开口箭提取物研究论文

【摘要】目的通过体外细胞培养技术，探讨开口箭提取物的细胞毒活性，为进行深层次研究提供依据。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总皂苷、30%总皂苷和70%总皂苷对HL-60和Caski细胞的抑制作用显著，与阴性对照相比（P<0.05）,对HL-60细胞的抑制率达到60.12%，72.25%，89.09%，95.17%，其IC50为65.57，45.07，35.40，22.89μg/ml。对Caski细胞的抑制率达到63.94%，71.48%，62.49%，73.43%，其IC50为108.42，84.53，41.02，47.19μg/ml。结论开口箭提取物对HL-60和Caski细胞具有明显的抑制作用。

【关键词】开口箭；皂苷；MTT法；细胞毒活性

Abstract：ObjectiveToobservethecytotoxicitiesoftheextractsofTupistrachinensisBak.withinvitrocellculturetechnology,andprovideevidenceforthefurtherresearch.MethodsThecytotoxicitieswereassayedbyMTTmethodsonHL-60andCaskitumorcells.ResultsTheinhibitioneffectoftheextractsofTupistrachinensisBak.,totalsaponins,30%totalsaponinsand70%totalsaponinsonHL-60andCaskicellswereallprominent,comparedwiththenegativemodelgroup(P<0.05).TheirinhibitionratiosonHL-60tumorcellswereasfollows:60.12%,72.25%,89.09%and95.17%，andtheirIC50were65.57,45.07,35.40and22.89μg/ml.TheirinhibitionratiosonCaskicellswere63.94%,71.48%,62.49%and73.43%，andtheirIC50were108.42,84.53,41.02,47.19μg/ml.ConclusionTheextractsofTupistrachinensisBak.havesignificantcytotoxicityonHL-60andCaskitumorcells.

Keywords：TupistrachinensisBak.；Saponin；MTTmethod；Cytotoxicity

开口箭（TupistrachinensisBak.）系百合科Liliaceae铃兰族开口箭属植物，为著名的传统中药，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛等症，民间用于治疗咽喉炎、扁桃体炎等。现证明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。

本实验室通过实验证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且含量较高［3］。皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性,近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性［4，5］。本文旨在通过体外抗肿瘤实验,观察开口箭提取物对HL-60和Caski细胞的细胞毒活性,现报告如下。

1材料

1.1细胞株人急性淋巴细胞性白血病细胞（HL-60）、人宫颈鳞状上皮癌细胞(Caski)均由三峡大学免疫教研室提供。

1.2药品与仪器RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品，胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品；四氮唑蓝(MTT)为美国AMRESCO公司产品；丝裂霉素(MMC，浙江海正药液股份有限公司，批号：051211)；酶联免疫检测仪(GENIOSTECAN)；CO2培养箱（日本三洋公司）；LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国Cornning公司)。

开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为TupistrachinensisBak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室（编号：TC200207SNJ）。

1.3药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取3次，合并3次提取液，浓缩后经石油醚脱脂用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗，30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得开口箭四部分皂苷。

分别取开口箭甲醇提取物、开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷4个样品，用含10%灭活的新生小牛血清RPMI-1640培养液将其配制成所需浓度，依次为62.5,125,250,500,1000,2000μg/ml。丝裂霉素(MMC)用含10%灭活的新生小牛血清RPMI-1640培养液将其配置为250μg/ml。所有受试样品均用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

2方法

2.1细胞培养HL-60和Caski细胞用RPMI-1640培养液（另加10mmol/LHEPES,2.0mg/mlNaHCO3，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2饱和湿度下培养。贴壁细胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.2MTT比色法［6］按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为0.8×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔接种180μl，转板6h后加20μl受试药,另设阴性对照组(不加药)、空白凋零组（只有培养基）和阳性对照组（MMC组），每组均设6个复孔，培养48h后加MTT(5mg/ml)15μl,继续培养4h后,弃去上清液，加DMSO100μl,用全自动酶联免疫检测仪于492nm波长处测定吸光度(OD)值［7］,求出IC50。抑制率（%）=［1-（实验组OD均值-空白组OD均值）/(对照组OD均值-空白组OD均值）］×100%。

2.3统计学处理实验数据以±s表示，数据分析采用SPSS11.5统计软件进行。用Origin软件，通过半对数拟合直线求IC50值。

3结果

3.1开口箭总提取物和总皂苷对HL-60细胞的影响结果见表1。

表1总提取物和总皂苷对HL-60细胞的抑制作用（略）

与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；n=6

由表1可知开口箭总提取物和总皂苷对HL-60细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有显著性差异（P<0.05或P<0.01），且呈良好的量效关系,总皂苷的抑制作用强于总提取物。

3.2开口箭30%总皂苷和开口箭70%总皂苷对HL-60细胞的影响结果见表2。

表230%总皂苷和70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用（略）

与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；n=6

由表2可知开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用显著，与阴性对照组比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。30%总皂苷最佳浓度为25μg/ml，其抑制率达89.09%，70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用虽药物浓度的增加而增大，量效关系明显。

3.3开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞的影响结果见表3。

表3开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞的抑制作用（略）

与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；n=6

由表3可知开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞抑制作用明显，与阴性对照组比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）,呈良好的量效关系，总皂苷的抑制作用强于总提取物。

3.4开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞的影响结果见表4。

表430%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞的抑制作用（略）

与阴性对照组比较，**P<0.01；n=6

由表4可知，开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞抑制作用显著，与阴性对照组比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）,呈现一定的量效关系。

4讨论

以上结果表明，开口箭甲醇提取物、总皂苷、30%皂苷和70%皂苷对体外培养的HL-60和Caski细胞株的抑制作用显著，与阴性对照组比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01），其细胞毒作用呈现较明显的剂量依赖性。其中30%开口箭皂苷在25μg/ml时与同浓度下丝裂霉素作用于HL-60细胞的效果相当，70%开口箭皂苷在50μg/ml与丝裂霉素在25μg/ml浓度下作用于HL-60细胞的效果相当。药理实验显示开口箭毒副作用小，因此开发其细胞毒作用有潜在价值。

开口箭总皂苷上大孔树脂柱所得95%开口箭皂苷部分量较少，目前正在研究之中。至于不同的开口箭部位细胞毒活性存在差异，应与它们所含不同皂苷成分有关，还需要对其进行深入研究。

从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。据文献报道开口箭对HepG2和S180细胞株亦有明显的抑制作用［8］,本实验室发现开口箭对HL-60和Caski细胞有较强的细胞毒作用，可见开口箭具有广谱抗肿瘤作用，此外开口箭还有祛痰抗炎等作用。因此对开口箭的抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。

【参考文献】

［1］杨春艳,邹坤,杨兴海,等.开口箭祛痰、抗炎和抑菌实验研究［J］.中国民族民间医药杂志,2005，2:103.

［2］汤子春,邹坤,汪鋆植,等.开口箭与筒鞘蛇菰提取物的醒酒作用的实验研究［J］.时珍国医国药,2006,17(11):2163.

［3］黄丽,廖全斌,邹坤,等.开口箭中甾体皂苷元含量的测定［J］.三峡大学学报·自然科学版,2003,25(6):562.

［4］沈平，王三龙,杨崇仁,等.弯蕊开口箭中的多羟基甾体皂甙元［J］.植物学报,2003,45(5):626.

［5］PanWb,ChangFR,WeiLM,etal.Newflavans,spirostanolsapogenins,andapregnamegeninfromTupistrachinensisandtheircytotoxicity［J］.J.Nat.Prod.,2003,66(2):161.

［6］司徒镇强,吴军正.细胞培养,第1版［M］.西安:世界图书出版公司,2004:199.

［7］徐叔云.药理实验方法学,第3版［M］.北京:人民卫生出版社,2002：1762.

［8］朱正光,余传林,蔡晶,等.开口箭提取物的抗肿瘤作用研究［J］.中药材,2006,29(3):277.