应在常温下很快完成,且在2h内保持稳定。

2.6干扰试验对药品辅料和尿液中常见的物质以及金属离子进行了试验。实验表明:在误差±5%范围内,500倍的葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、尿素、NH+4、Na+和K+不干扰测定;5倍的Mg2+、Zn2+和Fe3+不干扰测定。

2.7标准曲线与检出限按实验方法,在10ml容量瓶中依次加入1.5mlB-R缓冲溶液(pH=6.0)、0.5ml钙黄绿素溶液、5mlCR溶液和适量GFLX对照品溶液,用水稀释至刻度,摇匀,以质量浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标绘制工作曲线(见图6)。实验表明:加替沙星质量浓度在2.0~8.0mg/L范围内与荧光强度呈良好的线性关系,其线性回归方程为:Y=42.066+5.6866C(r=0.9991),检出限为0.051mg/L。

3样品的测定

3.1片剂中GTFX的测定取加替沙星样品10片,研磨均匀,精密称取0.177g(相当于加替沙星0.1g)加水溶解后定量转移置1000ml容量瓶中,用蒸馏水定容,干过滤,弃去初滤液,收集续滤液得样品溶液。按实验方法,用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对照实验,测定结果见表1。

3.2粉针剂中GTFX的测定精密称取0.143g(相当于加替沙星0.1g)粉针剂,加水溶解后置1000ml容量瓶中,用蒸馏水定容,干过滤,弃去初滤液,收集续滤液得样品溶液。按实验方法,用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对照实验,测定结果见表1。表1片剂和粉针剂中加替沙星的测定结果

3.3尿液中GTFX的测定取10ml加替沙星对照品溶液于100ml容量瓶中,用尿液定容,制成人工合成尿样。准确量取尿样溶液1ml于10ml容量瓶中,用甲醇定容后在离心机中离心5min(5500r/min),取上清液用工作曲线法进行测定,用文献[6]的紫外分光光度法做对照实验,测定结果见表2。

3.4回收率试验在样品溶液中加入适量的加替沙星对照品溶液,按实验方法进行回收率试验(见表3)。表2尿液中加替沙星的测定结果表3方法回收率试验

【参考文献】

1许铁男.新喹诺酮类抗菌剂AM1155.国外医药·抗生素分册,1998,19(4):302.

2邓立东,程强,徐勤.高效液相法测定加替沙星尿药浓度.右江民族医学院报,2002,24(3):344-345.

3连宁,孙春燕,赵慧春.加替沙星的荧光光度法测定.分析测试学报,2002,21(1):79-81.

4徐晓卫,张崇生,潘柔和.反相离子对色谱法测定甲磺酸加替沙星注射剂的含量.安徽医药,2006,10(7):505-506.

5朱斌,姜受军,胡昌勤.高效毛细管电泳法测定加替沙星含量.药物分析杂志,2002,22(5):397-400.

6秦雪莲,徐勤,邓立东.紫外分光光度法测定加替沙星片的含量.西北药学杂志,2004,19(4):154-155.