乌蕨抗氧化活性探究

[摘要]目的研究乌蕨总黄酮体外抗氧化活性。方法采用分光光度法，测定乌蕨总黄酮对羟自由基、脂质过氧化的清除能力、总还原力和总抗氧化作用，并通过多元线性回归分析，考察了乌蕨总黄酮含量及其体外抗氧化活性的相关性。结果乌蕨总黄酮具有较强的抗氧化性能、自由基清除能力和一定的还原力，可有效抑制脂质过氧化，且抗氧化作用与乌蕨总黄酮含量呈正相关。结论乌蕨总黄酮具有显著的抗氧化活性，黄酮类化合物可能是其抗氧化作用的主要物质基础。

[关键词]乌蕨;总黄酮;抗氧化

乌蕨[Stenolomachusanum(L.)Ching]为鳞始蕨科植物乌蕨的全草，又名野鸡尾、金花草、中华金粉蕨，具有清热、解毒、利湿、止血的功效[1]。其主要含有芳樟醇、松油醇和香叶醇等挥发性成分以及木犀草素、牡荆素等黄酮类化合物[2~4]。据报道，乌蕨具有抑菌、护肝、止血、解毒等作用，且安全，无毒副作用[5~7]。目前国内研究主要集中在乌蕨抗菌作用，笔者未见对其抗氧化作用的报道。为了合理利用该植物资源并确定其主要抗氧化活性成分，笔者对其进行了体外抗氧化研究，现报道如下。

1仪器与试药

1.1仪器BS224S精密电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，KQ-5000超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2试药乌蕨药材于2008年10月采自杭州九溪，经熊耀康教授鉴定为乌蕨[Stenolomachusanum(L.)Ching]的地上部分，阴干，粉碎，备用。芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所(批号:100080-20030);大豆卵磷脂购自Sigma公司(批号:F20070207);其他试剂均为分析纯。

2方法

2.1乌蕨提取物的制备定量称取乌蕨干燥粗粉10g，加16倍量含0.1%盐酸的60%乙醇回流提取4h，提取1次，提取液减压浓缩至含醇量约10%抽滤，除去杂质，加60%乙醇定容至100mL，作为供试品溶液，备用。参照文献[8]，经测定其总黄酮含量为11.89%。

2.2抗氧化活性实验[9~11]

2.2.1磷钼络合物法总抗氧化活性的测定在5mL具塞试管中加入供试品溶液适量，加试剂液4mL，加纯化水定容至5mL，加盖，混匀，置95℃水浴反应30min，冷却后，以纯化水作空白，于695nm波长下测定其吸光度。

2.2.2还原力测定取供试品溶液适量，加入磷酸缓冲液(0.2mol·L-1，pH6.6)1.5mL及1%铁氰化钾溶液1mL，50℃保温20min后，加入10%三氯乙酸溶液1mL，混匀，加纯化水2.5mL及0.1%三氯化铁溶液0.1mL。在700nm处测定反应液吸光度值。吸光度值越大，表示还原力越强。

2.2.3脂质体氧化法将大豆卵磷脂分散于去离子水中，20kHz超声波处理30min，周围以冰水冷却，制得大豆磷脂浓度为0.8%的人工脂质体。取脂质体1mL，加入供试品溶液适量，以10mmol·L-1乙酸铜溶液20μL催化氧化反应，混匀后放置于回转式恒温水浴振荡器上，于暗处37℃、100r·min-1进行开口氧化，每隔一定时间，取氧化液0.5mL，加纯化水至5mL，于235nm处测定其吸光度，以摩尔消光系数ε=26000(mol)-1·L·cm-1计算脂质体体系中共轭二烯氢过氧化物的生成量。

2.2.4抗羟自由基(·OH)作用实验在5mL具塞试管中加Tris-HCl缓冲液1.0mL，加入供试品溶液适量、亚甲基蓝溶液1.0mL、过氧化氢溶液0.50mL、硫酸亚铁溶液0.50mL，加纯化水稀释至刻度。用直径1cm比色皿，以纯化水作空白，于663nm波长处测定吸光度(A)，其清除率可用下式计算:

A样:加入清除剂后测得的反应体系吸光度值;A未损:指示剂本身的吸光度值;A损:未加清除剂时反应体系吸光度值。

3结果

3.1乌蕨总黄酮体外抗氧化活性见表1。样品还原力和总抗氧化值均以吸光度(A)值表示。

由表1可见，乌蕨总黄酮具有较强的抗氧化活性，可提高羟自由基的清除率，抑制卵磷脂氧化产物的生成。

3.2乌蕨总黄酮与抗氧化活性相关性分析以羟自由基清除率(X1)、还原力(X2)、CD抑制率(X3)和总抗氧化值(X4)为横坐标，乌蕨总黄酮含量(Y)为纵坐标，采用SPSS13.0软件对表1结果进行线性关系考察，得方差分析表(表2)和回归标准残差正态P-P图(图1)。

由表2和图1可知，P<0.01，自变量(Xn)与因变量(Y)服从正态分布，证明乌蕨总黄酮含量与抗氧化活性之间存在显著的线性关系。进而对其进行多元线性回归分析，得回归系数分析表(表3)。

在95%可信区间内，线性相关系数r=0.9995。

证明回归方程真实、可靠，具有统计学意义。可用于替代实验点对实验结果进行分析。

由此得拟合方程:Y=-17.453+11.015X1+36.458X2+35.917X3+12.790X4，经标准化后，拟合方程:Y=0.152X1+0.410X2+0.391X3+0.048X4。

4讨论

自由基是生物体生化反应的普遍介质。现代研究表明，许多疾病如心脑血管疾病、肝硬化、癌症以及人体衰老等过程都与自由基的作用有关[12]。目前在医疗和食品领域使用较多的是合成抗氧化剂，如二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)等，对生物体有潜在的毒副作用。黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂，具有抗衰老、增强机体免疫力等多种药理活性作用。其主要通过酚羟基与自由基进行抽氢反应生成稳定的半醌自由基，从而中断链式反应，达到抗氧化作用，且高效、低毒[13~15]。因此，越来越受到国内外医药工作者的重视。

本实验表明，乌蕨总黄酮具有较强的还原力、抗脂质体氧化和清除自由基等作用，且随提取液浓度的增加，其抗氧化性能逐渐增强，两者在6~42mg·mL-1浓度范围内均呈正相关。因此，笔者推断黄酮类化合物可能是其抗氧化作用的主要物质基础。

作为临床常用的心脑血管辅助治疗药物芦丁，无论在清除自由基、还原力，还是在总抗氧化作用等方面，体外抗氧化作用均不及乌蕨总黄酮。一方面，芦丁作为黄酮苷类，其水溶性大大增加，有利于其捕捉溶剂体系超负氧离子，但同时，3-OH也是黄酮类成分抗氧化活性的必需基团，而芦丁3位成苷，降低了整个分子的共平面性[16]，而乌蕨总黄酮是由多种黄酮类化合物组成的复合体，具有协同作用，因此，体外抗氧化作用强于芦丁。

但其活性成分有待进一步研究，以期为该植物资源的开发利用及其药理作用机制的研究提供参考。