转铁蛋白十篇

转铁蛋白篇1

WANG Yun, ZHANG Yunxia

Blood Disease Hospital of Medical Academy of China,Tianjin 300020, China

Abstract： Objective Comparing the results of transferrin and total iron binding capacity (TIBC), to study the relativity of transferrin and TIBC in the clinical apply and the results tested by the same library. Methods Different blood disease samples were tested for 2 items including transferrin and TIBC to analyze the relativity of transferring and TIBC. Results Transferrin and TIBC were identical in reference range and clinical application. The results’ relativity was well, r=0.999 3. Conclusion The relativity of transferrin and TIBC is well in reference range , clinical application and test result.

Key words: Transferrin; Total iron binding capacity; Relativity

转铁蛋白(Transferrin, Tf)是血清中铁（Iron）的转运蛋白。总铁结合力（TotalIron binding capacity，TIBC）是指血清中转铁蛋白与铁结合的总量，实际反映转铁蛋白的水平。但由于总铁结合力实际上是铁离子和各种蛋白的非特异结合，所以不能依据转铁蛋白的分子量将二者相互转换。同时，由于转铁蛋白和总铁结合力的检测系统和检测方法并不相同，所以在日常工作中二者之间的相关性究竟有多大并不十分清楚。本文即对二者在铁代谢障碍疾病中应用的相关性及测定结果之间的相关性进行了 研究 。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源

选取本院门诊、住院部不同血液疾病（排除肾功能障碍）患者106例，男46例，女60例，年龄3岁~69岁。用不含铁的注射器及促凝管采集空腹静脉血，3 000 r/min离心10 min分离血清。标本无溶血、黄疸和脂血。

罗氏公司转铁蛋白(Transferrin) 试剂盒，朗道公司总铁结合力（TotalIron binding capacity）试剂盒，朗道公司血清铁（Iron）试剂盒，罗氏公司转铁蛋白标准液，朗道公司铁标准液，朗道公司正常值及病理高值质控物。

1.1.3 仪器

东芝TBA40FR全自动生化 分析 仪（日本）。

转铁蛋白采用免疫透射比浊法。总铁结合力采用加入已知过量的铁标准液，使血清中全部的转铁蛋白与铁结合达到饱和状态，再用碳酸镁除去多余的铁；最后用亚铁嗪比色法测定铁含量，并 计算 出总铁结合力［1］。测定过程及参数设置均按试剂盒说明进行。

每份标本离心后同时检测转铁蛋白和总铁结合力。操作前均用标准液校正并做正常值及病理高值质控物，在质控结果在控的情况下进行检测。

[next]

2 结果

2.1 参考 范围比较

2.2 临床应用比较

转铁蛋白和总铁结合力主要用于铁代谢障碍疾病的辅助诊断。二者在缺铁性贫血、铁代谢障碍引起体内铁过多疾病及其他血液病中的测定情况见表2。在缺铁性疾病中，有79.4%的患者转铁蛋白和总铁结合力升高，升高的病例为绝大多数；而在铁过多的疾病中只有2.9%患者转铁蛋白和总铁结合力升高；在其他非铁代谢障碍的血液病中，没有患者转铁蛋白和总铁结合力升高。二者的升高可以有效地辅助诊断缺铁性疾病。在缺铁性疾病中，均无转铁蛋白和总铁结合力降低的病例；而在铁过多的疾病和其他非铁代谢障碍的血液病中，二者降低的比例均接近20%。转铁蛋白和总铁结合力的降低无特殊的诊断意义。表2 转铁蛋白和总铁结合力临床应用比较（略）

2.3 检测结果的相关 分析

经 计算 ，转铁蛋白（Y）和总铁结合力(X)的线性回归方程为：YTF=0.047XTIBC-0.016，相关系数r=0.999 3，说明回归统计的斜率和截距可靠。可见，在同一实验室内用常规 方法 测定的转铁蛋白和总铁结合力之间具有良好的相关性。

3 讨论

转铁蛋白是一个能够和铁相结合的蛋白家族，它是由670个~700个氨基酸组成的单链糖基化蛋白，分子量80 KDa左右。转铁蛋白在肝内合成，其合成速度根据体内对铁的需求和铁储存状态而调解。转铁蛋白的最基本的生理功能就是结合、运输三价铁离子，从而控制体液中自由铁的水平，这不仅提供可利用铁，而且阻止了铁的沉积［3］。总铁结合力是指血清（浆）中转铁蛋白全部与铁结合后铁的总量，实际反映的也是转铁蛋白的水平。二者在铁代谢障碍疾病的临床应用及测定结果之间有很好的相关性。

本实验室使用亚铁嗪比色法测定总铁结合力的参考范围是通过对正常人群的调查所得，而转铁蛋白尚在使用试剂盒内提供的参考范围。通过比较可以发现，转铁蛋白 目前 使用的参考范围与总铁结合力的参考范围在临床应用上基本相符。二者使用现在的参考范围不会给临床应用带来混乱。

转铁蛋白篇2

>> 铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析 龙眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆与表达分析 镉诱导PC－3细胞金属硫蛋白和锌转运体的基因表达 褐飞虱ABCG基因的克隆与表达分析 猪苓菌核2种热激蛋白基因的克隆及其表达分析 雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析 昆虫抗冻蛋白基因的克隆与表达研究进展 铁皮石斛Ty1copia类反转录转座子反转录酶（RT）序列的克隆与分析 铁皮石斛调控机体免疫功能的研究进展 石斛与铁皮石斛关系的本草考证 褐藻羊栖菜水通道蛋白基因SfLIP的克隆及其在淡水浸泡下的表达分析 猪偶发分枝杆菌核酸修复蛋白基因的克隆与序列分析 柱穗山羊草α—醇溶蛋白基因的克隆与序列分析 花生蛋白激酶基因AhSTK的克隆与序列分析 草莓NBS-LRR家族基因FaNBS1的克隆与表达分析 洋葱ANS基因启动子的克隆与瞬时表达分析 小立碗藓Ran基因的克隆与表达分析 白木香乙酰乙酰基辅酶A硫解酶基因（AsAACT）的克隆与表达分析 地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析 人参中苯甲酸胁迫响应基因WRKY7的克隆与表达分析 常见问题解答 当前所在位置：L）分析cDNA序列;用InterProScan（）分析蛋白质结构域和基元;Protparam（http：///protparam/）和SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin /secpred_sopma.pl）分析蛋白质理化性质和二级结构;ProtScale（http：///protscale）分析蛋白的亲水性/疏水性;SignalP 4.0 （http：//cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽;TMHMM（http：//cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白跨膜域。PSORT（http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/ form. htmL）进行亚细胞定位分析。用DNASTAR 6.0，MEGA 4.0分别进行DoZIP1蛋白的氨基酸序列比对和进化树构建分析。

1.5实时定量PCR分析分别用2 μg根、茎、叶样品总RNA反转录合成cDNA，EF1a为内参基因^[16]，qPCR分析DoZIP1基因的组织表达模式。引物为qPCR-F （5′-CGGGCTTCATCCACATACT CC-3′）和qPCR-R（5′-AACTATTCCCACCTCCAACACC-3′）的扩增产物长347 bp。用ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems， USA）进行扩增。反应体系25 μL包括2× SYBRR Premix Ex TaqTM Master Mix （Takara， China） 12.5 μL，正反向引物（10 μmol・L^-1） 0.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9 μL。每个反应重复3次，包括不加模板的对照，实验重复3次。PCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40个循环，反应结束绘制溶解曲线。根据ABI PRISM 7500 SDS软件（Applied Biosystems， USA）生成的循环阈值（Cycle threshold， CT），用2-ΔΔCt法^[17]计算相对表达量。

2结果与分析

2.1DoZIP1基因的克隆分析2次巢式5′-RACE扩增获得长度约为1.1 kb的目标条带（图1）。因为R2-nest下游引物跨原EST的终止密码子，该目标产物应该系基因全长。克隆、测序和拼接分析获得了一条1 100 bp的cDNA，BLASTx分析显示其与GenBank已注册的植物ZIP基因一致性为56%～64%。其包含的ORF长1 056 bp，5′-UTR长31 bp，3′-UTR长13 bp，起始密码子附近序列AAAATGA符合KOZAK规则^[18]，表明已成功获得基因全长，命名为DoZIP1，提交GenBank获得注册号KJ946203。

1.5′RACE扩增产物; M .DL 2 000相对分子质量标准。

2.2DoZIP1蛋白的理化特性推定的DoZIP1蛋白含Leu最多，为47个（13.4%），其次是Ala，Gly和Ile，均为33个（9.4%），其他氨基酸数目在6.0%～0.9%，如Phe为20个（5.7%），Thr为17个（4.8%），Trp仅3个，占0.9%。Protparam预测其分子式为C1727H2732N436O468S15，含351个氨基酸，等电点（pI）6.09，相对分子质量37.57 kDa，正电残基（Arg+Lys）21，负电残基（Asp+Glu）27，不稳定系数36.13，脂肪系数高达119.77，亲水性系数0.610。ProtScale分析结果显示，DoZIP1蛋白疏水性最大值为3.456，亲水性最高值为-3.211，且在较多位置上均表现出疏水性，说明其是1个疏水性蛋白质。

2.3DoZIP1蛋白的二级结构、结构域和保守基序分析SOPMA预测结果显示（图2），DoZIP1蛋白二级结构共有α螺旋（alpha helix， 50.71%）178处，随机卷曲（random coil， 36.18%）127处，延伸链（extended strand， 11.11%）39处以及β转角（beta turn， 1.99%）7处;α螺旋和随机卷曲为二级结构的主要元件，分散于整个蛋白质中。

InterProScan分析表明，DoZIP1蛋白含有锌铁调控转运相关蛋白结构域（42～348），以及1个典型的保守基序（HSVIIGLSLGA，209～219）。PROSITE SCAN分析表明DoZIP1蛋白含有数目不等的功能基元，包括2个N-糖基化位点（104～107，326～329）、3个蛋白激酶C磷酸化位点（42～44，225～227，287～289）、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（22～25，184～187）、8个N-肉豆蔻酰化位点（87～92，180～185，214～219，241～246，243～248，272～277，276～281，295～300）和1个酰胺化位点（34～37），这些基元可能对蛋白的结构和功能具有重要的作用。

2.4DoZIP1蛋白亚细胞定位、信号肽和跨膜域预测PSORT预测DoZIP1蛋白定位在质膜的可能性最高为64%，定位于高尔基体几率为46%，定位于内质网膜为37%，内质网腔为10%。SignalP4.1预测分析DoZIP1蛋白含1个信号肽（1～24），为分泌蛋白。TMHMM分析结果显示（图3），DoZIP1蛋白具有8个跨膜区（5～22，42～64，76～98，120～142，197～219，261～283，290～311，326～348），位于第4，5个跨膜域间的可变区处于胞内，说明该基因编码蛋白很可能为膜定位蛋白。

2.5DoZIP1和其他植物ZIP蛋白的多序列对比运用DNAStar 5.0中的MegAlign程序对DoZIP1蛋白和已知植物ZIP蛋白进行多序列对比分析。DoZIP1与葡萄（Vitis vinifera， XP_002264621）、柑橘（Citrus sinensis， XP_006481378）、毛果杨（Populus trichocarpa， XP_002307860）、蓖麻（Ricinus communis， XP_002527722）和水稻（Oryza sativa， Q7XLD4）等植物ZIP蛋白的一致性分别为61.8%，61.5%，61.3%，60.4%，50.1%（图4）。

2.6DoZIP1与拟南芥、水稻ZIP家族蛋白的进化关系下载具有代表性的拟南芥Arabidopsis thaliana和水稻Oryza sativa ZIP家族蛋白氨基酸序列，使用MEGA 4.0 软件邻接法（Neighbour-joining， NJ）构建系统进化树（图5）。结果显示，DoZIP1蛋白与ATIRT1，AtZIP8，OsZIP3，AtZIP10聚成一个分支，与OsZIP3，AtZIP10的亲缘关系较近。

2.7基因表达模式分析分别提取铁皮石斛根、茎、叶等样品总RNA，利用实时定量基因扩增荧光检测系统（QPCR）技术检测基因表达模式。DoZIP1基因在3种组织中为组成型表达，相对表达量有明显差异，转录本在根中相对表达量较高（图6），为茎中的4.19倍，叶中次之（1.12倍）。

3讨论

锌铁调控转运蛋白通过介导Zn2+，Fe2+，Mn2+，Cd2+等2价阳离子的转运，调节胞内离子稳态，在植物生长发育过程中起重要调控作用。关于植物ZIP基因的系统性研究主要来自拟南芥^[5]、苜蓿^[6]、菜豆^[7]、玉米^[8]、大麦^[9]和水稻^[10]等重要模式植物或者作物，尚未见到药用植物ZIP基因的相关报道。植物ZIP通常呈多基因家族，各成员之间协同作用控制着植物对微量元素的高效吸收和利用。铁皮石斛生于海拔约1 600 m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的特殊环境，生长缓慢，极难存活，野生资源濒危^[13]。鉴定铁皮石斛ZIP家族基因并研究其生物学功能，揭示特殊生长环境下微量元素高效利用的生理机制，将为道地药材形成的分子机制和高产优质品系的培育提供理论依据。因

此，本研究利用RACE技术分离到1个铁皮石斛锌铁调控转运蛋白编码基因DoZIP1，并分析了编码蛋白理化特性、结构域、跨膜域、亚细胞定位以及进化关系等生物信息学特征。

DoZIP1与多种植物ZIP基因一致性较高，编码蛋白有ZIP家族的保守结构域和多个基序，其氨基酸数（351个）介于植物ZIP蛋白氨基酸数309～476^[8]，可变区亦富含结合金属离子的组氨酸残基，这些符合植物ZIP的序列特征^[4]。DoZIP1蛋白包含信号肽和跨膜域，系膜蛋白，印证了PSORT的质膜定位分析，和其他植物ZIP蛋白的膜定位特性一致[2，4]。同一基因家族的不同成员一般包含相似序列和功能结构域，执行类似的生物学功能^[19]。DoZIP1与OsZIP3，AtZIP10处于ZIP系统进化树的同一分支上、亲缘关系较近，OsZIP3受缺锌条件诱导参与水稻对锌的吸收^[10]，DoZIP1蛋白应该具有相类似的作用。植物对矿质元素的吸收主要在根中进行，细胞利用离子通道、转运子等蛋白通过质外体或共质体策略介导矿质元素的吸收、转运和分配，调控植物的生理适应和生长发育^[6]。实时定量PCR分析结果显示DoZIP1基因在石斛根中表达丰度较高，因此推测该基因可能在石斛根中发挥转运微量元素的生理作用。当然，DoZIP1基因究竟在微量元素转运过程的怎样起作用，石斛ZIP基因家族其他成员与其功能有何差异，是否存在相互作用，这些有待于进一步深入研究。

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转铁蛋白篇3

【关键词】缺糖基转铁蛋白；酒精性肝病

酒精滥用是一个普遍存在的社会问题，随之而来的酒精性肝病的发病率近年也明显增高。血清缺糖基转铁蛋白（CDT）在长期酗酒者血清中出现频率较高，在国外已被广泛用于酒精性肝病的实验诊断[1]。本文通过检测酒精性肝病患者的血清CDT，并与其他肝功能指标ALT、AST、γ-GT、ALP进行比较，探讨CDT对酒精性肝病的诊断价值。

1资料与方法

1.1研究对象收集大连市友谊医院2012年1月至2012年12月期间确诊为酒精性肝病的患者33例，年龄为23-62岁。诊断标准为中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组2003年制定的《酒精性肝病诊断标准》。收集无饮酒史的病毒性肝炎患者45例，其中甲肝5例，乙肝37例，丙肝3例，年龄为21-65岁。收集无饮酒史的健康体检者50例作为对照组，年龄为18-55岁。

1.2仪器与试剂应用西门子BNⅡ全自动蛋白分析仪检测血清CDT，CDT试剂及标准品、质控品均为仪器配套试剂，正常参考范围为28.1-76.0mg/L。应用日立7600全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、γ-GT、ALP，检测试剂由北京九强生物技术有限公司提供。

1.3检测方法清晨空腹抽取静脉血4ml，分离血清。所有项目的检测都为当天完成。CDT采用乳胶颗粒增强的免疫散射比浊法检测，ALT、AST、γ-GT和ALP采用双波长速率法检测。

1.4统计学分析应用SPSS12.0统计软件对各组数据进行分析，两样本均数比较采用t检验。

2结果

2.1各组CDT的检测结果比较酒精性肝病组、非酒精性肝病组和对照组的CDT检测结果分别为137.3±32.4mg/L、45.6±9.5mg/L和41.5±10.1mg/L。酒精性肝病组与对照组比较，差异具有统计学意义（P0.05）。

2.2各组中各项生化指标测定阳性率的比较酒精性肝病组CDT、AST、ALT、γ-GT和ALP的阳性数和阳性率分别为29（88%）、9（27%）、8（24%）、24（73%）、7（21%）。非酒精性肝病组CDT、AST、ALT、γ-GT和ALP的阳性数和阳性率分别为4（9%）、39（87%）、41（91%）、27（60%）、23（51%）。对照组各生化指标的阳性数均为0。

3讨论

目前，肝组织病理学活检仍是确诊酒精性肝病的主要方法。此方法具有一定创伤性，易引起并发症且无法对酒精性肝病进行动态观察[2]。因此，寻找高敏感性和特异性的实验室诊断指标，诊断和评估酒精性肝病的发生及治疗的疗效具有重要意义。

酒精性肝病组CDT与对照组比较，差异具有统计学意义（P0.05）。表明CDT用于酒精性肝病的诊断具有较高的特异性。酒精性肝病组CDT的阳性率为88%，敏感度为88%，表明其用于酒精性肝病的诊断具有较高的敏感性。

非酒精性肝病组ALT、AST、ALP阳性率分别为91%、87%和51%，酒精性肝病组此三项阳性率分别为24%、27%和21%，表明这三项酶学指标可以有效地反映非酒精性肝病患者的肝损害程度，但是对酒精性肝病的敏感性不高，诊断价值不大。非酒精新肝病组和酒精性肝病组γ-GT的阳性率均较高，分别是60%和73%，表明γ-GT对酒精性肝病的诊断具有一定价值，但特异性不高，容易造成诊断的假阳性，这可能与γ-GT易受其他疾病和药物影响有关[3]。

综上所述，与ALT、AST、ALP、γ-GT比较，血清CDT用于诊断酒精性肝病具有较高的敏感性和特异性，可以作为酒精性肝病的诊断指标，对其诊断与预后具有重要价值。

参考文献

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转铁蛋白篇4

[关键词] 缺铁性贫血； 四物汤； 幼鼠； 铁代谢； 铁调素

[Abstract] To investigate the effect of Siwu decoction on improving iron deficiency anemia in infant rats and observe its regulatory effects on iron metabolism. SD rats were fed with low iron fodder for 2 weeks， and then the rats with hemoglobin level less than 75 g・L-1 were screened out and randomly divided into model group， Ferrous succinate 50 mg・kg-1 group， Siwu decoction 4 g・kg-1， 8 g・kg-1 and 16 g・kg-1 groups. After 4 weeks′ gavage administration， Wright-Giemsa′s staining of blood smear and HE staining of the livers were conducted， and all rats were tested for blood routine， serum iron， total iron binding capacity， serum ferritin， serum hepcidin and liver hepcidin. The expression levels of liver ferritin， transferrin and transferrin receptor 1 were also detected. The results showed that as compared with normal group， the activity level of model group was decreased， and the color and lustre of auricles and toes were pale white； the number of red blood cells was decreased； the volume was smaller， with an increased zone of central pallor； the body weight and blood routine parameters were decreased significantly； the livers were pale red， and the hepatic cords around thecentral veins were unclear and misaligned； the serum iron， serum ferritin， liver iron levels and the expression of liver ferritin were decreased significantly； the total iron binding capacity， serum hepcidin， liver hepcidin， the expression levels of liver transferrin and transferrin receptor 1 were significantly increased， indicating successful establishment of models.As compared with the model group， activity was increased in Siwu decoction group； the color and lustre of auricles and toes were ruddy； the number of red blood cells was increased； the volume was larger， with a decreased zone of central pallor； the body weight and blood routine parameters were increased significantly； the livers were red， hepatic cords around the central veins were clear and aligned；the serum iron， serum ferritin， liver iron levels and the expression of liver ferritin were significantly increased， the total iron binding capacity， serum hepcidin， liver hepcidin， the expression of liver transferrin and transferrin receptor 1 were decreased significantly. The results demonstrated that Siwu decoction had a certain effect on improving iron deficiency anemia in infant rats， and the mechanism may be associated with the regulatory effect of hepcidin iron metabolism.

[Key words] iron deficiency anemia； Siwu decoction； infant rats； iron metabolism； hepcidin

贫血影响着世界上大约三分之一人口的健康，其中有一半是铁缺乏造成的[1]。缺铁性贫血的发病率在经济不发达地区的婴幼儿、育龄妇女中明显增高[2]。目前，口服铁剂被认为是最佳的治疗手段[1]，但口服铁剂存在一些副作用，如常见的胃肠道反应等；并且过量补充铁剂会造成机体铁超载，诱发肝脏、心血管损害和神经退行性病变[3]。

四物汤来自《仙授理伤续断秘方》，由川芎、当归、熟地黄和白芍组成，是经典的中医补血方剂。但以往对四物汤的研究主要是通过放血、辐射损伤或注射环磷酰胺诱导骨髓抑制建立成年大、小鼠血虚模型，来观察其在造血系统[4-6]、免疫调节[7-8]和抗射线损伤[9-11]等方面的作用，而未见四物汤对幼年缺铁性贫血大鼠及对铁代谢调节的研究。本实验拟研究四物汤对幼鼠缺铁性贫血的改善作用及其对铁代谢的调节机制，为将四物汤应用于治疗妇女及婴幼儿贫血提供部分临床前试验依据。

1 材料

1.1 动物与饲料 80只SPF级21 d断乳SD大鼠，雌雄各半，购自重庆市中药研究院实验动物研究所，生产许可证号SCXK（渝）2012-0006，实验动物质量合格证号No.0001728；饲养于西南大学药学院实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK（渝）2014-0002。大鼠的饲养和使用均符合中国《实验动物管理条例》。AIN-93G标准饲料（含铁量约为0.004 5%）和AIN-93G低铁饲料（含铁量约为0.000 4%）均购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

1.2 药材与试剂 四物汤由川芎-当归-熟地黄-白芍按2∶3∶4∶3比例组成。药材均购自重庆鑫斛药房连锁有限公司，经西南大学药学院齐红艺教授鉴定均为正品。琥珀酸亚铁片购自四川奥邦药业有限公司。快速瑞吉氏染液、血清铁、总铁结合力和组织铁测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。HE染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。铁蛋白和铁调素酶联免疫试剂盒购自上海优选生物科技有限公司。RIPA裂解液、PMSF和BCA蛋白定量测定试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。铁蛋白（10727-1-AP）、转铁蛋白（17435-1-AP）和转铁蛋白受体1（10084-2-AP）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司。山羊抗兔IgG（bs-0295G）抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 仪器 旋转蒸发器（RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂）；全自动血液细胞分析仪（BC-2800 Vet，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；病理切片机（RM2016，上海徕卡仪器有限公司）；台式低温高速离心机（5417R，德国Eppendorf生命科学有限公司）；酶标仪（Elx800，美国BioTek仪器有限公司）；电泳槽和转印槽（美国BIO-RAD生命医学产品有限公司）；全自动化学发光图像分析系统（Tanon5200，上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 四物汤提取物配制 称取川芎20 g、当归30 g、熟地黄40 g、白芍30 g，添加10倍量水，浸泡30 min后，于中药煎药壶中煎煮60 min，用纱布过滤。残渣中再添加10倍量水，再煎煮60 min后过滤。合并滤液并旋转蒸发浓缩至含生药浓度1.6，0.8，0.4 g・mL-1，4 ℃存放，备用。

2.2 造模与分组 将80只21 d断乳大鼠适应性饲养1周，随机分为正常组10只和造模组70只，编号后饲养于不锈钢笼中。正常组饲喂标准饲料，造模组饲喂低铁饲料，自由饮去离子水，饲养过程中尽量避免铁接触。2周后，造模组大鼠内眦静脉采血200 μL，EDTA抗凝后测定血常规，筛选出50只血红蛋白含量少于75 g・L-1的大鼠作为造模成功大鼠。将其雌雄各半随机分为模型组，琥珀酸亚铁50 mg・kg-1，四物汤4，8，16 g・kg-1组，每组10只。

2.3 给药 除正常组和模型组灌胃等体积水外，其余4组分别灌胃设定剂量的琥珀酸亚铁或四物汤提取物，连续给药4周。给药期间，各组大鼠继续饲喂标准或低铁饲料，自由饮去离子水。

2.4 大鼠一般情况观察和体重测定 分别观察各组大鼠精神状态、活动、毛色、耳廓、_趾等情况，用天平称量大鼠体重，并比较各组差异。

2.5 组织样本制备 给药4周后，各组大鼠禁食不禁水12 h，内眦静脉采血1.5 mL，EDTA抗凝后备测。另采血1.5 mL，不抗凝，静置24 h后，3 000 r・min-1离心10 min，分离得到血清，-80 ℃保存。1%戊巴比妥钠按40 mg・kg-1剂量腹腔注射麻醉后，冰上分离肝脏，-80 ℃保存。

2.6 血涂片染色 滴加1滴血液于干净的载玻片上，推片，待血膜干燥后，严格按照说明书进行瑞氏-吉姆萨染色，镜检。

2.7 肝脏HE染色 将肝脏固定于4%多聚甲醛24 h以上，梯度脱水后包埋，行石蜡切片，片厚5 μm，严格按照说明书进行HE染色，镜检。

2.8 生化指标检测 采用全自动血液细胞分析仪测定血常规参数。采用比色法严格按照说明书测定血清铁，总铁结合力和肝脏铁含量。采用酶联免疫吸附测定法严格按照说明书测定血清铁蛋白，血清铁调素和肝脏铁调素含量。

2.9 Western blot检测 将肝脏置于4 ℃预冷的生理盐水中，剪碎，加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 13 000 r・min-1离心5 min，取上清液，严格按照说明书采用BCA法测定蛋白浓度。用去离子水将各蛋白样品调至等浓度，加入上样缓冲液，沸水浴5 min，冷却，制备10% SDS-PAGE凝胶后，加入等量蛋白样品电泳分离蛋白后，用湿法将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗（铁蛋白 1∶500，转铁蛋白 1∶200，转铁蛋白受体1 1∶500）过夜，TBST洗膜4次，每次10 min。室温孵育二抗（山羊抗兔IgG 1∶2 000）1 h，再用TBST洗膜4次，每次10 min。用ECL孵育后在化学发光成像系统中显影拍照，用Image J对图片进行分析。

2.10 统计学分析 试验重复3次，所得数据用SPSS 19.0进行分析，数值用±s表示。组间数据比较采用单因素方差分析，以P

3 结果

3.1 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠的生长情况 造模2周后，与正常组相比，模型组活动量减少，耳廓和脚趾呈苍白色，w重显著降低（P

3.2 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠红细胞形态 与正常组相比，模型组的红细胞数量减少，体积变小，中央淡染区扩大。与模型组相比，四物汤各组的红细胞数量增多，体积变大，中央淡染区缩小，见图4。

3.3 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠肝脏外观和组织形态 与正常组相比，模型组肝脏呈浅红色，中央静脉周围的肝细胞索分界不清晰，排列杂乱。与模型组相比，四物汤各组肝脏颜色逐渐变红，中央静脉周围的肝细胞索分界较清晰，排列趋于整齐，见图5，6。

3.4 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠血常规相关指标 与正常组相比，模型组的红细胞数量（RBC），血红蛋白含量（Hb），红细胞比容（HCT），平均红细胞体积（MCV），平均红细胞血红蛋白量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）均显著降低（P

3.5 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠血清铁、总铁结合力和血清铁蛋白含量 与正常组相比，模型组的血清铁和血清铁蛋白含量均显著降低（P

3.6 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠肝脏铁含量和肝脏铁蛋白、转铁蛋白及转铁蛋白受体1的表达 与正常组相比，模型组的肝脏铁含量和肝脏铁蛋白表达均显著降低（P

3.7 四物汤显著降低贫血大鼠幼鼠血清铁调素和肝脏铁调素含量 与正常组相比，模型组的血清铁调素和肝脏铁调素均显著升高（P

4 讨论

4.1 缺铁性贫血的治疗手段有待提高 缺铁性贫血是指缺铁引起的小细胞低色素性贫血及相关的缺铁异常。婴幼儿需铁量较大，常因添加辅食不当造成缺铁性贫血。青少年偏食也易致缺铁性贫血[2]。口服铁剂是治疗缺铁性贫血的首选方式，但是目前在口服铁剂治疗或预防缺铁性贫血的用药剂量、用药时间和停药时间等方面存在较多争议[12]。临床上使用的口服铁剂主要有琥珀酸亚铁，硫酸亚铁等，这些亚铁类补铁剂都会对婴幼儿产生较为严重的消化道反应，如恶心，便秘，腹泻，腹部不适和口腔异味等[13]。并且，若补充铁剂过量，又可能引起铁超载，导致氧化应激，增加慢性病的危险[14]。因此，寻找新的治疗缺铁性贫血的药物很有必要。

4.2 补血名方四物汤改善贫血的作用机制与调节铁代谢有关 四物汤作为经典的中医补血方剂，具有补血调血的功用，主治营血虚滞证。早在20世纪90年代初，龚跃新等[15]就对四君子汤、四物汤和八珍汤中的微量元素进行了测定，结果表明四物汤中的含铁量最高，这为缺铁性贫血患者增加了铁的来源。但同时他们也指出，四物汤补血的功效并不仅仅是通过补充铁元素，而是多种作用协同的结果。四物汤的有效成分主要包括多糖、阿魏酸、川芎嗪和芍药苷等[16]，有研究[17]发现，当归多糖与高价铁形成复合物后，可以升高缺铁性贫血大鼠RBC，Hb，HCT和全血铁含量。当归多糖还可以抑制转铁蛋白和铁调素的表达[18]，提示四物汤可能具有调节铁代谢的作用。本研究首次证明了四物汤具有较好的治疗幼鼠缺铁性贫血的作用，并证明了能显著纠正由于机体功能状态铁丢失时造成的血清铁降低和总铁结合力升高。另一方面，铁蛋白是人体铁储备的主要形式之一[19]，转铁蛋白是机体中转运铁的重要方式，四物汤可以显著升高血清铁蛋白和肝脏铁蛋白，抑制肝脏转铁蛋白和转铁蛋白受体的表达，并且可能通过抑制铁调素的表达，改善铁缺乏状况，对幼鼠缺铁性贫血模型的铁代谢紊乱起到显著的改善作用。

4.3 幼鼠低铁饲料造模结果更加接近临床实际 在本研究中，作者采用21 d断乳大鼠作为试验对象，以模拟婴幼儿缺铁性贫血。在模型的建立过程中，通过自由饮去离子水尽量减少铁接触，并且仅通过低铁饲料饲喂，未采取放血，尽可能与临床实际相符。其结果，模型组活动量减少，体重显著降低，耳廓和脚趾呈苍白色，肝脏呈浅红色，呈小细胞低色素性贫血，血清铁蛋白显著降低，有缺铁的依据，符合缺铁性贫血的诊断标准[2]。

综上所述，四物汤对幼鼠缺铁性贫血具有较好的改善作用，并且其对铁代谢的调节可能与铁调素有关，其进一步的机制还有待深入研究。

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转铁蛋白篇5

关键词：营养干预；运动性贫血；红细胞；锌卟啉；铜蓝蛋白

中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1007-3612(2007)04-0489-03

Research on the Influences of Nutrition Intervention on Sports Anemia Athletes'

Erythrocyte Zinc Protoprophyrin and Serum Ceruloplasmin

CAO Jianmin1, TIAN Ye2, ZHAO Jiexiu2, ZHENG Hongrong1, JIN Li3, ZHAO Ningning4

(1． Beijing Sport University, Beijing 100084, China;2． National Research Center of Sports Science，Beijing 100061,China;

3． Wuhan Institute of Physical Education,Wuhan 430070,Hubei China;4． P．E． College, Xuzhou Normal University,Xuzhou 221009,Jiangsu China)

Abstract:In order to research on the influences of nutrition supplements on sports anemia athletes' erythrocyte zinc protoprophyrin and serum ceruloplasmin, the experiments of nutrition intervention on sports anemia athletes are made and erythrocyte zinc protoprophyrin and serum ceruloplasmin are tested． In this way, the effects of nutrition intervention on sports anemia are researched． The results are as follows． The effects of nutrition intervention on sports anemia which is caused by intense exercises are obvious． Nutrition intervention obviously reduce erythrocyte zinc protoprophyrin and serum ceruloplasmin, which shows that nutrition supplements chosen in the experiment obviously improve athletes' iron reservoir, treat iron decompensation caused by sports training, and treat and prevent sports anemia．

Key words: nutrition intervention; sports anemia; erythrocyte; zinc protoprophyrin; ceruloplasmin

通过对运动性贫血运动员的红细胞参数和红细胞锌卟啉以及血清铜蓝蛋白浓度变化的进行研究，探讨运动员发生运动性贫血时铁代谢指标的变化规律，为阐明运动性贫血的发生机制提供理论依据；同时利用营养对运动性贫血运动员进行干预，观察其对运动性贫血运动员的治疗效果，为预防和治疗运动性贫血提供良好的营养补剂。

1研究对象与方法

1.1研究对象与分组

国家女子跆拳道运动员8名和北京石景山运动技术学校中长跑运动员20名作为研究对象，年龄12-17岁。所有研究对象均无肝、肾及内分泌疾病史，未服用过影响红细胞代谢的药物。根据运动员的性别和血红蛋白指标结果分为女性贫血组(n=8)、女性对照组(n=10)、男性贫血组(n=4)和男性对照组(n=6)。实验过程中运动性贫血研究对象补充“抗运动性贫血铁复合剂”，对照组补充安慰剂(表1)。

1.2运动方式

运动方式按照各自的运动模式从事运动训练，实验前后负荷量与强度基本相同。

表1研究对象的基本指标

1.3取样方法及样品保存

首先在安静状态时对两运动队的运动员进行一次血红蛋白水平普查测试，方法为氰化高铁血红蛋白比色法(HiCN)，结合运动员的身体健康状况、初步选取研究对象。正式实验前和实验后（即营养补充前和营养补充后）分别取血进行红细胞相关指标的检测，取血方法为肘静脉取血20 mL，一部分加入到预先用肝素处理的抗凝管中用于测定红细胞转铁蛋白受体、锌卟啉。

1.4营养补剂组成及补充方式

营养补剂组成：中药、血红

素铁、蕃红素、复合维生素等，通过动物实验结果以一定比例配比组成。中药主要成分有：人参、肉苁蓉、淫阳藿、黄芪、枸杞等以一定比例组成。

各营养补剂按人体需要量补充；对照组服用相同剂量的安慰剂。

1.5测试指标及方法

1.5.1红细胞参数测定

取抗凝血由专业血液学检测人员应用血细胞分析仪器（日本Sysmex SF-3000）对研究对象的血红蛋白水平、红细胞数目、红细胞压积等指标进行了测定。

1.5.2锌卟啉测定

样品处理：制备肝素抗凝EP管(12 500单位/50 mL生理盐水)，抽空腹静脉血，取0.3 mL放置于肝素抗凝的EP管中，-4℃保存，24 h内测定。

测试仪器：血液锌原卟啉测定仪（zpp-3800 型）广东省康达发展公司科学仪器部。

1.5.3铜蓝蛋白（Ceruloplasmin CP）测试

采用比色法测定，测试仪器美国Unico光电比色计。

1.6数据统计学处理方法

实验数据采用SPSS10.0统计软件包采用one-way ANOVA检验进行数据分析，实验数据以平均数±标准差表示，显著性水平为P＜0.05，非常显著性水平为P＜0.01；同时对各指标之间进行相关性分析。

2结果

2.1营养干预对运动性贫血运动员红细胞相关指标的影响

实验结果表明(表2)：实验前贫血组运动员血红蛋白、红细胞数目、红细胞压积指标显著低于同年龄和同性别对照组运动员。经过营养干预后贫血组与同性别、同年龄对照组相比各指标均无统计学显著性差异。运动员营养补充前后比较，女性贫血组HCT显著升高，男性、女性贫血运动员营运干预后血红蛋白浓度均具有升高，与实验前比较差异无显著性。

表2运动员实验前后红细胞相关指标的比较

2.2营养干预对运动性贫血运动员红细胞锌卟啉、血清铜蓝蛋白浓度的影响

研究结果女性贫血组实验前红细胞锌卟啉浓度显著高于女性对照组（高21.5％），男性贫血组实验前红细胞锌卟啉浓度显著高于男性对照组（高28.4％）；营养干预后女性贫血组红细胞锌卟啉浓度显著低于实验前（下降了30.9％），而男性贫血组营养干预后也显著低于男性对照组（下降了40.7％）；实验前各组运动员的血清铜蓝蛋白均无显著性差异，经过一个月营养干预的女性运动性贫血组运动员的血清铜蓝蛋白浓度明显低于未干预前（下降了22.5％），而男性运动性贫血组运动员经过营养干预后血清铜蓝蛋白浓度也具有下降的趋势（下降了23.7％），但无统计学意义；营养干预后男性贫血组血清铜蓝蛋白浓度显著低于安慰剂干预的男性对照组运动员的铜蓝蛋白浓度（降低了36.9％），女性对照组实验后有下降的趋势，男性对照组实验后有上升的趋势（升高19.4％），但显著性差异(表3)。

表3营养干预对运动性贫血运动员红细胞锌卟啉、

3讨论

3.1营养干预队运动性贫血运动员红细胞相关系数的影响

运动性贫血是运动员在不断的训练和比赛中产生的非病理因素引起的贫血。血红蛋白直接影响机体的有氧能力。优秀运动员的血红蛋白常高于一般正常人。国内诊断贫血的血红蛋白的标准为：成年男性低于120 g/L，女性低于105 g/L。运动性贫血的诊断标准一般与世界卫生组织诊断贫血的血红蛋白的标准相同：成年男性低于130 g/L，女性低于120 g/L。本实验通过测定运动性贫血运动员及抗运动性贫血剂治疗一个月后红细胞脂质过氧化、能量代谢、红细胞老化以及红细胞膜蛋白电泳，来进一步研究红细胞膜损伤及老化与运动性贫血的关系以及运动性贫血的预防和治疗措施。

正常人外周红细胞的寿命为120 d，红细胞从生成到老化消亡是一个自然的生理过程。在血液循环中，红细胞不断受到机体的代谢产生的自由基的侵袭，不可避免地会发生氧化损伤而造成红细胞的老化。当运动员进行激烈运动时，由于机体内代谢的加强，血液自由基的生成增加，血液循环中的红细胞遭受氧化应激损伤的机率增加，红细胞的老化增加。

WHO诊断贫血的标准为：血红蛋白，正常成年男性小于130 g/L，正常成年女性小于120 g/L。国内对运动员运动性贫血的诊断标准也采用WHO的贫血临界值。但是，此种与病理性贫血相同的诊断标准在实际应用时存在着严重的弊端，运动训练过程中的运动员在血红蛋白水平有所下降而低于病理性贫血标准贫血是指外周血中单位容积内血红蛋白的浓度、红细胞数目及（或）红细胞压积低于相同年龄、性别和地区的正常标准。此时已经明显影响运动能力［1］。本研究结果显示男、女运动性贫血组运动员的RBC、Hb和HCT显著低于对照组指标结果，并且男、女两贫血组的Hb平均值皆低于WHO诊断标准，说明运动训练引发的贫血一定程度上与病理性贫血类似，证明应用此分组方法研究运动性贫血的机理和防治措施是合理的、科学的。红细胞数目不一定能准确地反应贫血是否存在及贫血的程度，所以RBC和HCT指标并不及Hb指标判断贫血科学，即此结果中HCT水平的下降并不能判定贫血组实验后与实验前贫血程度的加重。女性对照组运动员在实验后RBC、HCT指标均表现出显著性下降的特点，RBC平均值水平也有降低的趋势，可能说明第二次测试前运动训练的强度和量高于第一次测试前或对照组研究对象也有运动性疲劳积累的迹象。而进行相同运动量运动训练的运动性贫血各组运动员进行抗贫血铁复合制剂营养干预后，血红蛋白浓度、RBC、HCT均呈现上升，表明“抗运动性贫血复合剂”具有缓解运动训练所造成的血红蛋白浓度下降的功效，延缓运动性贫血的恶化，促进运动员造血机能的提高。

3.2营养干预对运动性贫血运动员锌卟啉

实验结果表明：女性贫血组运动员的红细胞锌卟啉浓度实验前显著高于女性对照组（幅度达21.5％），男性贫血组实验前红细胞锌卟啉浓度显著高于男性对照组（高28.4％）。说明长期的大负荷运动训练造成了运动员运动性贫血，从而使运动员铁代谢发生紊乱，进而影响红细胞内的铁贮备，使红细胞铁缺乏，从而影响铁与原卟啉结合来合成血红蛋白，游离的原卟啉与锌结合增加，造成了红细胞锌卟啉浓度的增加的现象。因此，运动员的运动性贫血的发生与红细胞内铁贮备的低下有关，而红细胞内铁贮备又与机体铁贮备密切相关。经过一个月的抗贫血铁复合制剂营养干预后，女性贫血组红细胞锌卟啉浓度显著低于实验前（下降了30.9％），而男性贫血组营养干预后也显著低于男性对照组（下降了40.7％）。这说明给予贫血组运动员补充易于吸收的铁制剂可以提高其铁的贮备，并且抗贫血铁复合制剂中含有的丰富维生素C又促进了机体对铁的吸收，提高了血清铁的含量，从而明显改善红细胞内铁的状况，原卟啉与铁结合为铁卟啉，游离的原卟啉显著降低，从而使锌与原卟啉结合形成锌卟啉的量显著下降［2］。而对照组实验后的红细胞锌卟啉含量都有上升的趋势，这预示着长期的大负荷运动训练对红细胞铁代谢具有不利影响，如果在这种情况下不注意铁的补充，使其发展下去就会造成机体铁贮备的耗竭，从而对机体血红蛋白合成产生不利影响，这在运动训练导致对照组实验后血红蛋白浓度呈下降趋势中得到证实。锌卟啉与反映机体铁状况的血清铁、血清铁蛋白呈高度负相关，与红细胞转铁蛋白受体呈高度正相关，这与本研究的动物实验结果相一致。因此，在本实验的人体实验中进一步证实了红细胞锌卟啉是反映红细胞内铁状况以及机体铁代谢的良好指标。营养干预明显地改善了机体和红细胞的铁贮备，并降低了红细胞锌卟啉的浓度。

3.3营养干预对运动性贫血运动员血清铜蓝蛋白浓度的影响

铜蓝蛋白是一种丰富的血清α2－糖蛋白，其主要在肝脏中合成。一个铜蓝蛋白分子可以结合6个铜原子，它可以将血清中的二价铁离子氧化为三价铁离子，故又称亚铁氧化酶。转铁蛋白只能与三价铁离子结合才能转运铁，在生理条件下血清中铜蓝蛋白可以催化二价铁氧化为三价铁离子，从而促进铁与转铁蛋白的结合。因此铜蓝蛋白对铁的转运和平衡起着重要的作用［5，6］。铜蓝蛋白与组织铁的释放关系密切。而且与组织铁的摄取同样关系密切。铜蓝蛋白的合成由铁代谢来调控，当铁缺乏时可以刺激铜蓝蛋白的合成增加，从而促进铁的转运和进入细胞内来维持细胞内铁的稳态［5，7，9，10］。故临床上通常测定血清铜蓝蛋白浓度的升高可以反映机体铁定缺乏状况［5，6，11］。

运动训练对运动员血清铜蓝蛋白的影响研究报道较少，特别是当运动性贫血发生时对铜蓝蛋白代谢的影响目前尚未见研究报道。本实验结果：女性贫血组实验后血清铜蓝蛋白浓度显著低于实验前，男性贫血组实验后血清铜蓝蛋白浓度显著低于实验后男性对照组；而女性对照组实验后稍有下降，男性对照组则具有上升的趋势，且贫血组实验前铜蓝蛋白浓度都相应高于同性别的对照组。这可能是由于运动性贫血组运动员的铁缺乏刺激肝脏铜蓝蛋白合成和分泌增加所致［7］，经过抗贫血铁复合制剂干预后，铁制剂的补充有利于提高贫血组的血清铁浓度，从而减少肝脏铜蓝蛋白的合成和分泌，使贫血组血清铜蓝蛋白浓度显著下降［8］。由于铜蓝蛋白对于维持机体铁的转运和平衡起着重要作用。因此，抗贫血复合铁制剂也可以通过影响机体铜蓝蛋白代谢来稳定机体的铁代谢水平。同时血清铜蓝蛋白在一定程度上反映机体铁的状况。

4结论

1) 营养干预对缓解由于大强度的运动训练造成的血红蛋白低下具有较为明显的作用，具有预防运动性贫血发生和发展的作用

2) 运动性贫血组运动员的红细胞锌卟啉浓度实验前都显著高于对照组，说明当运动员发生运动性贫血时红细胞内的铁代谢紊乱，铁丢失增加而导致铁缺乏，红细胞锌卟啉是反映红细胞内铁状况的灵敏指标；运动性贫血运动员血清铜蓝蛋白浓度升高，血清铜蓝蛋白浓度指标可以反映机体铁贮备状况。

3) 营养干预显著降低了贫血运动员血清铜蓝蛋白浓度和红细胞锌卟啉浓度，表明本实验选用的营养补剂可有效的提高了运动员的铁贮备，改善由于运动训练造成的铁代谢紊乱，对预防运动性缺铁性贫血具有积极意义。

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投稿日期：2006-04-13

基金项目：科技部重点课题课题号：2002BA904B04－07；国家自然科学基金课题，课题号：30270642。

转铁蛋白篇6

关键词：糖代谢；铁代谢；血清铁蛋白；胰岛素抵抗；胰岛功能障碍

近年来研究发现，铁代谢异常与血糖升高密切相关，而且铁超载影响胰岛素的作用[1]。而据糖耐量受损的不同程度，糖代谢状态分三类，即正常血糖、糖调节受损（包括空腹血糖受损和糖耐量减低）和糖尿病。血清铁蛋白（Serum Ferritin，SF）是反应机体贮存铁的一个指标，已有研究[2]发现，糖尿病前期患者的SF高于对照组，且与血糖呈正相关，提出铁离子参与糖尿病前期的糖脂代谢异常，SF水平成为早期糖代谢紊乱的有效监测指标之一。

1 SF的概述

铁在人体内的贮存形式包括铁卟啉类和非铁卟啉类，SF属于非铁卟啉类，主要作用为贮存铁，为血红蛋白的合成和体内其他生理功能所需的铁提供一个储存库。SF是由法国科学家Laufberger在1937年分离马的脾脏实验发现的。铁蛋白是去铁蛋白和铁核心Fe3+形成的复合物，由肝细胞合成，主要分布于肝、脾、骨髓组织中，是体内含铁最丰富的一种蛋白，在铁代谢方面起着重要作用[3]。

有研究表明，SF与缺铁性贫血、肿瘤、肝肾疾病及糖尿病等均有一定的关系，近年来糖尿病与微量元素之间的相互关系成为各国学者研究的重要课题，铁超负荷可以引起胰岛素敏感性下降，同时，铁选择性储存在胰岛细胞内，引起β细胞凋亡[4]，铁超负荷时导致胰岛素抵抗，进一步加重2型糖尿病人的病情[5]。

2 SF与不同糖代谢状态的关系

SF水平高低与糖代谢状态有关，且SF与2型糖尿病的发生与发展密切相关，有研究表明，在对糖耐量不同程度受损的人群研究后发现，铁蛋白含量在2型糖尿病患者>糖耐量减低者>糖耐量正常伴一级亲属家族史者>正常对照者，说明铁在糖尿病发病进程中有相当重要的地位[6]。

2.1与正常糖代谢的关系 包括无糖尿病家族遗传病史的正常人群和糖耐量正常伴一级亲属家族史者，后者是2型糖尿病发病的高危人群。SF的生理功能：目前认为，机体摄入铁后，在肠黏膜中合成去铁铁蛋白，去铁铁蛋白可以调节吸铁率，铁蛋白分为碱性和酸性，碱性铁蛋白与铁的储存有关，酸性铁蛋白起着铁转运作用。

2.2与糖尿病前期的关系 糖尿病前期分为空腹血糖受损和糖耐量减低。空腹血糖受损主要表现为肝脏的胰岛素抵抗和基础状态下的β细胞功能异常，早期胰岛素分泌反应尚保存；糖耐量减低则主要表现为外周组织的胰岛素抵抗，同时糖负荷后早期胰岛素分泌减弱[7]。

有相关报道，在糖尿病前期人群中，SF高于正常男性上限值200 ug/L的人群其空腹血糖平均水平显著升高，说明SF与空腹血糖的改变存在一致性[8]。近年的研究提示，铁代谢异常与血糖升高密切相关，而且铁超载影响胰岛素的作用[9]。

2.3与糖尿病的关系 2型糖尿病的发病机制与胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能缺陷有关，在对发病机制的研究中发现，铁负荷可能是病因之一。已有的横断面调查显示，SF较高的人群患糖尿病的风险增加[10]。

目前，高SF引起糖尿病的机制尚不明确，可能跟氧化应激及胰岛素抵抗有关。近年来，国内研究有所发现：血SF水平与2型糖尿病患者血糖水平及HOMA-IR（胰岛素抵抗指数）呈正相关，且与胰岛β细胞功能呈负相关[11]。

3 结论

通过以上的研究，笔者认为在糖尿病前期人群中SF或许可以作为糖代谢异常的早期指标，预示着糖尿病的发生。同时鉴于所研究人群为西宁常居人口，西宁地处高海拔地区，最新有关海拔及低氧对SF的研究是：赵光斌、符本琪等人[12]在高原人血清铁蛋白、转铁蛋白测定及临床意义中指出高海拔地区低氧环境下，铁代谢率升高，体内储存铁增加，血清铁蛋白明显升高。对此有待以后进一步的研究。

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转铁蛋白篇7

【摘要】

目的 研究不同性别小鼠肝脏和脾脏铁相关蛋白烧伤前后的变化。方法 90℃水蒸气制备烧伤小鼠模型，采用比色法测定烧伤小鼠肝脏和脾脏中的铁含量，逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测肝脏hepcidin和膜铁转运蛋白1(Fpn1)表达，使用Western检测了肝脏和脾脏Fpn1蛋白表达。结果 烧伤后雄性小鼠脾脏铁含量升高，肝脏hepcidin表达升高同时肝脏和脾脏Fpn1蛋白含量减少。烧伤后雌性小鼠铁内稳态破坏程度较轻。结论 铁相关蛋白的表达变化可能是引起烧伤后铁内稳态破坏的重要原因，不同性别小鼠铁相关蛋白表达差异可能暗示了雌激素的保护作用。

【关键词】 烧伤 铁 hepcidin 膜铁转运蛋白

ABSTRACT: Objective To investigate the changes of ironrelated proteins in different sex mice before and after burns. Methods The burn model in mice were prepared with 90℃ vapor. Both liver and spleen iron contents were measured by colorimetric method. Hepatic hepcidin and Fpn1 mRNA content were determined with RTPCR. The Fpn1 protein was determined with Western blot. Results After burns， the content of spleen iron was increased and the expression of hepatic hepcidin was decreased in male mice， and at the same time the Fpn1 of liver and spleen was reduced. The content of iron homeostasis abnormality in female mice was less serious. Conclusion The change of ironrelated proteins after burns may be one cause of iron homeostasis abnormality. The differences of ironrelated protein expression in different sex after burns suggest that estrogen has a potentially protective function.

KEY WORDS: burn; iron; hepcidin; ferroportin 1

铁是生物生长和发育所必需的元素之一，其缺乏可造成贫血和细胞凋亡[1]。烧伤性贫血是一种炎症性贫血，是严重烧伤的常见并发症，常见临床特征包括贫血、血清铁含量下降、巨噬细胞铁滞留等[2]，这是由于烧伤引起的炎症反应可破坏机体铁的内稳态。目前已发现多种与铁内稳态相关蛋白，如hepcidin[3]、膜铁转运蛋白1(ferroportin 1， Fpn 1)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor1， TfR1)等[4]，这些蛋白共同调节了机体铁的内稳态。前期研究已确定hepcidin在烧伤性贫血发生过程中发挥着重要作用，而本实验目的在于进一步确定烧伤对铁相关蛋白及组织铁含量的影响，另外还确定烧伤对不同性别小鼠铁代谢影响的差异。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

2月龄KM小鼠(清洁级)购自河北省实验动物中心，体重25～27g，雌雄各半；试剂亚铁嗪(ferrozine)、Trizol试剂盒、AMV逆转录酶、PCR引物、DEPC等均购自上海生工生物工程技术有限公司，小鼠Fpn1一抗为Alpha Diagnostic公司产品，TfR1一抗为invitrogen产品，actin一抗为Sigma生产，HRP标记的羊抗小鼠二抗购自北京中山金桥，发光底物为Pierce公司产品，其他试剂为国产分析纯。1.2 烧伤模型小鼠的制备 将12只小鼠先雌雄分开，然后1/2雌雄小鼠进行烧伤处理，另外1/2作为对照。先对所有小鼠背部使用Na2S进行脱毛处理(面积占体表总面积30%)，12h后对烧伤组小鼠裸露处用90℃水蒸气处理15s，基本达到深Ⅱ度和Ⅲ度烧伤，对照组小鼠使用室温蒸馏水处理相同时间。处理完毕后对所有小鼠禁食(减少肝糖原)，但保留水供应。12h后将所有小鼠处死，取脾脏和肝脏备用。

1.3 小鼠肝脏和脾脏铁含量的测定

参照文献[5]并做适当修改。称取10mg干燥肝脏或脾脏组织并研碎，将其溶于100mL盐酸和300mL/L三氯醋酸混合液(1∶1)，随后使用超声处理(10s，3次)，95℃水浴30min，离心取上清。96孔板中依次加入水(空白对照)、铁标准液(84.7μmol/L)和组织上清液50μL，然后加入含10mmol/L亚铁嗪和32.6mmol/L抗坏血酸TrisHCl缓冲液(浓度50mmol/L，pH 4.0)50μL，37℃反应15min，用酶联免疫检测仪595nm测定各孔吸光度，将结果换算成铁浓度并计算单位克组织中肝脏和脾脏的铁含量。

1.4 肝脏hepcidin和Fpn1 mRNA的RTPCR测定

取适量小鼠肝脏组织先用Trizol试剂盒提取RNA，再通过逆转录获得cDNA，然后利用PCR扩增。Hepcidin和actin扩增20个循环(94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min)，Fpn1扩增29个循环(94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s)。将所得PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳分离，所得结果使用凝胶成像系统扫描并计算吸光度值。所用PCR引物为：

Hepcidin：Forward为CCTATCTCCATCAACAGATG；Reverse为AACAGATACCACACTGGGAA

Fpn1：Forward为ACAAACAAGGGGAGAACGC；Reverse为ATGACGGACACATTCTGAACCA

βactin：Forward为AGCCATGTACGTAGCCAT

CC；Reverse为TTTGAGGTCACGCACGATTT

1.5 肝脏和脾脏Fpn1以及肝脏TfR1的Western blot测定

100mg组织先用蛋白裂解液1mL处理，所得溶液使用考马斯亮蓝G250测定蛋白浓度，以保证蛋白上样量为50μg。100g/L的SDSPAGE分离胶分离，300mA转膜45min，将NC膜用脱脂奶粉室温处理2.5h，一抗4℃过夜，二抗室温2h，化学发光显带，并将结果记录。

1.6 统计学处理

小鼠肝脏和脾脏铁含量、小鼠肝脏hepcidin和Fpn1的mRNA相对含量数据采用成组设计的定量资料t检验分析，结果用柱形图显示。

2 结 果

2.1 烧伤后小鼠肝脏和脾脏铁含量的变化

组织铁测定显示：烧伤后雄性小鼠肝脏铁虽有微量升高但差异不显著，而脾脏铁明显增加(P

2.2 烧伤对小鼠肝脏hepcidin和Fpn1表达的影响

RTPCR结果显示：雄性小鼠烧伤后肝脏hepcidin的mRNA相对值(以βactin为内参照)明显增加(*P

2.3 烧伤对小鼠肝脏和脾脏Fpn1及肝脏TfR1蛋白含量的影响

Western blot显示：烧伤后雄性小鼠肝脏和脾脏Fpn1含量明显减少，然而肝脏TfR1却有一定程度增加；与此不同的是烧伤后雌性小鼠肝脏和脾脏Fpn1的蛋白含量下降都不显著，而肝脏TfR1却显著减少(图3)。

3 讨 论

烧伤是一种严重的机体损伤，可造成多种不良后果，铁代谢紊乱引发的贫血是其中之一。由于铁是血红蛋白生物合成的必需原料，它的含量减少使红细胞生成减少和机体抵抗力下降。随着铁代谢相关蛋白研究的深入，人们对铁内稳态调节分子机制的理解更加全面，这对烧伤性贫血发生机制的认识有重要帮助。本研究显示：烧伤可引起雄性小鼠hepcidin表达显著升高，同时肝脏和脾脏的Fpn1蛋白明显减少，肝脏TfR1却出现一定增加，脾脏铁滞留，肝脏铁少量增加(考虑到肝脏所占比重，少量增加对血清铁利用的影响也较为显著)，小鼠出现贫血。

相关研究表明烧伤可造成机体炎症的发生，而炎症可诱导hepcidin表达增加[3]。hepcidin是一种重要的机体铁内稳态负调节因子，它可诱导细胞铁输出蛋白Fpn1的内吞和随后的细胞内降解[6]，故Fpn1会随着hepcidin的增加而含量下降，从而造成细胞内铁输出减少。TfR1是位于细胞膜上的转铁蛋白受体，是组织的主要摄铁蛋白。已有研究证明炎症可诱导TfR1表达增加[7]，而本研究也得到相似结果。Fpn1和TfR1两种蛋白含量的这种变化趋势造成组织(尤其是肝脏和脾脏)铁摄入增加而排出减少，随后的结果是机体一方面出现组织铁滞留，另一方面造成血清可利用铁减少而出现贫血。

本研究还初步显示：烧伤对不同性别小鼠铁内稳态的影响存在差异。烧伤后雌性小鼠内稳态破坏程度明显低于雄性，从机体铁相关蛋白表达变化来看，二者也明显不同。正常雌性小鼠体内hepcidin较雄性小鼠低，而组织铁含量高于雄性，烧伤后尽管hepcidin表达出现增加，但同时Fpn1表达也增加，这可缓解因hepcidin表达增加诱导Fpn1降解而引起Fpn1蛋白减少的后果；Western blot也确定雌性小鼠烧伤后肝脏和脾脏Fpn1没有出现明显下降的趋势。此外烧伤后雌性小鼠的TfR1不升反降，这种变化可减少机体贫血状态下的血清铁摄入。雌雄小鼠铁蛋白表达的多方面差异使雌性小鼠烧伤后组织铁滞留较少，而血清可利用铁相对增多，故贫血程度较轻。

已知肝脏多种基因的表达都具有性别差异[8]。浓度测定显示hepcidin也具有这种特点，男性血清中hepcidin含量明显高于女性[9]。本实验也显示雄性小鼠hepcidin的mRNA相对值明显高于雌性。已有研究证明雌激素可抑制炎症引起的白介素6(IL6)表达增加[10]，而IL6是hepcidin表达的重要诱导因素之一，并且IL6诱导hepcidin需要转录信号转导子和激活子3(signal transducer and activator of transcription3， STAT3)的参与[11]，而STAT家族多个成员参与了性别差异基因的表达[8]。结合这些分析可初步推断，雌激素可能参与了hepcidin的表达，此外雌激素与Fpn1和TfR1的关联尚无法确定，但可初步得出的结论是雌性小鼠烧伤后贫血程度较轻的一个可能原因是雌激素参与了铁相关蛋白的表达调节过程。

本研究初步说明烧伤造成的铁相关蛋白表达变化是造成烧伤性贫血发生的原因之一，而雌激素可能通过影响相关蛋白的表达而发挥对机体的保护作用。详细机制尚待进一步阐明。

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转铁蛋白篇8

【关键词】 孕妇； 铁代谢指标； 缺铁性贫血； 妊娠期糖尿病

中图分类号 R556.3 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2016）1-0059-02

doi：10.14033/ki.cfmr.2016.1.032

缺铁性贫血（IDA）是指各种原因缺铁导致红细胞生成减少引起的贫血，按铁缺乏程度分为3个阶段：缺铁期（ID）、缺铁性红细胞生成期（IDE）、缺铁性贫血期（IDA）[1]。妊娠期糖尿病与体内多种微量元素（Fe、Cu、Mg、Zn等）的代谢异常有关，其中以铁的过量蓄积尤为突出[2]。为了解孕妇缺铁情况，铁代谢指标与贫血的关系及妊娠期糖尿病孕妇铁代谢指标，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年5-9月在笔者所在医院产前检查并生产的既往健康孕妇248例，年龄19～39岁，平均（28.6±5.1）岁，孕周28～35周。所有病例均未补铁、输血，无肝、肾、内分泌以及血液疾病史，无感染、炎症。以上孕妇均排除地贫筛查阳性、G6PD缺乏及妊娠期糖尿病。根据年龄、血红蛋白（Hb）结果将孕妇分组。同时选择同期已确诊的妊娠期糖尿病孕妇50例，随机选取248例孕妇中的60例作为对照。根据《血液学检验》诊断标准作为ID、IDE、IDA各期判断指标[1]。孕妇以血红蛋白

1.2 方法

1.2.1 Hb测定 抽取EDTA抗凝静脉血2 ml，用sysmex（xs-800i）全自动血球分析仪测定血液Hb。

1.2.2 铁代谢指标测定 包括血清铁（SI）、铁蛋白（SF）、总铁结合力（TIBC）、转铁蛋白（TRF），将产科送检的孕妇静脉血3 ml，离心后取血清用日产7600全自动生化仪检测各指标含量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P

2 结果

2.1 贫血与非贫血孕妇铁分布情况比较

贫血组铁缺乏率显著高于非贫血组，差异有统计学意义（字2=44.5，P

2.2 孕妇年龄与铁缺乏率的关系

随着年龄增加，孕妇铁缺乏率逐渐增加，详见表2。

2.3 不同Hb水平的孕妇铁代谢指标检测结果比较

随着血色素SI、SF呈下降趋势，TIBC、TRF呈升高趋势。Hb 100～110 g/L与>120 g/L组比较，除TIBC外，铁其余各指标比较差异均有统计学意义（P

2.4 妊娠期糖尿病组和对照组孕妇铁代谢指标检测结果比较

妊娠期糖尿病组SF高于对照组，差异有统计学意义（P

3 讨论

妊娠期由于胎儿的生长发育和孕妇的生理需要，对铁的需求量增加，王小钦[3]报道，妊娠妇女对铁的需求量是普通人的2～4倍，其需求部分通过膳食摄取来满足，还有部分来源于母体铁储备，孕妇会因妊娠反应、胃酸缺乏、胃肠蠕动减弱等因素影响铁的吸收。正常的铁平衡通过吸收的变化以及铁从储存部位的释放来完成。当铁摄入不足，丢失过多或需要增加时，造成长期铁的负平衡导致机体缺铁。铁是人体含量最多的微量元素，为必需的金属元素，成年人体内共含铁3～5 g，而孕妇含量更低，铁主要存在于血红蛋白中，含铁总量约为2.6 g。人体内的血红蛋白由四个亚基构成，血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成，血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合。缺铁影响血红蛋白合成，是妊娠期贫血最主要的原因，表1结果贫血孕妇缺铁率明显高于非贫血孕妇，印证了这一点。 缺铁还会导致机体多种代谢紊乱，影响免疫、胃肠道及内分泌等系统功能[4]。本研究结果显示，随着年龄增大，孕妇铁缺乏率增加。传统认为，女性最佳生育期为23～30岁，提示对于25岁以上的孕妇，应进行铁代谢检测，预防发生缺铁性贫血。为防止缺铁，孕妇应注意合理的膳食结构，多食用含铁丰富、吸收率高的瘦肉、动物肝脏、血、红枣等以增加铁的摄取，同时食用富含维生素C的果蔬以促进铁的吸收。影响缺铁性贫血的因素是多方面的，与年龄、收入、文化程度、月经量过多、妊娠反应、吸收不良及饮食结构等有关。表1中贫血但不缺铁的孕妇占47.5%，原因是孕妇骨髓造血增加，红细胞增多。而血容量从孕6周开始逐渐增多，30～34周时达最高峰，然后稍下降。红细胞增加少于血浆容量的增长，经过逐渐累积使血液被稀释，特别对于孕前血红蛋白处于正常低值的孕妇极易出现贫血。铁代谢指标，对判断缺铁、区分缺铁性贫血与妊娠期生理性贫血十分重要。从食物中吸收的铁被还原为二价铁离子（Fe2+），经膜铁转运蛋白FPN1运载出细胞进入血浆，被铜蓝蛋白氧化成三价铁离子（Fe3+），即血清铁（SI）。SI含量与铁的吸收、利用、贮存及排泄的动态变化有关。从肠道吸收进入肠上皮细胞内的铁以铁蛋白的形式储存在肠上皮细胞内，SF能够合成并提供铁元素，具有很强的铁储备能力，储存铁用于血红蛋白合成。SF是目前公认的判断储存铁耗竭的最敏感指标，铁蛋白下降表明储存铁逐渐不足[5]。但SF是一个急性时相反应蛋白，在创伤、炎症、感染时会升高，而且个体间差异较大，单一指标具有一定局限性。TIBC反映血液中可利用的转铁蛋白的总数量，当铁贮备减低时，TIBC增高。血清铁以三价铁离子（Fe3+）形式和血液中的转铁蛋白结合在血液中运输，当血清铁减少时，血液中未结合的转铁蛋白浓度升高。TRF作为一种铁的转运体，从肝实质细胞和肠上皮细胞等处把铁转运给骨髓的幼红细胞和网织红细胞以便合成HGB，研究证实TRF代谢活跃可以促进铁的吸收和利用[6-7]。铁代谢指标能反映机体的铁含量，而铁是血红蛋白合成的必需元素，当机体铁逐渐缺乏导致孕妇血红蛋白合成逐渐减少，甚至发生贫血。本研究结果显示，随着血色素降低SI、SF、呈下降趋势，TIBC、TRF呈升高趋势，TIBC敏感性较其余指标低。表明Hb下降与铁代谢指标变化密切相关。贫血的孕妇与非贫血的孕妇比较SI、SF下降，TIBC、TRF升高，表明贫血孕妇体内铁含量低于非贫血的孕妇，缺铁可发生贫血，从血红蛋白正常到贫血，血红蛋白下降越多，孕妇体内铁含量减少越明显。

妊娠期糖尿病为常见的妊娠合并症。本研究结果显示，妊娠期糖尿病组SF高于对照组。SF升高是体内铁过量的表现，提示机体存在铁负荷。过量的铁储存到胰岛细胞内引起β细胞凋亡，影响胰岛素分泌，使血糖升高。有研究表明铁超负荷时导致胰岛素抵抗，即通过拮抗胰岛素的作用而引起外周组织对葡萄糖利用的降低使血糖升高[8-9]。事实上，即使没有明显的过量铁沉着，铁元素也对葡萄糖代谢产生显著影响。铁和糖有着重要的相关性及可逆性，铁影响糖代谢，而长期高血糖又损伤铁代谢通路[10]。铁与糖的关系复杂，临床上对于SF升高的孕妇应进行糖尿病筛查，有利于发现妊娠期糖尿病。对于妊娠期糖尿病孕妇应进行SF检测，适当降低铁储备，有利于妊娠期糖尿病治疗，同时还能避免因盲目补铁而加重妊娠期糖尿病的病情。

总之，缺铁是孕妇贫血的主要原因，铁代谢指标的变化与贫血发生紧密相关，预防贫血进行补铁的同时应对SF进行监测，对SF偏高的孕妇应注意妊娠期糖尿病筛查。

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转铁蛋白篇9

【关键词】 贫血，缺铁性；大鼠；铁载体；评价研究

【中图分类号】 R-332 R 556.3 【文献标识码】 A 【文章编号】 1000－9817(2007)05－0391－03

缺铁性贫血是世界范围内最常见的一种营养素缺乏病，在发展中国家尤为突出，是重要的全球性营养问题[1-2]。目前，对铁缺乏的易感因素和铁吸收代谢过程的研究已较为深入，少数发达国家以特定人群为对象进行缺铁的预防研究，已取得了阶段性成果[3]。但在大多数发展中国家，铁摄入不足或吸收障碍所导致的缺铁性疾病，仍然是科研工作者及临床医生所面临的一大难题。有研究表明，约一半发展中国家的儿童和约10%的发达国家儿童都表现出不同程度的铁缺乏[4]。目前国内外预防缺铁性贫血的研究主要侧重于在食物中进行铁的添加强化，以提高铁的摄入量，通过各种铁强化食品去满足机体对铁的需要。但实践表明，传统的铁强化食品中铁的吸收率仍较低，有的因存放时间较久，易被氧化而影响食物的感官性状和口感。因此，研制具有生物利用率高、口感好、符合大众化需要的补铁食品是营养学和食品生产领域研究的热点。笔者就巧克力载体铁剂加橙汁对缺铁性贫血大鼠复健的效果进行了实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料 于2006年3-6月，选用健康清洁级SD大鼠60只，雌、雄各半，体质量为70～80 g，由南方医科大学动物中心提供(实验动物机构许可证号2002-009 2005A047)。雌、雄大鼠养于不锈钢笼内，控制室温在20 ℃左右，相对湿度50%～60%，每笼5只。参照AOAC推荐配方[5]改良配制低铁饲料(硫氰酸钾法[6]测铁含量

1.2 方法

1.2.1 缺铁性贫血模型的建立 先以常规饲料适应性喂养大鼠3 d，按照随机数字表法随机抽取20只(雌、雄各半)作为对照组，其余40只为模型组，编号后饲养于不锈钢笼中，完全避免铁接触。实验前称体质量，测其血红蛋白浓度、红细胞计数，并记录。对照组食常规鼠饲料，饮自来水；模型组喂低铁饲料，饮蒸馏水。模型组全部大鼠每周剪尾放血3次，放血量每次每只0.5～1 mL。每周称体质量、测血红蛋白浓度、红细胞计数。喂养3周后，模型组平均血红蛋白浓度降至90 g/L左右时，模型建立成功。2组大鼠各随机处死10只(雌、雄各半)，测大鼠体质量及脏器系数、血清铁及血清转铁蛋白受体。

1.2.2 恢复实验组 将建模时余下的10只大鼠为正常对照组，喂常规鼠饲料和饮自来水，不进行任何处理。将模型组余下的30只大鼠按照随机数字表法随机分为3个组，每组10只，雌、雄各半，分别为模型对照组、硫酸亚铁组及巧克力橙汁组。3组饮食及灌胃情况：模型对照组喂常规鼠饲料，饮蒸馏水，每日以蒸馏水灌胃；硫酸亚铁组喂常规鼠饲料，饮蒸馏水，每日以硫酸亚铁溶液灌胃；巧克力橙汁组喂常规鼠饲料，饮蒸馏水，每日以巧克力载体铁剂加橙汁灌胃。其中硫酸亚铁组及巧克力橙汁组灌胃液的含铁量均为6 mg/(kg・d)。每周2次称体质量，并测血红蛋白浓度、红细胞计数。干预40 d后，终止实验。观察缺铁性贫血大鼠的血液指标(血红蛋白、红细胞)变化情况，测血清铁及血清转铁蛋白受体。称取4 g肝组织，制备肝细胞蛋白质，280 nm波长定量，取50 μg加入顺乌头酸酶测定体系中作用1 min，即于零级反应期测定240 nm波长吸光度，计算顺乌头酸酶活性[7]；另于同样体系中测定硫酸亚铁及巧克力载体铁剂加橙汁处理的细胞浆蛋白质的酶活性，同时计算巧克力载体铁剂加橙汁的生物利用率[8]。

1.3 统计学分析 数据采用SPSS 10.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验，多样本均数比较采用方差分析。

2 结果

2.1 缺铁性贫血模型建立后大鼠各项指标变化情况

2.1.1 体质量及脏器系数 实验前，对照组和模型组大鼠体质量差异无统计学意义(P＞0.05)；3周后模型组大鼠体质量减轻，并明显低于对照组(P＜0.05)。见表1。模型组大鼠肝脏、脾脏的脏器系数增加，并明显高于对照组(P＜0.01)；心脏及肾脏脏器系数无明显差异(P＞0.05)。见表2。

2.1.2 血红蛋白、红细胞、血清铁和转铁蛋白受体 血红蛋白、红细胞血清铁和转铁蛋白受体在造模成功后明显改变，其中血红蛋白、红细胞、血清铁显著低于对照组，而转铁蛋白受体显著高于对照组(P值均＜0.01)；对照组的指标前后比较，差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。

2.2 实验40d后贫血恢复情况 由表3可见，正常对照组及模型对照组大鼠处理前后血红蛋白、红细胞、血清铁和转铁蛋白受体差异均无统计学意义(P值均＞0.05)；硫酸亚铁组及巧克力橙汁组的各项指标在处理前后都有所变化，其中Hb，RBC，SI处理后均比处理前升高(P值均＜0.01)；sTfR处理后显著降低。处理后的各项血液指标显示，硫酸亚铁组、巧克力橙汁组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，硫酸亚铁组、巧克力橙汁组与模型对照组比较有明显不同(P＜0.01)。见表4。

恢复实验前模型对照组、硫酸亚铁组、巧克力橙汁组大鼠的肝细胞浆蛋白质顺乌头酸酶活性明显低于正常对照组。而经过恢复实验处理后，硫酸亚铁组及巧克力橙汁组的顺乌头酸酶活性显著高于治疗前(P值均＜0.01)。

由表5可见，以恢复期硫酸亚铁的生物利用率为100.0%，则巧克力载体铁剂加橙汁使IDA大鼠的血红蛋白总铁增加值，与硫酸亚铁使IDA大鼠血红蛋白总铁增加值之比，相对生物利用率为106.7%。说明相对于单纯硫酸亚铁处理组，巧克力载体铁剂加橙汁的相对生物利用率增加明显。

3 讨论

本组模型建立的方法采取的是低铁饮食辅以定期少量放血，并通过一般形态、各项血液及其他指标与正常大鼠进行比较，从而说明缺铁性贫血模型的建立。在恢复试验中，观察不同处理组大鼠的营养状况及各项血液指标含量的恢复情况，结果显示，以硫酸亚铁组和巧克力橙汁组恢复的速度最快，而仅靠从食物中摄取铁的模型对照组恢复速度最为缓慢。相对于单纯硫酸亚铁组，巧克力载体铁剂加橙汁的生物相对利用率明显增加。巧克力是一种营养素很全面的食品，含铁量也较为丰富，且其中所含的核黄素、果糖、脂肪、蛋白质、维生素A及维生素E均有促进铁吸收的作用[9-11]。但它也含有抑制铁吸收的成分――多酚类化合物，因此，选择在巧克力载体铁剂中加入足量的铁吸收促进剂――富含维生素C的橙汁。在该实验中，笔者选用的某品牌橙汁经过维生素C含量测定，每100 g中含有187 mg的维生素C。按每只大鼠6 mg/（kg・d）的剂量补充铁剂，通过计算，巧克力橙汁组的灌胃液中维生素C含量约为铁剂含量的3倍，符合剂量要求[12]。

转铁蛋白篇10

[关键词] 乳铁蛋白；成骨细胞；胰岛素生长因子结合蛋白-3；胰岛素生长因子结合蛋白-4；胰岛素生长因子结合蛋白-5

[中图分类号] R329.2+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（b）-0004-05

乳铁蛋白是一种分子量为80 kDa的铁结合蛋白，属于转铁蛋白家族，主要存在于母乳、中性粒细胞及其次级颗粒中[1]。正常情况下，乳铁蛋白在体内的浓度为2×106～6×106 g/ml[2]，具有免疫调节、抑菌抗炎等作用，是一种多效应因子[3-4]。近年来，乳铁蛋白被发现具有促进成骨细胞增殖和骨生长的作用。除了胰岛素样生长因子结合蛋白1（insulin-like growth factor binding protein 1，IGFBP-1），成骨细胞表达IGFBP-2～6，它们是六种同源异构物[5]。大量相似的研究发现，成骨的增殖和骨形成受胰岛素生长因子结合蛋白的调控，其中IGFBP-3，4，5很可能是发挥作用的关键因子。本研究通过不同浓度乳铁蛋白作用于原代鼠成骨细胞1、3、5、7 d后用实时荧光定量PCR检测大鼠成骨细胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达，以探讨乳铁蛋白影响成骨细胞增殖及与IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之间的关系机制。

1 材料与方法

1.1 材料

出生24 h内的SD乳鼠（吴氏动物），牛源乳铁蛋白（恒天然 Fonterra，纯度>90%），胎牛血清（GIBCO），DMEM（GIBCO），0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO），双抗（青霉素、链霉素，Hyclon公司），碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物公司），SABC免疫组织化学试剂盒（武汉博士德公司），Ⅰ型胶原酶（Invitrogen）DMSO（GIBCO），TRIZOL（美国Invitrogen公司），RNAiso Plus（TAKARA），Primescript RT reagent kit（TAKARA：DRR037A），dH2O，引物（TAKARA），SYBR？ Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）（Takara Code：DRR081），反转录仪（Takara），实时荧光定量PCR仪（Takara），紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000）。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠成骨细胞的培养

取出生24 h内的SD乳鼠6只，颈部脱臼处死消毒，剪下头颅浸泡于75%乙醇5 min。将头颅置于装有PBS的培养皿中，剔除颅骨的结缔组织及其骨膜。用PBS冲洗骨片至发白后将其剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织片。3 ml 0.25%胰酶（含EDTA）磁粒子37℃恒温搅拌15 min，去上清后加入0.25%胰酶和Ⅰ型胶原酶（1 ml∶4 ml）混合物，再次37℃恒温搅拌消化60 min。取上清，1000 r/min离心10 min后弃上清。取10%完全培养液6 ml重悬，一分为二置于两个培养瓶中，10 min差速贴壁分离成纤维细胞两次后置于37℃、湿度5%的细胞培养箱内培养。

1.2.2 成骨细胞的鉴定

1.2.2.1 细胞形态学观察 在倒置相差显微镜下观察细胞形态结构及生长状况。

1.2.2.2 碱性磷酸酶染色 采用偶氮偶联法，将二代细胞接种于5 cm×5 cm无菌盖玻片上，置于6孔板培养。固定：取出细胞爬片用固定液固定3 min左右；加底物应用液：在固定后的细胞爬片上滴加新鲜配制的底物应用液并盖满样本部分，加盖疏水膜，放置湿盒中，避光37℃孵育15 min，水洗；复染：用苏木素或甲基绿染3 min，水洗，镜检，拍照。

1.2.2.3 Ⅰ型胶原免疫组织化学（SABC法） 取出提前制备好的密度均匀的细胞爬片，PBS洗3遍，5 min/次，用多聚甲醛固定30 min；吸出固定用的多聚甲醛，用PBS洗3遍，5 min/次，用蒸馏水洗3次，2 min/次；用3%H2O2去离子水室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性；蒸馏水浸泡冲洗5 min；滴加封闭山羊血清工作液，室温下孵育15 min，甩去多余液体勿洗；滴加稀释的一抗，即兔抗大鼠的Ⅰ型胶原抗体，浓度为1∶100，37℃孵育2～3 h或4℃过夜（对照组不加一抗，用蒸馏水代替）；PBS冲洗3 min×3次，加入生物素标记山羊抗兔二抗；20～37℃孵育20 min，用PBS洗2 min×3次；滴加试剂SABC，20～37℃孵育20 min，PBS洗5 min×4次；DAB显色：取1 ml蒸馏水，加入试剂盒中A、B、C液各1滴，混匀后加至细胞爬片，室温下显色，镜下控制反应时间（5～30 min），蒸馏水冲洗；镜下观察染色情况并拍照。

1.2.3 实验分组

实验根据乳铁蛋白浓度共分为6组，分别为对照组（0 μg/ml）、乳铁蛋白1组（0.1 μg/ml）、乳铁蛋白2组（1 μg/ml）、乳铁蛋白3组（10 μg/ml）、乳铁蛋白4组（100 μg/ml）、乳铁蛋白5组（1000 μg/ml）。

1.2.4 实时荧光定量PCR测定IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的相对表达量

1.2.4.1 引物的设计和合成 引物详细信息从GenBank获取，引物合成由TAKARA Biotechnology （Dalian）Co.，Ltd.完成。引物序列和分子量见表1。

1.2.4.2 总RNA的提取和cDNA的合成 贴壁细胞总RNA的提取按照RNAiso Plus（Takara code：D9108A）的操作说明书提取，用紫外分光光度计检测浓度和纯度，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。参照Primescript RT reagent kit （Takara公司）说明书配制反转录反应体系，在反转录仪上进行cDNA的合成。

1.2.4.3 实时荧光定量Real Time PCR反应 根据说明书配制PCR反应液后在扩增仪上进行PCR反应。PCR扩增标准程序：Stage one：预变性（Repeat 1），95℃ 30 s。Stage two：PCR 反应（Repeat 40），95℃ 5 s；60℃ 30 s（荧光信号采集）。Stage three：融解曲线分析（Repeat 1），95℃ 15 s；60℃ 30 s；95℃，15 s荧光信号采集。

根据Real Time PCR反应结果中的Ct值，进行mRNA的相对表达量计算，每组设3个平行孔，实验分别重复3次。mRNA的相对表达量计算：设定对照组相对表达量为1，表达差异计算：=2-ΔΔCt。ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）对照组。2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学分析软件处理数据，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量设计的方差分析，以P

2 结果

2.1 相差显微镜下的原代大鼠成骨细胞（染色前）

在相差显微镜下观察细胞，发现细胞状态良好，细胞完全伸展，折光性好，可见胞核及胞质，体积较大，胞质丰富，多为单核，有多边形、长梭型及三角形，呈“铺路石样”排列，胞质向外伸展，并伸出突触，符合成骨细胞的特征（图1）。

2.2 成骨细胞鉴定

2.2.1 SABC：Ⅰ型胶原酶免疫组织化学结果

免疫组织化学染色结果阳性，胞质被染成棕黄色，符合成骨细胞特征（图2）。

2.2.2 ALP鉴定结果

倒置相差显微镜下可见细胞呈典型成骨细胞特征，贴壁生长，体积较大，胞质丰富，形态不规则，多为单核，有1～3个核仁，细胞呈三角形、多边形、长梭形等，呈“铺路石样”排列，胞质向外伸展，并伸出突触。碱性磷酸酶染色结果显示，细胞呈阳性反应，细胞核呈蓝紫色，胞质中有咖啡色颗粒，有少量颗粒分散在细胞周围，符合成骨细胞特征（图3）。

2.3 不同浓度乳铁蛋白干预原代大鼠成骨细胞1、3、5、7 d后对IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA表达的影响

2.3.1 IGFBP-3 mRNA的表达

第1天，乳铁蛋白1～5组与对照组比较，乳铁蛋白4、5组抑制了IGFBP-3 mRNA的表达；第3天差异无统计学意义（P>0.05）；第5天，乳铁蛋白1～4组与对照组比较，抑制了IGFBP-3 mRNA的表达，而乳铁蛋白5组又促进了其表达，但是促进趋势不高；第7天，乳铁蛋白3、4组与对照组比较，抑制了IGFBP-3 mRNA的表达，而乳铁蛋白5组又促进了其表达（表2）。可见，乳铁蛋白对IGFBP-3 mRNA表达的调控不稳定，与时间和浓度不呈一定规律性。

2.3.2 IGFBP-4 mRNA的表达

第1、5天，与对照组比较，除了乳铁蛋白1组外，其他各组对IGFBP-4 mRNA的表达呈一定浓度梯度的抑制（P

2.3.3 IGFBP-5 mRNA的表达

第1天，与对照组比较，乳铁蛋白1～5组对IGFBP-5 mRNA的表达主要起抑制作用（P

3 讨论

乳铁蛋白是一种铁结合蛋白，主要存在于母乳、中性粒细胞及其次级颗粒中[1]，近年来被发现有促进成骨细胞增殖的作用[5-6]。Cornish等[7]利用培养3周的原代大鼠成骨细胞研究以评估骨小结形成，骨小结形成包括分化的成骨细胞的两种骨形成活动即骨基质沉积和矿化，研究发现乳铁蛋白剂量依赖性地增加骨小结数量及骨矿化区。同时，本课题前期研究[8]发现不同浓度乳铁蛋白干预原代大鼠成骨细胞1、3、5、7 d后具有促进成骨细胞增殖的作用。目前，乳铁蛋白作用的分子机制大部分仍未清楚。最近，有研究用芯片技术研究乳铁蛋白对成骨细胞基因表达的改变，发现上调了人原代成骨细胞胰岛素样生长因子1（IGF-1）mRNA的表达[9]，成骨细胞IGF-1表达上调后，与IGF-1受体（IGF-1R）结合，引起胰岛素受体底物1（IRS-1）磷酸化，再激活PI3K依赖的Akt，最后促进成骨细胞增殖和存活。但是，激活这条信号通路的前提是IGF-1与胰岛素生长因子结合蛋白（IGFBPs）分离，这样游离的IGF-1才能与IGF-1R结合[10]。并且生理条件下，IGFBPs比IGF-1更加严密调控着成骨细胞的增殖与骨形成[11]。故而，关于IGFBPs与成骨细胞增殖和骨形成的相关研究不断涌出。有研究指出持续过表达IGFBP-3的转基因小鼠，被发现破骨细胞数量和骨吸收明显增加，而抑制了成骨细胞的增殖和骨形成[12]。同时，有研究用rhIGF-1/IGFBP-3复合物发现有促进骨形成的作用[13]。与骨相邻的肿瘤细胞可以释放IGFBP-4，其可能抑制IGF-1促进成骨细胞增殖的作用，并且导致骨形成减少[14]。也有研究指出IGFBP-5可促进IGF-1对成骨细胞的刺激作用[11]。分别向敲除IGF-1的成骨细胞和野生型小鼠成骨细胞内添加IGFBP-5后，发现成骨细胞增殖以及骨形成标记的ALP活性和骨钙素的表达增加。同样的，分别在敲除IGF-1和野生型小鼠颅骨外骨膜上局部注射rhIGFBP-5后，骨形成系数和标志ALP以及骨钙素增加[15]。有体外研究发现，过表达IGFBP-5的小鼠成骨细胞株MC3T3却发现成骨细胞功能降低，骨形成标记和骨基质形成减少[16]。可见，IGFBPs在影响成骨细胞增殖和骨形成的作用上存在争议。但是，不可否认的是IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5在调控骨量和影响成骨细胞增殖方面可能发挥着重要作用。

故而，根据一系列研究，本研究提出乳铁蛋白是否可以通过影响IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5的表达而达到调控骨量和影响成骨细胞增殖的作用这一问题。然而要证明这点，首先得探索乳铁蛋白是否影响了IGFBPs的表达。正如本研究结果显示乳铁蛋白影响原代大鼠成骨细胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达。其中，乳铁蛋白对IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA的表达的调控不稳定，不同时间及浓度的干预对其的表达没有一定的规律性。对IGFBP-4 mRNA的表达的影响呈时间和浓度的依赖性，浓度越高抑制作用越强，故而进一步猜测乳铁蛋白影响胰岛素生长因子结合蛋白的表达可能在乳铁蛋白调控骨量和影响成骨细胞增殖方面可能发挥着重要作用。但是，IGFBP-3、-4、-5在蛋白水平是否受到影响未可知。其次，是否体内研究也同样受到影响。因乳铁蛋白可上调IGF-1[9]，那么要证明乳铁蛋白是通过调控IGFBPs来促进成骨细胞增殖的前提得先排除IGF-1的影响。此外，IGFBPs具有独立作用[10]，即不依赖IGF-1的影响成骨细胞的作用，那乳铁蛋白是否只是通过影响IGFBP单条途径影响成骨细胞的增殖也未可知。想要回答以上问题，可继续进行体外研究乳铁蛋白对IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5蛋白表达的影响，另外通过体内研究进一步佐证。实验发现，乳铁蛋白抑制了IGFBP-4 mRNA的表达，则可通过腺病毒过表达IGFBP-4以进一步确定IGFBP-4乳铁蛋白是否通过抑制其表达而达到促进成骨细胞增殖的作用。此外，为排除IGF-1促成骨细胞的作用，可利用基因沉默技术，沉默IGF-1来证实。

综上所述，本研究证实乳铁蛋白影响IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达，若能进一步研究出乳铁蛋白调控骨量和影响成骨细胞增殖与IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之间的关系，将给临床提供更多治疗骨质疏松的药物靶点。

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