解析异位种植结肠癌肝转移

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年超过100万人诊断为结直肠癌［1］，近年来其发病率在欧洲跃居第1～2位［2］，我国居第4位［3］。影响患者预后的主要问题是肿瘤复发或转移，其中肝脏是结直肠癌血行转移最主要的靶器官［4］。大约25％的患者在诊断结直肠癌时就已出现肝转移［5、6］。手术切除结直肠肿瘤后仍有大约20％～50％的患者出现肝转移，其5年存活率约10％～58％［7］。研究和建立结直肠癌肝转移的动物模型，特别是具有高转移率的肝转移动物模型，对研究结直肠癌肝转移的治疗以及抗肿瘤药物的筛选等具有重要意义。结肠癌肝转移种植性动物模型主要有肿瘤细胞原位种植和异位种植，后者主要包括肿瘤细胞肝门静脉注射（Intraportalinjection），脾脏种植（Intras－plenicinjection）两种方式。虽然这两种异位种植的?动物模型应用广泛，关于它们形成结肠癌肝转移效率及效果的认识还不统一［8］。早在20世纪80年代初就有学者进行研究，迄今为止已有多种结肠癌肝转移异位种植动物模型报道，各具优缺点［9］。本研究对结肠癌异位种植动物模型肝门静脉注射法和脾脏种植法的肝转移率及其效果进行分析比较，为结肠癌肝转移的预防和治疗提供动物模型。

1材料与方法

1．1实验材料

1．1．1实验动物BALB／c小鼠共60只，由广西医科大学实验动物中心提供，雌雄各半。体重20～25g，周龄6～8周。合格证号：SCXK桂2003－0003。在II级动物实验室饲养。

1．1．2实验瘤株BALB／c小鼠结肠腺癌细胞株（CT26）由美国引进，第二军医大学曹雪涛教授惠赠。常规培养CT26细胞于含10％胎牛血清的RP－MI－1640营养液。取指数生长期的细胞（图1），消化吹打成单细胞悬液，952g（1000rpm）离心5min，弃上清液，加适量不含血清的RPMI－1640营养液调整细胞浓度至1×106个／mL。图1对数生长期CT26细胞（10×10）

1．2实验方法

1．2．1脾脏种植不保留脾脏法造模30只BALB／c小鼠称重后采用腹腔内注射法麻醉，选用0．2％的戊巴比妥钠，剂量控制在40～50mg／kg，小鼠麻醉成功后固定于手术台上。常规皮肤消毒，取左侧腋中线纵行切口进腹腔，长约1cm，显露柳叶状脾脏，牵出腹腔外，用0．2mL注射器（31G针头）从脾下极进针，注入瘤细胞液0．2mL。拔针后酒精棉球按压针眼约3min，促进瘤细胞经脾静脉进入肝脏，查无出血，结扎脾血管及胃短动静脉，切除脾脏，再次查无出血，依次间断缝合肌肉、皮肤，关腹。术后继续在Ⅱ级动物实验室饲养。

1．2．2肝门静脉注射法造模30只BALB／c小鼠称重后采用腹腔内注射麻醉，选用0．2％的戊巴比妥钠，剂量控制在40～50mg／kg，小鼠麻醉成功后固定于手术台上。常规皮肤消毒，取腹正中切口进腹腔，长约1cm，显露肝门静脉，用0．2mL注射器（31G针头）从肝门静脉与水平成30度进针，注入瘤细胞液0．2mL。拔针后酒精棉球按压针眼约15min，查无出血，依次间断缝合肌肉、皮肤，关腹。术后继续在Ⅱ级动物实验室饲养。

1．3观察指标

小鼠苏醒后常规饲养，每日观察其饮及活动情况，所有小鼠待其自然死亡，观察生存期。小鼠死亡后均剖腹观察腹腔内肿瘤生长情况，肝转移率及肝脏成瘤情况，肺转移率，切取肝脏转移瘤置于10％中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，HE染色，进行常规病理组织学观察。1．4统计学方法采用SPSS13．0软件进行数据分析，卡方检验比较计量资料的组间统计差别，t检验比较计数资料的组间统计差异，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1大体观察

两组小鼠接种后大体观察相似。术后10d内BALB／c小鼠活动如常，体形无明显变化。10d后个别小鼠开始出现摄食量下降，行动渐迟缓，消瘦，腹部渐膨隆，但尚无小鼠死亡。20d后小鼠进一步消瘦，腹部膨隆明显，严重者出现死亡，第一只小鼠自然死亡时间出现在肝门静脉注射组术后第22d。术后第30～55d，大部分小鼠死亡，最后一只死亡时间出现在脾脏注射组术后58d。

2．2肝转移率

两组分别成功接种30只小鼠，肝门静脉组29只有肝转移灶形成，1只未发现肝脏表面及切面转移灶，肝脏转移率为96．7％。脾脏注射组24只小鼠发现肝转移灶，肝脏转移率为80％。两组间差异具有统计学意义（P＝0．044，表1）。

2．3肝转移灶成瘤情况

肝转移灶成瘤情况描述为：成瘤级别（高）－转移灶布满全肝；成瘤级别（中）－转移灶占全肝1／2及以上；成瘤级别（低）－转移灶占全肝低于1／2。肝门静脉组成瘤级别高、中、低的小鼠数量分别为：14只、8只、6只；脾脏种植切脾组成瘤级别高、中、低的小鼠数量分别为：9只、6只、15只。两组相比，肝门静脉组肝脏转移灶高转移和中转移例数均比脾脏种植组多（图2）。

2．4生存时间

肝门静脉组30只小鼠术后自然生存时间为22～55d，平均（34．6±8．7）d。脾脏种植切脾组30只小鼠术后自然生存时间为30～58d，平均（49．3±7．8）d。两组间差异具有统计学意义（P＝0．000）。

2．5肺转移率

两组分别成功接种30只小鼠，肝门静脉组18只有肺转移灶形成，肺转移率为60％。脾脏种植切脾组12只发现肺转移灶，肺转移率为40％。两组间差异无统计学意义（P＝0．121）。2．6病理观察镜下见肝转移灶癌细胞聚集成团，伴有癌结节形成，癌细胞形状不规则，分化差，异形性明显，胞质少，核大，深染不规则，核分裂像易见，符合低分化腺癌的结构特征（图3）。

3讨论

研究和建立具有高转移率的结肠癌肝转移动物模型一直是结直肠癌研究的重点和难点之一。目前，结直肠癌肝转移动物模型大体包括三种类型，基因工程模型，自发或诱发模型和种植性模型，而种植性模型目前应用较为广泛，根据种植的部位又可分为肿瘤细胞株原位和异位种植模型。原位移植模型是将肿瘤组织通过手术种植在体内的相应部位，从而进行相应部位肿瘤研究的方法。原位移植模型目前应用较为广泛，但对于研究结肠癌肝转移的治疗特别是药物筛选而言，原位移植模型所达到肝转移率还是不能令人满意。结直肠癌异位种植模型肿瘤接种部位包括皮下、脾脏、肝脏、门静脉和肠系膜静脉等。皮下种植模型因皮下生长的肿瘤通常易被纤维膜所包裹，难以发生肿瘤浸润和转移，表现出极低的肿瘤转移率［10］。肝脏种植模型是将结直肠癌细胞或组织块直接种植于肝脏而形成转移瘤。据国外研究报道，此法小鼠肝脏成瘤率也仅为80％［11］。脾脏和门静脉接种均表现出极高的肝转移率，国外研究报道均为100％［12、13］，然而他们所用的是裸小鼠。本研究采用具有免疫能力的BALB／c小鼠对比脾脏和肝门静脉种植法的肝转移率及肝脏成瘤效果。本研究中，肝门静脉法具有更高的肝转移率及肝脏成瘤效果，而脾脏种植切除脾脏法在生存时间和操作难易程度上表现出优势，两者的肺转移率差异无统计学意义。肝门静脉法模型肝转移率为96．7％，与国外报道结果相似［14］，比脾脏种植法高；同时在肝脏成瘤效果方面，肝门静脉法有更多的例数出现全肝或肝脏一半以上的转移，能更好地满足各种检测方法取材的需要；缺点为生存时间相对较短，并且实验时应注意不能选择过粗的针头，否则容易引起拔针后门静脉不容易止血而导致小鼠死亡，不能注射过多的肿瘤细胞，否则易出现肝血管栓塞造成小鼠死亡［15］。而脾脏种植切除脾脏法虽然肝转移率稍低，但具有更长的生存时间及更易操作，较适合验证周期较长的药物实验，同时，它很好地模拟了结直肠癌根治术后因血行转移而发生肝转移的过程。本研究中的两种异位种植模型均能达到很高的肝转移，重复性好，但属于实验性方法产生的肝转移的最后阶段，并非研究结肠癌肝转移的全过程。在选择动物模型中注意实验方案选择适合的模型。本研究建立并对比了两种具有高转移率的结肠癌肝转移小鼠模型，肝门静脉法在肝转移率成肝脏成瘤效果方面更具优势，适合对肝转移率成取材要求较高的实验研究；而脾脏种植切除脾脏法则更适合验证周期较长的药物实验。