消斑颗粒质量标准研究论文

【摘要】目的建立消斑颗粒的质量标准。方法应用薄层色谱法对消斑颗粒中制何首乌、陈皮、当归与川芎进行了定性鉴别；采用高效液相色谱法对颗粒中2,3,5,4ˊ四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷进行了含量测定。结果薄层色谱斑点清晰，阴性样品无干扰；2,3,5,4ˊ四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷在0.131～1.965μg范围内呈良好的线性关系，r=0.99997，加样回收率在95%～105%之间，RSD为2.05%（n＝5）。结论该方法简便且精确，重现性好，可以作为消斑颗粒的质量控制标准。

【关键词】消斑颗粒；薄层色谱法；高效液相色谱法

TheQualityStandardofXiaobanGranules

Abstract：ObjectiveToestablishthequalitystandardofXiaobanGranules.MethodsPolygonummultiflorumThunb.,CitrusreticulataBlanco,Angelicasinensis(Oliv.)DielsandLigusticumchuanxiongHort.wereidentifiedbythinlayerchromatography,andthecontentof2,3,5,4ˊTetrahydroxystilbene2OβDglucosideweremeasuredbyHighPerformanceLiquidChromatography.ResultsChromatographyspeckleswereclear,andthenegativesampleshowednointerference;2,3,5,4ˊTetrahydroxystilbene2OβDglucosideshowedagoodlinearrelationshipatarangeof0.131～1.965μg,r=0.99997,therecoverywasbetween95%and105%,withRSD2.05%（n＝5）.ConclusionThemethodissimpleandaccuratewithgoodreproducibility.ItcanbeusedforqualitycontrolofXiaobanGranules.

Keywords：XiaobanGranules;TLC;HPLC

消斑颗粒由制何首乌、熟地黄、当归、川芎、陈皮等药组成，具有益气养血活血、滋阴填精补肾的功效，主要用于气血两虚型黄褐斑的治疗。为确保制剂质量，对制剂中制何首乌、陈皮、当归与川芎进行了定性薄层色谱鉴别，并选择君药制何首乌中所含2,3,5,4ˊ四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷作为控制消斑颗粒质量的控制指标，采用高效液相色谱法测定其含量，建立了消斑颗粒中2,3,5,4ˊ四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷的HPLC含量测定方法。

1仪器和试药

1.1仪器HP1100高效液相色谱仪（惠普），惠普化学工作站，二极管阵列检测器，电子分析天平（十万分之一,STRTORIUS公司），AS10200超声波清洗器（50kHz）。

1.2试药硅胶G、硅胶H（青岛海洋化工厂）；甲醇、乙腈（色谱纯）；重蒸馏水；其余试剂均为分析纯；橙皮苷对照品，批号：7219405；2,3,5,4ˊ四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷对照品，批号：110844200505；何首乌对照药材，批号：9349403；陈皮对照药材，批号：9699201；当归对照药材，批号：9279202；川芎对照药材，批号：9189001；以上对照品及对照药材均由中国药品生物制品检定所提供。

2方法与结果

2.1定性鉴别

2.1.1制何首乌的薄层色谱鉴别取本品5g，加10ml水溶解，用乙醚提取两次，20ml/次，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇提取2次，20ml/次，合并正丁醇液，水浴挥干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。取缺制何首乌的阴性样品5g，同法制成制何首乌阴性供试品溶液。另取2，3，5，4ˊ-四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。取何首乌对照药材0.25g，加乙醇50ml，加热回流1h，滤过，滤液浓缩至3ml，作为对照药材溶液。吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μl分别点于同一以0.2%CMCNa为黏合剂的硅胶H薄层板上，以苯乙醇（2∶1），苯乙醇（4∶1）为展开剂(第一次展开3.5cm,第二次展开7cm)，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸硫酸溶液，加热至斑点清晰，日光下检视［1］。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，且阴性对照无相应斑点见图1。

2.1.2陈皮的薄层色谱鉴别取本品5g，加醋酸乙酯超声提取两次，10ml/次，合并醋酸乙酯提取液，水浴挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。取缺陈皮的阴性样品5g，同法制得陈皮阴性供试品溶液。取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。取陈皮对照药材0.3g，加甲醇10ml，加热回流40min，滤过，滤液浓缩至1ml，作为对照药材溶液［1］。吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各2μl分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷丙酮甲醇（5∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点，且阴性对照无相应斑点见图2。

2.1.3当归、川芎的薄层色谱鉴别取本品15g，加乙醚30ml，超声处理10min，分取乙醚液，挥至1ml，作为供试品溶液。取缺当归、川芎阴性样品15g,同法制得当归、川芎阴性供试品溶液。取当归对照药材0.5g，加乙醚20ml，超声处理10min,分取乙醚液，挥至1ml，作为当归对照药材溶液。取川芎对照药材0.5g，加乙醚20ml，超声处理10min，分取乙醚液，挥至1ml，作为川芎对照药材溶液。吸取对照药材溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μl分别点于同一以0.2%CMCNa为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷醋酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点，且阴性对照无相应斑点见图3。

图1制何首乌TLC鉴别（略）

图2陈皮TLC鉴别（略）

图3当归、川芎TLC鉴别（略）

2.2含量测定［2～3］

2.2.1色谱条件色谱柱为依利特ODSC18（150mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈水（25∶75），流速：0.6ml/min，检测波长：320nm，柱温：20℃。

2.2.2对照品溶液制备精密称取2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷对照品1.31mg，置10ml量瓶中，用稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3供试品溶液制备取本品约0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加50%乙醇25ml，称定重量，回流提取40min，放冷后用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4线性关系考察精密吸取2，3，5，4，四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷对照品溶液1，3，5，10，、15μl，分别进样，按上述色谱条件测定峰面积。结果见表1。以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，计算回归方程，并以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，见图4。

表1线性关系考察结果（略）

图42，3，5，4ˊ-四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷标准曲线（略）

回归方程：Y=3781X﹣43.749，r=0.99997结果表明，2，3，5，4，四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷在0.131～1.965μg的范围内呈良好的线性关系。

2.2.5方法学考察

2.2.5.1精密度实验精密吸取供试品溶液5μl，按上述色谱条件，重复进样5次，测定峰面积。结果见表2。

结果表明，供试品中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷峰面积的相对标准偏差小于2.0%，精密度良好。

表2精密度实验结果（略）

2.2.5.2重现性实验取同一批供试品5份，按供试品溶液的制备方法制备，分别进样5μl，测定峰面积。结果见表3。

结果表明，供试品中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷含量相对标准偏小于2.0%，重现性良好。

表3重现性实验结果（略）

2.2.5.3稳定性实验精密吸取供试品溶液5μl，于0，2，4，6，8h分别进样，依次测定峰面积，计算相对标准偏差，结果见表4。

表4稳定性实验结果（略）

结果表明，在8h内，供试品溶液稳定性良好（RSD＝0.80%）。

2.2.5.4专属性实验取二苯乙烯苷对照品溶液，何首乌对照药材溶液，缺何首乌阴性供试品溶液和供试品溶液，按照2.2.1色谱条件进行测定，结果见图5。

a2，3，5，4，四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷

b何首乌对照药材溶液c阴性供试品溶液

d供试品溶液

图5HPLC图谱（略）

结果表明，在上述色谱条件下，其他组分对2，3，5，4，四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷峰无干扰，分离良好。

2.2.5.5加样回收率实验取已知含量的供试品约0.5g，精密称定6份，置100ml具塞锥形瓶中，分别精密加入1ml2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷对照品溶液（2.38mg/ml），按照供试品溶液的制备方法操作得供试品溶液，按照上述色谱条件测定，并计算回收率，结果见表5。

结果表明，2，3，5，4四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷平均回收率为100.69%，回收率在95%～105%之间，RSD＝2.05%，加样回收率良好。

表5加样回收率实验结果（略）

2.2.6样品含量测定取本品3批，每批两份，取约0.5g，精密称定，按照供试品溶液的制备方法，分别制成供试品溶液。分别精密吸取2，3，5，4四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷对照品溶液（0.131mg/ml）、供试品溶液各5μl，按上述色谱条件测定，结果见表6。

表6供试品中二苯乙烯苷含量测定结果（略）

3讨论

3.1制何首乌为方中君药，主要含2，3，5，4四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷，且方中其它药材无该成分，故选择2，3，5，4四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷作为控制本品质量的指标成分。

3.2在薄层色谱鉴别研究中，陈皮按照药典收载方法展开，斑点暗淡,Rf值较小，不易鉴别，根据橙皮苷的理化性质，将药典中0.5%氢氧化钠－硅胶G薄层板改为聚酰胺薄膜，斑点清晰，分离度较好，且Rf值合适。川芎和当归，两者均含有阿魏酸，易互相产生干扰，将其一起鉴别，结果阴性无干扰，斑点圆整、清晰。

3.3在制何首乌含量测定中，分别考察不同提取方法、不同提取溶剂和不同提取时间对供试品溶液中2，3，5，4四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷含量的影响，结果以50%乙醇回流提取40min为最佳。

在色谱条件的优选中，对色谱柱、检测波长、流动相、柱温、流速进行了考察确定采用依利特ODSC18（150mm×4.6mm，5μm）柱，波长320nm，乙腈水（25∶75）为流动相，柱温20℃，流速0.6ml/min为测定条件。

3.4在2，3，5，4四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷含量测定过程中，发现对照品溶液和供试品溶液在放置24h后，含量有降解下降的趋势，故样品和对照品配制成供高效液相色谱测定用溶液后，应该在8h内完成测定。

本研究应用薄层色谱法对消斑颗粒中制何首乌、陈皮、当归与川芎进行了定性鉴别，采用高效液相色谱法对颗粒中2,3,5,4ˊ四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷进行了含量测定，操作简便，结果准确，重现性好，可作为质量控制方法。

【参考文献】

［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：122，132.

［2］刘斌,王晓强，王伟.何首乌配方颗粒质量标准研究［J］.中药材，2003,26(2)：115.

［3］唐斌，尚北城，张青，等.何首乌中二苯乙烯苷的含量测定［J］.西南国防医药，2004,14(5)：496