深究组织工程微粒皮肤的构建及其性能

摘要：目的探索利用人成纤维细胞和York猪脱细胞真皮基质(ADM)微粒复合构建组织工程微粒皮肤的可行性并对其进行初步研究。方法体外培养取自胎背的人成纤维细胞，用PKH26标记，将细胞与ADM微粒复合构建微粒皮肤，用荧光显微镜观察、电镜观察和MTT法检测组织工程微粒皮肤的性能。结果脱细胞真皮基质微粒均匀柔软，弹性、韧性好，三维结构完整且排列规则。细胞与ADM微粒的复合情况良好，2h后开始黏附，2d后增殖明显，10d增殖达到高峰；7d时取材，HE和SEM显示成纤维细胞在ADM微粒表面成层黏附，并分泌大量基质；细胞生长良好。结论利用人成纤维细胞和York猪的ADM微粒可以构建具有活性的组织工程微粒皮肤。

关键词：组织工程微粒皮肤脱细胞真皮基质成纤维细胞

皮肤是覆盖与保护体表的重要组织器官。由于炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后及先天性畸形等原因常造成皮肤的缺损与异常。对于这种组织缺损目前多采用自体皮肤移植，这种方法不仅造成供皮区新的创伤缺陷，而且经常受供皮来源的限制。随着组织工程技术研究的深入，应用组织工程皮肤修复皮肤缺损是目前皮肤缺损修复研究的热点之一。脱细胞真皮基质(acellulardermalmatrix，ADM)是目前最有应用前景的支架材料，它去除了引发宿主排斥反应的细胞成分，完整地保留了细胞外基质的形态结构和组成成分，力学性能好，抗原性低，可诱导具有再生能力的成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞按照应有的组织学方式长入真皮层，其临床应用效果最好，并且其在体内降解吸收与宿主组织改建相一致。笔者在实验中借鉴烧伤治疗中的微粒皮技术，利用改良消蚀法(另文发表)制备相容性良好的ADM微粒，与成纤维细胞复合构建组织工程微粒皮肤，以期延展组织工程在皮肤缺损修复上的应用前景。

一、材料与方法

1、材料

York猪(第四军医大学实验动物中心提供)；DMEM低糖培养基(美国Sigma公司)；胰酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；超净工作台(Nuair公司)；CO2孵箱(Nuair公司)；倒置显微镜(Olympus公司)；低温高速离心机(北京医用离心机厂)；培养板(Falcon公司)，；取皮鼓(无锡新达轻工机械有限公司)；恒温箱(HHS21-4型，上海跃进医疗器械厂)；扫描电子显微镜(TXA-840，日本电子光学公司)；真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；全自动酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司MK3型酶标仪)。

2、新型脱细胞真皮基质微粒的制备

取York猪(20kg)新鲜背部皮肤，切成5cm×10cm大小，用取皮鼓反向取皮，去除含猪表皮面约0.3mm厚的皮片；将余下的猪真皮，再用取皮鼓同法于近表皮面取约0.3mm厚皮片，用质量浓度2.5g/L胰蛋白酶消化90min，大量纯水冲洗，然后将皮片用4%NaOH溶液消蚀，B型超声清洗仪间断振荡清洗，每隔4h更换消蚀液1次，消蚀18h时将皮片取出，用滴加青、链霉素的PBS浸洗24h以上，其间多次换液，直至溶液变为清亮，pH7.2。最后将皮片放于-80℃冰箱，反复冻融3次，每次4h，使细胞完全破裂崩解。然后置冷冻干燥机冻干，再用物理方法切割成约0.3mm×0.3mm×0.3mm大小的ADM微粒，用PVC袋分装、60Co照射、无菌保存。取部分材料用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，组织切片后常规苏木精-伊红(HE)染色和扫描电镜观察，观察ADM微粒的颜色、结构和细胞残留情况。

3、成纤维细胞的分离培养及扩增

背部皮肤取自合法水囊引产的5月龄男胎，将其切成2mm×5mm的条块，在4℃下用含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS浸泡冲洗，修剪多余的脂肪和肌肉组织，用质量浓度2.5g/L胰酶4℃消化，机械分离表皮层和真皮层，将真皮层吹散，收获其中的成纤维细胞，接种于75cm2的培养瓶中，用含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液扩大培养并传代，取2～9代生长良好的成纤维细胞使用。

4、PKH26标记成纤维细胞

细胞示踪剂PKH26是亲脂性的荧光染料，散发红色荧光。它可以与细胞膜不可逆地结合，对细胞进行荧光标记。按文献所述方法，在nitName="℃">25℃条件下进行，用质量浓度2.5g/L胰酶消化对数期生长的细胞，制备单细胞悬液，计数。用PBS洗涤上述单细胞悬液，离心5min，小心吸去上清，加入1ml专用重悬液DiluentC重悬细胞，在染色之前即刻，在另一离心管中配制浓度4×10-6mol/L的PKH26染料。迅速均匀地将1ml重悬细胞液和1ml的染料液相混合，轻轻吹打、混匀，孵育2～5min。加入等量的血清终止反应，放置1min，再加入等量的含血清DMEM。离心，移去上清，将细胞移入新的离心管中，用PBS洗涤3次。加入10mlDMEM洗涤细胞，培养、传代。在荧光显微镜下检查标记的成纤维细胞染色效果和荧光强度，并观察细胞的活力。

5、组织工程微粒皮肤的构建

将制备好的ADM微粒用DMEM浸泡24h后，平铺于12孔板中，以2×106/孔密度加入培养好的2～9代成纤维细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，置37℃、体积分数5%CO2孵箱中培养2周，每天换液，用倒置相差显微镜观察细胞生长情况，第3、7天取材HE染色，电镜扫描。同法准备另一铺好ADM微粒的12孔板，加入同样浓度PKH26标记的成纤维细胞，培养，在荧光显微镜下观察细胞在微粒上的黏附、生长情况。

6、细胞增殖检测

在96孔板中，将成纤维细胞分别按2×103/孔接种在已灭菌处理好的ADM微粒上，加入DMEM培养液(含10%胎牛血清)至100μl，在37℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。对照组直接接种细胞到孔板中，空白对照以100μlDMEM培养液代替细胞悬液接种，隔日换液。接种后第0、2、4、6、8、10、12天用MTT法测细胞在微粒上的增殖情况:先换无血清培养液80μl孵育2h，再加MTT(质量浓度5mg/ml)20μl，置于37℃恒温培养箱中4h后，弃去孔内上清加DMSO100μl，在37℃恒温培养箱中孵育10min，待沉淀溶解后在酶标仪上读取吸光度(A)值，检测波长570nm。根据A值绘出增殖曲线。每组56孔，每时相检测点测8孔，重复4次。

7、统计学方法

对照组和实验组各时间点A值均采用均数±标准差表示，利用SPSS11.0统计软件，均数间两两比较采用Student-Newman-Keul(SNK)法，设定α=0.05。组间比较采用t检验。

二、结果

1、脱细胞真皮基质微粒观察

脱细胞真皮基质微粒外观呈瓷白色，厚度为3000μm左右，表面(乳头层侧)平整光滑(图1a)，微粒均匀，质地柔软，有弹性，韧性好。镜下观察可见胶原纤维稍松散但排列规则，三维结构完整(封二插图图1b)，真皮基质内未见细胞及细胞碎片存在。扫描电镜显示，胶原纤维连续不断，相互交织成立体网状结构，排列整齐，分布均匀，孔隙直径约20~50μm，孔隙间相互连通(图1c)。

2、组织工程微粒皮肤的细胞生长情况观察

成纤维细胞在ADM微粒上2h即可黏附，2d后在微粒上开始增殖，可以看见细胞在微粒上生长良好(封二插图图2a)，7d时可见大量成纤维细胞以微粒为核心生长数层并分泌大量基质(封二插图图2b)。7d时，在荧光显微镜下可见与ADM微粒复合的PKH26标记的成纤维细胞数量增多(封二插图图"0"NumberType="1"Negative="False"HasSpace="False"SourceValue="2"UnitName="C">2c)。电镜扫描显示复合7d后，成纤维细胞在ADM微粒上生长伸展良好(图2d)。

3、组织工程微粒皮肤的细胞增殖情况检测复合培养2、4、6、8、10、12d时微粒组成纤维细胞的增殖活力比较结果见图3。由MTT结果可知，10d时组织工程微粒皮肤上的细胞与之前时间段相比增殖明显(P<0.05)，特别是与2d时的增殖情况相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。

三、讨论

理想的人工真皮，其内部应具有一定孔径和孔隙率，以利于组织中成纤维细胞和毛细血管的长入，并且在移植后一段时间保持其网状结构。这样既具有合适的被吸收率和降解速度，同时，又具有良好的创面黏附性。ADM作为天然的生物材料，保持了细胞外基质的主要成分及结构，而脱去了细胞成分，从而最大限度地降低了免疫原性，且有较好的组织相容性，为其应用于创面修复提供了物质基础，并且ADM本身无毒性，其降解产物可被机体吸收，不对机体产生危害；同时，胶原的三维空间结构具有一定的强度，是构建组织工程支架的良好材料。作为永久性人工真皮支架，ADM已应用于临床，对改善创面的愈合提供了新的选择。但由于ADM植入创面后血管化速度较慢，移植成分常因血供困难而愈合欠佳或坏死，特别是异种ADM的移植。因此，加速ADM血管化，对提高ADM支架的实用性，有着重要的临床意义。研究表明，成纤维细胞能够分泌多种细胞外基质和生长因子，诱导表皮细胞、内皮细胞增殖，利用成纤维细胞的这种特性，将成纤维细胞种植于人工支架上，可以降低排异反应，增加生物亲和性，促进创面肉芽组织生长。Hansbrough等在PGA/PLA网上种植异体成纤维细胞，培养2～3周，网孔中可被融合的成纤维细胞及其合成分泌的基质填充，植入创面后易于血管化，适于与网状皮片复合移植。但当不种植成纤维细胞时，单纯的PGA/PLA网血管化较慢，导致重叠移植的网状皮片坏死。因此，在人工替代物中引入成纤维细胞，可提高生物亲和性，加速新生血管形成。这可能与其分泌多种细胞因子、生长因子和细胞外基质成分，从而增强真皮替代物的亲和性，促进血管化有关。肖仕初等报道，在ADM上种植成纤维细胞构建活性人工真皮，细胞基本上是在表面生长，向支架内部生长缓慢。

笔者实验借鉴烧伤临床的微粒皮技术，将成纤维细胞种植于自制的一种新型具有良好生物相容性的脱细胞真皮基质微粒上，期望能够获得一种血浆容易渗透、血管易于长入、应用方便的组织工程脱细胞真皮基质微粒皮肤。从实验中可以看出，种植前2d，成纤维细胞在ADM微粒上能够较好黏附，但增殖缓慢，之后细胞增殖明显加快，10d时达到增殖高峰。这一点从细胞增殖曲线和荧光显微镜观察结果也得到了印证。虽然细胞在ADM微粒上的增殖不如直接在培养板上生长，但两组细胞的增殖活性并没有统计学差异，这与其他相关报道的结果不完全一致。对HE显微照片和电镜照片观察可见，构建好的组织工程微粒皮肤上成纤维细胞呈多层生长，并分泌大量细胞外基质，与天然皮肤的结构相似。综上所述，笔者在实验中所构建的微粒皮肤是具有生物活性的组织工程产品，通过进一步的体内实验有望扩展组织工程皮肤的应用范围。