干扰素抗病毒作用研究论文

[摘要]本文棕述了干扰素的分类、信号传导及其影响因素、受干扰素刺激的基因产物的抗病毒作用，以及干扰素在临床用于抗病毒治疗的效能，并提出了一个早期治疗SARS感染的建议方案。[关键词]干扰素；抗病毒；SARSAntiviralInterferonsandTheirTherapeuticPotentialsforSARSYANGLiping1,CAOSuyan2,SHAOHong31.DepartmentofClinicalPharmacology,BeijingHospital,Beijing100730;2.DepartmentofEmergency,BeijingHospital,Beijing100730;3.DepartmentofPharmacyAdministrationandClinicalPharmacy,SchoolofPharmaceuticalSciences,BeijingUniversity,Beijing100083[Abstract]Thispaperisabird’s-eyeofclassification,signalingpathways,IFN-stimulatedantivirusgenesofinterferons,asummaryofeffectsofviral-inducedfactorsoninterferonsignalingpathways,andsomeclinicalpractices.Inconclusion,atherapeuticprotocolforinhibitingSARSviralinfectionisrecommended.[KeyWords]Interferon(IFN);Antiviral;SARS病毒是专性细胞内寄生的微生物，大多数细胞都固有抗病毒的能力。机体在受到病毒感染时，免疫细胞和非免疫细胞（如感染的组织细胞）会产生多种细胞因子，如白介素-1、白介素-8、白介素-6、白介素-12、肿瘤坏死因子-a、干扰素-a和干扰素-b.这些细胞因子在机体发挥着非特异性的效应，包括致炎、致热、引发急性期反应、趋化炎症细胞、激活免疫细胞、抑制病毒复制、胞毒作用等，这些都属于天然免疫反应的范畴。机体的天然免疫机制主要限制病毒早期的感染和传播。在病毒感染的早期阶段常常是宿主防御能力与病毒感染能力的竞争过程。一旦宿主防御系统被突破，早期天然（非特异）免疫的防御因素，如干扰素，自然杀伤（Naturalkiller,NK）细胞和巨噬细胞，首先被激活。随着感染的进行，获得（特异）性免疫应答被启动，细胞毒T细胞，辅助T细胞和抗病毒抗体随之出现。抗病毒抗体的出现给病毒在细胞和组织间传播建起了一道屏障，特别是限制病毒在血液中的传播。但特异性免疫应答相对于非特异的应答要晚得多。感染初期主要是天然免疫起到防护作用，病毒直接激活被感染细胞转录的是I型干扰素基因而刺激机体的抗病毒反应，而II型干扰素主要在获得性免疫应答（而非天然免疫应答）中起重要作用。因此，I型干扰素是宿主细胞和临近细胞抵御病毒感染的第一防线。2003年初，在世界范围内爆发的严重急性呼吸综合征（severeacuterespiratorysyndrome，SARS）威胁了成百上千的无辜生命。Peiris等在Lancet(2003,361:9365)上提供的证据强有力地表明，SARS与一种新的从未在人类或动物中发现过的冠状病毒有关，现称为SARS病毒。这种状病毒通过近距离飞沫传染并迅速发展为严重的非典型肺炎。为了控制这种致命性病毒感染，首先应搞清SARS病毒的致病机制，这需要研究SARS病毒是如何逃逸免疫防御系统而得以在机体中迅速扩散；弄清病毒是否编码相关因子来抑制免疫应答，如抑制细胞对IFN应答反应等。如果存在这类因子，则有可能成为药物作用的靶点；而且去除这些因子基因的病毒还可用于疫苗的研究。干扰素的分类和信号传递1干扰素的分类IFN是人类和动物细胞在对各种病毒刺激的应答中产生的具有多种功能的一类蛋白或糖蛋白，是细胞因子家族中成员。它可激活别的基因亚群进行转录。根据其抗原性和分子结构，可将IFN分为5个不同种类：IFNα，IFNβ，IFNγ，IFNτ和IFNω。IFNα，IFNβ和IFNγ在体内分别由白细胞或淋巴母细胞、纤维母细胞和受免疫刺激的T淋巴细胞产生，IFNβ在DNA水平上与IFNα有30%的同源性，而IFNγ与IFNα和IFNβ无明显的同源性。它们是常作为药用的几个亚型，在体外可通过重组DNA技术进行生产[1]。其中，IFNα是了解最多也是用得最广的抗病毒药物，约有23个变种，较详细研究的有约13种亚型。IFNτ，即所谓的TP-1，是由反刍动物营养细胞分泌的，不同的宿主有不同的多肽序列。IFNω，由病毒感染的白细胞分泌的一种单糖蛋白，是人类白细胞IFN的主要成分，也可通过体外重组DNA技术进行生产。IFNω与IFNα高度同源，与IFNβ有较疏远的关系，而与IFNγ无关。IFNα，IFNβ，IFNγ，IFNω和IFNτ分别由156-166，166，143，172和172个氨基酸组成，其中α，β，γ各自的亚型在结构上又有不同（见表1），作用基本一样，这可能是由于不同厂家为了竞争而研究开发的结果。表1IFN亚型的结构差异名称

蛋白的氨基酸变化

IFNα

第23氨基酸第34氨基酸IFNα-2a赖氨酸组氨酸IFNα-2b精氨酸组氨酸IFNα-2c精氨酸精氨酸

IFNβ

第1氨基酸第17氨基酸第80氨基酸IFNβ-1a甲硫氨酸半胱氨酸糖基化IFNβ-1b丝氨酸非糖基化

IFNγ

第1氨基酸第139氨基酸IFNγ-1a氢,酪氨酸,半胱氨酸精氨酸,丙氨酸,丝氨酸,谷氨酰胺,羟基IFNγ-1b氢,甲硫氨酸羟基2干扰素的信号传递根据IFN生物信号传递途径（受体）的不同，将其分为2种类型：I型IFN(IFNα,IFNβ,IFNτ和IFNω)和II型IFN(IFNγ)。I型干扰素实现其生理功能主要通过与高亲和力浆膜受体结合，使JAK激酶（Jak1和Tyk2）磷酸化，然后磷酸化转录信号传导子与活化子（signaltransducerandactivatoroftranscription，STAT）蛋白（STAT1和STAT2），STAT1和STAT2转录因子与DNA结合蛋白p48（也称IFN调节因子——IRF）形成复合物。该复合物转入细胞核，与IFN-刺激应答元素（IFN-stimulatedresponseelement，ISRE）结合，最终激活IFN-刺激基因（IFN-stimulatedgenes，ISG），导致ISG的转录2]。而II型IFNγ与其受体结合后，通过受体分子内SH2-磷酸酪氨酸相互作用，诱导两个STAT1同型聚合形成IFNγ激活因子（IFNγactivatedfactor，GAF）[3]。随后GAF转移进细胞核，直接与保守的IFNγ应答基因启动子上的IFNγ激活位点(GAS;TTN5AA)结合，刺激相应的基因转录。由IFN刺激产生的基因产物表现出的生物活性包括抗病毒、抗增殖和免疫调节。两种信号传导途径的特性见表2。表2I型和II型IFN信号传导途径的特性I型II型IFNIFNα，IFNβ,IFNτ,IFNωIFNγ诱导复合物ISGF3复合物(三聚体)：STAT1,STAT2,IRF9(p48)GAF复合物（同型二聚体）：STAT1复合物功能启动ISG的转录启动IFNγ应答基因的转录IFN刺激基因IFN-刺激基因（ISG）IFNγ应答基因作用阻挠病毒DNA复制(抗病毒，抗增殖，抗肿瘤及抗炎)调节获得性免疫应答（抗肿瘤）GAF：IFNγ激活因子；IRF：IFN调节因子；ISG：IFN-刺激基因；ISGF：IFN-刺激基因因子；STAT：磷酸化转录信号传导子与活化子受IFN刺激的抗病毒基因最近，用基因芯片的方法研究发现，受IFN刺激的基因有300多种，包括有4个肿瘤抑制基因、8个抗病毒基因、12个激素基因、16个受体基因、19个程序死亡基因及39个免疫调节基因等[4]。其中有8个受IFN刺激的抗病毒基因，它们是IFNAR1,IFNAR2,PRKR,GBP2,MX1,MX2,SCYA5和OAS2（见表3）。

表3受IFN刺激的抗病毒基因及其性质

基因蛋白作用靶位活性或效用IFNAR1IFNα和IFNβ的受体Jaks,Tyk2,STAT,IFN-Ra和b酪氨酸磷酸化作用IFNAR2IFNα和IFNβ的受体Tyr激酶(Jak1),STAT1,STAT2信号传导PRKR蛋白激酶催化EIF2的α亚单位磷酸化受双链RNA活化；抑制蛋白合成的启动GBP2鸟苷酸结合蛋白2GTP,GDP和GMP结合作用MX1抗GTP-结合蛋白MXAGTP抗流感病毒和VSV(弹状病毒属)MX2抗GTP-结合蛋白MXBGTP抑制RNA病毒的转录(对DNA病毒几乎无作用)SCYA5趋化因子的(C-C基序)配体5血单核细胞；记忆T辅助细胞；嗜酸性细胞；CCR1,CCR3,CCR4,CCR5靶细胞的化学引诱物；引起组胺释放HIV和SIV的抑制剂OAS22'''',5''''-寡腺苷酸合成酶2ATP聚合作用以裂解单链的RNA而破坏病毒mRNA在这8个由IFN激活的抗病毒基因中，Mx蛋白能够抑制不同种类的RNA病毒的转录，而对DNA病毒的作用极小[5]。而OAS则代表了一个受IFN诱导的蛋白家族，并涉及到IFN抗病毒作用机制。在被双链RNA激活后，该家族蛋白将ATP聚合成pppA(2''''p5''''A)n(n=1或n>1)寡聚体，进而激活潜在的核糖核酸酶L（RNAseL），被激活的RNAseL裂解单链RNA而使病毒的mRNA降解，起到抗病毒的作用[6]。IFN信号传导途径中病毒因子的作用IFN是宿主抗病毒应答反应的主要成分。相应地，许多病毒能产生病毒因子（蛋白或RNA分子）或抑制或激活IFN信号传导以及与IFN有关的抗病毒效应[7]。表4列举了4个负调节和1个正调节的病毒因子。表4病毒因子及其影响病毒因子来源靶途径作用结果SeVC蛋白仙台病毒I和II型IFN信号途径抑制酪氨酸磷酸化使细胞失去对IFN的应答MeVC和或V蛋白麻疹病毒I型IFN信号途径抑制Jak1磷酸化抑制IFN诱导的抗病毒状态MVV蛋白流行性腮腺炎病毒I型IFN信号途径减少STAT-1α负调节活性NipahV蛋白Nipah病毒I和II型IFN信号途径抑制STAT1和STAT2功能消除宿主对细胞因子刺激的敏感SM核蛋白Epstein-Barr病毒(EBV)I型IFN信号途径增加STAT1mRNA的累积正调节作用以上资料说明，感染机体的病毒可负调节也可以正调节IFN应答途径的不同层面，并以负调节居多。为了最终控制某些致命性病毒的感染，如SARS病毒，需要首先搞清其发病机制，即研究病毒是如何逃避宿主免疫清除的，病毒编码的因子（如NipahV,MeVC/V和SeVC蛋白）是否可能抑制细胞对IFN的应答而使病毒在机体内迅速扩散等。如果病毒确有编码抑制因子，这些因子还可能成为药物干预病毒致病的靶点；而除去病毒因子基因的病毒核酸还可用于疫苗研究。IFN抗病毒的临床应用1IFNα抗丙型肝炎病毒IFNα的制剂已被批准用于慢性丙型肝炎治疗。丙型肝炎病毒（HCV）是一种在世界范围内引起慢性肝炎和肝病的主要病原体。大约80%的慢性肝炎病例是由HCV感染引起的。为了了解IFNα在人体中的作用，对使用IFNα的丙型肝炎患者的外周血单核细胞基因表达的轮廓进行了基因阵列分析[8]。结果显示，IFNα上调包括抗原处理和呈递、T细胞活化、淋巴细胞游走及效应功能在内的多种基因，以增加免疫抵抗HCV的效能。上调的基因属于很宽的功能途径范围，有多个IFNα上调的基因是直接抗病毒的基因。在运用IFNα治疗HCV患者时，有相当部分患者出现IFNα抵抗现象。对抵抗IFNα的HCV患者，临床上进行再治疗时困难很大。有人用IFNα、利巴韦林、金刚烷胺联合治疗方案能够逆转IFNα抵抗状态，使HCVRNA转阴[9]。而更多的则是采用IFNα与利巴韦林联合的治疗方案。IFNα与利巴韦林联合治疗慢性HCV感染，31%~64%的患者可彻底消除病毒。HCV特异性CD4和CD8T细胞应答被认为是IFNα/利巴韦林联合疗效的重要因素，即使HCV患者康复的重要因素[10]。除此之外，一种长效IFN——聚乙烯乙二醇偶合IFNα-2a（polyethyleneglycol-interferon,PEG-IFNα-2a）单独用于治疗慢性HCV感染时，完全应答率可达36%-39%[11]。采用PEG-IFNα-2a与利巴韦林联合治疗比PEG-IFNα-2a单独使用的疗效还要好得多。联合治疗是指皮下注射PEG-IFNα-2a和口服利巴韦林，对HCV患者是一种新的治疗方案，对初次进行治疗的HCV患者，PEG-IFNα-2a/利巴韦林联合治疗可引起患者对病毒持久性地应答[12]；对抵抗IFNα的HCV患者，PEG-IFNα-2a/利巴韦林联合治疗初期应答虽然较弱，但足以克服对IFNα无反应现象[13]。疲劳是使用IFNα的肝病患者常常抱怨的事。大多数病例单独运用IFNα治疗后1~3个月内出现疲劳，6个月后疲劳才减轻。相应地，用IFN和卡尼汀联合治疗的患者疲劳程度明显减轻，且减轻时间早于6个月[14]。2IFNα抗人类免疫缺陷病毒IFNα不仅用于治疗HCV患者，也用于治疗受HIV感染的患者。在HIV感染的患者中，代表NK细胞活性的细胞毒活力、穿孔素和颗粒酶A表达及NK细胞的百分比都很低下[15]。给予PEG-IFNα能恢复患者NK细胞表达穿孔素的水平，但病毒的载量并不降低。HIV诱导的NK细胞功能障碍，可能部分由穿孔素和颗粒酶A表达缺损造成。而PEG-IFNα可增强感染患者的天然免疫能力，并最终减少病毒。3对治疗SARS感染的建议以上的临床应用结果启示我们，就是对未知病毒的感染，尽早给予外源性I型IFN也能激活由IFN诱导的抗病毒状态和/或激活NK细胞表达穿孔素和颗粒酶A，从而增加宿主抗病毒的能力。一项对病毒性心肌炎的实验研究显示[16]，在接种病毒前、同时或24h内给予IFN，小鼠病毒性心肌炎可得到改善。病毒侵入心肌后，第一波在心脏出现的浸润细胞主要有NK细胞组成。NK细胞和IFN常常相互影响以控制病毒感染。当对付大量病毒时，病毒诱导的IFN的量不足以保护宿主。如果在感染前或感染早期给予外源性IFN，可以改善心肌炎症状，也只有在感染前或感染早期给药，才能有效。因此，可以尝试用IFN联合抗病毒药治疗现在的病毒引起的SARS感染。这也是为什么重组DNA技术生产的I型IFN（IFNα-2b和IFNω）最近在中国被建议用于治疗SARS病毒。尽早使用IFN以帮助SARS患者战胜病毒的感染，可能开启一个重新评估IFN抗病毒作用的新纪元。在SARS感染早期，给予外源性IFN可能通过增强天然免疫反应来拮抗冠状病毒的感染，最大程度的减少感染范围。这样有利于帮助病人度过急性期，避免感染范围过大而引起后期特异性免疫带来的过度反应。但是注意到有些中晚期的SARS病人体内免疫活性过高——据称这是主要的致命原因，因此不建议中晚期SARS患者用IFN进行治疗。由于IFN抗病毒作用强、毒性低，因此，建议在SARS感染发病初期给予利巴韦林的同时，给予IFNa-2b进行免疫治疗，这将有希望在感染早期遏制住病毒的大量复制，从而能减轻急性期症状，使患者能度过急性期，顺利进入恢复期，避免恶化的发生。对感染SARS病毒患者的早期治疗方案具体用药建议如下：1)皮下注射300万单位IFNa-2b/Qd,1周；2)静脉注射600mg利巴韦林/Q6hrs，2周。在SARS治疗方案中，IFN与利巴韦林还有协同抗病毒的作用，所以可以减少两者用量。这样就能减少IFN和利巴韦林的副作用，特别是利巴韦林的溶血性毒性。结语IFNα,PEG-IFNα,IFNα/利巴韦林及PEG-IFNα/利巴韦林都已经用来治疗不同病毒引起的感染，如HCV和HIV感染等。虽然IFNα和利巴韦林不是抗HCV或HIV病毒的特效药，但它们具有广谱的抗病毒效能，在抗病毒临床治疗中是有效的。特别是PEG-IFNα和PEG-IFNα加利巴韦林的治疗方案比其他IFN的方案更有效，这已经得到证实。因此，治疗SARS感染如果能尽早给予外源性IFNα，加上利巴韦林，患者可能有更多的机会战胜病魔。我们的建议被来自德国同行的最新研究（Lancet.2003362:293）有力地证实了。他们用重组IFN对在Vero细胞和Caco2细胞内复制的SARS冠状病毒（SARS-CoV）临床分离株的抑制作用进行了评估。体外实验证明，重组干扰素a和b(IFNa/b)都有抑制SARS-CoV复制的作用，IFNb的抑制作用更强。感染发生前，IFNb有预防作用；感染发生后，IFNb有治疗作用。因此，IFNb也可单独应用或与其他抗病毒药联合应用治疗SARS。[参考文献][1]ReynoldsEFJames.Martindale—TheExtraPharmacopoeia.32theed.1999,pp.615~622.[2]RudickRA,RansohoffRM.Biologiceffectsofinterferons:relevancetomultiplesclerosis.MultScler，1995,1Suppl1:S12-16.[3]ShuaiK,SchindlerC,PreziosoVR,etal.ActivationoftranscriptionbyIFN-gamma:tyrosinephosphorylationofa91-kDDNAbindingprotein.Science,1992,258:1808–1812.[4]deVeerMJ,HolkoM,FrevelM,etal.Functionalclassificationofinterferon-stimulatedgenesidentifiedusingmicroarrays.JLeukocBiol,2001,69:912~920.[5]LRoitt,JBrostoff,DMale.Immunology,2001,p236HarcourtAsiaPteLtd.[6]HovnanianA,RebouillatD,MatteiMG,etal.Thehuman2'''',5''''-oligoadenylatesynthetaselocusiscomposedofthreedistinctgenesclusteredonchromosome12q24.2encodingthe100-,69-,and40-kDaforms.Genomics,1998,52:267-77[7]RuvoloV,NavarroL,SampleCE,etal.TheEpstein-BarrvirusSMproteininducesSTAT1andinterferon-stimulatedgeneexpression.JVirol,2003,77:3690~3701.[8]JiX,CheungR,CooperS,etal.InterferonalfaregulatedgeneexpressioninpatientsinitiatinginterferontreatmentforchronichepatitisC.Hepatology,2003,37:610~621.[9]YounossiZM,MullenKD,HodnickS,etal.Triplecombinationofinterferonalpha-2b,ribavirin,andamantadinefortreatmentofchronichepatitisC.JClinGastroenterol,2003,36:427~430.[10]SreenarasimhaiahJ,JaramilloA,CrippinJ,etal.Concomitantaugmentationoftype1CD4()andCD8()T-cellresponsesduringsuccessfulinterferon-alphaandribavirintreatmentforchronichepatitisCvirusinfection.HumImmunol,2003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