胚胎工程十篇

胚胎工程篇1

一、考点精析

（一）体内受精和早期胚胎发育

1.、卵子的发生与受精作用

（1）卵子的发生

特别提醒：①减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后完成，初级卵母细胞分裂产生一个大的次级卵母细胞和一个小的第一极体；减数第二次分裂是在和卵子结合的过程中完成的，次级卵母细胞分裂产生一个大的卵子和一个小的第二极体.②人类及大多数哺乳动物减数第一次分裂产生的第一极体大多数时候不会继续进行减数第二次分裂产生两个第二极体.有时会进一步分裂产生两个第二极体，但是第一极体与次级卵母细胞的分裂不可能完全同步.所以判断是否受精的标志是在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精.③卵巢是卵子形成、卵泡存在的场所，内部包含许许多多不同发育阶段的卵泡，而成熟的卵泡中可释放出卵子.排卵指卵子从卵泡中排出，而非卵泡从卵巢中排出.

（2）的发生

特别提醒：①精原细胞是由体细胞经细胞分化形成初始的精原细胞，初始的精原细胞经数次有丝分裂形成能进行减数分裂的精原细胞.②在精细胞的变形过程中，细胞发生较大的变化：细胞核成为头的主要部分；高尔基体发育为头部的顶体；中心体演变为的尾；线粒体聚集在尾的基部形成线粒体鞘；细胞内的其他物质浓缩为原生质滴，最后脱落.

（3）受精作用

2.早期胚胎发育

特别提醒：①卵裂期的细胞只进行有丝分裂，细胞数目不断增多，但胚胎的总体积并不增加或略有缩小.②桑椹胚前的每一个细胞都有发育成完整胚胎的潜能，属于全能性细胞.③囊胚期出现囊胚腔，细胞开始分化，但其全能性仍很高，可用于胚胎分割.个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，将来发育成胎膜和胎盘.④原肠胚期出现有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔.

（二）体外受精和早期胚胎培养

1.体外受精

特别提醒：①就卵母细胞的采集和培养而言，对体型小的动物用促性腺激素处理，从输卵管冲取卵子（可直接受精）；对体型大的动物从卵巢中采集卵母细胞（要在体外培养成熟）.②获能的和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程.③超数排卵是指给供体母畜注射促性腺激素，使其，一次排出比自然情况下多几倍到十几倍的成熟卵子，经合理的人工授精方法，可以获得数量较多的可移植胚胎.

2.早期胚胎培养

与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力.培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质.当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存.不同动物胚胎移植的时间不同，牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植.

（三）胚胎工程的应用及前景

1.胚胎移植

（1）生理学基础

①动物排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的，这就为供体的胚胎移人受体提供了相同的生理环境. ②早期胚胎在一定时间内处于游离状态，这就为胚胎的收集提供了可能. ③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体的存活提供了可能. ④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响.

（2）基本程序

胚胎工程篇2

笔者在全市高效课堂研讨活动中对“胚胎移植”一节课按照上述理念做了很好的处理，得到了与会同行和专家的好评，也受到了学生的喜爱。在此将本节课的教学设计整理成文，以期起到抛砖引玉的作用。

1　教材分析

人教版选修三“胚胎工程的应用及前景”这一节，集中讲述了胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞的分离和培养这三种胚胎工程技术，而第一课时主要讲述胚胎移植方面的内容。

关于胚胎移植，教材首先从胚胎移植的概念导入，通过概念的学习使学生知道胚胎移植的含义及在胚胎工程中的地位，即体外受精、核移植、胚胎分割等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，胚胎移植是胚胎工程的最后一道“工序”。关于胚胎移植的现状和意义，教材先用数字简述了胚胎移植的现状，以引起学生的重视，再用图解的方式，从加速育种工作和品种改良、大量节省购买种畜费用、一胎多产、保存品种资源和保护濒危物种等几方面，阐述了胚胎移植在充分发挥雌性优良个体繁殖潜力方面的意义。关于胚胎移植的基本程序，教材是在讲述胚胎移植的生理学基础之上，以图代文的方式进行讲述，用形象的流程图来讲解生物技术的基本程序，可使学生更深入、更直观地理解所学的内容。

2　学情分析

学习本节内容前，学生已学习了胚胎工程专题中的体内受精和早期胚胎发育、体外受精和早期胚胎的培养等内容。除此之外，学生通过报刊、电视等媒体对“试管动物”、“借腹怀胎”、胚胎移植等有关知识也有一定的了解。这些都是学生学习本专题的基础。

3　教学目标及其重难点

3.1　教学目标

(1)知识目标：简述胚胎移植的概念；理解胚胎移植的生理学基础；说出胚胎移植的基本程序；了解胚胎移植的现状和意义。(2)能力目标：解读概念时能抓住关键词；能对胚胎移植是否能成功实现提出自己心中的疑问，增强学生提出问题，解决问题的能力；能通过阅读教材，画出胚胎移植流程图，提高概括知识的能力；能搜集胚胎移植现状和意义的资料，增强收集信息、提取有用信息的能力。(3)情感、态度与价值观目标：认同胚胎移植在胚胎工程中的地位；了解胚胎移植的现状和意义，关注它的最新进展。

3.2　教学重、难点

胚胎移植的生理基础和基本程序。

4　教学过程

4.1　设置情景，通过问题导入新课

教师的组织和引导：教师向学生展示世界上第一例试管婴儿的图片，图片上这个试管婴儿的到来给这个家庭带来了天伦之乐(暗示着该技术的现实意义)。教师提问：说起试管婴儿，人们很容易想起“试管”和“婴儿”，以为婴儿就是从试管中培育出来的，是不是呢?(不是)。继续追问：试管婴儿(动物)的培育哪些过程是在体外进行的呢?(受精和早期胚胎的培养在体外进行)进一步追问：早期胚胎如何才能发育成幼体?(进行胚胎移植)至此，引入本课课题，并用幻灯片展示课时学习目标。

学生的活动：通过思考回答问题；在教师的引导下明确本节课的学习目标。

预期目标：通过隋景的设置和问题的思考，让学生认识到自己所学知识的现实价值，激发学生强烈的求知欲。同时阶梯式的问题又让学生将上节课的内容与本节课内容有机地联系起来，起到承上启下的作用。

4.2　自主阅读，解读“胚胎移植”概念中的关键词

教师的组织和引导：什么叫胚胎移植呢?请学生阅读教材“胚胎移植”这部分内容，并解读以下三个关键词的含义(课件展示)：受体条件、早期胚胎的获得途径、地位。教师在学生阅读汇报的基础上进行点评，并且帮助学生辨析以下两点：(1)同种的“种”是什么含义?(2)核移植和体外受精得来的胚胎有何区别?

学生的活动：学生阅读教材，在重点部分做上记号，然后汇报阅读成果。在教师进行点评后讨论、质疑两个辨析题。

预期目标：让学生通过阅读学会分析、解读概念的关键词，同时在师生共同的讨论质疑中进一步提升对概念的理解。

4.3　分组讨论，质疑胚胎移植，理解其生理学基础

教师的组织和引导：幻灯片展示牛胚胎移植示意图，简述其过程。提问：从供体内收集的胚胎移植到受体体内，这个胚胎转移的过程中会不会碰到一些困难呢?你对它的成功实现抱有什么疑虑?在学生讨论质疑的过程中教师巡视。接下来在学生汇报的基础上点评、肯定学生的问题，提炼出有价值的问题进行展示：

(1)准备移植的胚胎，移植到任何一头母牛的子宫内都能发育吗?

(2)从供体内收集胚胎会不会对供体和胚胎产生伤害呢?

(3)受体对移入子宫的外来胚胎会不会发生免疫排斥反应?

(4)移植到受体的胚胎能保留供体双亲的遗传特性吗?

之后教师让学生带着问题阅读教材“胚胎移植的生理学基础”这部分内容。阅读后让学生以自我检测的形式检验阅读成果。幻灯片演示自我检测题：

在学生理解了生理学基础的前提下，教师用幻灯片展示思维拓展题：

(1)在胚胎移植操作中，怎样才能使胚胎在移植前后供、受体所处的生理环境保持一致。

(2)供体胚胎移入受体子宫的位置，应与在供体内的位置相同或相似吗?胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。你认为这样的概括正确吗?

(3)为什么供体的胚胎移植到受体后，孕育成的后代其遗传性状仍与供体相同?

学生的活动：学生通过分组讨论，提出对胚胎移植能否实现的疑问；并带着这些疑问阅读教材，寻找答案；当堂对照自我检测题进行检测；在理解了胚胎移植生理学基础的前提下，思考教师提出的思维拓展题。通过这几步的自主学习，学生理解、巩固了胚胎移植的生理学基础这部分知识。

预期目标：让学生在相互合作中提出问题，在问题地强烈驱动下去寻找答案，明确胚胎移植的生理学基础，突破本课时的难点。通过自我检测，学生当堂学的内容当堂巩固，从而获得课堂的高效率。通过思维拓展题的思考，使学生加深对生理学基础的理解，同时拓宽知识面，加强前后知识的联系。

4.4　图文解读，完善胚胎移植流程图

教师的组织和引导：那么，胚胎工程技术人员是如何进行胚胎移植的呢?引入胚胎移植基本程序的学习。教师请学生阅读教材胚胎移植的基本程序，完成下列胚胎移植的流程图(图1)，并思考右侧相关问题。

教师对学生的回答做适当点评，并用幻灯片展示思维拓展题：

(1)如果上述过程是为了培养世界上产奶量最高的奶牛品种之一――荷斯坦奶牛，产下的牛犊的性别怎样?如何对移植前的胚胎性别进行鉴定，以培养

出更多的母牛?

(2)若要让不同的受体母牛生下基因型完全相同的牛犊，应在胚胎移植前对胚胎做怎样的处理?

学生的活动：学生自主阅读教材，在学案上完成填图，并思考有关问题。然后两位学生分别到讲台前汇报自学成果，其他学生补充、修正。了解了胚胎移植的基本程序后，思考思维拓展题。

预期目标：自学能力是学生获取知识的最重要的能力，通过这个环节的学习，学生这方面的能力得到加强，同时通过汇报自学成果，提升了语言表达能力。思维拓展题的思考加深了对胚胎移植程序的理解，拓宽了知识面，加强了前后知识的联系，其中第二个问题又为第二课时的学习打下了伏笔。

4.5　搜集资料，了解胚胎移植的现状和意义

教师的组织和引导：教师提供课前学生搜集的有关材料，结合教材上关于“胚胎移植的现状和意义”部分内容，请学生阅读，了解胚胎移植的现状，总结胚胎移植的意义。阅读后师生共同总结出5点意义：

(1)加速育种工作和品种改良。(2)胚胎移植不受时间和地域的限制，大量节省购买种畜的费用。(3)一胎多产。(4)保存品种资源和濒危物种。(5)可充分发挥雌性优良个体的繁殖潜能。

教师在总结的基础上进一步提出2个问题：

(1)胚胎移植不受时间和地域的限制，保存品种资源和濒危物种等需要什么技术来支持它?

(2)为什么说胚胎移植能充分发挥雌性优良个体的繁殖潜能?

然后教师在学生回答的基础上做适当点评。

学生的活动：阅读课外搜集的材料和课本上介绍的材料，了解胚胎移植的现状，总结胚胎移植的意义。在此基础上再思考2个问题，使学生对胚胎移植意义的理解更上一个层次。

预期目标：学生通过搜集胚胎移植现状和意义的资料，增强收集信息的能力。通过阅读资料概括出胚胎移植的意义，增强了提炼、获取有用信息的能力。这部分知识的学习能引领学生进一步认识科学、技术、社会三者之间的关系。

4.6　及时反馈，巩固所学知识，发现存在问题

教师的组织和引导：课前精心准好合适的练习题。

学生的活动：在学案上思考解答，然后相互批改，暴露存在问题。

预期目标：通过及时的反馈练习，既使本节课的学习内容得到及时巩固，又能发现学习过程中存在的问题，及时采取补救措施。

胚胎工程篇3

关键词：高中生物;知识;链接

在教学中，依照章节的次序，让学生学习、归纳生物学基本事实，让生物学原理与概念有机结合，从中探寻知识的规律组成，发现当前生物应用技术与生物科学理论的建构模式，掌握生物学发展动向，帮助学生梳理各个知识点，强化理解能力，稳固而扎实地获取知识。将高中生物知识的各个环节通过一定教学方法来完成链接，让系统化、层次分明的知识网络形成于学生的头脑，提高学生的逻辑思维以及对知识按照先后顺序进行统一的能力。

1.创建知识链接

1.1形成章节内的知识链。知识链是指将生物学核心概念、基本原理、基本事实及运动过程等用文字箭号的形式串联起来，用来表现生命结构的特征及生命运动的特点，或人们利用生物学的原理来解决实际问题的过程。这种归纳方式简单明了，脉络清晰，是生物学教学中常用的一种手段。如在学习基因工程、动物细胞工程、胚胎工程等生物技术过程中，可引导学生尝试形成以下有关的知识链，例如基因工程部分，基因获取目的、基因构建的表达方式与载体、基因导入受体细胞、基因鉴定及检测，最后进入转基因部分;动物细胞核移植的知识链接创建，从动物体细胞过渡到MⅡ卵母细胞，分析细胞重组与胚胎、细胞代孕、动物的克隆技术等;胚胎移植部分，早期胚胎代孕母体子代;胚胎分割：早期胚胎二、四、八等份胚胎代孕母体子代;胚胎干细胞分离和培养：早期胚胎胚胎干细胞组织器官某器官缺陷的个体。用知识链形式归纳，可以将复杂的操作过程简约化，有利于学生的理解和记忆。

1.2寻找知识联系的“节点”。要建立起不同知识链之间的联系，关键是寻找知识链之间的联系的“节点”。所谓节点，就是指联系两条或几条知识链之间的关键概念、过程或原理，通过节点，可以梳理几条知识链之间的关系，就像交通要道的十字路口，方便地从一条知识链到达另一条知识链。上述的基因工程、细胞工程、胚胎工程中的几条知识链之间如何进行链接？可以通过引导学生探究如下问题来寻找链接的“节点”：⑴利用基因工程技术获得转基因哺乳动物常用的受体细胞是什么？受体细胞怎样对目的基因进行操作才能够发育形成转基因动物？⑵应用动物细胞核移植技术最终完成动物克隆时，完成重组的早期胚胎培养场所是怎样的形式？继续的发育场所是什么？⑶胚胎分割在什么时期进行操作的？分割后的早期胚胎如何处理才能得到遗传性状完全相同哺乳动物？⑷提取胚胎干细胞一般在什么时期？它有什么意义？通过探究可以发现，培育转基因动物和克隆动物，受体细胞或重组细胞都是在体外培养成早期胚胎，然后再移植到代孕母体内发育的。而胚胎分割和胚胎干细胞其实都是在早期胚胎水平上的操作的。这样就可以将“早期胚胎”作为一个节点，把几条知识链联系起来，达到链接的目的。

1.3链接不同的知识链。知识链接就是将不同的知识联系起来，这种链接可以是章节内的，也可以是跨章节的。通过寻找知识联系的节点，建立起不同知识链的沟通。有时几条知识链之间的节点并不特别明显，这就需要分析，仔细研究它们的关系，找出最关键的联系节点。找到“早期胚胎”这样一个关键的节点后，可以引导学生进行这样的链接：⑴进行胚胎移植的早期胚胎可能有哪些来源？⑵早期胚胎有几种去向？就可以从早期胚胎的来源和去向这两个方面来联系：哺乳动物早期胚胎可以通过正常的体内受精作用或体外受精收集到，也可通过基因工程或细胞工程获得的改造后细胞在体外培养而成。早期胚胎移植到母体内，由代孕的母体生出子代个体，就是说，通过基因工程和核移植培养的早期胚胎，只有通过胚胎移植过程，才能发育成所期望的哺乳动物。胚胎分割和胚胎干细胞分离和培养都是在移植前对早期胚胎的处理，以获得更多的遗传性状相同的子代，或定向分化成组织器官，后者用以对有缺陷的动物进行器官移植。如下图所示。

2.知识链接的几种类型

2.1直链式链接。几条知识链通过关键的节点链接后，仍然为直链的链接方式。直链式链接结构简单，知识梳理清晰，特别适宜进行一章或一节内的知识联系，在一章或一节的复结中常使用。例如植物和动物的内在相关能量转变过程为光能、电能以及ATP等物质的活跃，化学能在ATP等物质中的活跃，光合作用的暗反应以及大部分有机物含有的稳定化学能ATP中的活跃化学能（动植物的呼吸作用）;ATP中的活跃化学能机械能、光能、电能、化学能（动植物细胞中能量的利用）。通过链接完成生物体之间能量转变的过程，例如光能、电能以及ATP等物质内含有的活跃化学能;大部分有机物内含有的稳定化学能、活跃于ATP物质中的化学能、机械能、光能、电能以及化学能等。

2.2放射式链接。若干条知识链之间不形成紧密的联系，每条知识链只表现生命活动的某一方面，几条知识链由一个关键的节点链接后，形成放射式链接结构，就可以说明完整的生命活动过程，这种形式特别适宜建立不同章节之间的联系，在总复习课中经常使用。如血糖的调节过程，体温调节过程，水和无机盐调节过程，PH调节过程，免疫调节等几条知识链，可以通过“内环境稳态”这一节点联系起来，因为这些调节过程都是维持内环境稳定的重要方面，只有多种调节过程维持正常，才能表现内环境的稳定。如下图所示。

2.3网络式链接。不同的知识链，由关键的节点链接，各条知识链之间的关系错综复杂，不止在一个知识点处有关联，于是就形成了复杂的网络式结构，这种链接适宜跨模块或跨章复习时的归纳总结。如上述基因工程、动物细胞的核移植、胚胎工程之间的知识联系就是这种链接。

2.4体验式链接。体验式链接亦可称为体验式教学，它强调利用课堂体验来提高学生对于学习的主动性，以兴趣培养为前提，巩固生物知识的链接基础。体验式链接的内涵在于，教师充分向学生展示日常生活中可以见到的生物学相关知识，理解生物学与日常生活之间的关联，利用体验式教学来为知识链接注入活力，创造轻松愉快的生物课堂。体验式链接能够有效利用到学生原有的生物知识结构，通过实验和体验来将知识结构横向拓宽，为链接下一部分的知识打下基础。另外，体验式链接能够为学生带来一些反思，快速找到当前生物知识尚且存在的不足，通过对学生的引导，端正学习态度与学习的方式方法，创造一些可以利用到生物知识经验的教学场景，进而提高生物课堂的整体性与关联性，让知识链接得以事半功倍。

胚胎工程篇4

1.1样品的采集

通过对江苏省常州市各典型企业工业污水处理工艺流程、污水处理量以及排放情况进行现场走访调研，选取8家工厂为采样点。采集各工厂污水处理系统的进出水水样，用棕色瓶分装并贴好标签，4℃下保存。

1.2工业废水常规项目的测定

现场测量采样点的常规理化数据(温度、pH值、电导率等)，并将样品带回实验室，按照《水质pH值的测定玻璃电极法》(GB6920－86)《水质化学需氧量的测定重铬酸盐法》(GB11914－89)《水质五日生化需氧量(BOD5)的测定稀释与接种法》(HJ505－2009)《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》(HJ535－2009)《水和废水监测分析方法》(第4版)分别测定pH值、COD、BOD5、氨氮和电导率。

1.3工业废水发育毒性的测定

1.3.1热带爪蟾胚胎的获取挑选实验室养殖的性成熟热带爪蟾15对，采用人工注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)的方法诱导产卵，每对爪蟾各注射2次(初次注射20IU，36h后注射100IU)。待爪蟾抱对产卵结束后，从产卵较好的3对爪蟾中，挑选出达到NF10～11阶段且发育正常的胚胎。

1.3.2暴露实验采用ringer溶液作为对照组，与试验组各设4个平行。在24孔板上试验，每孔放入10个胚胎，加入3mL水样。暴露条件:25℃多功能培养箱，24h后换液，记录孵化个数，并将未孵化的胚胎挑出，48h后统计死亡个数。

1.3.3胚胎的观察与分析将存活胚胎用100mg/LMS－222麻醉处理后固定于4%的甲醛溶液中。取出经固定的胚胎，在解剖镜下观察胚胎的发育状况，用显微照相系统(ZEISSAxioCamICc3)拍照。相关指标有4个:①孵化率(孵化出的幼体占受精卵的百分比);②存活率(胚胎在48h内存活个体数占孵化出总个体数的百分比);③体长(胚胎头部至尾尖的直线长度);④畸形率(48h后胚胎畸形个体数占总存活个体数的百分比)。

1.3.4数据处理以每孔中的胚胎为一个平行样，数据以平均值±标准差(SD)表示，n=4。用SPSS16．0分析差异性，其中所有百分比数据的差异性均先平方根，反正弦转换后再用Tukey-test分析，方差齐时用Dunnett检验组间差异，不齐时用Dunnett＇sT3检验。

2结果

2.1工业废水水质状况

参照《太湖地区城镇污水处理厂及重点工业行业主要水污染物排放限值》(DB32/1072－2007)和《污水综合排放标准》(GB8978－1996)，通过对比8组水样的进出水理化指标，发现经污水处理系统处理后，水质明显好转:S1、S2、S3和S4pH值分别由1．30、11．97、10．05和1．84恢复到了6～9之间;S3、S4、S5和S8的氨氮值以及S3、S7和S8的BOD5值均明显下降，满足达标排放标准;COD值也显著降低，可S2、S3和S6的COD值均已超过太湖地区城镇污水处理厂及重点工业行业主要水污染物排放限值，超标量分别为53．8%、36．2%和78．0%。

2.2污水处理系统进出水对热带爪蟾胚胎的影响

热带爪蟾胚胎测定污水处理系统进出水发育毒性。各进水水样测定结果:S1、S2、S4和S6水样中的胚胎均未孵化，S3的孵化率为27．5%，S5、S7和S8的胚胎全部孵化;S7的存活率为97．5%，其余点位全部死亡。各出水水样测定结果:S1、S2和S4水样中的胚胎孵化率为100%，S6水样中的胚胎孵化率较进水水样增加了7．5%;S8水样中出水存活率与进水相比增加了25%，S5水样中的胚胎也由进水的全部死亡变为全部存活。各点位水样对胚胎造成不同程度的畸形，主要特征有色素减少、鳍变窄、泄殖腔膨大、体轴弯曲和眼睛畸形等，见图1。进水中，仅S7有存活，畸形率为2．5%，与对照组相当。出水中，S2、S5和S7与对照相比无显著差异，S1的畸形率为25%，S4和S8则分别达到了87．5%和58．3%，试验表明，经过污水处理系统处理后，出水水质的整体状况变好。

2.3热带爪蟾胚胎对工业废水毒性的表征

在监测的8个点位中，进水水样总体孵化率极低，表明未经处理的工业废水具有很强的生态毒性，严重影响胚胎孵化。电子和电镀行业废水pH值过高或过低是导致胚胎均未孵化的主要原因。S5和S8的高氨氮也致使热带爪蟾胚胎在孵化后全部死亡。S6较S7的各项理化指标值均较低，胚胎孵化率却分别为0和100%，这可能是S6(印染企业)的进水中含有较多难降解有毒污染物所致。污水经处理后，S3和S6的出水存活率依然为0，这与出水中较高的COD和BOD水平有关。S1、S4和S8出水胚胎畸形率较高，表明废水经污水系统处理后依然具有较强的毒性，而理化指标却显示水样治理效果良好，已达到排放标准。S1和S4出水理化指标值较低，却产生了较高的胚胎畸形率，表明出水水样中可能含有未列入监测范围的有毒污染物，因此常规理化监测有时无法反映废水的毒性。邹叶娜等采用成组生物毒性测试(包括发光细菌急性毒性实验、大型溞急性毒性试验和单细胞凝胶电泳试验)研究了常州市典型企业污水处理厂进出水的综合毒性，同样表明理化指标达到排放标准的出水，却仍然具有较大的急性毒性和遗传毒性。这些工厂的废水直接排入城市河道，势必会对城市水生生态系统和水质安全产生威胁。综上所述，S3、S4、S6和S8的出水发育毒性明显大于其他各样点，毒性大小顺序为S6＞S3＞S8＞S4。S3、S4和S6分别为啤酒、电镀和印染工业，尽管我国也制定了相应的行业污染物排放标准，可相应的理化指标并不能反映出废水排放到自然环境中对生物的综合毒性。热带爪蟾胚胎检测结果利用胚胎孵化率、死亡率、畸形率以及畸形类型等指标可以对不同点位的工业废水水样进行毒性表征。

2.4热带爪蟾胚胎在工业废水监测中应用的可行性

目前我国仍没有工业废水毒性测试方法及毒性排放控制标准。虽然，利用生物检测技术评价工业废水的毒性已有大量试验基础，但仍需筛选多种代表性敏感水生生物才能更加客观准确地评价废水毒性。FETAX对低浓度的污染物表现出较强的敏感性，已作为评价化合物发育毒性的有效方法，被用于多种不同类型环境样品的生态毒性检测，为工业废水的毒性检测提供了一种快速有效的毒性监测方法。此外，已有研究表明，不同的污染物导致热带爪蟾胚胎畸形现象也不一样，且某些污染物能导致爪蟾胚胎产生独特的畸形表型，如用环境浓度三丁基氯化锡(50ng/L～400ng/LTBTCl)对热带爪蟾胚胎进行24h，36h和48h暴露能够导致胚胎眼睛异常、泄殖腔突出和鳍变窄等多种畸形现象。随着对不同污染物致畸机制的深入研究，热带爪蟾胚胎的畸形表型可为污染物识别提供帮助。尽管将热带爪蟾胚胎应用于工业废水的生物监测尚处于起步阶段，但其所需要的时间短、经济成本低，暴露48h便可获得各项评价指标，操作简便易行，表现出巨大优势。目前，仅参照现有的指标无法进一步区分不同工厂污水的水质状况，在以后的研究中应考虑将畸形指标量化、各个类型的畸形程度等级化，并结合不同器官的致畸权重系数评判致畸等级。总之，热带爪蟾作为一种评价环境样品毒性的生物已得到越来越多的认可，随着热带爪蟾模式生物在各领域研究的发展，其在工业废水监测中的应用也会更加广泛深入。

3结语

胚胎工程篇5

关键词激素;小鼠胚胎;体外发育;影响

abstractthe system for mouse embryo culture,and the effects of two different hormone on mouse preimplantation embryos in vitro were explored.one-cell mouse embryos were cultured in different culture media to determine the optima system,and thendifferentconcentrationhormone were added to the medium to observe the effect ofhormone on mouse embryo development in vitro. htf +10% fbs medium was the best culture system of mouse preimplantation embryod in viting. after hormone of different concentrations and kinds were added to htf +10% fbs medium,the development rate of different stages embryos declines compared with control group. high concentration hormone could depress development of mouse preimplantation embryos in vitro,and lessens the developmental proportion of different stage embryos,then significant decreased the occurrence of blastocyst.

key wordshormone;mouse preimplantation embryos;development in vitro;effects

早期胚胎体外培养技术在发育生物学、胚胎移植、转基因动物等领域的研究工作中都有很重要的作用[1]。早期胚胎发育是一个复杂的过程,在此过程中,可受到各种激素的影响,激素通过不同途径来调控早期胚胎发育[2,3]。目前,在不孕治疗中经常使用到各种促排卵激素,在孕妇妊娠期间也经常使用一些激素类药物,有报道,使用不同剂量和不同种类的激素,可能影响到胚胎的质量[4-7]。另外,环境中也存在着多种激素的类似物,这些激素和激素类似物对胚胎发育的影响研究,目前还缺乏系统性,尤其是较高浓度的激素水平如何影响胚胎的发育、胚胎发育与激素的浓度之间是否存在着剂量依存性、同种激素对不同发育阶段的胚胎的影响等,这些都还不十分明了,很有必要进行深入的研究。本研究旨在以小鼠为试验动物模型,在基础胚胎发育培养液中分别加入不同种类和不同浓度的激素,以探讨其对鼠早期胚胎体外发育的影响机理。

1材料与方法

1.1试验试剂

孕马血清促性腺激素(pmsg)和人绒毛膜促性腺激素(hcg)购自宁波第二激素厂,htf培养液购于美国in-vitro公司,透明质酸酶购自vitrolife公司,bsa 粉剂购自bovomax公司,fbs(胎牛血清)购自gibco公司。胚胎操作液配制:czb-hepes(nacl为478.9mg/100ml,kcl为36.3mg/100ml,kh2po4为15.9mg/100ml,mgso4为14.195mg/100ml,nahco3为210.0mg/100ml,c6h12o6为100.0mg/100ml,cacl2·2h2o为25.0mg/100ml,乳酸钠(60%糖浆)为370mg/100ml,链霉素为50mg/100ml,青霉素为60mg/100ml,hepes为238.0 mg/100ml)。使用时,添加bsa粉剂4mg/ml,过滤除菌,使用前加温,用于体外胚胎的收集和清洗操作。

1.2试验动物及处理

昆明品系性成熟小鼠,6～8周龄,购自浙江中医药大学动物实验中心,饲养于光照控制(10l∶14d)、恒温恒湿的饲养室,自由采食饮水。雌鼠于17∶30左右腹腔注射10iu孕马血清促性腺激素(pmsg),48h后腹腔注射10iu人绒毛膜促性腺激素(hcg),hcg注射后与正常雄鼠按1∶1比例合笼,次日清晨检查有无阴栓。有阴栓者于注射hcg后14～21h采用颈椎脱臼法处死小鼠。

1.3胚胎收集

取出输卵管移入操作液,在体视显微镜下找到输卵管膨大部,划破输卵管膨大部使受精卵(云雾状)游离出来。用枪头吸出卵团,移入含透明质酸酶的液滴中反复吹打,镜下观察,当受精卵游离出来后,用移卵管(自制巴氏管)吸出来移入新液滴内清洗3次,备用。

1.4试验分组与胚胎培养

1.4.1检查通过2-细胞阻滞情况。收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为2组,分别置于htf+10% fbs和htf+4mg/ml bsa培养液小滴中。于37℃、5% co2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,24h后观察2-细胞发育情况并做好记录。

1.4.2检查培养体系。收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于htf+10% fbs培养液小滴中。于37℃、5% co2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每 24h观察1次,并记录各发育阶段胚胎数目。

1.4.3激素对胚胎发育的影响。选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于添加100、50、10iu/ml的hcg和100、50、10iu/ml pmsg的htf+10%fbs培养液中。于37℃、5% co2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每24h观察发育情况,并记录各发育阶段的胚胎个数。以不添加激素的htf+10%fbs培养液作为对照组(ck)。

2结果与分析

2.1培养液中添加fbs和bsa检查培养系统突破2-细胞阻滞效果

在试验体系中,分别在htf培养液中添加胎牛血清-fbs(10%)和牛血清白蛋白-bsa(4mg/ml),检查培养系统能否突破小鼠胚胎发育的2-细胞阻滞情况,结果发现:添加fbs和选购的bsa均可以使原核期胚胎突破2-细胞阻滞,而以添加血清效果较好,在以下的试验中将选择htf添加血清作为基础培养液(见表1)。

2.2培养体系检查

应用htf+fbs培养原核期胚胎,可以平均获得2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚的比例分别为80.3%、78.3%、76.0%、75.5%、68.5%,各发育阶段胚胎个数的具体数值见表2。

2.3小鼠胚胎发育各阶段的显微摄影

培养后每间隔24h,在相差显微镜下观察胚胎的发育情况,并拍照,各发育阶段胚胎的形态如图1所示。各发育阶段胚胎发育正常,培养系统相对稳定。

2.4激素对小鼠原核胚胎体外发育的影响

不同浓度的激素对小鼠胚胎体外发育的影响结果见表3。由表3可知,添加激素后,各发育阶段胚胎的发育率与对照组相比均有所下降,原核期胚胎的2-细胞发生率与对照组相比有所下降,但未发现浓度依赖性;添加不同浓度的hcg使4-细胞胚胎及其后的各阶段胚胎发育下降尤为明显,并且未发现发育到囊胚阶段;添加不同浓度的pmsg,囊胚的发育率与对照组之间也存在着显著差异;添加hcg似乎可以降低胚胎异常分裂率,而添加pmsg 似乎使异常分裂胚胎的比例升高,具体情况如何还需要深入的研究。

3结论与讨论

胚胎的早期发育过程中,很容易受到激素的影响,在辅助生殖实施过程中,往往需要使用激素进行超数排卵处理,激素对早期胚胎的发育影响研究可以为人类辅助生殖技术提高成功率提供一定的理论基础。近年来,随着动物胚胎工程的发展,试管动物、转基因动物和体细胞核移植动物已相继出现,而生产这些动物的一个关键步骤就是胚胎的体外培养,获得稳定的体外发育率是这些技术广泛推广的基础。

试验发现,应用htf添加10%血清的培养系统可以很好地支持小鼠胚胎体外发育,使用的系统在多次试验检测过程中相对比较稳定,几次试验培养的原核期(1-细胞期)胚胎可以在体外发生分裂,并可以发育到囊胚阶段。

昆明品系小鼠早期胚胎体外培养中表现出严重2-细胞阻滞现象[8],应用模拟输卵管培养液添加血清和血清白蛋白的方式可以突破2-细胞阻滞,在本研究中进口血清突破2-细胞阻滞的效果要好于选购的bsa。这可能与血清中含有多种促进胚胎发育的细胞因子有关[9]。

pmsg和hcg这2种激素经常被用于动物的超数排卵。孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,pmsg)具有体内的fsh和lh的作用,而人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hcg)是模拟体内lh的作用,促进黄体发育,fsh和lh二者在体内促进卵泡发育、排卵和黄体发育。hcg由人胎盘和胞体滋养层细胞合成,现已可高度纯化,并可由基因重组生成。自1978年首例经体外受精胚胎植入创造的louise brown诞生后,近10余年来随着art技术的进展,hcg的临床应用也日益广泛,但其在妊娠早期的功能迄今仍未完全明了。虽然hcg对维持黄体功能是必需的,在不孕症患者诱导排卵出现黄体功能障碍时,重复给予hcg能有效地支持黄体功能[10],但也有hcg溶解黄体的报道,试验表明在大鼠、小鼠、兔和羊于胚胎植入前和植入时,给予1次或多次hcg,会导致产生不同程度的胚胎死亡[11]。特别是最近用促性腺激素诱导排卵,在体内或体外受精治疗不孕症时,常继之出现缩短黄体期致胚胎植入失败、妊娠率降低等现象,其机理也还很少阐明。在程渭玉等[12]的研究中也表明hcg对胚胎的毒性,且存在时间、剂量依赖关系。试验添加不同浓度的hcg使4-细胞胚胎及其后的各阶段胚胎发育下降尤为明显,并且未发现发育到囊胚阶段的胚胎。

pmsg在母马妊娠38~40d时可以检测出,60d时达到高峰,而在120d时开始下降,170d时下降到检测不出的水平;hcg在非孕妇女处于较低水平,在胚胎发育早期也处于低水平,在妊娠第2周以后显著增加。近来也有学者研究认为胚胎体外发育与激素pmsg、hcg存在关联[13],其他激素也可能影响到胚胎的质量[14-16]。在辅助生殖和超数排卵过程中,需要使用高浓度的pmsg和hcg,在血中二者的浓度高于正常值。在培养体系中添加高浓度的pmsg和hcg,调查其对早期胚胎发育的影响,研究发现胚胎暴露在高浓度的pmsg和hcg降低了胚胎体外发育到各阶段的比例,尤其是明显降低了囊胚的发生率,而hcg对胚胎体外发育的影响似乎更大。由于所调查的样本还较小,其具体情况和具体机制等尚需要深入研究,下一步将扩大试验次数并深入研究多种激素的联合作用对胚胎体外早期发育的影响。

4参考文献

[1] gardner d k,lane m.amino acids and ammonium regulate mouse ova from two-cel1 to blastocyst[j].biol reprod,1993,48(2):377-385.

[2] de castro m p,cortell c,moce e,et al.effect of recombinant gonadotropins on embryo quality in superovulated rabbit does and immune response after repeated treatments[j].theriogenology,2009,72(5):655-662.

[3] ashkar f a,semple e,schmidt c h,et al.thyroid hormone supp-lementation improves bovine embryo development in vitro[j].hum reprod,2009(17):339-344.

[4] abate a,nazzaro a,salerno a,et al.efficacy of recombinant versus human derived follicle stimulating hormone on the oocyte and embryo quality in ivf-icsi cycles:randomised,controlled,multi-centre trial[j].gynecol endocrinol,2009,25(8):479-484.

[5] krause b t,ohlinger r,haase a.lutropin alpha,recombinant human luteinizing hormone,for the stimulation of follicular development in profoundly lh-deficient hypogonadotropic hypogonadal women:a re-view[j].biologics,2009(3):337-347.

[6] melo m,busso c e,bellver j,et al.gnrh agonist versus recomb-inant hcg in an oocyte donation programme:a randomized,prospective,(下转第323页)

(上接第321页)

controlled,assessor-blind study[j].reprod biomed online,2009,19(4):486-492.

[7] guerif f,lemseffer m,couet m l,et al.serum antimüllerian hormone is not predictive of oocyte quality in vitro fertilization[j].ann endocrinol(paris),2009,70(4):230-234.

[8] 李逸平,左嘉客.哺乳动物早期胚胎发育组织的形成与突破[j].细胞生物学杂志,1992,14(2):135-138.

[9] pinyopummintr t,bavister b d.in vitro-matured/in vitro-fertil-ized bovine oocytes can development intomorulae/blastocysts in chemi-cally defined,protein—free culture media[j].biol reprod,1991,45(5):736-742.

[10] blumenfeld z,nahhas f.luteal dysfunction in ovulation induc-tion:the role of repetitive human chorionic gonadotropin supplem-entation during the luteal phase[j].fertil steril,1988,50(3):403-407.

[11] hahn d w,allen g,mcguire j l.a relationship between estrog-enicity and antifertility activity of 1-diphenylmethylenyl-2-methyl-3-ethyl-4-acetoxycyclohexane(orf 8511)and similar nonsteroidal anti-implantive agents[j].contraception,1974,9(4):393-401.

[12] 程渭玉,goh h h,陈觉生.人绒毛膜促性腺激素对早期胚胎发育的影响[j].天津医药,1992,20(1):37-40.

[13] martin-coello j,gonzalez r,crespo c,et al. superovulation and in vitro oocyte maturation in three species of mice(mus musculus,mus spretus and mus spicilegus)[j].theriogenology,2008,70(6):1004-1013.

[14] orvieto r,nahum r,rabinson j,et al.ultrashort flare gnrh agonist combined with flexible multidose gnrh antagonist for patients with repeated ivf failures and poor embryo quality[j].fertil steril,2009,91(4):1398-1400.

胚胎工程篇6

1978年，世界上首例试管婴儿诞生于英国，30年来，试管婴儿技术，使世界上无数不孕不育夫妇圆了生育梦，而作为试管婴儿重要技术之一的“胚胎冷冻”技术更是功不可没。

由于促排卵药物的应用，一次试管婴儿的治疗周期往往可以获得几个、十几个甚至几十枚胚胎，而一次胚胎移植，最多可以移植3枚胚胎进入子宫内，而剩余的优质胚胎则被建议冷冻保存。

自1983年，世界上首例“冻胚宝宝”诞生于澳洲，截止于2008年，世界上有大约50万个婴儿诞生于冷冻胚胎技术。

冷冻可以损伤生物体，而冷冻同时又可以保存生命。神奇的低温生物学在经过200多年的发展后，应运而生的胚胎冷冻技术愈来愈趋向完善，操作更简单。保存效果更优的“玻璃化冷冻技术”诞生后，已经被世界上越来越多的辅助生殖中心所采纳应用。

山东大学附属生殖医院作为中国最早开展“玻璃化冷冻胚胎及冷冻卵子技术”的中心之一，已经成功将这项前沿技术应用于临床，并取得了稳定、高效的保存成功率。

需要着重说明的是，只有“优质胚胎”才有冷冻价值，作为早期优质胚胎，应含有较少的细胞碎片，大小均等的卵裂球，而晚期的胚胎，则应有相对饱满的内细胞团和完整的滋养细胞层。达不到标准的胚胎，本身的发育能力有限，再经过冷冻保存融解的过程，其进一步发育的可能就更低了，医生常规是建议患者夫妇将这种胚胎放弃并销毁。

那么胚胎究竟可以冷冻保存多久呢？冻存的时间越久，存活率是不是越差呢？冻胚婴儿是不是比普通的试管婴儿及自然生育的婴儿的出生缺陷多呢？这些应该都是试管婴儿父母们比较关心的问题。

不论是何种冷冻技术，最终胚胎将被保存在液态氮中（-196℃）。在液氮中细胞酶的活力几乎完全受到抑制，也就是说细胞进程处于停滞状态，唯一的损害因素是来源于外界的物理辐射对遗传基因的破坏。而专家通过实验证明：使用相当于自然界2000年的辐射剂量对液氮中保存的小鼠胚胎进行照射，既不影响它们的生存力和活力，也没有导致畸胎率的升高。也就是说在理论上，在稳定的液氮环境及自然界辐射下，胚胎可以保存2000年以上！

2006年在西班牙诞生了液氮里被保存了13年的胚胎婴儿，这一记录在2010年被刷新，美国诞生了在液氮里被保存了13.5年的胚胎婴儿！因此，从实践意义上出发，胚胎可以在液氮里保存5到10年。

胚胎工程篇7

关键词：苜蓿；Mfhb－1基因；HD－Zip转录因子；体细胞胚胎；营养元素；电感耦合等离子体发射光谱技术

中图分类号：S541＋．1；Q786；Q813．7 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）06－1165-06

Effect of the Expression of Transcription Factor Gene Mfhb－1 on the Content of Nutrient Elements in the Somatic Embryogenesis in Medicago falcata

ZHOU Yan1，HE Nan－nan1，2，WEI Qi－chao1，ZHANG Sheng－li1，XUE Xiao－feng1，ZHAO Jun－jie1

（1． School of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China；

2． Hongqi Farm of the Sixth Agricultural Division， Xinjiang Production Crops， Changji 831702，Xinjiang， China）

Abstract： The gene named Mfhb－1 which was isolated during the induction of the early stages of somatic embryogenesis in Medicago falcata L． by subtractive cDNA cloning technology belonged to a kind of HD－Zip I transcription factor gene． Relevant studies had indicated that the Mfhb－1 gene closely associated to somatic embryogenesis in M． falcata． In this study， young leaf cell from sense and antisense transgenic plants with Mfhb－1 gene was inducted by 2，4－D to process the somatic embryogenesis， 10 kinds of nutrient elements were surveyed by inductively coupled plasma emission spectroscopy（ICP－AES） technology． The results showed that the expression of Mfhb－1 gene most likely promoted the increase of the content of Na elements while inhibited the content of Mg， Zn element during the somatic embryogenesis in M． falcata； Alternatively， the expression of Mfhb－1 had not showed an obvious impact on the change of the content of Cu， K， Fe and Mn， respectively． Further study would be required to illustrate the relationship between the expression of Mfhb－1 gene and the content of nutrient elements so that to take a step leading to reveal the insight of the detailed molecular mechanism of the Mfhb－1 gene．

Key words： Medicago falcata L．； Mfhb－1 gene； HD－Zip transcription factor； somatic embryo； nutrient element； inductively coupled plasma emission spectroscopy

苜蓿（Medicago falcata L．）是研究植物体细胞胚胎发生的典型模式植物之一，Mfhb－1基因是在苜蓿体细胞胚胎发生诱导早期，经扣除杂交得到的 同源异型域――亮氨酸拉链蛋白（Hemeodomain leuzine zipper，HD-Zip）Ⅰ类转录因子基因。为了研究该基因的生物学功能，在前期利用正义、反义转化技术将该基因导入到了苜蓿中，并已得到该基因过量表达和低量表达的转化植株［1，2］。

转录因子对各种功能基因的调控作用可能受到光照、植物激素、低温等逆境条件的影响。营养元素是植物体内一系列生理生化反应的关键辅助因子，因而在参与调控植物早期生长发育及其植物形态构建的过程中发挥着重要作用。前期研究结果显示，基因的表达可能与苜蓿体细胞胚胎发生过程密切相关［1］，但具体的分子机理尚不清楚。本研究利用电感耦合等离子体发射光谱（Inductively coupled plasma emission spectroscopy，ICP－AES）法检测Mfhb－1基因正义、反义转化植株体细胞胚胎发生过程中的10种营养元素含量，以探讨Mfhb－1的过量表达或低量表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素的吸收产生的影响，从而确定在苜蓿体细胞胚胎发生过程中该基因表达与营养元素含量变化的关系，进而为全面揭示Mfhb－1基因作用的分子机理提供相关的研究方法和理论依据。

1 材料与方法

1．1 植物材料

试验所用的苜蓿材料共有4 种，分别是47／1－5、D3、F4、C5；其中47／1－5为苜蓿未转化的材料，作为试验的对照；D3、F4和C5是以 47／1－5为起始材料经转化得到的转化体，D3为携带Mfhb－1基因编码区反向序列的反义转化植株；F4为携带Mfhb－1 基因编码区序列的正义转化植株；C5为携带全长 Mfhb－1基因，包括编码区以及该编码区上游的保守序列开放阅读框（upstream open reading frames，uORF）序列的正义转化植株。4 种苜蓿材料均在MS固体培养基、22 ℃、光照时间16 h／d的条件下进行试验材料的扩大培养。

参照Denchev等建立的的苜蓿直接体细胞胚胎发生体系［3］，取培养8～12 d的植株，剪下靠近顶端的叶片约 12片，在含有少许 B5O培养基的培养皿里切成小块，然后吸出液体，把切碎的叶片转入含有40 mL B5Ⅳ（2，4－D 4．0 mg／mL）培养基的100 mL三角瓶里，进行液体悬浮振荡培养，直接诱导其体细胞胚胎发生，诱导时间为18 d。然后转入B5／3 M培养基中，使前期叶肉细胞悬浮培养物继续发育，每 10 d 更换培养基一次，共发育培养30 d。培养条件为温度 22 ℃、光照时间16～18 h／d、转速为120 r／min。在苜蓿体细胞胚胎发生诱导培养的开始、第五天、第十天、第十五天、第十八天和发育培养的第十天、第二十天、第三十天分别取材，并称取1 g培养物，3次重复，经液氮速冻后放入超低温冰箱（－80 ℃）中保存，待用。

将材料从超低温冰箱中取出后放入烘箱中，105 ℃杀青3 h，80 ℃烘干至恒重，转移至瓷坩埚中，用马弗炉200 ℃ 炭化1 h、400 ℃灰化3 h，至灰化完全（无黑色颗粒）后取出冷却，加 3 mL HCl－HClO4（4∶1，体积比）混合液混匀，在电阻板上加热至完全溶解，定容至10 mL。

1．2 Mfhb－1基因结构

Mfhb－1基因正义与反义结构如图1所示，在图1中，Construct 2为携带Mfhb－1基因编码区上游的开放阅读框（uORF）序列；Construct 3为Mfhb－1基因反义编码区，D3 植株携带该片段；Construct 4为Mfhb－1基因正义编码区（CDS），F4植株携带该片段；Construct 5为Mfhb－1基因全长序列（开放阅读框＋编码区序列），C5植株携带该片段。

1．3 主要试剂与设备

HCl、HClO4、HNO3均为分析纯，由天津德恩化学试剂有限公司生产；试验用水均为超纯水，由德国SG公司Ultra Clear UV Plus超纯水机现制现用。

使用Optima 2100 DV电感耦合等离子体原子发射光谱仪（美国PerkinElmer公司），垂直观测，观察位置自动优化；双阵列背投式固态CCD检测器光学系统、RYTON材料雾化器、内置式三通道蠕动泵、40．68 MHz 自激式固态高频发生器、空气切割消除尾焰技术系统、Polyscience循环水冷却系统等均为实验室原已具备的仪器。

营养元素标准溶液储备液为Cu、Fe、Zn、Mn、Na、K、Ca、Mg、Se、Co 混合标准液，浓度均为1 000 μg／mL（德国默克公司）。将标准储备液用体积分数为2％ 的 HNO3逐级稀释，Cu、Fe、Zn、Mn、Na、K、Ca、Mg、Se、Co等混合标准液按0．00、0．50、1．00、2．00、4．00、8．00 μg／mL梯度进行配制。

1．4 ICP－AES工作参数

用ICP－AES检测样品溶解液中Cu、Fe、Zn、Mn、Na、K、Ca、Mg、Se、Co的离子浓度，ICP－AES仪器工作参数分别是工作功率1．3 kW、辅助气体流量0．2 L／min、冷却气体流量15．0 L／min、载气0．8 L／min、进样泵流量1．5 L／min，

2 结果与分析

2．1 分析波长的选择及背景的校正

ICP－AES法对每种营养元素的测定都可以同时选择多条特征谱线，且具有同步背景校正功能。因此，试验过程中对每种检测营养元素同时选取2～3条谱线进行测定，综合分析强度、干扰情况及稳定性，选择谱线干扰少、精密度高的分析线。各营养元素的分析波长选择结果分别是Cu 324．75 nm、Fe 259．93 nm、Zn 213．85 nm、Mn 257．61 nm、Na 589．59 nm、K 766．49 nm、Ca 317．93 nm、Mg 279．07 nm、Se 196．02 nm、Co 228．85 nm。

2．2 回归方程和相关系数

按选择的工作条件检测各营养元素在配制好的系列梯度浓度的标准品混合溶液下的峰面积，用峰面积（y）对标准液浓度（x，μg／mL）绘制标准工作曲线。各营养元素的线性方程和相关系数见表1。

2．3 样品测定结果

经ICP－AES检测，4种苜蓿材料中Co元素和Se元素含量的测定结果为负值，低于系统检出限；其他8种营养元素的测定结果见图2，其中图2A为Ca元素的含量动态变化，图2B为Mg元素的含量动态变化，图2C为Na元素的含量动态变化，图2D为Zn元素的含量动态变化，图2E为Cu元素的含量动态变化，图2F为K元素的含量动态变化，图2G为Fe元素的含量动态变化，图2H为Mn元素的含量动态变化。

由4种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中各营养元素含量动态变化可以看出，Ca元素在4种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中均表现出先下降后上升再下降并保持平稳的变化趋势，在诱导培养阶段的第五天，4种苜蓿材料的Ca元素含量由高到低表现为F4、47／1－5、C5、D3；在诱导培养后期（18 d），C5和F4的Ca元素含量上升，D3和47／1－5的Ca元素含量保持平稳的态势。

Mg元素含量在4种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的动态变化较为复杂。在体胚诱导培养阶段内，除47／1－5表现出先下降后上升的趋势外，D3、F4和C5均表现出先上升后下降的变化，而D3的峰值在诱导培养阶段的第十天出现，早于C5的第十五天，也早于F4的发育培养阶段第十天。Mg元素含量在发育培养阶段的初期（发育培养10 d）还有一个高峰出现，此时4种苜蓿材料的Mg元素含量由高到低分别为F4、C5、47／1－5、D3。

Na元素含量在4种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化波动较为复杂，F4和47／1－5大致表现为在诱导培养阶段的第五天有一个高峰，然后下降，最后在发育培养阶段的末期有一个小幅上升；C5的Na元素含量在诱导培养阶段峰值出现前有一个下降的过程，诱导培养的第五天开始迅速上升，诱导培养的第十天达峰值后开始下降，在发育培养阶段表现出与F4和47／1－5类似的变化趋势；D3的Na元素含量在诱导培养阶段一直增加，在发育培养阶段开始后才表现出下降趋势。

Zn元素含量在4种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化十分明显，除了D3的峰值出现在诱导培养阶段的第十天外，其他3种材料的峰值均出现在诱导培养阶段的第十五天，4种材料在诱导培养阶段的Zn元素含量峰值由高到低分别为D3、C5、47／1－5、F4。而在发育培养阶段开始后，4种苜蓿材料的Zn元素含量基本上一直处于很低的水平，并且保持平稳。

Cu元素含量在4种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化跌宕起伏，F4、C5、47／1－5、D3都表现为在诱导培养阶段先下降后上升再下降的变化趋势；进入发育培养阶段后，都是先上升后下降；以47／1－5材料的Cu元素含量最高，峰值出现在诱导培养阶段的第十五天；其次是C5材料，Cu元素含量峰值出现在诱导培养阶段的第十天；第三是D3材料，Cu元素含量峰值出现在发育培养阶段的第十天；而F4材料的Cu元素含量峰值出现在诱导培养阶段的第十五天。到发育培养阶段结束前10 d（发育培养20 d），4种材料的Cu元素含量都处在最低值，并且一直维持到发育培养阶段结束。

K元素含量在4种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中基本上处于下降的趋势，4种材料的K元素含量峰值大都没有超过诱导培养阶段的起始水平；到发育培养阶段结束时（发育培养30 d），4种苜蓿材料的K元素含量由高到低分别为47／1－5、F4、C5、D3。

Fe元素含量在苜蓿4种材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化起伏很大，在发育培养阶段结束前10 d（发育培养20 d），与Cu元素含量的变化趋势基本一致，4种材料的Fe元素含量大都处在最低值；但在发育培养20 d后，4种材料的Fe元素含量出现了戏剧性的变化，其含量水平大幅上升，最后都超过了前面水平，达到了峰值，此时4种苜蓿材料的Fe元素含量由高到低分别为C5、47／1－5、D3、F4。

Mn元素含量在4种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化趋势和Zn元素正好相反，其在诱导培养阶段基本上都处在较平稳的状态，而一进入发育培养阶段，4种材料的Mn元素含量立即大幅度上升，峰值出现在发育培养阶段的第十天，而后迅速下降，到发育培养阶段结束时，又恢复到诱导培养阶段的水平。4种材料的Mn元素含量达峰值时由高到低的排序为F4、D3、47／1－5、C5。

3 讨论

3．1 Mfhb－1基因的表达对苜蓿体细胞胚胎发生发育的影响

苜蓿4种材料体细胞胚胎发生发育的显微观察［4，5］显示，在诱导培养阶段的第十天，F4和47／1－5的表面会形成一些突起结构；在第十五天时，D3和C5表面才出现微小的突起结构。在发育培养阶段，D3和C5的表面白色组织增多，且培养液浑浊不清，在发育培养的第三十天时，观察到F4培养物中出现一些小的子叶胚，而其他3种材料多是鱼雷胚。在发育培养的第二十八天时，统计4种材料的体细胞胚胎数目，由高到低依次为F4、47／1－5、C5、D3。上述结果表明，Mfhb－1基因编码区的表达可能促进了苜蓿体细胞胚胎胚性细胞的诱导，从而促进了苜蓿体细胞胚胎的发生，而uORF的表达可能对该基因的表达有一定的抑制作用。

3．2 Mfhb－1基因的表达对苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中营养元素含量的影响

Mfhb－1基因的表达可能促进了苜蓿对Ca元素的吸收。由图2A可以看出，在苜蓿体细胞胚胎发生发育进行诱导培养的第五天，4种材料的Ca元素含量由高到低依次为F4、47／1－5、C5、D3，这与苜蓿体细胞胚胎发生发育情况和最后（发育培养的第二十八天［4，5］）体细胞胚胎数量所观察到的排序结果相吻合。在诱导培养后期，F4和C5的Ca元素含量上升，D3和47／1－5的Ca元素含量保持平衡，说明Ca元素对胚性细胞的形成可能有一定的促进作用，由此可推测Mfhb－1基因的表达可能促进了苜蓿体细胞胚胎诱导后期阶段对Ca元素的吸收。

Mfhb－1基因的表达可能促进了苜蓿对Mg元素的吸收。图2B表明，Mg元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中的变化较为复杂。除47／1－5表现出先下降后上升的趋势外，D3、F4和C5均表现出先上升后下降的趋势，而D3的峰值在诱导培养阶段的第十天出现，早于C5的第十五天，也早于F4的发育培养阶段第十天。在发育培养的初期，4种材料的Mg元素含量由高到低表现为F4、C5、47／1－5、D3，并且与最后所观察到的体细胞胚胎数目排序情况类似［4］；由此可推测Mfhb－1 基因的表达可能促进了苜蓿对Mg元素的吸收。

Mfhb－1基因的表达可能促进了苜蓿对Na元素的吸收。图2C揭示，Na元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中变化波动较为复杂，在诱导培养阶段的第五天，除了C5的Na元素含量呈下降趋势外，其他3种材料的Na元素含量均呈上升趋势，其中F4上升的最迅速；该现象可能是由于uORF的表达而导致C5的Na元素含量峰值较F4与47／1－5 滞后。结合体细胞胚胎发生发育观察结果［4］，可以推测Mfhb－1基因的过量表达可能在苜蓿体细胞胚胎发生诱导的初期，就促进了苜蓿对Na元素的吸收。

Mfhb－1基因的表达可能抑制了苜蓿对Zn元素的吸收。由图2D可以观察到，Zn元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中的变化十分明显，除了D3的峰值出现在诱导培养阶段的第十天外，其他3种材料的峰值均出现在诱导培养阶段的第十五天，且4种材料在诱导培养阶段Zn元素含量峰值由高到低表现为D3、C5、47／1－5、F4，与最后的体细胞胚胎数目统计结果呈反比关系。由此表明，高含量的Zn元素可能不利于苜蓿胚性细胞的分化，由此可推测Mfhb－1基因的表达在苜蓿体细胞胚胎发育培养阶段初期就可能抑制了对Zn元素的吸收。

在47／1－5、D3、F4和C5这4种材料中，Cu元素、K元素、Fe元素、Mn元素含量在苜蓿体细胞胚胎诱导和发育过程中的变化大体趋于一致，表明 Mfhb－1基因的过量或低量表达，对Cu、K、Fe、Mn元素的含量变化影响不明显。

3．3 主要营养元素对体细胞胚胎发生发育的影响

目前对营养元素在体细胞胚胎发生发育中的具体生物学功能的研究较少，主要集中在与体细胞胚胎发育模式相似的合子胚上。如许淑苹［6］在研究杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook］合子胚的发育时发现，Cu元素的含量在合子胚发育进程中呈小幅上升变化；P元素含量总体上呈较大幅度上升；K、Mn、Ca元素含量呈先下降后上升的变化；Mg元素含量在体胚发育的后期呈持续上升趋势，而后达到最高值；Co和Ni元素含量较低，Co元素的含量不超过 1 μg／g，Ni元素的含量不超过3 μg／g。甄艳等［7］在研究湿地松（Pinus elliottii Engelmann）×加勒比松（P. caribaea Morelet）的杂种合子胚发育过程中，发现Mn、Ni、B、Na、Al和K元素在胚胎发育早期的合子胚中含量最高；P、Mg和Fe元素呈相似的变化趋势，在发育开始后先小幅下降而后随胚发育逐渐上升；Ca元素在合子胚发育早期的含量较高，随后下降，而后大幅度上升，在合子胚发育后期达到最大值。本研究发现，对照材料47／1－5的体胚发育培养10 d后，K、Na元素含量随着胚胎的发育不断升高；Zn元素含量总体变化不大；Ca、Cu、Fe元素含量峰值均出现在体细胞胚胎诱导或发育的中间阶段，Mg元素含量峰值出现在体胚诱导末期；Mn元素含量峰值出现在体胚发育初期。

已有研究发现，高浓度的钠离子可以使蛋白变性，也可以影响细胞质中蛋白质的功能［8］。液泡缺少钠离子将会削弱酶的功能，也会限制生长发育。拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）atrab28基因在胚胎形成后期表达，它编码的核内靶蛋白可以增加胚胎形成后期的阳离子容量，当该蛋白在拟南芥中过量表达时还可以促进拟南芥萌芽的发生［8］。钙离子对于调节植物渗透压扮演着重要的角色，不同的植物细胞对钙离子存在不同的响应，一般情况下，钙离子在细胞信号传导过程中起到中心作用［9］，如在组织培养中，钙离子的浓度变化体系中含有大量胚胎表达的钙离子依赖蛋白激酶［10］。铁是植物生长发育所必需的元素，主要作为结构螯合物或金属蛋白存在于植物组织中，常参与氧化还原反应，然而铁的不溶性限制了它的吸收；通过细胞质膜三磷酸腺苷酶的细胞外酸化，可以帮助将铁泵进细胞内，铁被膜还原酶还原成二价铁离子，然后转运进细胞内［11］。黄立皓［12］研究发现，Cu、Fe和Mg离子含量的增加可以提高愈伤组织中细胞的渗透势，促进细胞中遗传物质的形成，从而提高愈伤组织分化率。Priyanka等［13］在研究卵叶车前（Plantago ovata Forssk）体胚与非胚性愈伤组织中营养元素含量时发现，高含量的K、Ca、Fe、Cu和Zn是体胚形成的关键因素。本研究发现，在对照材料47／1－5体细胞胚胎的发育过程中（转入发育培养基10 d之后），体细胞胚胎发育培养物中的K、Na元素含量不断上升，表明K、Na元素在苜蓿体胚的发育成熟过程中可能起重要的作用。

综上所述，Mfhb－1基因的表达与苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中多种营养元素含量的变化有着密切的关系。该基因的表达可能在体细胞胚胎发生发育过程的不同阶段，通过促进植物体细胞胚胎诱导材料对营养元素的吸收（如在体细胞胚胎诱导前期促进Na元素的吸收），同时抑制对另一些营养元素的吸收（如在体细胞胚胎诱导前期对Mg、Zn元素的吸收），或者通过影响这些营养元素含量的变化趋势或模式，从而参与调节体细胞胚胎发生进程中各类基因群的表达，以及一系列相应的生理生化反应，进而达到调控苜蓿体细胞胚胎发生发育过程的作用。但营养元素含量与Mfhb－1基因表达在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中的相互关系，以及详细的分子作用机理还有待进一步探讨。

参考文献：

［1］ YAN Z． The genetic control of embryogenic competence in alfalfa （Medicago falcata L．） ［D］． U K， Leicester：De Montfort University，2004．

［2］ YAN Z， MARK R． F， JENNY R， et al． Molecular identification of the regulation of the HD－Zip gene expressed during the induction stage of direct somatic embryogenesis in alfalfa ［A］． Seventh International Congress of Plant Molecular Biology Society Proceedings［C］． Spain：Barcelona， 2003．

［3］ DENCHEV P D， ALEXANDER I K， ATANAS I A， et al． Alfalfa embryo production in airlift vessels via direct somatic embryogenesis ［J］． Plant Cell， Tissue and Organ Culture，1994，38： 19－23．

［4］ 王文洁，魏琦超，周 岩． 苜蓿转录因子基因Mfhb－1的生物学功能初探［J］． 河南农业科学，2008（11）：50－54

［5］ 王文洁． 苜蓿HD－Zip 转录因子Mfhb－1基因的表达及生物学功能研究［D］． 河南新乡：河南科技学院，2008．

［6］ 许淑苹． 杉木合子胚和雌配子体蛋白质与金属元素分析［D］． 南京：南京林业大学，2009．

［7］ 甄 艳，于 敏，边黎明，等． 湿地松×加勒比松的杂种合子胚和雌配子体组织不同发育时期的金属元素分析［J］．分子植物育种，2008，6（6）：1117－1122．

［8］ BORRELL A， CUTANDA M C， LUMBRERAS V， et al． Arabidopsis thaliana Atrab28： A nuclear targeted protein related to germination and toxic cation tolerance［J］． Plant Mol Biol， 2002， 50：249－259．

［9］ SANDERS D， PELLOUX J， BROWNLEE C F， et al． Calcium at the crossroads of signaling ［J］． Plant Cell Rep，2002，14：401－417．

［10］ VEENA S A， HARMON A C， RAO K S． Spatio－temporal accumulation and activity of calcium－dependant protein kinases during embryogenesis，seed development， and germination in Sandal wood［J］． Plant Physiol，2000，122：1035－1043．

［11］ GUERINOT M L． The Zip family of metal transporters［J］． Biochim Biophys Acta， 2000，14（65）：190－198．

胚胎工程篇8

外源性基因导入受体动物有不同的方法，同时，由于有不同的受体动物，因此要根据实际情况采用不同的方法对动物进行转基因。大致而言，动物转基因的方法有：逆转录病毒法、显微注射法、胚胎干细胞介导法、载体法和体细胞核移植法（体细胞克隆介导法）等。

通过逆转录病毒转移基因

研究人员早就发现，逆转录病毒常常能侵入宿主细胞并整合于细胞中的DNA，因此逆转录病毒被用来当成载体以进行外源性基因的转移。一般做法是，把外源性基因插入到逆转录病毒，再由逆转录病毒感染受体动物的胚胎。此后将感染的桑椹期胚胎导入动物子宫，就可发育成携带外源性基因的子代动物。

具体的原理是，逆转录病毒的核酸在逆转录酶作用下会反转录为双链DNA，然后整合到受体细胞核基因组中。由于逆转录病毒DNA的长末端重复序列（LTR）区域具有转录启动子活性，如果把外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，加入到动物早期胚胎的培养液中，或与胚胎共同培养，或注入囊胚腔中，携带外源性基因的逆转录病毒DNA就可以整合到宿主染色体上，达到外源性基因转移到受体动物胚胎的目的。

2001年，美国哥伦比亚大学的帕克等人利用逆转录病毒将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转入猪的成纤维细胞和耳上皮细胞，然后用这些细胞的细胞核进行核移植，获得了能发出绿色荧光的转基因猪。与此同时，其他研究人员利用这种方法培育出转基因猴。

但是，逆转录病毒作为载体具有潜在的致癌性，而且载体的构建较为复杂，容纳外源性基因的大小也有限，因此这项技术的应用受到一定限制。

显微注射法转移基因

动物转基因的显微注射法又称受精卵原核显微注射法，是用直径约0.5～1微米的玻璃微管吸入外源性基因，直接插入到受体动物的受精卵的细胞内，将外源性基因注入细胞中，然后通过受体动物基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等，使外源性基因嵌入受体动物的染色体内，最后这样的胚胎移植到代孕母体子宫内并发育成子代个体。

1980年美国的戈登等人首先用显微注射法创造了转基因小鼠。他们把小鼠的受精卵取出来，在显微镜下将胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的细胞中，然后将受精卵输入代孕母鼠的子宫内，最终发育成转基因小鼠。此后研究人员相继把人的珠蛋白基因和胰岛素基因转入小鼠体内。

显微注射法的优点是，动物的任何外源性基因都可转入受体动物体内，而且用这种方法已经获得转基因小鼠、鱼、大鼠、兔子以及转基因牛、羊、猪等。但是，这种方法转移外源性基因到受体动物的染色体时是随机整合的，因而难以控制其整合率。另外对外源性基因能否稳定整合于受体基因组的检测必须等到子代个体出生后才能进行和确认，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。

胚胎干细胞介导法

胚胎干细胞（ES）是从哺乳动物囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育的多能性，能够分化出各种组织。20世纪80年代中期研究人员就开始利用胚胎干细胞进行动物转基因。方法是，将外源性基因直接导入胚胎干细胞，经体外培养筛选后再注入到受体胚胎，与其中的胚胎细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。

此后，这种胚胎可发育成嵌合体的转基因动物，这种动物体内有一部分组织来源于整合有外源性基因的供体胚胎干细胞。在嵌合过程中，从胚胎干细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将转入的外源性基因传递到子代。

研究证明，胚胎干细胞介导法可使受体动物细胞中外源性基因整合率达50%，其中生殖细胞中外源性基因整合率可达30%。但是，建立胚胎干细胞系比较困难，现在只建立了小动物的胚胎干细胞系，猪、羊、牛等大型动物的胚胎干细胞系尚未建立。

载体法

早在1971年，研究人员就发现，外源性基因可以进入动物。后来，研究人员将反复冷冻或经化学物质处理后与外源性基因共同孵育，使外源性基因与结合，通过人工授精获得转基因个体。

1989年，意大利研究人员拉维特拉诺将小鼠附睾与线粒体或环状pSV2CAT质粒一起在37℃下孵育30分钟，再用这种对成熟卵子进行体外授精，这样得到胚胎移植入受体鼠的子宫孕育，通过受体鼠孕育产出250只小鼠，以CAT基因为标记进行检测，发现有30%的小鼠成为转基因鼠。

目前研究人员通过载体法已获得了12种转基因动物，如转基因牛、猪、家兔和小鼠等。但是，这种方法进行动物转基因的成功率不高，效果也不稳定，还有待进一步研究和发展。其中，必须弄清楚和外源性基因结合的分子机制，外源性基因在和受精卵内的复制机理，以及促进结合外源性基因的方法和途径。

体细胞核移植法

体细胞核移植法又称体细胞克隆介导法，原理是，将外源性基因导入动物体细胞染色体中，然后通过显微操作技术将转入了外源性基因的细胞核移植到去核的卵母细胞中构成一个重建卵子，然后用人工方法让这个卵子发育，形成胚胎，再把胚胎移植到受体动物中，经妊娠、分娩后获得转基因克隆动物。

利用体细胞核移植法是目前动物转基因中的高级技术，1997年世界上第一个转基因绵羊（克隆羊）多利就是用这种方法产生的，是英国PPL公司与罗斯林研究所率先应用体细胞核移植法获得的成果。

多利诞生的过程和原理可以详细解释体细胞核移植法进行的动物转基因。

研究人员先从一只6岁的芬兰多塞特雌性白面绵羊（简称A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，这个细胞称为供体细胞。此后，研究人员从一头苏格兰黑面雌性绵羊（简称B）的卵巢中取出未受精的卵子，并将细胞核去除，使这个卵子成为一个无细胞核的卵细胞，也称为受体细胞。

然后，研究人员利用电脉冲方法让供体细胞和受体细胞融合，在这个过程中A细胞的细胞核融入B细胞中并像受精卵一样产生细胞分裂、分化，从而形成胚胎。最后将这个胚胎移植到另一只苏格兰黑面雌性绵羊（简称C）的子宫内，胚胎正常发育，足月孕育后绵羊C娩出小绵羊多利。

胚胎工程篇9

关键词 繁殖技术 生物分子 移植 无性繁殖 进展

家畜繁殖技术是生物技术的重要分支。传统的生物技术革新换代是从20世纪70年代初期开始的。

一、家畜的人工授精

人工授精是家畜繁殖应用最为广泛的一项技术。在此项技术中，的保存，是整个家畜的人工授精过程的前提，也是关键一步。

1948年发现，在保存液中添加甘油能使在冷冻和解冻后仍保持受精力，这个发现使的保存进入一个新的阶段。的保存目前大多以细管冷冻为主。

用于冻精的保存液力求配方简化。有人认为牛的冷冻用脱脂奶稀释保存既经济又效果好。1976年保加利亚试验结果证明脱脂奶和乳糖混用效果更好。在稀释液添加剂中除常用的甘油外，最近日木从大蒜中提取一种维生素B的衍生物TPD （Thiamin Propyl Disulfide，内二硫化硫胺，新维生素B1），据称对保存有良好作用。在冻洁稀释液中加入Tris（ 三轻基甲基氨甲烷）己广为应用。此外，二甲基亚枫（DMS0），乙二胺甲乙酸（EDTA），聚乙烯吡（咯烷）酮（P.V.P），乙烯二醇等也被采用。英国试用0.025 %低浓度甲醛加入稀释液中，发现对的脂膜在冷冻时能起到保护作用。

家畜冻干的研究近年来取得了进展，美国E.V.拉尔森等人将牛冻成颗粒，抽干至含水量25%，在25度常温下保存约一个月，然后授精，受胎率达34%。如果冻干在技术上全面突破，将给家畜人工授精技术，再一次带来革命。但是，目前在测定各公畜耐冻性的问题还没完全解决，这将会影响冷冻方法的改善。冷冻保存期是很长的，依据理论可以无限期保存。

二、控制

动物的控制首先在于周期的调节（同期），其次就是对排卵的排制。排卵技术的成熟与否直接影响到家畜繁殖技术的发展。

Smith和Engle （1927）首先发现丁超排现象。Cole和Hart（1930）发现孕马血洁可使末成熟的大鼠超排，以此奠定了超排的基础。孕马血清促性腺激素（PMSG）与另两种垂体促性腺激素促卵胞（FSH）和促黄体素（LH）具有相似的生物活性这些使家畜超排的促性腺激素制剂引起人们的重视，但却存在着以下3个问题：①制备中效价不精确。日前，家畜用FSH制剂的生物活性还没有统一的标准；②激素制剂的生物半衰期不一致性。PMSG半衰期长，通常牛卵巢上有大量卵泡产生，但大多数不排卵；FSH半衰期短，卵泡产生的数量不多，但可利用的卵泡多。比如循环系统中PMSG的半衰期，在小鼠体内是6h，大鼠是24h。③FSH和LH之间的比率影响超排。Murphy等（1989）比较了几种商业制品中FSH与LH的比例，发现其中存在着批次之问的差异而引起超排效果的不同。Arm-strong等（1984）在使用LH/FSH制剂量最低，对绵羊进行超排处理，结果超排率和胚胎产量高。Chupin等（1985）对不同品种的牛试验的结果表明：不同LH /FSH的比例超排反应不同，发现夏洛来与荷斯坦牛在使用LH/FSH比例高的FSH制剂，尤其是在不含LH时，均产生高效的超排效果。追其原因可能是牛体内的LH水平足以提供与外源FSH协同作用所需的供诱导超排LH量。

三、家畜体外授精方面

体外授精的技术内容包括：卵母细胞的体外成熟；体外获能等。目前，体外受精技术在日本得到很大的发展。

1985年日本首次从屠宰后母牛的卵巢取出卵子并进行体外授精，从而成功地生产出一头小牛。从此以后，人们迫切期待体外授精技术能作为一种低成本的技术来生产和牛胚胎。1993年，日本政府制定相关法令，要求私营组织或公司带头把提供体外授精胚胎作为经商的基础。随着近年来技术的进步，受胎率逐渐上升。体外授精胚胎的生产率得到提高，在一个卵巢生产三到四个胚胎已成为可能。根据母牛胭体的等级来确定从中分离卵细胞是复杂而麻烦的，由于血统不清楚，采用这种方法生产出的日本肉牛的价格并不高。所以，将来根据养牛主的意愿生产出的体外受精胚胎牛的销售及其育肥将会增加。

与此同时，利用超声波介导来吸引卵泡和卵细胞，从而生产体外受精胚胎技术近来得到发展，采用这一技术可以利用对超数排卵处理不起作用的供体来生产体外受精胚胎。所以，这一技术有希望用于使有繁殖障碍的高品质母牛或由于年龄的原因对超数排卵处理不起作用的母牛来生产胚胎。

四、胚胎的移植及胚胎低温保存

世界上第一例非外科手术移植牛是在日本国家动物工程研究所诞生的，从那时起，这种技术就得到广泛应用。

（一）胚胎的移植

兔、羊、猪、牛、马等家畜的受精卵移植已陆续获得成功。用非手术法移卵有两种方法：①用移卵器通过子宫颈直接插到子宫角；②用阴道穿刺法。整个手术仅5～10min。一般来说，手术成功率要高于用非手术法移卵的成功率。

（二）胚胎冷冻保存

胚胎冷冻保存技术山初始的缓慢冷冻发展到快速冷冻、一步冷冻、直接移植冷冻、及玻璃化冷冻。M.Kasai （1994）报道玻璃化冷冻用乙二醇，水溶性聚蔗糖，蔗糖的混合液代替以二甲基亚砜等玻璃液能较大程度减少溶液的溶性。C.Vajta等（1995）报道，体外受精发育成的半囊胚玻璃化冷冻后，采用细管内直接脱除冷冻剂的效果好。对于牛和兔来说，胚胎的低温保存己属常规技术。对于猪来说，H.Nagashima等人（1994）报道，因猪胚不耐冻，所以对猪胚进行脱脂，以降低胚胎温度敏感性。

五、无性繁殖（克隆）

动物克隆即细胞核的移植Spreeman（1983）定义胚胎细胞核移植技术是指将一个多细胞胚胎的卵裂球或细胞核，通过显微手术和细胞融合的方法，移植到一个去核的卵母细胞或去核的受精卵中，构成新胚胎（克隆胚胎），然后移植给受体，获得与核供体胚胎基因型相同的后代（克隆动物）的生物技术。采用细胞核移植的方法把受精卵的基因全部置换，是基因工程在家畜品种改良中发展起来的一个重要途径。直到1952年，Briggs和King首次获得两栖类美洲豹蛙的胚胎核移植后代，而Wilmut等（1997）获得了成年绵羊乳腺上皮细胞核的克隆后代这一突破性成果，翻开了动物克隆新一页，为动物完整复制打下了基础。

胚胎工程篇10

与物理领域中发生的科技革命相比，生物革命呈现出了全新的、无法预测后果、不可回复的特点，这是因为这两种科技革命产生的后果完全不同，后者仅仅附着于其所作用的客体之上，而前者则会通过其自身向外扩散。[29] 对于科技革命，它仅涉及到无生命的物质自身的变化，而生物革命则可能会通过生物体的延续与扩展造成无法预测与无法控制的影响。例如，如果人类破坏了生物遗传因子，就可能会使数百万年的进化过程受到阻碍，并且会破坏数百万年以来的生物世界的平衡状态。因此在这个角度上，对基因工程所引起的冲击以及回应最大的社会学科，应属生命伦理学，而非法学。这是因为伦理研究确立的是行为界限的问题。而法学解决的是行为控制的最低限度问题。但虽然如此，由于科技发展的脚步在当代社会的日新月异，物权法中也开始沾染上了基因革命的气息，例如受精卵以及胚胎等法律地位问题，具体表现为以下几个方面：

（1）受精卵、胚胎的法律地位

无庸置疑，现代人工生殖技术已经极大地改变了人们传统的生殖方式，在医学实践中应用颇广，由此产生的法律问题也十分耐人思索。欧美国家中注重胚胎伦理的科学家认为，胚胎在受精14天具有神经系统出现的初期迹象时，可视为人。英国的法律也规定人命始于怀孕14天后受精卵着床之日时起，英国瓦诺克委员会、我国台湾地区“人工生殖技术伦理指导纲领”以及“人工协助生殖技术管理办法”也都禁止使用受精超过14天的胚胎。由此可以断定，在医学上，14天以前的人类胚胎还不算是一条人命，因而并不能获得这种延伸而来的特殊地位。但是否可以将这些特殊的生物体归类为客体的范畴？不孕夫妇是否可以将其通过人工生殖所形成的胚胎转让给他人，如果可以的话，这一转让是属于合同法上的赠与关系还是身份法上的收养关系？这个问题涉及到受精卵的民事法律地位，非常耐人寻味，在理论上也存在多种认识，下文择几种典型观点予以介绍：

第一，人格说。此说认为“人的生命从受精的一刻开始”，因此从这一刻起胚胎就具有人权，从而应认为其具备人的条件，从而应受法律的保护。该观点为美国的一些反对人工妊娠的团体以及英国天主教主教团等团体所支持。如美国路易斯安那州1986年修正法第121条规定，所谓人类胚胎，是指受法律保护的体外受精卵，由一个或一个以上活的人体细胞与基因物质组成，并得于子宫内发育成为胎儿。第126条规定，体外受精卵为生物体上的人（biological human being），既非受理手术的医疗机构也非精卵提供者的财产。如果体外受精的病人出示其身份，依照该州民法典的规定，其父母的身份将被保留，无法证明其身份者，医疗机构为胚胎的暂时监护人，直到胚胎植入子宫时为止，该机构应对胚胎尽善良管理人的注意义务。依上述规定，可以认为胚胎在该州具有法律上的人格（juridicaial personhood）。日本学者北川善太郎也认为，将冷冻受精卵视为物并不妥当，应当将生物体作为新的权利主体在法律上进行确认，使之在性质上区别于物。[30]

第二，物说。此说认为试管中成孕之物，不过是“输卵管或子宫中的物质而已”。美国不孕协会也主张，虽然早期胚胎较人类的细胞组织更值得加以尊重，但不得视之为人（actual person）。因为胚胎固然有成为真正的人的潜力，但在没有发育成为具有人类特征的独立个体之前，仍只能视为具有生物学上之物。

第三，介于人物之间的权利主体或客体的中间说。这种观点认为，德国民法典关于动物不是物的规定开启了一个介于人与物之间的中间概念，胚胎或受精卵可以纳入此类概念之中。美国高等法院在Davis诉Davis一案中，就采用了美国生育协会伦理委员会（Ethics Committee of the American Fertility Society）所持的中间说，认为胚胎具有特殊的地位，此地位居于人与财产之间。

第四，潜在的人格说。此种观点为法国生命和健康科学伦理咨询委员会所支持，认为胚胎自受精时起就存在潜在的人格。

第五，道德主体说。这种观点认为，胚胎不是物，也不是社会的人，但为生物的人，具有发展为社会的人的潜力，因此，应当具有比一般生命物质更高的道德地位，因此应受法律保护。1981年欧洲理事会各委员会均认为即使胚胎不具有法律主体地位，也应给予法律保护。[31]

我们认为，不宜将胚胎或受精卵视为法律上的主体，理由如下：

首先，胚胎不具有生命权。上述无论是人格说，还是道德主体说、中间说等，都是出于对胚胎生命权考虑的结果，生命权是一切权利的根本，依照现代各国法律的规定，生命权的保障范围及于自然人和胎儿，那么其他的生命形式的生命权应否受到保护？对此各国的做法有相当分歧。其中，德国法采纳了肯定说。为了维护德国基本法规定的人类尊严与生命权，该国于1991年1月1日施行的胚胎保护法将胚胎作为生命权保护的对象。因此可以说，德国宪法保护的生命权的对象除了作为个体的人以外，还包括未出生的生命（胎儿）以及体外制造的生物体（胚胎或受精卵）。而将胚胎视为物的国家，则显然不可能认为胚胎具有生命权。我们认为这一问题已经超越了法律的界限，与人权观念、伦理观念甚至人口政策都有密切的关系，结合我国的实际，胚胎显然不具有生命权。

其次，受精卵不同于胎儿，不能比照适用民法关于胎儿的有关规定。对此，即使是肯定受精卵具有人格的美国路易斯安那州修正民法典，也持相同意见。该法第133条规定，受精卵虽具有法律上的人格，但在植入母体子宫之前，无法得到法律应有之保护，因而不得主张继承权。现代各国民法虽不将胎儿视同自然人，但一般都肯定其具有继承能力，就继承方面视其为已出生。这是因为，胎儿属于在人出生之前、孕育在母体之中的阶段，为了维护其出生后的特殊利益，法律赋予其一定的主体资格，享有一定的权利能力，因此可以视为是对人格的延伸规定，[32]与此相反的当属美国等国家的做法，他们认为，精子、卵子、胚胎有其相对的价格，也具有财产上的价值，因此可以将之视为财产权的客体，日本有学者也认为，受精卵应当属于日本民法第85条所称的物，但还具有一定的特殊性，即对其进行任何处分时须尊重精子、卵子提供者及受提供者的意思。[33]

再次，随着胚胎冷冻技术的不断提高，使得将胚胎与受精卵视为主体的做法不能自圆其说。冷冻受精卵可以保留生物特有的结构与信息，而且在相同温度下，凭借现代科学可以将生物体的这些特性保存数百年甚至更长时间。一个不难想象的后果是，可能在人们去世几十年甚至上百年之后，其子女的冷冻胚胎因为具有人格性不能销毁而不得已出生，这无疑会使人类繁殖的自然性受到冲击，人伦关系与血统辈分都会因此受到影响，而因此产生的后果将在东方国家表现得尤为明显。此外，由于医疗资源的有限性，在物质条件上也不允许胚胎以及受精卵无限期地保存。为此，各个国家或地区多对胚胎冷冻的期限作出限制，如英国瓦诺克委员会建议保存10年，超过10年者，其使用或处置权应移转至受许可的保存机构；我国台湾地区“人工协助生殖技术管理办法”第15条第1项也规定，医疗机构施行人工生殖技术，于活产后，不得再使用该人工生殖过程中所用之精子、卵子以及胚胎，并应于2个月内予以销毁。除此之外，各国对受精卵的保存期限多规定为2年或5年。而保存期限届满之后也并不全部都要求将其销毁，也可以用作实验研究，以达物尽其用[34].所有这些做法，都动摇了使受精卵或胚胎成为主体的基础，即其所谓“生命权”或“生存权”并不可能得到起码的保障。

胚胎、精子、卵子均为人类的出产物，不能将其认定为法律主体，同样也不能认为其具有财产上的价值，禁止对其收取报酬或对价，当然不能作为物权或债权等财产权的对象。禁止将胚胎等同于一般的物，并不意味着也禁止将胚胎应用于医疗和研究目的，例如在德国，已经开始了对胚胎的医疗目的的使用，实践中有人为了治疗的目的，将取自胚胎的脑细胞移入帕金森氏症患者的脑内来治疗这种疾病。同样，在将胚胎作为科学研究的对象时，也应受到一定的法律限制，如2001年4月10日出炉的我国台湾地区“基因科技安全管制法”将人类和人类胚胎的基因改造排除在外，仅规定了动植物的基因改造问题，其目的就在于防止将人物化。德国早在1990年就已经颁布了“胚胎保护法”，这部法律规定了“滥用繁殖科技的情形、人类胚胎的滥用、禁止性别选择、擅自受孕或胚胎移植、精子捐献或者死亡后的人工受孕、人工胚胎细胞的人工转变、人类的无性生殖” 等内容，对于胚胎保护和禁止情形都规定得相当严格。美国密执安州也认为胚胎研究可能将生命健康暴露于危险之中，故禁止使用有生命的胚胎进行研究，虽然使用受精卵进行科学研究具有减少不孕、促进受孕、及早发现遗传缺陷等优点，即使如此，也不能进行任意的研究，法律必须对其施加严格的限制。这些人类出产物不能认定为主体，对其也只能限于为医学上的实验以及临床应用目的而进行有限制的使用，例如，必须取得精、卵提供者的同意；不得进行任何转变基因的研究；进行实验的胚胎必须是为生殖目的而产生，不能专为研究目的而创造胚胎，必须非医学上的人，即受精未超过14天；实验必须具有良好的医学基础等等。

胚胎与受精卵非人，亦非物，对其法律地位如何进行界定较为困难，随之而来的是胚胎与受精卵被侵害后的民事责任承担问题，也就是说，侵害胚胎或受精卵的行为人应否承担民事责任，应承担何种民事责任？对此，各国做法不一。1973年美国哥伦比亚大学基督教医院为Doris 及John Del Zio夫妇因不孕而实施体外受精，在受精卵正在顺利培养的过程中，由于执行医生未向医院提出报告，医院负责人就以该程序有违道德要求为由，在未通知当事人夫妇与执行医生的情况下，将受精卵进行销毁。一年后，Doris 及John Del Zio夫妇以胚胎财产权受侵害导致精神受损害为由提起诉讼，法院虽然无法接受受精卵为财产的观念，也不认为胚胎为人（personhood）， 仍判决被告赔偿原告精神损害赔偿50万美元。[35]德国也发生过储存精子灭失案件，原告甲预见有不能生育的可能性，将其精子冷冻储存于乙大学附属医院，在其结婚后欲取用精子时，才知因乙大学过失致其储存的精子灭失，故向乙请求25000马克的慰抚金。下级和原审法院均否认了原告甲的请求权，德国联邦法院则肯定乙系侵害甲的身体权，认为此种分离身体部分在其与身体分离期间，构成“功能上的一体性”，对分离身体部分的侵害，应认为是对身体的侵害，符合德国民法典第847条之要件，对原告的抚慰金请求予以支持。[36]相比较而言，将精子、卵子作为人体之一部尚可理解，但受精卵与胚胎均非人体直接的出产物，而为外力作用而形成，将其比照适用身体权之保护，未免过于牵强。

可以说，在解决胚胎这类生物体的法律地位问题的时候，民法的身份法和财产法都面对着尴尬的处境。而这其实正符合关于财产保护的规则的要求，如美国财产法学者Calabresi与Melamed提出，社会一般通过三种方式来实现对产权的保护：第一是财产法则；第二是责任法则；第三是不可让渡规则。[37]这三种规则已经为财产保护提供了一个广泛适用的体制。其中不可让渡规则（rules of inalienability）是指一个实体（entitlement）并非在任何环境下都可以通过合同或讨价还价来达成交易，例如人们既不能将自己出卖为奴，也不能出卖自己身体之一部或自己生育的婴儿。我国卫生部有明文禁止精子、卵子、受精卵和胚胎的买卖，并要求对精子、卵子的提供者进行严格检查，以保证人口素质，禁止代孕，表现出对该类生物体的基本态度。但是对如此复杂的问题进行如此简单的禁止性规定，并不能实现对实践中的未知领域进行事先合理规制，我们建议正在草拟的物权法能未雨绸缪，对该类生物体给予关注。

（3）、人的复制（Clone）

生物科技中最引人注目、同时也是争议最多的当数“复制”。复制（Clone）并不是一个新鲜的概念，例如植物学家早就可以复制并移植植物，但这与动物的复制尤其是涉及脊椎动物的复制相比有着巨大的差别。所谓复制，是指只凭借一个单纯的身体细胞、以无性的、无须雄性精子的方式就可以制造出完全成熟的脊椎动物。现代的复制技术可以分为两类，一种是把成年动物细胞的细胞核移植到一枚未受精的卵子之中而构成复制，这种方法又称为“体细胞核转置的复制”，另一种是模仿自然的复制过程，以人工分裂早期胚胎，再让分裂后的两个胚胎长成两个一模一样的个体。依照现在的技术水平，这两种方法都要将胚胎植入母体之中，才能顺利发育。1997年多利羊的出世就是第一种方法培育的结果。

由于对人体的复制在伦理学上明显违背了人的生存自决权原则，在技术上又威胁着人类的安全，因而禁止克隆人已经成为一种世界范围内的普遍共识，如联合国教科文组织于1997年就通过了关于禁止进行克隆人类实验的世界宣言。

我们认为，应当反对人体的复制行为，但器官的复制不应当完全禁止，理由如下：

第一，复制行为违反了人类尊严，人类尊严的内容至少包括无可混淆的“个别性”和“无与伦比性”，而对人类的整体复制违反这两点基本要求。

第二，同时也必须认识到，复制作为医学发展的重要一环，不应被完全禁止，即对人类器官（主要是内脏器官和感觉器官）的复制行为不应被禁止。复制人体器官会有利于医疗移植事业的发展，但移植后的器官又会引发一系列法律问题，例如复制的移植器官的归属问题，有待于进一步的探讨。

3、“动物不是物”的法律思考

与将动物作为物的作法相同，关于动物的伦理地位和道德权利的争论也并非一个新话题，相反，它们早就出现在古代哲学家的论坛之上。古希腊和罗马的哲学家曾经提出过一种明确的自然法思想，认为假如存在着另外一种关于“动物法”的道德体系，则应是符合逻辑的。公元3世纪的罗马法学家乌尔比安指出，动物法是自然法的一部分，因为后者包括了“大自然传授给所有动物的生存法则，这种法则不为人类所独有，而属于所有的动物。”[38] 但自基督教出现以来，这种观点就受到了人类中心主义（或者人类优位主义）的影响而开始衰落，越来越多的人开始相信，动物没有任何权利，包括动物在内的非人类生存物的存在是为了服务于人类，在这个世界上并不存在一个宽广的“伦理共同体”。因此，人与大自然之间的恰当关系是便利和实用。笛卡儿是这种观念的坚定支持者，他坚持认为，人类是大自然的主人和拥有者。[39] 这种将大自然客体化的做法势必影响到其他领域，传统民法理论将动物视为无生命的财产从而属于物的做法与此种观点具有同源性。

尽管基督教的出现削弱了非人类存在物在伦理上和道德上的地位，使人类中心主义的思想得到充分张扬，但动物法与自然法的思想却在欧洲思想史的发展长河中经久不息。最典型的是1641年世界上第一个尊重动物的法律-“自由法典”在美国马萨诸塞州出台，此部法律提出要对那些于人类有用的家畜给予保护，而不包括野生动物，虽体现了一定的功利主义思想，但在当时仍属巨大的进步。在17、18世纪西方人类中心主义思想和二元主义思想中，能够从财产的角度理解动物享有权利的当属洛克。洛克认为，动物能够被人类拥有，这一事实使得动物也获得了某些权利。在他看来，对动物的伤害在道德上的错误不是源于动物享有天赋权利，而是对动物的残忍会给人的道德造成影响。[40] 康德则认为，不能虐待动物的理由在于人类不得残酷对待动物的义务，同样也是对其自身的义务，因为此种粗暴行为将会“麻木人类同胞感同身受的感觉”。[41]自20世纪60年代以来，环境污染成为一个全球性的问题，论坛上出现了环境伦理学者甚至激进的环境主义者的声音。这些声音虽然没有与财产法律制度发生直接的联系，但已经开始影响到民事立法例。例如德国民法典第90条a规定：“动物不是物。它们受特别法的保护。法律没有另行规定时，对于动物适用有关物所确定的有效规则”。此条是基于对动物保护的需要，将动物排除在一般意义上的物的概念之外，也是对强大的动物保护呼声和环境保护压力而在法律上采取的必要回应，倡导动物（包括家养动物和野生动物）享有一定的伦理权利和道德权利。正如有观点提出的那样，是将动物视为伦理主体和“有限的法律主体”，给予必要的道德上和伦理上的关怀，[42]我们认为，尊重生命，敬畏自然，保护环境应当成为是现代财产法的伦理和道德内涵，针对我国正在进行的物权立法，关于动物的法律地位，结合对动物的特别保护，笔者主张以下基本观点：

第一，动物为物，但对其应适用特别法的保护。无论动物保护主义者如何呼吁，动物与人类之间仍然存在着本质的区别，那就是法律上的主体意识，如果此理由带有一定的人类优位主义的思想，那么即使从自然界的生存法则来看，人类享有绝对支配动物的地位，因此，动物仍然而且只能认定为物权的客体，在法律地位上相当于动产。但基于当今动物面临的艰难处境，我国也应尽快制定有关对动物给予特别的伦理保护的法律，动物为物的前提是要符合法律对动物的特别保护；

第二，确定动物享有道德上和伦理上的权利，这种权利只能从人和动物的关系上来理解。动物拥有某些权利，旨在表明，它只是在与人类的共存关系中所处的某种地位，而远非其他。如果将这种权利扩大化，将会在另一个方面表现出新的“主客体的差序主义”，正如有学者所指出的，“接受动物享有法律上权利的观念并不意味着动物已经取得了人至所以为人的实质性内容”，[43] 这种做法与人类优位主义一样，都应该为现代民法观念所避免。

第三，动物享有某种权利，同时意味着人类就享有相应的义务。这种义务并不是动物界或自然界强加于我们，其存在的最深刻的根源就是可持续发展的需要，即我们对作为整体人类延续的后代负有义务，后代人享有的继续生存和发展的权利决定了我们有善待动物的义务。[44] 为了更切实保护动物的这种权利，有学者提出应当允许人们以动物的名义进行诉讼，[45]德国学者考夫曼也指出，在强化动物法律地位的同时，应考虑创设未来世代请求充分生活条件且可资诉讼的固有权利。[46]

我国物权立法也在一定程度上吸收了对动物实行特别保护的做法，并作出了一定的回应，如梁慧星教授主持的中国物权法草案建议稿中，就否定人们可以对动物进行任意处分。[47]

（二）无体物的扩张

1、无形财产的基本理论

无形财产的概念可以追溯到罗马法，古罗马法学家就已经将物分成了有体物和无体物（或者有形物和无形物），认为有体物（Corporales）是指可以触摸的物品，无体物（Incorporales）则是指不可以触摸的物品，它们往往体现为某种权利，如继承权、债权和用益权等。[48] 这就是说，债权和他物权均为一种“无体物”，都属于物和客体的范畴，因此在立法上和理论上都是不加区分地作为物上利益来对待，整个财产权体系由一种宽泛的所有权统领着。这种做法被近代的法典所采纳，如法国民法典就继承了这种关于物的分类，该法典第526条、529条分别规定了建立于不动产之上的权利为不动产，而将债权和股权等视为动产。其后的意大利、奥地利、荷兰民法典中也都有类似规定。[49]1896年德国民法典受到黑格尔哲学思想的影响，没有采纳罗马法中关于无体物的相关规定，将物仅限于有体物，显示了有体物和无体物的差别。此后的日民、台民也都继受了这一做法。