肌球蛋白十篇
时间：2023-03-16 03:18:20
肌球蛋白篇1
[关键词] 共同性斜视 眼外肌组织化学染色免疫组化染色
共同性斜视其发病机制比较复杂，可能与辐凑和分开兴奋不平衡有关，还可能与解剖因素、遗传因素等有相当的联系。视动功能需要快速而有力的肌肉收缩来完成，视静功能需要肌肉长久维持一种姿势张力。本研究分别采用免疫组织化学染色的方法对共同性斜视患者弱侧眼外肌和正常人眼外肌的收缩蛋白和快慢纤维进行研究，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料：收集福建医科大学附属第一医院眼科中心2006年1月至2006年11月共12例共同性斜视患者弱侧眼外肌作为实验组，其中内斜视7例，外斜视5例；男性6例，女性6例；年龄最小7岁，最大25岁，平均14岁；于斜视矫正手术中取其缩短的直肌为标本。收集同期无眼肌疾患行眼球摘除的患者6例作为对照组，于手术中取其直肌为标本。所有标本在离体后用显微手术剪剪成2部分，均为4×4×2mm大小，一份立即置于10%甲醛中性固定液中，石蜡包埋，待用；一份速存于液氮速冻后-80℃保存，待用。
1.2 主要试剂：三磷酸腺苷二钠盐（ATP 产地美国，购自上海捷瑞生物工程有限公司）；鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（购自北京中杉公司）；鼠抗人骨骼肌肌球蛋白单克隆抗体（购自北京中杉公司）； PV9000二步法检测系统（美国GBI公司产品，购自北京中杉公司）
1.3 肌球蛋白及肌动蛋白免疫组织化学步骤：取包埋好的肌组织沿肌肉长轴及纵轴连续切片2张，层厚约为5 μm，脱蜡和水化；3%H2O2去离子水孵育10分钟， PBS液冲洗；滴加一抗 ，37℃孵育一个小时，PBS液 冲洗； 滴加 Polymer Helper， 37℃孵育20min，PBS液冲洗；滴加二抗，37℃孵育20分钟，PBS液冲洗；DAB显色；自来水冲洗，苏木素轻度复染，自来水冲洗返蓝；梯度酒精脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封片。
1.4 观察方法：光镜下观察免疫组化染色结果。肌动蛋白和肌球蛋白阳性反应为棕黄色颗粒，主要表达于细胞浆，在放大200倍下对热点视野以OLYMPUS BH2显微摄像系统对切片进行摄像，每张切片取5个视野，每个视野取100个肌纤维作形态学图像分析（JEDR 801D形态学图像分析系统6.0软件，福建医科大学组胚教研室提供），取平均光密度值，数据以“均数标准差”表示。
1.5 数据统计分析方法：运用SPSS 11.5软件包对数据进行处理。组间差异采用成组t检验方法，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 肌动蛋白的表达 光镜下棕黄色颗粒为肌动蛋白阳性染色，表达在肌浆中 (图1，图2为免疫组织化学两步法，DAB染色, 苏木素复染，×200）。
对照组切片可见明显的棕黄色颗粒；共同性斜视组切片可见棕黄色颗粒表达明显减弱，表明对照组较共同性斜视组肌动蛋白表达明显，平均光密度值较高。两组平均光密度值结果以 表示，组间差异采用成组t检验。结果显示两组间的差异有统计学意义（表1）。
2.2 肌球蛋白的表达 光镜下棕黄色颗粒为肌球蛋白阳性染色，表达在肌浆中 (图3，4为免疫组织化学两步法，DAB染色，苏木素复染，×200)。
对照组可见明显的棕黄色颗粒；共同性斜视组中可见棕黄色颗粒表达明显减弱，表明对照组较共同性斜视组肌球蛋白表达明显，平均光密度值较高。两组光密度结果以 表示，组间差异采用成组t检验。结果显示两组间的差异有统计学意义（表2）。
3 讨论
眼位偏斜不能被融合机能所遏制，眼球运动无障碍，各种方向注视时斜视角保持恒定者，称为共同性斜视。共同性斜视的病因学说不一[2]，主要有：1．调节学说；2．双眼反射学说；3．解剖学说；4．遗传学说。各种学说均有一定的理论根据，但尚无一种学说能够解释所有的共同性斜视的问题。
骨骼肌负责运动功能的蛋白质主要是收缩蛋白质，即肌球蛋白和肌动蛋白，它们存在于肌原纤维中。肌球蛋白是粗肌丝的主要成分，具有二个生物学作用：一是具有ATP酶活性，能裂解ATP，释放化学能；二是具有与肌动蛋白结合的能力。它决定了肌纤维收缩的速度和力量，是肌纤维收缩特性的最主要决定因素。肌动蛋白结构及功能相对简单，分子单体上有与肌球蛋白头相结合的位点 [1]。关于肌球蛋白和肌动蛋白异常性疾病国内外报道较多的是选择性肌球蛋白缺失性肌病，这种肌病临床表现为不同程度的肌肉无力和麻痹，是肌肉组织去神经化所致的肌肉源性肌病[3]， 其主要的病理改变：光镜下肌球蛋白三磷腺苷酶阳性物质减少或消失[3]；电镜检查可看到大范围选择性的肌球蛋白粗肌丝丧失,较少累及肌动蛋白丝和肌纤维Z区[4]。
本研究对肌纤维肌动蛋白和肌球蛋白的免疫组织化学染色，通过鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体和鼠抗人骨骼肌肌球蛋白单克隆抗体对两组标本进行研究。结果发现共同性斜视组肌动蛋白和肌球蛋白的表达与对照组相比明显下降（光密度值两组间比较有显著性差异，P值＜0.01）。根据这一发现，我们认为眼外肌收缩蛋白表达下降在共同性斜视的形成过程中可能起重要作用，并且这一发现在某种程度上也支持了共同性斜视发病机制中的肌肉源性因素。
本研究应用免疫组织化学二步法，检测了正常人和共同性斜视病人弱侧眼外肌的肌纤维分型分布和两种收缩蛋白包括肌球蛋白和肌动蛋白的表达情况，初步阐明肌纤维分布和收缩蛋白表达情况在共同性斜视的发病中可能起重要作用，并从两个方面证明了共同性斜视发病机制中的肌源性因素，为共同性斜视发病机制的进一步研究打下基础，而关于亚型肌纤维的存在与否有待进一步研究。
参考文献
[1] Pelouch V. Molecular aspects of regulation of cardiac contracti on. Physiol Res,1995,44(1):53
[2] Massa R, Carpenter S, Holland P, et al: Loss and renewal of thick myofilaments in glucocorticoid-treated rat soleus after denervation and reinnervation. Muscle Nerve 1992; 15:1290-1298
肌球蛋白篇2
［关键词］ 下颌角截骨;咬肌;肌球蛋白重链;兔
面部形态是软组织及骨组织相互作用和影响的最终产物，这种互动作用在面部轮廓形态中具有重要意义。最富有变化且体现个性特征的是面中、下1.3，下颌骨和咬肌对于面下部形态起着重要作用。按照东方人的审美观，以椭圆形或“瓜子脸”为美，因此，下颌角截骨治疗方腮畸形的措施是目前颅颌面外科常行的美容手术之一。我们用兔模拟临床下颌角截骨，通过对咬肌肌球蛋白重链的两个亚型，即肌球蛋白重链（myo-sin heavy chain，MHC）Ⅰ、Ⅱ型mRNA表达量的测定，研究咬肌的改建能力及功能的恢复特点，为临床下颌骨架改变手术提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
雌性3月龄新西兰大白兔25只（东南大学医学院实验动物中心提供），体重220～270g。左侧下颌角截骨，为手术侧，右侧为非手术侧，设为对照。以0.6%戊巴比妥钠静脉注射麻醉。于左侧下颌角处作一长2～3cm切口，沿骨面分离咬肌和翼内肌附着部至下颌角前后切迹连线，以前后切迹沟连线作垂线与下颌角形成交点，该交点沿垂线上0.5cm取一定点，以前后切迹点和定点作一条弧线，用磨钻沿弧线打孔定位后截骨。肌肉放置原位，缝合切口。术后3d用抗生素预防感染。分别于术后2、4、8、12和24周处死5只动物，于定点处取部分咬肌，大小0.8cm×0.5cm×0.5cm，迅速放入-70℃冷冻保存。
1.2 RNA的提取与RT.PCR
（1）总RNA的提取:采用Trizol一步法提取组织的总mRNA。（2）总RNA反转录为cDNA:根据Revertaid TM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书，以总mRNA为模板合成相应的互补cDNA。反应体系为20μl，反应条件为70℃变性5min，42℃反转录1h，最后70℃5min灭活反转录酶。（3）PCR:在同一管中扩增MHCⅠ、MHCⅡ及GAPDH mRNA的cDNA产物，反应体系为50μl，反应条件为94℃预变性5min，95℃变性40s，59℃退火1min，72℃延伸2min，共循环29次，最后72℃再延伸10min。（4）本实验所用的PCR引物为MHCⅠ上游5′.GGATCCCTGGAGCAGGAGAA.3′、下游5′.CTTG-CATTGAGGGCATTCAG.3′，大小173bp;MHCⅡ上游5′.CCCTAAAGCGGGAGAATAAG.3′、下游5′.GCTCTG-CATCGACTCTACCAC.3′，大小307bp;GAPDH上游5′.GATCCATTCATTGACCTCCACTA.3′、下游5′.CACCACCT-TCTTGATGTCGTC.3′，大小703bp。
1.3 MHC mRNA转录量分析
各组分别取8μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。对经EB染色后的目的条带和内参条带进行摄像，应用Imagemaster图像分析仪进行扫描，Total Lab图像分析软件分析图谱，计算目的MHC的相对含量。目的mRNA的相对含量:某mRNA水平相对值=目的条带光密度值.内参GAPDH条带光密度值。
2 结 果
2.1 PCR产物的凝胶电泳 见图1。PCR产物经凝胶电泳鉴定，扩增片断特图1 不同时间MHCⅠ、MHCⅡ和GAPDH的电泳条带
2.2 统计结果
见表1。术后2周左侧咬肌MHCⅠ和MHCⅡ的mRNA表达量较右侧显著下降，4周后MHCⅡ的mRNA左、右侧咬肌无显著性差异。12周后MHCⅠ的mRNA表达量双侧无显著性差异，MHCⅡ.MHCⅠ之值2、4、8周左侧高于右侧，双侧有显著性差异。
2.3 检测指标与统计学处理
根据原始数据分别计算各组MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡ.MHCⅠmRNA含量的相对值，其中MHCⅠ与MHCⅡ分别代表各自的mRNA水平，MHCⅠ.MHCⅡ之值代表了两种亚型之间的比例关系。
全部数据均采用统计学软件SPSS11.0进行统计学分析，手术侧和非手术侧的比较采用t检验。 表1 非截骨侧和截骨侧咬肌MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡ.MHCⅠmRNA含量的相对值（略）
3 讨 论
面部改形手术主要通过骨架的延长或缩短，从而达到矫正畸形、美化面容的效果，功能和外形是手术必须兼顾的两方面。人体的正常形态结构和生理机能是密切相关的，口腔颌面系统作为一个功能整体，其中任何一部分出现形态的变化都可能会导致机能的改变。在下颌角弧形截骨术中需要去除部分骨质，在下颌角附着的咬肌、翼内肌下部进行剥离，其末端附着也随着骨质的去除而上移。由于术后肌肉的张力发生变化，故在其附着重建的同时，咬肌会自发地发生相应的萎缩，从而变薄变短［1］ 。肌力对咬合功能的影响、肌肉萎缩与骨架缩短匹配的程度，这些都是方腮畸形行下颌角截骨手术应考虑的。
根据肌纤维所含MHC亚型的不同主要分为慢肌纤维（MHCⅠ）与快肌纤维（MHCⅡ）两种2］ ，Ⅰ型纤维氧化酶活力高，磷酸化酶和ATP酶活力低，收缩慢，耐疲劳，Ⅱ型与之相反。不同动物与不同部位肌肉中各亚型比例是不同的。肌肉中所含的肌纤维亚型不同，它们的收缩和代谢特性也不同。肌纤维的类型主要由遗传决定，但是肌肉组织的生物可塑性很强，一些外部环境因素如功能负荷、神经支配、激素和慢性电刺激等均可通过调节其基因表达而改变其亚型比例，以适应功能变化的需要［3，4］ 。在这个变化过程中，较之于蛋白质的合成增加或减少，其
本实验研究显示，在兔下颌截骨后2周咬肌MHCⅠ和MHCⅡmRNA表达降低，说明骨架缩短早期咬肌的功能下降。4周后MHCⅡmRNA的表达量恢复正常，快肌主要参与位移变化，而慢肌纤维主要参与维持体位，在咀嚼功能中快肌起主导作用，优先得以恢复。MHCⅡ.MHCⅠ之值前8周术侧较对侧升高，而肌肉大体形态术侧表现为萎缩。这个过程中MHCⅠmRNA的表达下调，可能发生了Ⅰ型纤维向Ⅱ型纤维转化。这与Song等［1］ 的ATP酶染色结果一致，同时Lambert5］ 发现，肥大的嚼肌标本Ⅰ型肌纤维明显增加，Ⅱ型肌纤维则明显减少。临床下颌角肥大的病人往往伴有咬肌肥大，本实验缩短下颌骨架咬肌发生萎缩，出现了与Lambert研究咬肌肥大病人肌纤维组成相反的变化结果。由此可见，MHCⅠ表达的下降与MHCⅡ表达的变化不是一个简单的对等关系，而是肌肉组织根据功能的需要调节各个亚型基因表达的结果。
总之，骨骼肌是一种动态的多样化的组织，肌纤维类型和肌纤维蛋白同功型的多种多样可适应不同的功能要求。在兔下颌截骨后咬肌发生了肌纤维亚型表达的改变，表明下颌骨架缩短后发生了慢肌向快肌转化，快肌的功能优先恢复，这种变化有利于建立一个新的口颌系统平衡，满足咀嚼功能的需要。
［参考文献］
［1］SONG H S，PARK C G.Masseter muscle atrophy after ostectomy of the mandibular angle in rabbits［J］.Plast Reconstr Surg，1997，99（1）:51.59.
［2］ALBIS A，JANMOT C，BECHET J J.Comparison of myosins from the masseter muscle of adult rat，mouse and guinea-pig persistence of neonatal-type isoforms in murine muscle［J］.Eur J Biochem，1986，156（2）:291.296.
［3］GOLDSPINK G，SCUTT A，LOUGHNA P T，et al.Gene expression in skeletal muscle in response to stretch and force gene ration［J］.A J Physiol，1992，262:356.363.
［4］READER M，SCHWARTZ G，ENGLISH A W.Brief exposure to testosterone is sufficient to induce sex differences in rabbit masseter muscle［J］.Cells Tiss Org，2001，169:210.217.
肌球蛋白篇3
[关键词] 糖尿病视网膜病变；糖尿病肾病；肾小球率过滤；尿微量白蛋白/肌酐
[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2017）02（b）-0178-03
Correlation between the Diabetic Retinopathy and Glomerular Filtration Rate and Urine Microalbumin or Creatinine
FU Zheng1， ZHU Li-xiu2， LIN Feng-sen1
1.Endocrine Department， Ningde Hospital affiliated to Fujian Medical University， Ningde， Fujian Province， 352100 China；2.Department of Hematology and Rheumatism， Ningde Hospital affiliated to Fujian Medical University， Ningde， Fujian Province， 352100 China
[Abstract] Objective To analyze the changes correlation between the diabetic retinopathy and glomerular filtration rate and urine microalbumin or creatinine in order to study the correlation between the diabetic retinopathy and diabetic nephropathy. Methods The medical records of inpatients were retrospectively analyzed， and the patients were divided into three groups according to the fundus examination situations of ophthalmology specialty， and the GFR， U-mAlb/Cr and related clinical indexes were collected and calculated. Results The GFR obviously decreased in the DR group compared with that in the NR group， and the U-mAlb/Cr obviously increased， with the progress of DR， the GFR obviously decreased and U-mAlb/Cr obviously increased， at the same time， the GFR decreased， and the morbidity of DR increased， at the time of GFR
[Key words] Diabetic retinopathy； Diabetic nephropathy； Glomerular filtration rate； Urine microalbumin/creatinine
肌球蛋白篇4
【关键词】小儿急性重症病毒性心肌炎；大剂量丙种球蛋白；临床效果
小儿急性重症病毒性心肌炎是儿科心血管系统常见病，该病起病急，进展迅速，临床症状无特异性，因此不易早期诊断，治疗不及时会引发严重心律失常、心源性休克及急性心衰，病死率较高[1]。笔者对该院收治的急性重症病毒性心肌炎患者在常规治疗的基础上联合静注大剂量丙种球蛋白治疗，效果满意，现做如下报告：
1资料与方法
1.1一般资料 选择我院2013年1月-2013年12月收治的急性重症病毒性心肌炎患儿86例，所有患儿均符合1999年昆明全国小儿病毒性心肌炎诊断标准(修正草案)[2]，其中，男性52例,女性34例；年龄2-14岁，平均年龄7.6±3.8岁，随机分为观察组和对照组两组，每组43例，两组患儿在年龄、性别及病程方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2方法 对照组给予常规治疗：抗生素抗病毒及维持水电解质平衡，大剂量维生素C等综合治疗；观察组在与对照组相同治疗的基础上静滴丙种球蛋白治疗：丙种球蛋白治疗200-300mg，1次／d，连续治疗4周。
1.3观察指标 观察记录两组患儿的症状消失时间及治疗效果。
1.4疗效判定标准 （1）治愈：治疗后主要临床症状消失或大部消失，体征、心电图、心功能及心肌酶接近正常或正常；（2）好转：治疗后主要临床症状部分消失，体征、心电图、心功能、心肌酶明显改善；（3）无效：治疗后临床症状及体征无改善甚至恶化。
1.5统计学处理：运用SPSS17.0统计学软件分析处理所得数据，并计数资料率的比较，采用卡方检验，当P0.05时，认为差异有统计学意义，具有可比性。
2结果
2.1两组患儿临床症状消失时间比较 如表1所示，观察组患儿胸闷消失时间（3.9±1.4）d、发热消失时间（2.9±0.5）d、心率失常消失时间（2.2±0.6）d，显著早于对照组（6.7±2.5）d、（4.1±1.7）d和（4.6±1.8）d，差异有统计学意义（P
表1 两组患儿临床症状消失时间比较（d）
组别 例数 胸闷 发热 心率失常
观察组 43 3.9±1.4 2.9±0.5 2.2±0.6
对照组 43 6.7±2.5 4.1±1.7 4.6±1.8
2.2两组患儿治疗效果比较 如表2所示，观察组治疗有效率95.35%，显著优于对照组76.74%，差异有统计学意义（P
表2 两组患儿治疗效果比较（例，%）
组别 例数 痊愈 显效 无效 总有效率（%）
观察组 43 30（69.77） 11（25.58） 2（4.65） 41（95.35）
对照组 43 8（18.60） 9（20.93） 10（23.26） 34（76.74）
3讨论 引起小儿后天性心脏病的主要因素是病毒性心肌炎，常见病毒有柯萨奇病毒、腺病毒及埃可病毒等。发病机制是：病毒入侵，使细胞因子及补体参与变态反应，降低了机体对氧自由基清除的功能，损伤心肌细胞。该病对心肌及间质造成损害，使心脏的传导及起搏受阻，造成心律失常，治疗不及时会发生心力衰竭、心脏增大等，迁延不愈者最终导致扩张型心肌病，患者的预后较差。维生素C不仅可以使冠状动脉血流量增加、清除氧自由基，对心肌代谢有促进作用。作为血液中蛋白质的一种――丙种球蛋白，大部分来源于献血者的血液，含有大量的抗病毒IgG抗体，广谱抗菌，临床上常常用以治疗和防止感染。其对病毒性心肌炎的治疗机制表现在：（1）其包含的各种病毒的抗体可以促进机体清除病毒，最大可能的使机体避免病毒的损伤；（2）对有害的机体免疫反应有改善或阻止功能，使心肌炎症状显著改善。姬乃明[3]通过对102例病毒性心肌炎患儿分别采用常规治疗及联合大剂量丙种球蛋白治疗，球蛋白组治疗效果显著优于常规治疗组。本研究也证实，观察组患儿胸闷消失时间（3.9±1.4）d、发热消失时间（2.9±0.5）d、心率失常消失时间（2.2±0.6）d，显著早于对照组（6.7±2.5）d、（4.1±1.7）d和（4.6±1.8）d，差异有统计学意义（P
综上所述，大剂量丙种球蛋白可以迅速改善小儿急性重症病毒性心肌炎的临床症状，显著提高治疗效果，值得临床推广。
参考文献
[1]汤东平.小儿急性重症病毒性心肌炎8例诊治体会[J].社区医学杂志，2011,9（6）：83-84.
肌球蛋白篇5
【关键词】 ，，重症肌无力;受体，胆碱能;小鼠，转基因
［摘要］ ［目的］ 探讨电鳐乙酰胆碱受体诱导人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力的机制. ［方法］ 将电鳐电器官分离并纯化的乙酰胆碱受体作为免疫原，免疫人免疫球蛋白转基因小鼠，以放射免疫方法测定小鼠血清中抗乙酰胆碱受体抗体滴度，以免疫荧光技术观察小鼠骨骼肌中抗乙酰胆碱受体抗体的结合性. ［结果］ 小鼠血清中的抗乙酰胆碱受体抗体滴度为155～539pmol，小鼠肌肉中具有人抗乙酰胆碱受体抗体. ［结论］ 电鳐乙酰胆碱受体刺激人免疫球蛋白转基因小鼠产生的人抗乙酰胆碱受体抗体，可与肌肉组织中的乙酰胆碱受体结合，导致肌肉收缩无力，可诱导重症肌无力.
［关键词］ 重症肌无力;受体，胆碱能;小鼠，转基因
ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the pathogenesis of experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG），induced with Torpedo acetylcholine receptor（AChR），in mice transgenic for human immunoglobulin（Ig）loci.METHODS Mice transgenic for human Ig loci were immunized with Torpedo AChR，isolated and purified from electronic organs of Torpedo.The titers of anti-mouse AChR antibody in the sera of mice were determined by radioimmunoassay.The binding of human anti-AChR antibodies to the AChR in the muscle of mice was measured by immunofluorescence technique.RESULTS The titers of anti-mouse AChR antibodies in the sera ranged from155to539pmol.The human anti-AChR antibodies were found to bind to the muscle section.CONCLUSION The human anti-AChR antibodies，secreted from the mice transgenic for human Ig loci，induced with Torpedo AChR，are able to bind to AChR in the mouse muscles，which leads to the damages of AChR，resulting in the animal EAMG.
Key words:myasthenia gravis;receptors，cholinergic;mice，transgenic
抗乙酰胆碱受体抗体与神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合，可激活补体而使突触后膜乙酰胆碱受体遭到破坏，导致肌肉收缩无力，出现重症肌无力症状.引起重症肌无力的病因目前尚不清楚，但若给动物免疫乙酰胆碱受体或注射抗乙酰胆碱受体抗体，可引发实验性自身免疫性重症肌无力 ［1，2］ .在以乙酰胆碱受体作为免疫原建立重症肌无力动物模型中，常用由电鳐电器官制备的乙酰胆碱受体，是因为电鳐的乙酰胆碱受体含量及与哺乳类动物骨骼肌乙酰胆碱受体的同源性均较高 ［3］ .电鳐乙酰胆碱受体刺激动物产生的抗电鳐乙酰胆碱受体抗体可与动物本身骨骼肌的乙酰胆碱受体进行交叉反应.本实验室曾报道了以电鳐乙酰胆碱受体免疫人免疫球蛋白转基因小鼠建立重症肌无力动物模型 ［4］ ，其中发现实验动物出现重症肌无力的关键症状，即肌肉收缩无力，血清中亦检测到了抗电鳐乙酰胆碱受体抗体.本文探讨了电鳐乙酰胆碱受体诱导人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力的机制.
1 材料与方法
1.1 材料 含人免疫球蛋白μ，γ1，κ胚系基因的转基因小鼠由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经学系神经免疫学实验室根据文献［5，6］介绍的方法建立.电鳐乙酰胆碱受体由本实验室从电鳐电器官（Pacific Biomarine，California，USA）中分离，并经眼镜蛇毒素亲和层析纯化获得 ［7］ ; 125 I-α-银环蛇毒素为英国Amersham Pharmacia Biotech公司产品;小鼠乙酰胆碱受体粗提液由本实验室从小鼠骨骼肌中提取;羊抗人免疫球蛋白血清为本实验室自制;羊抗人免疫球蛋白G购自美国Cappel，ICN Pharma-ceuticals公司，用时以1∶100稀释;异硫氰酸荧光素标记的兔抗羊免疫球蛋白抗体购自德国Cappel，ICN Biochemicals公司，用时以1∶50稀释.
1.2 动物的免疫 15μg纯化的电鳐乙酰胆碱受体中加入完全弗氏佐剂，注射于9只小鼠尾根部皮下，3，5周后分别以15μg纯化的电鳐乙酰胆碱受体加入不完全弗氏佐剂行加强免疫;对照组3只小鼠只注射完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂.
1.3 抗乙酰胆碱受体抗体的测定 应用放射免疫方法测定小鼠血清中抗乙酰胆碱受体抗体的滴度. 将2nmol25 I-α-银环蛇毒素混合入200μL小鼠乙 酰胆碱受体粗提液内，在4℃条件下标记4h，加入5μL动物血清，4℃过夜，以过量的羊抗人免疫球蛋白血清沉淀小鼠乙酰胆碱受体-抗体复合物，用磷酸盐缓冲液洗涤后，在γ计数仪上测定放射比活性.抗体滴度用每升α-银环蛇毒素结合摩尔数表示.
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1.4 骨骼肌抗乙酰胆碱受体抗体结合性测定 应用免疫荧光技术观察小鼠骨骼肌中抗乙酰胆碱受体抗体的结合性.将小鼠骨骼肌冰冻切片并以丙酮固定后，用20g/L牛血清白蛋白封闭15min，加入羊抗人免疫球蛋白G，作用45min，洗涤，加入异硫氰酸荧光素标记的兔抗羊免疫球蛋白抗体，继续作用45min，观察结果.
2 结果
2.1 小鼠血清抗乙酰胆碱受体抗体滴度 在行第2次加强免疫注射电鳐乙酰胆碱受体3d后，心脏穿刺采血，检查血清中抗体滴度.9只实验小鼠的抗乙酰胆碱受体抗体滴度为155～539pmol（Fig1）.
2.2 骨骼肌抗乙酰胆碱受体抗体的结合 免疫荧光观察结果表明，小鼠肌肉冰冻切片中可见抗乙酰胆碱受体抗体（Fig2略）.
3 讨论
自从1973年Patrick和Lindstrom ［8］ 应用电鳗乙酰胆碱受体免疫家兔建立第一个重症肌无力动物模型以来，已经在小鼠、大鼠、豚鼠、猴及猪等多种动物中成功地建立了重症肌无力模型，为研究重症肌无力的发病机制和免疫治疗提供了有效途径.制作出与人重症肌无力更为接近的实验性自身免疫性重症肌无力动物模型已成为紧迫的研究课题.较为理想的动物模型应含有人免疫球蛋白、主要组织相容性抗原和乙酰胆碱受体基因.1994年Lonberg等 ［5］
建立了表达人免疫球蛋白的转基因小鼠，这使制作 这种新的重症肌无力动物模型成为可能.人免疫球蛋白转基因小鼠无论接受何种乙酰胆碱受体的免疫刺激，均将产生人免疫球蛋白，得到的重症肌无力动物模型在免疫学方面更接近人重症肌无力.本研究结果表明，人免疫球蛋白转基因小鼠在接受电鳐乙酰胆碱受体刺激后，小鼠血清中抗乙酰胆碱受体抗体滴度在155～539pmol范围内，仅为抗电鳐乙酰胆碱受体（免疫原）抗体滴度（6～296nmol） ［4］ 的0.2%，与Berman等 ［9］ 研究结果相一致.免疫荧光观察证实，小鼠肌肉中存在人抗乙酰胆碱受体抗体.上述结果表明，电鳐乙酰胆碱受体作为免疫原，可刺激人免疫球蛋白转基因小鼠产生人抗乙酰胆碱受体抗体，它可与肌肉组织中乙酰胆碱受体结合，导致乙酰胆碱受体功能失调，最终诱导实验性自身免疫性重症肌无力.人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的建立及其机制的阐明，为研究制作理想的重症肌无力动物模型奠定基础，亦为获得人源性抗乙酰胆碱受体单克隆抗体及基因工程抗体提供了新的途径.
［参 考 文 献］
［1］ Meng F，Stassen M，Schillberg S，et al..Constructionand characterization of a single chain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravis ［J］.Autoimmunity，2002，35:125.
［2］ De Baets M，Stassen M.The role of antibodies in myas- thenia gravis［J］.J Neurol Sci，2002，202:5.
［3］ Lennon VA，Lindstrom JM，Seybold ME.Experimental autoimmune myasthenia:a model of myasthenia gravis in rats and guinea pigs［J］.J Exp Med，1975，141:1365.
［4］ 李红花，金桂花，孟繁平，等.重症肌无力转基因小鼠模型的建立［J］. 延边大学医学学报 ，2006，29（2）:79.
［5］ Lonberg N，Taylor LD，Harding FA，et al..Antigen- specific human antibodies from mice compressing four distinct genetic modifications［J］.Nature，1994，368:856.
［6］ Fishwild DM，O'Donnell SL，Bengoechea T，et al.. High-avidity IgGκmonoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice［J］.Nat Biotechnol， 1996，14:845.
［7］ 杨康鹃，孟繁平，de Baets M.电鳐乙酰胆碱受体的分离 和纯化［J］. 延边大学医学学报 ，2004，27（1）:5.
肌球蛋白篇6
【关键词】 糖尿病；糖化血红蛋白；肌酐清除率
糖尿病在全世界的发病率日益增高，目前已成为全世界的常见病和多发病，2003年美国统计糖尿病的发病率接近全球人口的8%[1]。糖尿病肾病（DN）是糖尿病严重并发症之一，也是糖尿病致死的原因之一。糖尿病肾病常是糖尿病多器官微血管病变的一个组成部分，早期表现为肾脏体积过大，肾小球容积过多，以及肾小球基质积聚，尿白蛋白、肌酐排泄增加，最后肾小球硬化，出现肾功能衰竭[2]。本研究以随机抽选的住院糖尿病患者为研究对象，探讨糖尿病早期肾损害中糖化血红蛋白的影响及临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2008年7月――2010年7月住院治疗的2型糖尿病（T2DM）患者95例，其中男62例，女33例，年龄55-79岁，全部符合1999年WHO制定的DM诊断标准，均无高血压及急、慢性肾炎病史，无明显心、脑、肺及肝脏疾病，排除感染、发热、糖尿病足等因素影响。
1.2 分组方法 按HbA1c不同分为两组：A组为HbA1c≤6.5%组，46例（男29例，女17例），平均年龄60.15±12.09岁，肾小球滤过率56.00±26.10ml/（min・1.73m2）；B组为HbA1c>6.5%组，49例（男33例，女16例），平均年龄52.94±13.03岁，肾小球滤过率84.52±29.84ml/（min・1.73m2）。2组的年龄比较，B组低于A组，差异有统计学意义（P
1.3 测定方法 所有患者于上午空腹采集外周静脉血2ml置于普通试管，应用酶法测定血肌酐（Scr）；采用免疫比浊法检测糖化血红蛋白；用Cockcroft-Gault 公式计算肌酐清除率：Ccr=[（140-年龄）×体重（kg）]/[0.818×Scr（umol/L）]。使用MDRD公式计算肾小球滤过率：
GFR=186×（SCr）-1.154×（年龄）-0.203×（0.742女性）。
1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组计量资料间比较采用方差分析，等方差采用t检验，异方差采用t检验，P
2 结 果
2.1 一般情况 A组患者一般状况良好，无明显多饮、多尿症状，有6例伴视物模糊，眼底检查示视网膜病变，有8例伴手足远端麻木刺痛，考虑发生糖尿病周围神经病变；B组患者大部分（42例）伴多饮、多尿症状，发生糖尿病视网膜病变38例，发生糖尿病周围神经病变35例，均明显高于A组患者，并发酮症酸中毒2例，均抢救成功，死亡1例，考虑死亡原因为糖尿病继发冠心病所致的心力衰竭。
2.2 两组患者的糖化血红蛋白、肌酐清除率比较 B组患者的糖化血红蛋白值高于A组患者，差异有统计学意义（P
3 讨 论
糖尿病（DM）慢性并发症可发生在全身多个重要器官，特别是慢性肾功能衰竭已成为糖尿病患者的主要死亡原因之一。糖尿病肾损害早期形成肾小球内高灌注、高压力和高滤过。虽然经严格控制血糖后可减少糖尿病肾病的发生率和死亡率，但糖尿病肾病的危险性仍无明显改善。本文通过观察早期糖尿病肾病患者的糖化血红蛋白与肌酐清除率的关系，来探讨血糖对早期肾损害肾小球血流动力学改变等病变的影响。
糖尿病肾病的病理变化开始为肾脏体积增大、肾小球血流量增加，之后肾小球系膜细胞增殖、系膜细胞外基质增加、肾小球基底膜增厚，最后发展至肾小球硬化。近年来对于糖尿病肾病的发病机制进行了大量研究，取得了较大进展。认为遗传易感性及环境因素（即高血糖）是DN发生的病因，它们的共同作用导致DN的发生与发展。另外，环境因素还包括高血压、高血脂等其他因素，但高血糖相对来说更为重要。糖化血红蛋白控制越差者，其DN发生率越高[3]。
糖尿病早期肾损害发生的机制是高血糖刺激机体产生氧化应激，使低密度脂蛋白氧化为过氧化低密度脂蛋白[4]，造成微血管内皮细胞损伤、细胞间间质增殖等[5]。内皮细胞损伤后释放内皮素、P-选择素等，使肾小球毛细血管张力发生变化[6]，从而引起血流动力学改变，导致跨毛细血管壁压力增高，引起肾小球高灌注、高过滤，导致肾损害。该发病机制主要是对管-球反馈的抑制，而葡萄糖的结构因素可能与其相关[7]。其次，可发生系膜细胞扩张、上皮细胞足突融合并产生致密小滴、上皮细胞脱落等。同时肾小球基膜Ⅳ型胶原信使糖核酸含量增高，使基膜增厚，最终形成系膜的弥漫性、结节性病变，从而发生肾小球硬化，这也是糖尿病肾病的诱发原因之一。亦研究认为主要在压力增高的情况下，蛋白滤过增加，并沉积于系膜区和肾小球基底膜，促进基质增生，形成恶性循环，并可造成结节性和弥漫性肾小球硬化。故肾脏的高灌注、高滤过是导致糖尿病肾脏病变的重要机制。
糖尿病患者血糖升高使肾小球处于高滤过状态，导致肾小球毛细血管通透性改变、血管增殖、管腔闭塞，使肾脏病变进展。但糖尿病早期肾损害时无明显症状，仅表现为尿微量白蛋白的排出[8]，本研究亦证实血糖控制越差，肌酐清除率越高，这与肾小球受损、肾小球系膜增生和肾小球基底膜增厚等有关。英国前瞻性糖尿病研究的数据表明，糖尿病HbA1c每下降1%，微血管并发症的发生率下降35%[9]，HbA1c>8%时发生糖尿病肾病的危险性明显升高。降低HbA1c可减轻肾脏微血管病变，降低微量白蛋白尿的发生率[10]。
糖尿病患者并发DN的患者死亡率是未并发DN患者死亡率的30倍。由于早期肾损害表现不明显，因此大部分DN都是在有尿蛋白阳性时才被发现。微量白蛋白尿能反映肾脏的轻度损害或早期损害[11]。有研究显示，糖尿病患者血糖控制越差，其尿微量蛋白/尿肌酐阳性率越高，肌酐清除率亦越高，其肾病发生率越高。即使T2DM患者FBG控制达标后，糖化血红蛋白及餐后血糖控制不好还会使尿白蛋白排泄率增加，故糖尿病人要同时重视FBG、2hPBG、HbAlc及尿微量白蛋白/血肌酐的监测[12]。肌酐清除率可反映肾小球高灌注、高滤过情况，而HbA1c和尿微量白蛋白可能是2型糖尿病并发肾损害的危险因素。因此对糖尿病患者进行HbA1c、尿微量白蛋白和肌酐清除率的联合检测，可较早发现肾病患者，对其采取必要的措施，如使用ACEI类药物扩张血管，从而降低肾小球内压力及血管阻力，以延缓糖尿病并发症的病程[13]。
综上所述，糖尿病病人在接受卫生教育、饮食控制和使用降糖药物治疗时，对糖尿病肾病一定要提高警惕，避免病情恶化后带来更为严重的危害。应定期检测FBG、2hFBG、HbA1c及肌酐清除率，及时了解糖尿病控制情况，以便调整方案，预防和延缓糖尿病肾病的发生发展[14]。
参考文献
[1] The 15th annual report of the United States Renal Date Systems[R].USRDS Coordinating Center，2003.
[2] 仝德贵，张晓明.糖尿病肾功能衰竭患者血糖水平与肾功能的关系[J].基层医学论坛，2002，（2）：26-27.
[3] 孙利红.糖尿病肾病的早期诊断与糖化血红蛋白的关系探讨[J].中国社区医师，2007，9（24）：44-45.
[4] 黄红艳.2型糖尿病血糖控制与尿微量白蛋白的相关分析[J].内科，2007，2（4）：535.
[5] 王笠.糖化血红蛋白的检测和临床应用[J].上海医学检验杂志，2003，（18）：2.
[6] 董德平，钱开成.糖尿病患者P-选择素检测的临床意义[J].上海医学检验杂志，2000，（15）：155.
[7] 祁忠华，林善铰，郝传明，等.血糖导致肾脏高灌注的机制研究[J].中华医学杂志，1994，74（l）：5-7.
[8] Rebold G，Gentile G，Angeli F，et al.Microalbum inuria and hypertension[J].Minerva Med，2005，96（4）：261.
[9] Association AD.Implications of the diabetes control and complications trial[J].Diabetes Care，2003，（26）：s25.
[10] 李妍妍.老年糖尿病糖化血红蛋白与尿微量白蛋白/肌酐的关系[J].吉林医学，2009，30（19）：2240-2241.
[11] 姜傥，尿液蛋白与肾脏病[J].中华检验医学杂志，2002，25（5）：312-313.
[12] 黄平，黄勤，张振洪，等.2型糖尿病患者糖化血红蛋白、餐后血糖与尿微量白蛋白/肌酐比值的相关性分析[J].国际医药卫生导报，2009，15（24）：60-62.
肌球蛋白篇7
[关键词] 肌钙蛋白I（cTnI）；急性心肌梗死（AMI）；肌酸激酶（CK）；肌酸激酶同工酶-MB（CK-MB）
[中图分类号] R541.6[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2009）12-128-02
Clinical Value of Troponin I in Patients with Acute Miocardial Infarction
GUOZhaolin
Clinical laboratory，Chaoyang Dafeng Hospital，Shantou，Guangdong 515100
[Abstract] Objective To study a highly sensitive and specific blood marker，it can earlier examine and diagnose a patient with AMI. Methods Gather 400 patients blood sample with AMI. To respectively take its blood into be measured the cTnI or CK-MB levels，studying its positive rate，sensitivity and specificity. Results cTnI positive rate：93.4%，sensitivity：100%，specificity：93.4%；CK-MB positive rate：32.1%，sensitivity：48.2%，specificity：32.1%. Conclusion cTnI appeared to have a high predictive value that AMI occurred，its sensitivity is 100%. cTnI -negative value indicates very little risk of AMI occurrence； cTnI is the highly sensitive and specific blood marker as myocardial cell was injured. It can early foresee that the patient’s tiny thrombus is formed. It is the marker which excludes patient’s myocardial infarction.
[Key Words] Troponin I（cTnI）； Acute myocardial infarction（AMI）； Creatine kinase（CK）； Creatine kinase isomer-MB（CK-MB）
肌钙蛋白由肌钙蛋白I、T、C三亚基构成，与原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4～6h后开始在血液中升高，升高的肌钙蛋白I能在血液中保持很长时间6～10d。肌钙蛋白I具有高度心肌特异性和灵敏度，所以肌钙蛋白I已成为目前最理想的心肌梗死标志物。其为肌肉的主要调节蛋白质，在I细丝（Filament）上以40毫微米周期与原肌球蛋白结合，直接参与钙所控制的肌肉收缩。它占肌原纤维蛋白的5％。钙从肌质网（Sarcoplasmic reticulum）释放出来与肌钙蛋白结合而结构发生改变，于是被抑制的肌动蛋白和肌球蛋白相互作用开始，而使肌肉发生收缩。如果钙被除去，肌钙蛋白恢复原来状态，肌肉便发生松弛。TN-C（肌钙蛋白C）分子量为1万8千，与4个原子钙结合（在Mg 存在下的结合常数为106）而结构发生改变。TN-I分子量2万3千，无论有无钙，它都可以阻止肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用，并抑制ATP酶活力。TN-T分子量为3万7千，与原肌球蛋白结合。这三种成分之间存在着钙依赖性的相互作用，三者结合通过钙控制肌肉的收缩。肌钙蛋白为江桥节郎（1965）发现的，三种成分于1972年得到纯化分离。
1材料与方法
1.1一般资料
全组300例，男性175例，女性125例；年龄48～75岁，平均年龄61岁。
1.2原理
cTnI是一种心肌细胞调节收缩蛋白的亚级单位。正常情况下在血液中不被发现，当心肌细胞受损或坏死时才释放到血液中。
1.3仪器与试剂
1.3.1仪器美国Bayer Acs-180 全自动化学发光免疫分析仪和日立7060型全自动生化分析仪。
1.3.2试剂由美国Bayer公司原厂提供和上海科华试剂有限公司提供。
1.4检测方法
分别收集400例AMI患者的血液，分离出血清并对其进行cTnI和CK-MB的定量检测。
1.5统计学处理
统计学软件版本号为Chiss2004，全部数据以均数±标准差（χ±s）表示，数据分析采用方差分析，两组间均数比较用t检验，多组间均数用方差分析，组间率的比较用卡方检验，单因素分析采用Pearson相关分析。
2结果
cTnI和CK-MB的阳性率（%）、敏感性（%）、特异性（%）三者比较分析如下。见表1。在AMI中，cTnI预见AMI发生的敏感性100.00%，cTnI阴性结果提示AMI发生的风险性极低微。因此，cTnI是心肌细胞损伤时最具有特异性和敏感性的标记物，它可预见早期患者微血栓形成或作为排除患者的AMI的标记物之一。
3讨论
心肌梗死（MI）使冠状动脉闭塞，血流中断，部分心肌因严重的持续性缺血而发生局部坏死[1]。cTnI的心脏特异性及其在心脏受损后的快速及长时期的升高反应决定了cTnI是一种诊断心肌损伤性疾病，特别是诊断心肌梗死的最佳指标[2]。急性心衰患者血液中的cTnI可有不同程度的升高，提示cTnI可作为急性心衰患者心肌损害的敏感的生化指标[3]。心肌炎的诊断与CK-MB活性相比，患心肌炎时，因cTnI相对较高的血清检测值和较长的升高时间，使cTnI具有较高的检测敏感性。cTnI是心脏肌钙蛋白复合物成分之一，是心肌特异性抗原，由于其具有在心肌中含量丰富、胞浆中浓度较高和分子量小（22.5kD）的特点，使之可以更灵敏地反映AMI[4]。短暂性心肌炎症也可引起心肌损伤。近年临床上以CK、CK-MB的监测作为诊断AMI的常用方法，但其存在不足之处，如诊断特异性差、早期诊断（6h）灵敏度不高，而cTnI存在于心肌中，是心脏特异性抗原，在AMI时，心肌细胞受到损伤，cTnI血清浓度可升高10～50倍甚至上百倍，持续2～3周，而CK、CK-MB仅升高2～20倍，仅持续数天[5]。我们的结果也发现，cTnI敏感性、特异性均高于CK、CK-MB，两者峰值升高均显著高于CK及CK-MB。
本研究结果显示，cTnI对AMI的早期诊断是最具有特异性和敏感性的标记物，早期检测cTnI可以降低发生急性心肌梗死和心脏性死亡的风险。
[参考文献]
[1] Hamm CW，Ravkilde J，Gerhardt W，et al. The prognostic value of serum troponin Tin unstable angina[J]. N Engle J Med，2006，327：146-150.
[2] Ravkide J，Horder M，Gehardt W，et al. Diagnostic performance and prognostic value of serum troponin T in suspected acute myocardial infarction[J]. Scand J Clin Lab Invest，2007，53：677-685.
[3] 康格非，巫向前. 临床生物化学和生物化学检验[M]. 第2版. 北京：人民卫生出版社，2001：167-168.
[4] Hamm CW，Ravkide J，Gerhardt W，et al. The prognostic value of serum troponin T in unstable angina[J]. N Engl J Med，1992，327：146-150.
肌球蛋白篇8
【关键词】 心肌肌钙蛋白I；急性心肌梗死
心肌肌钙蛋白I（cTnI）在心肌组织中表达，在胎儿、健康人或疾病状态的成人骨骼肌中不表达〔1〕，因而对心肌具有高度特异性。1987年Cummins等〔2〕首先报道通，过测定血中cTnI浓度可诊断急性心肌梗死（AMI）。由于肌钙蛋白具有组织特异性强、诊断窗口期长、测定方法快速、在血中出现早等优点，使其在AMI诊断中的作用越来越受到人们的重视，并于1994～1995年被美国国家食品与药品管理局(FDA)批准应用于临床AMI的诊断〔3〕。本文就cTnI及其临床应用研究进行综述。
1 cTnI的分子结构与组织细胞分布
肌钙蛋白属于调节蛋白，分子呈球形，包括三个亚单位：TnT、TnI和TnC。TnT是一种非对称性蛋白质，伴有一球形C端功能区，它有一个与原肌球蛋白结合的位点。原肌球蛋白与肌钙蛋白结合成TmTn复合物，附着在肌动蛋白双股螺旋的纵沟内。TnI是一种碱性蛋白， 209个氨基酸组成。在无Ca2+和TnC的情况下，TnI是阻止肌肉收缩的亚单位，通过抑制肌动肌球蛋白ATP酶的活性，阻止肌球蛋白运动，而阻止肌肉收缩。TnI是一个延伸分子，采取反向平行与TnC形成二元复合物，在TnT和TnI之间形成卷曲螺旋，结成一刚性不对称的结构IT臂，约有80埃，它桥连原肌球蛋白锚定位点〔4〕。TnC呈亚铃形，两个球形功能区被一个长的中央螺旋体相连，TnC是钙离子受体，参予调节细丝的活化过程。Takeda等〔5〕研究了在Ca2+饱和形式下的心肌肌钙蛋白核心结构域的晶体结构，核心结构域能进一步分为结构明显区分的子域，它们由可变的接头连接，使整个分子具有高度的可变性。人cTnI有5个螺旋区域，呈伸展式构型。抗体识别相应抗原表位不依赖于蛋白质的三级结构，使cTnI氨基酸序列易被免疫系统识别，故cTnI具有较强的抗原性。在cTnI蛋白质的功能域中，抑制区是其最重要的功能区，它能在无钙离子存在的情况下，与组成细纤丝的肌动蛋白相互作用，抑制肌球蛋白的ATP酶活性。
cTnI以不同形式存在于心肌细胞中，如以游离形式存在于胞浆内cTnI只占很少部分，为可溶性〔6〕，大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合以复合体形式存在。当心肌损伤时，外周血中cTnI主要以cTnITnC复合物形式居多（90%以上）〔7〕。cTnIcTnT复合物仅发现存在于50%以下病人的血中，因此，检测的重要性远不如cTnIcTnC复合物；其他形式的cTnI（如氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化、蛋白降解形式）较少〔8〕。因cTnI分子质量较CKMB小，对心肌损伤较敏感，“微型心肌损伤”时cTnI即可出现阳性结果，而此时CKMB未增高或处于正常高限。当心肌细胞膜的完整性受破坏，cTnI先从胞浆内释放，因此，血清水平很快升高，而结合的cTnI由于相对分子质量大，从心肌细胞结构蛋白缓慢持续的释放〔9，10〕，心肌损伤后，外周血中肌钙蛋白一般在5～8 h出现增高，在12～24 h达最高值，且高水平往往维持7～10 d〔cTnI〕或10～14 d〔cTnT〕〔11〕。肌钙蛋白在循环血中的半衰期为数小时，由肾脏排出体外。游离cTnI在循环血中的半衰期为67 min。所以，cTnI较早出现在血中，且持续时间长，这对于心肌损伤的诊断很有价值。
2 血清cTnI测定的方法学
2.1 cTnI检测方法
cTnI的测定始于20世纪80年代中期，多采用双抗体竞争放射免疫法和竞争性ELISA测定法。目前对cTnI的检测多采用化学发光法。用化学发光物质标记抗cTnI抗体大大提高了对cTnI测定的精确性和敏感性，但现在通用的cTnI测定方法尚无标准化，不同的方法采用不同的抗体识别位点，所以，在使用商品cTnI试剂盒时，必须明确商品试剂的特性，并使用相同的标准品进行质量控制。
鉴于cTnI作为心肌损伤诊断标志物的重要性及缺乏方法的标准化，目前有不少研究者对这些检测系统进行了比较评价。临床上常用的方法有Stratus检测法、AxSYM检测法、Access检测法、Opus Plus检测法、RxLHM检测法等。早在1997年，美国临床病理学会对检测cTnI的Access，Opus Plus和Stratus Ⅱ三个检测系统进行比较，结果显示，三个系统检测到的cTnI浓度有实质性差异。AxSYM检测法与Stratus检测法有显著相关性(r=0.88)，两种方法对AMI检测的一致性为95.3%。Mullen等〔12〕用分别表达有4个cTnI片段的E.coli细菌裂解液来测试它们与StratusⅡ、Opus Plus和Access免疫试剂盒之间的反应性，结果表明，Stratus和Opus Puls抗体识别cTnI的N末端部分，而抗Access抗体识别cTnI的C末端部分，而且，cTnI的C末端部分更易被降解，这也可能是造成这三种测定方法之间变异的主要原因之一。此后，Hafner等〔13〕对RxLHM检测法进行评价，它是以两个特异性的单克隆抗体为基础的一步酶免疫检测法，比Stratus检测法更敏感，且能提供更好的预后信息。Liu等〔14〕研究表明，通过基因工程方法得到的两种cTnIcTnC单链多肽：ScTnIC和ScTnIC2(ScTnIC由全长的人cTnI和cTnC组成，ScTnIC2由人cTnI 28～110片段和全长cTnC组成)，经单抗亲和层析纯化后，均可作为标准品使用。靳彩宁等〔15〕也对Access一代、Opus和immulite三种心肌肌钙蛋白I测定试剂盒进行评价，显示3种测定方法间具有良好的相关性，但不同方法所测cTnI参考值和患者血清中cTnI含量相差悬殊。抗凝对不同厂商出品的cTnI测定试剂影响程度不尽相同，另外，immulite测定的再现性比较好，Opus相对较差，Access一代试剂测定结果随着患者血样放置时间的延长，测定结果下降的幅度较大。据报道〔16〕，新一代的Access cTnI测定用抗体，特异识别cTnI分子位于残基33～110之间的肽段，因而，所测cTnI值具有较好的稳定性。
2.2 cTnI检测方法的影响因素
2.2.1 抗体的氨基酸序列抗体
cTnI在患者的血清中会有不同程度的降解，而且由于其在血清中存在形式的不同其半衰期也不同，各种检测方法针对不同抗原决定簇的cTnI抗体，其免疫反应也必然不同。Katrukha等〔17〕发现，将AMI的心肌坏死组织体外培养3 h后，cTnI的一级结构、二级结构和三级结构都出现了不同程度的改变。用不同的免疫学方法分析在心肌坏死组织血清中cTnI的降解情况时，发现位于氨基酸残基33～110之间的片段高度稳定，能产生较长的持续信号，并分析可能是由于其与cTnC形成了复合物所致。Madsen等〔18〕分析显示，cTnI的蛋白水解片段中，具有96～116个氨基酸残基的片段有较强的抵抗蛋白水解作用，在血清中与TnC形成二聚物的TnI片段是稳定的，而且可能拥有整个抑制区域。cTnI的抑制区域对cTnIcTnC复合物的免疫活性和稳定性有重要作用。因此，建议选择能够优先识别较稳定的氨基酸序列的抗体，这助于cTnI免疫检测的标准化并有利于提高检测的特异性和敏感性。
2.2.2 选用标本抗凝剂
采用全血或血浆标本时的某些抗凝物质(如EDTA)也会对检测产生影响，EDTA螯合血标本中的钙离子可使cTnIcTnC复合物解离，使游离cTnI单体增加，从而影响检测值，使不同方法测得的血清cTnI绝对值无法比较。肝素也可以直接与cTnI结合阻断抗原表位或改变分子构象而影响检测结果。
2.2.3 标本贮存时间和温度
存储时间的长短及存储运输温度的差异也会对检测结果产生影响。
2.2.4 干扰反应对测定产生的影响
另外，理论上存在着由于抗原抗体反应的干扰而引起的假阳性。类风湿因子(RF)、人抗鼠抗体(HAMAs)或嗜异性的抗体对商品试剂有明显的干扰，肌钙蛋白也可能受内源物质，如Hb和胆红素的阴性或阳性干扰。溶血或高胆红素血症及风湿等因素对cTnI测定也有一定的影响，有的可能会产生假阳性结果〔19〕。
3 心肌肌钙蛋白在临床诊断中的应用
3.1 对心肌损伤的诊断
在诸多诊断AMI的临床生化指标中，CKMB曾一度被认为是诊断“金标准”，已广泛应用多年。随着对cTnI的深入研究，无论其特异性还是敏感性，CKMB的地位都受到了严重挑战。cTnI被认为是目前最好的确定标志物，并已逐步取代CKMB成为AMI的诊断“金标准”。
在各种发生心肌细胞损伤的冠状动脉疾病患者中，有些患者的临床表现可能不完全符合WHO关于AMI诊断标准(不稳定心绞痛就是其中之一)，但却伴有某些心肌损伤标志物(如cTnT等)的升高，这使得心肌细胞损伤标志物的检测成为可能。cTnT和cTnI在AMI后(3～6 h)血中的浓度很快升高，其表现和CKMB(3～8 h)相当或稍早，但它们的特异性和灵敏度明显高于CKMB， 而且cTn具有相当长的诊断窗口期(cTnI 7～10 d，cTnT 10～14 d)。数据表明cTn对患有急性胸痛病人(无论有无心肌损伤)的诊断及鉴别诊断均优于CKMB〔20，21〕。
不论是不稳定心绞痛还是无Q波的心肌梗死患者，cTnI都具有预后诊断价值。对不稳定冠状动脉疾患病人的随访发现，cTnI检测值大于0.1 mg/L病人的死亡率较cTnI小于0.1 mg/L病人的死亡率大3倍多。因此，任何急性冠状动脉疾患病人同时测得cTn增高，都应视为高危险性〔22，23〕。
3.2 AMI后溶栓治疗的指示物
静脉注入溶栓药物是近年来常用的AMI治疗方法，在治疗后判断是否出现再灌注也成为临床医生最关注的问题之一。研究表明，如果肌钙蛋白的峰值提前出现，往往说明出现再灌注，早期冠状动脉再灌注的指示物CKMB、肌红蛋白(Mgb)、cTnT和cTnI在血栓治疗成功后的早期动力学比较研究表明，四种标志物在溶栓后释放的早期动力学基本相似，但是，cTnT和cTnI在发病90 min的冠状动脉再灌注平均指数显著大于CKMB和Mgb〔24〕。
3.3 对围术期心肌梗死的诊断
冠状动脉搭桥术后心肌梗死的诊断在心脏手术中有重要作用。cTn是围术期心肌梗死的敏感和特异性标志物，能够鉴别出没有达到常规围术期心肌梗死判断标准的微小的围术期心肌损伤。
3.4 对心肌炎的诊断
与CK活性相比，心肌炎时，cTnT因其相对较高的血清检测值和较长的上升时间，而具有较高的检测敏感性，血清cTnT水平可作为急性心肌炎的诊断标志物〔10〕。
3.5 与肾衰竭的关系
缺血性心脏病是晚期肾病病人发病和死亡的主要原因之一，占总死亡率的大约40%；这些缺血性心脏病患者中，大约25%发展为AMI。因此，在晚期肾脏病病人的临床治疗中，心血管并发症的诊断成为至关重要的问题。在晚期肾脏病病人血清中，cTnT和cTnI的检测值存在着差异。晚期肾脏病人血清的cTnT升高的可能原因有：检测方法的交叉反应；cTnT在骨骼肌中的重表达；存在着微小心肌损伤。第二代cTnT分析法不会因为cTnT在晚期肾脏病病人骨骼肌中的重表达而产生假阳性，从而排除了分析法的交叉反应。研究认为，晚期肾脏病病人血清中cTnT的升高可能是由于存在一定程度的心肌损伤〔25〕。
3.6 与骨骼肌损伤的鉴别诊断
肌钙蛋白是横纹肌收缩的重要调节蛋白，存在于心肌和骨骼肌中，由3种亚基组成:肌钙蛋白C，肌钙蛋白I和肌钙蛋白T。运动性骨骼肌和心肌损伤后，骨骼肌肌钙蛋白抑制亚基和心肌肌钙蛋白会发生特异性变化，因此相对于血浆肌酸激酶活性以及血浆肌红蛋白，肌球蛋白重链和肌酸激酶同工酶，骨骼肌肌钙蛋白抑制亚基和心肌肌钙蛋白分别是反映运动性骨骼肌和心肌损伤的特异性敏感标志。由于第二代cTnT分析法已排除了分析法的交叉反应。因此，cTn可作为骨骼肌损伤病人的心肌损伤诊断时较好的标志物。
3.7 甲状腺功能减退病人心肌损伤的诊断
甲状腺功能减退导致胆固醇上升，使病人易患冠状动脉疾病以及AMI。同时，甲状腺功能减退病人常有抽筋、肌痛等骨骼肌损伤症状，因此，这种病人的血清CK、CKMB水平都有不同程度增高。此时，cTn是甲状腺机能减退病人心肌损伤诊断时较好的标志物。
3.8 药物作用
cTn还被用于观察某些药物的药理作用与心脏关系的观察研究，了解是否改善或者加剧心肌缺血现象。
3.9 其他
如心脏移植后的排斥反应或急性心功能衰竭时，也常常出现cTn增高而CKMB无异常的现象〔26〕。
4 小 结
由于cTnI对心肌梗死的敏感性及检测的高敏感性，使其在心脏疾病诊断与鉴别诊断中的作用越来越受到人们的重视，通过对cTnI的检测不仅可以提高心肌损伤的诊断而且大大提升了对患者的救治效率，并促使人们对已存在的诊断与鉴别诊断的方法学重新认识，然而，由于相关检验的标准仍然没有统一，以及检测中众多干扰因素的存在，使其在临床以及科研中的应用仍然受到一定的限制。
参考文献
1 Bodor GS，Porterfield D，Voss EM，et al.Cardiac troponinI is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue〔J〕.Clin Chem，1995；41(12 pt 1)：17105.
2 Cummins B，Auckland ML，Cummins P.Cardiac specific troponinI radioimmunoassay in the diagnosis of acute myocardial infarction〔J〕.Am Heart J，1987；113（6）:133344.
3 Jaffe AS，Landt Y，Parvin CA，et al.Diagnostic efficiency of troponinI measurements in acute myocardial infarction〔J〕.Clin Chem，1998；44(8):17706.
4 Dong WJ，An J，Xing J，et al.Structural transition of the inhibitory region of troponin I within the regulated cardiac thin filament〔J〕.Arch Biochem Biophys，2006；456(2):13542.
5 Takeda S，Yamashita A，Maeda K，et al.Structure of the core domain of human cardiac troponin in the Ca2+saturated form〔J〕.Nature，2003；424(6944)：3541.
6 Deléaval P，Descombes E，Magnin JL，et al.Differences in cardiac troponin I and T levels measured in asymptomatic hemodialysis patients with last generation immunoassays〔J〕.Nephrol Ther，2006；2(2):7581.
7 Peronnet E，Becquart L，Poirier F，et al.SELDITOF MS analysis of the Cardiac Troponin I forms present in plasma from patients with myocardial infarction〔J〕.Proteomics，2006；6(23):628899.
8 Giuliani I，Bertinchant JP，Granier C，et al.Determination of cardiac troponin I forms in the blood of patients with acute myocardial infarction and patients receiving crystalloid or cold blood cardioplegia〔J〕.Clin Chem，1999；45(2)：21322.
9 Mockel M，Heller G，Jr Berg K，et al.The acute coronary syndrome diagnosis and prognostic evaluation by troponin I is influenced by the test system affinity to different troponin complexes〔J〕.Clin Chem Acta，2000；293(12)：13955.
10 Keller T，Zeller T，Peetz D，et al.Sensitive troponin I assay in early diagnosis of acute myocardial infarction〔J〕.N Engl J Med，2009；361(9):86877.
11 Miller WL，Hartman KA，Burritt MF，et al.Profiles of serial changes in cardiac troponin T concentrations and outcome in ambulatory patients with chronic heart failure〔J〕.J Am Coll Cardiol，2009；54(18):171521.
12 Mullen JC，Bentley MJ，Scherr KD，et al.Troponin T and I are not reliable markers of cardiac transplant rejection〔J〕.Eur J Cardiothorac Surg，2002；22(2):2337.
13 Hafner G，Peetz D，Dati F，et al.Analytical and clinical evaluation of troponin Ⅰ determination on dismension RXLHM〔J〕.Clin Chem Lab Med，2000；38(4)：35561.
14 Liu S，Zhang MY，Song Q，et al.Recombinant single chain cardiac troponin IC polypeptides：superior calibration and control materials for cardiac troponin Ⅰ immunoassays〔J〕.Clin Lab，2001；47(12):1927.
15 靳彩宁，徐国宾，朱立华，等.几种心肌肌钙蛋白I测定试剂盒的初步评价〔J〕.中国实验诊断学，2002；6（6）：3636.
16 Wilson SR，Sabatine MS，Braunwald E，et al.Detection of myocardial injury in patients with unstable angina using a novel nanoparticle cardiac troponin I assay：observations from the PROTECTTIMI 30 Trial〔J〕.Am Heart J，2009；158(3):38691.
17 Katrukha A，Bereznikova A，Filatov V，et al.Biochemical factors influencing measurement of cardiac troponin I in serum〔J〕.Clin Chem Lab Med，1999；37(11/12)：10915.
18 Madsen LH，Lund T，Grieg Z，et al.Cardiac troponin I degradation in serum of patients with hypertrophic obstructive cardiomyopathy undergoing percutaneous septal ablation〔J〕.Cardiology，2009；114(3):16773.
19 Lamb EJ，Kenny C，Abbas NA，et al.Cardiac troponin I concentration is commonly increased in nondialysis patients with CKD：experience with a sensitive assay〔J〕.Am J Kidney Dis，2007；49(4):50716.
20 Kavsak PA，Wang X，Ko DT，et al.Short and longterm risk stratification using a nextgeneration，highsensitivity research cardiac troponin I (hscTnI) assay in an emergency department chest pain population〔J〕.Clin Chem，2009；55(10):180915.
21 Apple FS，Smith SW，Pearce LA，et al.Use of the Centaur TnIUltra assay for detection of myocardial infarction and adverse events in patients presenting with symptoms suggestive of acute coronary syndrome〔J〕. Clin Chem，2008；54(4):7238.
22 SzyguaJurkiewicz B，Wasilewski J，Wilczek K，et al.Twelvemonth outcome of 658 patients with acute coronary syndrome without STsegment elevation assigned to early invasive strategy〔J〕.Wiad Lek，2006；59(78):497501.
23 Fox KA，Dabbous OH，Goldberg RJ，et al.Prediction of risk of death and myocardial infarction in the six months after presentation with acute coronary syndrome：prospective multinational observational study (GRACE)〔J〕.BMJ，2006；333(7578):1091.
24 Sundstrm J，Ingelsson E，Berglund L，et al.Cardiac troponinI and risk of heart failure：a communitybased cohort study〔J〕.Eur Heart J，2009；30(7):77381.
肌球蛋白篇9
关键词 高血压病 微量蛋白尿 血管损伤 肾小球损害
随着高血压患者的逐年递增，临床治疗也对高血压最终导致的靶器官损害予以高度重视，高血压病终末期最严重的靶器官损害就是肾功能衰竭，因此，早期观测肾脏功能变化的指标可以减少靶器官损害率目前微量白蛋白检测已广泛应用于糖尿病和高血压的检测指标，成为指导临床用药和判断预后的精细指标之一[1]。本实验主要观察尿mALB、β2微球蛋白（β2-MG）等检测指标的变化与肾小球损伤及血管内皮损伤的相关性。报告如下。
资料与方法
2010年2月～2011年12月收治高血压患者60例，作为研究组，诊断均符合（WHO-ISH高血压诊断标准），其中男27例，女33例，年龄46～77岁，平均50.5±12.5岁；病程3～32年，平均21.5±3.5年。收集门诊体检健康者60例作为对照组，其中男30例，女30例，年龄45～77岁，平均51.5±10.4岁。两组一般临床资料无统计学差异，均无肝肾功能异常、糖尿病及心力衰竭等严重慢性基础疾病。
资料采集项目：①所有入选病例入院均记录吸烟、饮酒及其他不良生活嗜好，采集工作环境及生活史；②采用台式水银血压计测量患者血压，3次/日，分别于清晨6：00、中午2：00、晚上11：00记录3个时间段的血压值，并计算每天平均动脉血压（mmHg）。采集所有病例静脉血3～5ml，采用半自动生化分析仪，检测肌酐（Scr）、尿酸（UA）；③收集24小时尿量，采用分析仪进行免疫透射比浊法测验，分别测定尿mALB、β2微球蛋白（β2-MG）、尿转铁蛋白（TRU）、尿免疫球蛋白IgG（IGU）。
统计学处理：本实验所有统计学计算采用SPSS16.0统计学软件完成。血压、肌酐、尿酸及尿蛋白等数据差异比较采用方差分析x2检验，以P
结 果
血压、微量白蛋白和血肌酐值关系：研究组与实验组对比发现血肌酐、尿酸与血压增高情况无相关性。见表1。
血管内皮及肾小球组织损害相关性：研究组尿微量蛋白、β2微球蛋白、尿转铁蛋白、尿免疫球蛋白IgG显著降低，提示研究组存在肾小球损害及血管内皮功能异常，与对照组相比差异有统计学意义（P
讨 论
微量白蛋白尿在高血压及其他心血管损害性疾病的发生发展过程中具有重要影响意义，尤其与合并肾脏早期损害的筛查工作中显示出突出的参考价值[2]。患者血压波动较大或持续增高，首先影响肾脏循环血量，破坏肾脏代谢机制[3]。同样，肾脏功能损害相关指标的检测，也可以用于为高血压患者的治疗方案制定工作提出参考意见。因此，尿微量白蛋白的检测不仅成为临床治疗高血压的疗效观察指标，还成为有效防止高血压造成靶器官损害的重要措施[4]。
肌球蛋白篇10
>> 丛枝菌根共生的信号转导及其相关基因 丛枝菌根真菌对丹参内源激素的影响 WWOX基因在乳腺癌发生过程中的表达及其意义 氮沉降对植物―丛枝菌根共生体影响的研究进展 农牧交错带柠条根围丛枝菌根真菌的空间分布 丛枝菌根真菌对红树植物耐盐性的影响 丛枝菌根真菌对改善植物磷素营养机制的研究进展 丛枝菌根真菌对丹参幼苗生理特性的影响 丛枝菌根真菌与哈茨木霉菌合用对连作丹参生长及质量的影响 食管癌发生过程中相关的癌基因的研究 TNF―α在末端病发生过程中的作用 逆境胁迫下丛枝菌根对茶树生长及茶叶品质的影响 重庆植烟区丛枝菌根真菌资源调查及初选分析 α―L―岩藻糖苷酶基因在斑马鱼发育过程中的功能分析 从适应到创新形式基因在环境设计创作过程中的应用形式探讨 刍议知识发生过程中的概念建构 卵泡发生过程中GDF-9和BMP-15(GDF-9B)的作用 运动性心脏肥大发生过程中心房肌内皮素基因的表达 林木—菌根菌共生体在抗旱造林中的作用机制 ipt基因在植物基因工程中的应用 常见问题解答 当前所在位置：l）进行钙调素蛋白的理化性质分析，推测AMF中的CaM氨基酸序列。利用NCBI的蛋白质序列数据库（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列的同源性比对，找到其中已正式发表的具有代表性物种的CaM序列。
1.4 共生前期试验材料的获取
用于抽提RNA的不同生长阶段AMF材料的获取：休眠期孢子，取 4 ℃保存的接种剂，利用湿筛法筛选干净的休眠孢子；萌发的孢子，挑取表面灭菌[12]后的孢子置于含根分泌物[12]的灭菌水中，暗培养3～5 d，待孢子萌发管长度达到3～5 mm时收获，同时以不含根分泌物为负对照；盆栽试验，用AMF孢子侵染紫花苜蓿，根据AMF的侵染状况收获不同共生时期AMF侵染的根段，分为附着胞形成时期、根内菌丝生长期、丛枝形成期和泡囊期。
1.5 胁迫试验
将接种的苜蓿进行不同胁迫处理。重金属胁迫：以锌（ZnSO4）和镉（CdCl2）进行处理；盐胁迫：以NaCl溶液及类金属砷（Na3AsO4）对盆栽植物进行处理。
ZnSO4处理：浓度为100、200 mg/kg（以土壤中的Zn含量计算）。从植株长出第一片真叶开始，分3 d 3次浇ZnSO4溶液，植株在含锌环境下生长4周为长期处理，短期处理则是3周后检测AMF侵染率≥80%后，浇入200 mg/kg的ZnSO4溶液，在第0.5、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、168.0 h取样，共7次，3次重复。对照（CK）为种植3周后浇同样水量的蒸馏水，0.5 h取样的植株。
NaCl处理：浓度为0.8、1.2 g/kg（以NaCl在土壤中的含量计算），长期处理使用0.8 g/kg浓度处理，短期处理使用1.2 g/kg的胁迫浓度处理，方法与Zn胁迫相同。
CdCl2处理：60 mg/kg CdCl2进行4周的长期处理，90 mg/kg CdCl2进行短期处理，处理方法与ZnSO4胁迫相同。
Na3AsO4处理：60 mg/kg Na3AsO4进行4周的长期处理，120 mg/kg Na3AsO4进行短期处理，处理方法与Zn相同。
除此之外，对未萌发孢子转录水平变化进行了比对（材料为对照组菌根）。
1.6 实时荧光定量PCR引物的设计及基因转录量的分析
根据钙调素基因的ORF区段设计特异性引物RT258F1/RT258R1，肌球蛋白基因片段序列设计特异性引物myoF/myoR。用荧光定量PCR检测CaM基因和myosin基因 mRNA的转录情况，内参基因选用Gi 18sRNA，内参引物为ALO/S112[13]。反转录后，取0.5 μL模板，用特异性引物RT258F1/RT258R1、myoF/myoR进行反转录效果的检测；同时，利用基因的内含子区段引物201F/201spR2进行36个循环反应，对反转录产物进行DNA污染的验证，无扩增条带则为合格的cDNA样品，用于进行实时荧光定量PCR分析。将cDNA进行5倍梯度稀释，筛选最佳的模板加入量。
实时荧光定量PCR反应体系：上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）10 μL，反转录产物 （cDNA第一链）2 μL，补蒸馏水到20 μL。利用Applied Biosystems step oneTM Real-Time PCR system Thermal cycling（ABI 7300）荧光定量PCR仪进行反应。扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；之后加溶解曲线分析反应。结果分析采用2-ct的计算方法。
2 结果与分析
2.1 钙调蛋白序列
结合反向PCR与3′RACE技术的结果，可从基因组DNA及cDNA上同时获取较为完整的序列信息，将所得的序列信息使用生物软件ClustalW程序进行序列分析，所在编码区从起始密码子ATG到终止密码子TAG的cDNA长度为450 bp，ORF为762 bp，包含4个外显子和4个内含子，而ATG前的启动子和5′端非翻译区的片段长度为433 bp，所得到的整个序列的G+C含量为30.87%，符合丛枝菌根真菌的基因组碱基G+C低含量的特点[14]。将丛枝菌根真菌所表达的钙调素蛋白氨基酸序列与有代表性的其他物种所表达的钙调素蛋白氨基酸序列进行同源比对，相似度为90.34%（图1）。
通过已知的ORF，可按照标准的密码子利用表获得AMF的蛋白质序列，共149个氨基酸组成，预测其分子量大小为 17 kDa，等电点为4.18，并根据同源性比对找出其两端的保守区域，钙调素基因所表达的蛋白质两端具有可与钙离子结合的区域――EFhand超家族。
在蛋白质结构预测系统[Protein structure prediction server，（PS）2-v2）]上对钙调素基因的编码蛋白质进行同源建模模拟，得到其三维结构如图2所示。所预测的蛋白质三维结构符合公认的钙调蛋白质的三维结构特点。
2.2 实时荧光定量PCR
2.2.1 丛枝菌根真菌不同时期的生长状况 经过统计，丛枝菌根真菌孢子萌发状态良好，真菌孢子的萌发率均为70%，而在无菌水中的真菌孢子则没有萌发，可用于后续试验。前期预试验是将侵染的紫花苜蓿根段经TB染色制片后进行显微镜观察，通过统计侵染率、各时间段特定结构（如附着胞、丛枝、泡囊）的数量，确定在合适时间进行后续试验的侵染根段取样，用于研究不同时期丛枝菌根真菌CaM的表达量变化。通过镜检观察不同时期的侵染状况（图3）：从第5天开始进行抽样观察，第10天开始出现附着胞，第12天侵染点增至30%且有菌丝贯穿于根细胞内，第18天开始出现丛枝，直至第25天会有大量丛枝产生，到50 d后有泡囊形成。2.2.2 不同共生时期的盆栽试验结果 根据丛枝菌根真菌对紫花苜蓿的侵染状况，收获12、18、25、50 d的根样品提取RNA，经反转录后用于实时荧光定量PCR检测。挑取消毒处理的丛枝菌根真菌孢子放入根分泌物中进行萌发生长，2周后收获并提取RNA反转录成cDNA，并进行半定量的电泳检测。结果发现，相较于休眠期孢子，萌发的丛枝菌根真菌CaM有明显的上升表达，而肌球蛋白（Myosin）的上升表达更为明显，可进行荧光定量分析。
丛枝菌根真菌CaM的荧光定量结果（图4a）表明，与休眠孢子比较，该基因在共生早期，从孢子萌发开始有明显的上调表达，这说明丛枝菌根真菌CaM蛋白质在侵染早期的功能较为显著；12 d时表达量达到最高，但随着侵染的深入逐渐降低。证明钙离子和钙调蛋白质主要是在菌根真菌与宿主植物共生早期的信号转导上起作用。
丛枝菌根真菌肌球蛋白的荧光定量结果（图4b）表明，在菌丝生长过程中，丛枝菌根真菌Myosin表达量增加最为明显；在菌根真菌侵染紫花苜蓿形成共生体后该基因表达量明显下降，但是随着真菌菌丝在植物细胞中的延伸其表达量逐渐增高；之后由于侵染的深入、丛枝分化以及内生菌丝的生长均需要肌球蛋白来延伸AMF的细胞骨架，从而促进其生长，故呈持续递增趋势；50 d时，产生大量根外菌丝，丛枝菌根真菌肌球蛋白表达量增长更为明显。肌球蛋白在菌根真菌与宿主植物的共生过程中呈梯度增长模式，这可能是因为肌球蛋白在菌丝生长过程中协助钙调素定位在生长的活性部位。
2.2.3 共生体中丛枝菌根真菌CaM在不同胁迫处理下的转录变化 丛枝菌根真菌CaM在胁迫处理下的转录变化结果（图5）表明，CaM对于细胞外环境刺激下的应激效应很迅速。当加入过多量的钠盐时，24.0 h丛枝菌根真菌CaM表达量与对照相比上升了1.75倍；在加入镉离子后，CaM表达量在3.0 h后有上升表达，比对照高1.75倍；加入锌离子后6.0 h，CaM表达量是对照的1.6倍；加入砷酸盐后，与对照相比，CaM表达量有2次明显的上升表达，分别是1.5 h和12.0 h，其中1.5 h时CaM的表达量升高较明显。以上4种胁迫处理的结果表明，菌根共生体中菌根真菌的钙调素在砷酸盐、镉离子和钠盐的高渗胁迫下作用较为明显，推断可能存在钙离子的信号转导过程。
3 讨论
3.1 丛枝菌根真菌中钙调素基因的功能
本研究中从AMF中克隆到CaM基因序列，与其他物种进行比对后，发现不同物种间钙调素无论在基因序列、氨基酸序列还是功能上都是高度保守的，但是不同种属间又有其特异性[15]。钙调素对于细胞适应环境变化具有重要的调控作用，在一些真菌细胞中钙调素的一些功能是保守的，但是也存在差异性，因为钙离子信号转导途径会通过钙调蛋白在不同宿主细胞内所表现的不一样的功能来适应不同的环境[6]。病原真菌在面对环境压力时，CaM会首先激活下游的钙调素相关激酶（由CMK1和CMK2共同编码）和磷酸酶（Calcineurin）[7]。
AMF中的钙调素对于共生前期的信号转导、早期的共生建立以及细胞适应环境变化都具有重要的调控作用。由不同时期的荧光定量分析可以看出，钙调素的功能主要体现在共生早期阶段，对于孢子萌发及共生建立有重要的指示作用，当AMF接收植物分泌的信号物质，会在真菌细胞内产生钙离子激增现象，而钙离子浓度的变化会被钙调素识别，并激活下游的共生相关基因的表达。不同胁迫条件下的CaM表达量差异分析则表明细胞要适应外界的环境压力，也需要钙离子和钙调素的共同参与。
钙离子和氢离子作为转导化学信号和环境信号的指示物质[4]，并将信号转导给钙调素后的分子机制仍有待研究。
3.2 丛枝菌根真菌中钙调蛋白与肌球蛋白间的功能联系
对丝状真菌中钙调素的研究证明，钙离子对菌丝顶端生长具有促进及引导的作用，而钙调素作为钙离子的主要受体是这一系列变化的枢纽，从丛枝菌根真菌中分离得到的钙调素基因与丝状真菌的钙调素基因在序列结构上有高度的同源性，从而推断钙调素在引导菌根真菌菌丝极性生长从而促进共生中有着重要的作用。本研究中丛枝菌根真菌萌发后CaM有明显的上调表达，也可证明这一点。肌球马达蛋白（Myosin motor）可以沿着肌动蛋白运输细胞器，其中肌球蛋白Ⅰ型（Myosin 5α）为钙离子依赖型，它的活性受重链尾部的调控。研究证明，肌球蛋白Ⅰ型在微摩尔浓度的钙离子的刺激下，它的重链上的异亮氨酸-谷氨酰胺基序（IQ motif）会与CaM结合，这表明钙离子和CaM是以此来调控肌球蛋白的功能[16]。而丛枝菌根真菌中获得的动力蛋白typeⅠmyosin基因，在萌发过程中有非常明显的上调表达，这很可能是因为在菌丝生长过程中肌球蛋白协助钙调素定位在其活性部位，之后肌球蛋白基因的表达量下降，直至共生建立后菌丝在根内延生，其表达量才开始逐渐回升。
在关于轮藻（Chara）的肌球蛋白研究中也发现CaM可能是作为肌球蛋白的一条轻链存在，因为当钙离子与CaM结合后，不仅可以激活肌球蛋白的能动性以及肌动蛋白依赖型ATPase的活性，还可与肌球蛋白的重链结合[17]。在酿酒酵母中CaM对极性生长过程也具有重要的调控作用，它会与一种肌球蛋白V型（Myo2p）相互作用行使这一功能[5]。在体外，Myo2p所包含的IQ结构位点可与CaM结合，而不需要钙离子的参与，在细胞周期中Myo2p和CaM可能是结合共定位[18]。肌球蛋白沿着肌动蛋白运输线粒体、分泌囊泡和液泡。在丛枝菌根真菌菌丝的萌发生长过程中，也会发现线粒体会聚集在菌丝的活性生长部位，这可能也是在肌球蛋白的参与下进行的[19]。
综上所述，钙离子对菌丝顶端生长中具有促进及引导作用；在菌根真菌中，钙调素接收钙离子的信号后引导真菌的菌丝极性生长、参与钙离子的信号转导从而促进共生；在抗逆性的研究中发现，钙调素可能参与了细胞抵抗高渗环境下的钙离子信号转导途径。对于今后研究菌根共生早期钙离子信号转导及砷胁迫下的细胞抗逆性机制有一定的指导作用。
参考文献：
[1] BONFANTE P， REQUENA N. Dating in the dark： How roots respond to fungal signals to establish arbuscular mycorrhizal symbiosis[J]. Current Opinion Plant Biology， 2011，14（4）：451-457.
[2] FU Q S， XIANG S K. Molecular process of arbuscular mycorrhizal associations and the symbiotic stabilizing mechanisms[J]. African Journal of Microbiology Research，2011，6（5）：870-880.
[3] AKIYAMA K， MATSUZAKI K， HAYASHI H. Plant sesquiterpenes induce hyphal branching in arbuscular mycorrhizal fungi[J]. Nature，2005，435（7043）：824-830.
[4] RAMOS A C， FACANHA A R， FEIJO J A. Proton （H+） flux signature for the presymbiotic development of the arbuscular mycorrhizal fungi[J]. New Phytol，2008，178（1）：177-188.
[5] CHEN S， SONG Y， CAO J， et al. Localization and function of calmodulin in live-cells of Aspergillus nidulans[J]. Fungal Genetic Biology，2010，47（3）：268-278.
[6] WANG G， LU L， ZHANG C Y， et al. Calmodulin concentrates at the apex of growing hyphae and localizes to the Spitzenkorper in Aspergillus nidulans[J]. Protoplasma，2006，228（4）：159-166.
[7] KRAUS， PETER R， JOSEPH H. Coping with stress： Calmodulin and calcineurin in model and pathogenic fungi[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，1（10）：1151-1157.
[8] ADOLPHE Z， HUBERT D， VIVIENNE G P. DNA cloning and screening of a partial genomic library from an arbuscular mycorrhizal fungus， Scutellospora castanea[J]. Mycorrhiza， 1994， 4（1）：251-254.
[9] BREUNINGER M， REQUENA N. Recognition events in AM symbiosis： Analysis of fungal gene expression at the early appressorium stage[J]. Fungal Genetics and Biology，2004，4（2）：794-804.
[10] ELIZABETHl S L， GUANG W D， MICHAEL A F. 3′ end cDNA amplifi cation using classic RACE[J]. Nature Protocols，2007，1（6）：2742-2745.
[11] SAMBROOK J， RUSSELL D W， RUSSELL D W. Molecular Cloning： A laboratory Manual （3-volume Set） [M]. Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor， New York，2001.
[12] 董昌金， 郑世学， 赵 斌. 球囊霉属几种AM真菌孢子表面消毒与萌发的研究[J].菌物系统，2003，22（3）：410-416.
[13] BUEE M， ROSSIGNOL M， JAUNEAU A. The pre-symbiotic growth of arbuscular mycorrhizal fungi is induced by a branching factor partially purified from plant root exudates[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2000，13（6）：693-698.
[14] HOSNY M， BARROS J P， VIVENNE G P. Base composition of DNA from glomalean fungi： High amounts of methylated cytosine[J]. Fungal Genetics and Biology， 1997，22（23）： 103-111.
[15] MA Z B， ZHAO J X， WANG L A， et al. Cloning， prokaryotic expression， and bioactivity of the calmodulin gene of Magnaporthe grisea[J]. FEMS Microbiol Lett，2009，300（1）：107-114.
[16] KAKEI T， SUMIYOSHI H， SUGIE H F. Characteristics of light chains of Chara myosin revealed by immunological investigation[J]. Proceedings of the Japan Academy， Series B， 2012，88（5）：201-211.
[17] LU Z， SHEN M， CAO Y， et al. Calmodulin bound to the first IQ motif is responsible for calcium-dependent regulation of myosin 5a[J]. J Biology Chemistry， 2012，287（20）：16530-16540.